Implementação de um microscópio não-linear baseado em espalhamento Raman estimulado

Engineering

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Summary

Neste manuscrito, é descrita a implementação de um microscópio de espalhamento Raman (SRS) estimulado, obtido pela integração de um conjunto experimental de SRS com um microscópio de varredura a laser. O microscópio de SRS é baseado em duas fontes do laser do femtossegundo (FS), em um ti-safira (ti: SA) e em oscilador paramétrico ótico sincronizado (OPO).

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Ranjan, R., Indolfi, M., Ferrara, M. A., Sirleto, L. Implementation of a Nonlinear Microscope Based on Stimulated Raman Scattering. J. Vis. Exp. (149), e59614, doi:10.3791/59614 (2019).

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Abstract

A microscopia de espalhamento Raman (SRS) estimulada usa luz de excitação near-infrared; Conseqüentemente, compartilha de muitas propriedades microscópicas da imagem latente do multi-fóton. A modalidade da imagem latente de SRS pode ser obtida usando microscópios comerciais da laser-exploração equipando com um detector dianteiro não-descanned com filtros apropriados do bandpass e o esquema de deteção do fechamento-no amplificador (LIA). Uma disposição esquemática de um microscópio típico de SRS inclui o seguinte: dois feixes de laser pulsado, (isto é, a bomba e a ponta de prova dirigidas em um microscópio da exploração), que deva ser sobreposta no espaço e no tempo no plano da imagem, a seguir focalizada por um objetivo do microscópio em a amostra através de dois espelhos de digitalização (SMs), que raster o ponto focal através de um plano x-y. Após a interação com a amostra, os pulsos de saída transmitidos são coletados por um objetivo superior e medidos por um sistema de detecção de avanço inserido em um microscópio invertido. Os pulsos da bomba são removidos por uma pilha de filtros óticos, visto que os pulsos da ponta de prova que são o resultado do processo de SRS que ocorre no volume focal do espécime são medidos por um fotodiodo (paládio). O leitura do paládio é demodulado pelo lia para extrair a profundidade da modulação. Uma imagem bidimensional (2D) é obtida sincronizando a unidade de detecção direta com a unidade de digitalização do microscópio. Neste trabalho, a implementação de um microscópio de SRS é descrita e demonstrada com sucesso, bem como a comunicação de imagens sem rótulo de grânulos de poliestireno com diâmetros de 3 μm. Vale a pena notar que os microscópios SRS não estão disponíveis comercialmente, por isso, a fim de tirar proveito dessas características, a construção caseira é a única opção. Desde que a microscopia de SRS está tornando-se popular em muitos campos, acredita-se que esta descrição cuidadosa da implementação do microscópio de SRS pode ser muito útil para a comunidade científica.

Introduction

Em aplicações da ciência da vida, a microscopia de SRS emergiu como a ferramenta poderosa para a imagem latente Label-Free. A idéia básica da microscopia SRS é combinar a força do contraste vibracional e sua capacidade de adquirir imagens em poucos segundos.

SRS é um processo em que a diferença de frequência entre duas freqüências de feixes de laser (sinal da bomba e sinal Stokes em diferentes frequências) coincide com a vibração molecular de uma amostra investigada, causando dispersão Raman estimulado e uma significativa aumento do sinal Stokes. Ao contrário da Espectroscopia Raman linear, o SRS apresenta uma dependência não linear dos campos de luz recebidos e produz radiação coerente. SRS tem duas vantagens fundamentais: 1) velocidade, o que torna as imagens menos sensíveis aos artefactos resultantes do movimento da amostra ou degradação, e 2) uma excelente relação sinal-ruído (SNR). Além, SRS exibe um espectro idêntico ao Raman espontâneo, e o sinal de SRS é linearmente proporcional à concentração da ligação química excited1,2,3,4, a 5.

Em nosso microscópio, um femtossegundo (FS) SRS experimental set-up é integrado com um microscópio óptico invertido equipado com uma unidade de digitalização de espelhos rápidos (Figura 1)6,7,8. Duas fontes de laser pulsada são usadas para implementar este microscópio. O primeiro é um FS-ti: SA com uma duração de pulso de aproximadamente 140 FS, taxa de repetição de 80 MHz, e comprimentos de onda de emissão na faixa de 680-1080 nm. O segundo, usado como feixe de sonda e bombeado por ti: SA, é um oscilador paramétrico óptico sincronizado femtossegundo (Sopo), com uma duração de pulso de aproximadamente 200 FS, taxa de repetição de 80 MHz e comprimentos de onda de emissão na faixa de 1000-1600 nm. Deve-se notar que a diferença mínima de energia do fóton entre o feixe ti: SA e SOPO é de 2500 cm-1. Portanto, usando essa combinação de sistemas a laser, apenas a região C-H de alta frequência (2800-3200 cm-1) dos espectros Raman pode ser explorada6,7,8.

A fim estabelecer um microscópio de SRS, há três edições cruciais a considerar, que são descritas nos parágrafos sucessivos. A primeira é a implementação de um método de transferência de modulação de alta frequência (ver Figura 2 e etapa 2,1 do protocolo para uma descrição). Em uma investigação experimental SRS, um parâmetro crucial é a sensibilidade do sistema. Um sinal de SRS é detectado como uma pequena alteração na intensidade dos feixes de excitação; Conseqüentemente, pode ser corrompido pelo ruído da intensidade do laser e pelo ruído do tiro. Esta edição pode ser superada integrando este sistema com um método de transferência de alta freqüência da modulação (veja Figura 2 e etapa 2,1 do protocolo para detalhes). Neste método, um modulador electro-óptico (EOM) é usado para modular a bomba. A modulação transferida para o feixe de sonda pode então ser detectada por um PD depois de bloquear o feixe da bomba com uma pilha de filtros ópticos [estimulado o ganho Raman (SRG) modo de detecção]. A saída PD é conectada por um filtro passa-baixo para um amplificador de bloqueio (LIA), que demodula o sinal medido. Ao aumentar a frequência de modulação do feixe para freqüências acima de 1 MHz, o limite intrínseco do PDs pode ser obtido.

A segunda edição a considerar é a instalação de uma montagem mecânica que permita realizar a deteção para diante e ao mesmo tempo preservar a observação do microscópio no brightfield. Além, tem que reduzir o ruído devido à vibração mecânica durante a geração de imagens e permitir o reposicionamento preciso do sistema de deteção (veja Figura 3 e etapa 2,2 do protocolo).

A terceira é a sincronização do sinal adquirido pelo esquema de detecção sensível à fase, com o feixe posicionado na amostra monitorada pelo cabeçote de varredura do microscópio. A fim realizar imagens, os SMs exigem três sinais do TTL que são disponibilizados pelo controlador do microscópio conectado à unidade da cabeça da varredura: pulso de disparo do pixel, sincronização da linha, e sincronização do frame. A sincronização é conseguida controlando usando um cartão do PCI, os três sinais do TTL, e a aquisição de um sinal da tensão no canal de saída de lia6,7,8. Um software caseiro foi desenvolvido e descrito anteriormente6,7,8, enquanto o hardware do sistema de sincronização é relatado na Figura 4.

Um procedimento fundamental ao realizar a imagem latente de SRS é alinhamento do microscópio. Realiza-se ao longo de quatro etapas, que são descritas nos parágrafos sucessivos. A primeira é a sobreposição espacial de duas vigas (ver passo 3,1 do protocolo). Nesta fase experimental, as duas vigas foram combinadas espacialmente por um espelho dicróico. A etapa preliminar é o alinhamento de OPO e de ti: SA de modo que cada um alcangue o microscópio. Em seguida, considerando OPO como um feixe de referência e tirando proveito de um detector de posição sensível, o ti: SA é espacialmente sobreposta a OPO.

O segundo aspecto crucial é a sobreposição temporal de duas vigas (ver passo 3,2 do protocolo). Mesmo se a bomba e os feixes de OPO são perfeitamente sincronizados9, uma vez que seguem caminhos de feixe ligeiramente diferentes dentro da habitação opo, na saída opo eles têm um atraso de cerca de 5 ns e diferença espacial de 5 cm. Portanto, ti: SA e OPO exigem re-cronometrado opticamente para garantir a sobreposição temporal na amostra. Isso normalmente é realizado com uma linha de retardo óptico finamente sintonável, que neste caso é inserida entre o ti: SA e o microscópio (veja a Figura 1). A fim de obter a sobreposição temporal de dois feixes, duas técnicas são usadas. O primeiro é realizado usando um PD rápido e osciloscópio, enquanto o segundo é baseado em correlações auto e Cross-Optical. Usando a primeira técnica, uma sobreposição áspera de dois feixes é obtida (incerteza de 10 picosegundo), quando uma sobreposição temporal exata de dois feixes for obtida usando um cross-correlator (definição de 1 FS).

O terceiro aspecto crucial é o alinhamento das duas vigas no interior do microscópio (ver passo 3,3 do protocolo). Uma observação preliminar da luz branca da amostra permite individuar o campo de visão desejado (FOV). Em seguida, os feixes de laser, entrando no microscópio por uma porta lateral do microscópio, são alinhados a fim alcangar o paládio montado na parte superior (Figura 3). No entanto, para uma aquisição de imagem correta, é necessário definir um número de parâmetros (por exemplo, dimensão de pixel e tempo de permanência do pixel). A frequência de amostragem deve respeitar a restrição imposta pelo teorema de Nyquist, a fim de preservar todas as informações em uma imagem, enquanto que para uma correspondência correta entre as coordenadas espaciais de pixels e o valor de SRS medido em cada pixel, o tempo de integração de LIA deve ser igual ou comparável ao tempo de permanência do pixel.

Na etapa final do alinhamento do microscópio, são realizados inúmeros testes para otimizar o alinhamento espacial e temporal (ver etapa 3,4 do protocolo). Uma série de imagens de transmissão (TI) para ti: SA e OPO são adquiridas a fim de otimizar a sobreposição espacial. Em um TI, um único feixe é usado, e a intensidade transmitida do feixe da amostra é medida por um PD. No caso de TI realizado por OPO, o sinal de saída PD está diretamente conectado ao cartão PCI, enquanto no caso de TI realizado por ti: SA, o sinal de saída PD é conectado a LIA e saída analógica de LIA está conectado a placa PCI. As imagens de transmissão são muito úteis para otimizar o FOV, a iluminação, a posição focal dos objetivos do microscópio e verificar se as duas vigas são espacialmente sobrepostas6,7,8.

A otimização da sobreposição temporal da bomba e do feixe de sonda é obtida através da digitalização da linha de retardo com etapas de 0, 1 mm correspondendo a um deslocamento de tempo de 3,3 FS e realizando uma medição de SRS em um único ponto de uma amostra de grânulo de poliestireno de 3 μm de diâmetro. A amplitude de um sinal de SRS mede valores de lia, em função do retardo da sonda-bomba, e fornece um máximo correspondente com a sobreposição temporal exata das duas vigas6,7,8. Antes de concluir, deve-se notar que todas as etapas discutidas são obrigatórias para obter uma imagem de alta qualidade.

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Protocol

1. iniciando o sistema a laser

  1. Verifique se a temperatura dos resfriadores é mantida a ou abaixo de 20 ° c.
  2. Verifique se a unidade de controle de umidade está funcionando corretamente e a umidade é mantida em um valor em torno de 40%.
  3. Ligue o laser ti: SA, seguindo rigorosamente as instruções do manual.
  4. Defina o comprimento de onda para 810 nm.
  5. Ligue o OPO e o mini-computador conectado. Execute o aplicativo que controla o laser OPO.
  6. Selecione bypass se 100% da saída de laser ti: SA é necessária na saída da caixa opo.
  7. Desmarque a opção bypass se 20% da saída de laser ti: SA e a saída de laser opo forem necessárias na saída da caixa opo.
  8. Abra o obturador de ti: SA e solte o feixe ti: SA para a entrada opo.
  9. Solte os dois feixes de laser na saída OPO, clicando em sinal-out e Pump-out.
  10. Aguarde até que ambos os lasers ti: SA e OPO são estabilizados (cerca de 45 – 60 min).
  11. Verifique o ponto de feixe na saída da caixa OPO para ambos ti: SA e OPO usando um cartão de detector de papel e verificar a energia usando um medidor de energia.
  12. Sintonize o comprimento de onda do laser OPO para 1076 nm.
  13. Reduza a potência para ~ 10 mW para cada feixe de laser para executar o alinhamento.

2. Configurando o microscópio

  1. Implementação de método de transferência de modulação de alta freqüência
    1. Realize o procedimento de alinhamento óptico do modulador de tal forma que o feixe ti: SA entra e sai sem qualquer distorção.
    2. Ligue o gerador de funções e gere um sinal TTL (onda quadrada com amplitude = 5 V, offset = 2,5 V, frequência = 5 MHz).
    3. Divida o sinal TTL em duas partes usando uma junção T; um para o EOM e outro para o amplificador de bloqueio (LIA) (ver Figura 2).
    4. Verifique todos os níveis de sinal com um osciloscópio.
    5. Gire sobre o LIA e conecte o canal de saída do gerador ao canal de referência do LIA.
    6. Conecte o canal de saída do gerador ao amplificador de potência de alta tensão de EOM.
    7. Ligue o amplificador e definir a tensão para quase o nível máximo. Monitore a potência da viga na saída da EOM.
  2. Integração da montagem mecânica para fixar o PD e atribuir movimento relativo x e y
    Nota: com o microscópio, um suporte externo é introduzido, equipado com um micrômetro que tenha o controle de movimento em sentidos de x e de y.
    1. Monte dois estágios de tradução de viagem para permitir movimentos ao longo das direções x e y (veja a Figura 3).
    2. Fixe o estágio em um borne de Ø 1,5 "da altura apropriada.
    3. Monte o PD em um suporte externo.
    4. Maximize a potência do feixe na PD, ajustando as posições de PD (coordenadas x e y) usando os micrômetros anexados ao suporte (veja a Figura 3).

3. alinhamento do microscópio

  1. Sobreposição espacial das vigas
    Nota: Considerando o feixe de OPO como uma referência e aproveitando-se de um detetor sensível da posição, o ti: SA deve ser sobreposto ao OPO de acordo com o seguinte procedimento:
    1. Alinhe o OPO e os feixes de laser ti: SA para que ambos alcancem o microscópio.
    2. Coloc os detectores dos sensores da posição do feixe de laser em duas posições entre o espelho dichroic 1 e o espelho 6, a primeira posição é ficada situada perto do espelho dichroic 1 e a segunda está próxima ao espelho 6. Para cada posição, use os sensores para detectar as coordenadas x e y do feixe OPO (siga a Figura 1).
    3. Verifique se as coordenadas x e y do feixe de laser ti: SA são o mesmo OPO em ambas as posições dos detectores de sensores. Se em algumas posições as coordenadas de ti: SA e OPO não coincidirem, sintonize a inclinação do espelho adjacente para compensar a diferença (siga a Figura 1).
    4. Siga o mesmo procedimento para alinhar as posições de feixe ti: SA em relação ao OPO para o trajeto entre M6-M7 (siga a Figura 1).
  2. Sincronização temporal das vigas
    1. Uso do fotodiodo rápido mais o osciloscópio:
      1. Pare a propagação das vigas ti: SA e OPO e coloque um detector rápido na frente do feixe OPO (entre M6 e M7).
      2. Conecte o sinal de disparo fornecido pela caixa de laser ti: SA com um osciloscópio no canal 2.
      3. Conecte o cabo do detector com o osciloscópio no canal 1 e visualize o perfil temporal OPO.
      4. Registre o tempo (abscissa) medido pelo osciloscópio correspondente ao seu valor máximo, ou seja, T1.
      5. Pare o feixe de OPO e libere o feixe de ti: SA.
      6. Visualize o perfil temporal ti: SA e registre o tempo (abscissa) correspondente ao seu valor máximo, ou seja, T2.
      7. Minimize a diferença entre T1-T2 usando a linha de retardo para sobrepor as duas vigas. No nosso caso, a diferença mínima mensurável é de 10 PS.
      8. Retire o detector rápido entre M6 e M7.
    2. Uso do autocorrelator:
      Nota: no diagrama esquemático mostrado na Figura 1, um autocorrelator é instalado sem interferir com os caminhos ópticos das vigas. Além disso, um espelho adicional é introduzido e montado em uma montagem flip-flop (referida como FFM/AM) entre M6 e M7 para desviar o feixe para o autocorrelator.
      1. Vire o AM para direcionar o feixe para o autocorrelator.
      2. Pare o ti: SA e libere o OPO.
      3. Defina o micrômetro de parafuso de ajuste da distância do feixe do autocorrelator para a posição normal (8,35 mm).
      4. Ligue o controlador autocorrelator e inicie o aplicativo de software no computador pessoal controlando-o.
      5. Projelhe o feixe de OPO de FFM/AM ao espelho da entrada no autocorrelator.
      6. Controle o ponto de reflexão (usando uma placa de detector de papel) da viga na janela de alinhamento do autocorrelator.
      7. No caso de não-feixe ou baixa-feixe de intensidade, ajustar a posição e orientação de FFM/AM para a melhor extensão, e tentar ajustar o espelho de entrada (montado sobre o autocorrelator) para maximizar o sinal de pulso laser. O sinal de autocorrelator é obtido como mostrado na Figura 5a.
      8. Pare o OPO e o projeto do feixe de ti: SA de FFM/AM para introduzir o espelho no autocorrelator. Repita as etapas 3.2.2.6 e 3.2.2.7. O sinal de autocorrelator é obtido como mostrado na Figura 5b.
      9. Defina o micrômetro de parafuso de ajuste da distância do feixe para a posição cruzada (7,30 mm).
      10. Libere as duas vigas.
      11. Digitalizar a linha de atraso para obter as duas vigas OPO e ti: SA sobreposta. O sinal de cruz-correlator é obtido como mostrado na Figura 6.
      12. Vire o espelho FFM/AM para que as vigas podem chegar M7 e cabeça de digitalização do microscópio.
  3. Alinhamento do microscópio
    1. Realize a observação microscópica da luz branca:
      Nota: antes da observação microscópica, assegure-se de que o microscópio esteja devidamente alinhado.
      1. Prepare a amostra de teste, que consiste em uma solução tampão fosfato em que grânulos de poliestireno com diâmetros de 3 μm são dispersos. A solução é colocada dentro de um sanduíche de duas lâminas de vidro.
      2. Gire sobre o microscópio e a fonte de alimentação da luz branca. Siga o manual para observação luz branca.
      3. Use um condensador para iluminar a amostra. Use o objetivo de 60x para coletar a luz. Coloque a amostra no palco. Otimize a posição focal do objetivo do microscópio 60x.
      4. Selecione o FOV de interesse. Pegue uma imagem CCD da amostra (Figura 7).
      5. Desligue a fonte de alimentação da luz branca.
    2. Alinhamento do microscópio com feixes de laser femtossegundo: opo e ti: SA
      1. Retire o condensador usando o botão escape para retrair temporariamente a lente objetiva do microscópio 60x. Mova a lente objetiva do microscópio 60x fora do trajeto ótico, girando o Nosepiece.
      2. Monte o detector na parte superior do microscópio usando o suporte mecânico externo. Conecte a saída do detector através de um filtro passa-baixo de 50 Ω ao osciloscópio e monitore o sinal de OPO.
      3. Ative o processador que controla a cabeça do scanner. Projelhe o feixe de OPO na cabeça do varredor do microscópio.
      4. Verifique a posição do feixe dentro do microscópio, certifique-se de que a localização do feixe está no centro ou perto do centro.
      5. Verifique se a posição do feixe dentro da cabeça do PD está no centro.
      6. Maximize a potência medida pelo detector usando um tradutor x-y.
      7. Mude o feixe de OPO para ti: SA e verifique se um sinal máximo também é obtido para o laser de titânio-safira. Isso indica que ambas as vigas estão bem alinhadas.
      8. Finalize o alinhamento do feixe, introduzindo a lente objetiva do microscópio 60x e girando para trás o Nosepiece.
      9. Use o botão Refocus no microscópio para recuperar o foco finalizado para a lente objetiva de microscópio 60x.
      10. Coloque o objetivo com ampliação 40x no lugar do condensador sem tocar ou perturbar a amostra.
  4. Otimização de sincronizações espaciais e temporais de vigas
    1. Sincronização temporal
      1. Defina o poder de ti: SA e OPO medidos antes do microscópio para 30 mW para ambos os feixes. Ajuste o comprimento de onda de opo a um valor diferente com respeito ao precedente de modo que a bomba e a ponta de prova não estejam na ressonância com a freqüência vibracional dos grânulos.
      2. Libere ambas as vigas (ti: SA e OPO) para que entrem no microscópio.
      3. Execute a linha de atraso de digitalização Tradutor computadorizado e registre a intensidade medida pela LIA para cada posição da linha de retardo. Aguarde até que a verificação da linha de atraso esteja concluída. O perfil temporal obtido é visualizado na figura 8a.
      4. Ajuste o comprimento de onda de opo a 1076 nanômetro outra vez de modo que a bomba e a ponta de prova estejam na ressonância com a freqüência vibracional dos grânulos. Repita a etapa 3.4.1.3 (o perfil temporal obtido é visualizado na Figura 8B).
      5. Defina a posição de feixe de sobreposição obtida na linha de atraso para adquirir imagens SRS.
    2. Sincronização espacial das vigas
      Nota: as imagens de transmissão são úteis para otimizar o FOV, a iluminação e a posição focal dos objetivos do microscópio, e para verificar se as duas vigas são sobrepostas espacialmente.
      1. Aquisição de imagem de transmissão de OPO
        1. Pare o feixe ti: SA e reduza a potência OPO para 8 mW.
        2. Ligue a leitura do detector ao cartão de aquisição de dados.
        3. Execute o programa de aquisição de dados junto com o console de digitalização do microscópio.
        4. Salve o arquivo e processe os dados para obter a imagem. A imagem bruta aparece como mostrado na Figura 9A.
      2. Aquisição de imagem de transmissão de ti: SA
        1. Pare o feixe de OPO e reduza o poder de ti: SA a 2.5-4.5 mW.
        2. Conecte o detector com leituras LIA e LIA com o cartão de aquisição de dados.
        3. Repita as etapas 3.4.2.1.3 e 3.4.2.1.4. A imagem bruta aparece como mostrado na Figura 9B.

4. aquisição de imagens SRS

Nota: um algoritmo dedicado foi realizado a fim armazenar dados. Ele suporta os seguintes formatos de imagem: 512 PX x 512 PX e 256 PX x 256 px, com tempos de aquisição de 16 s, 8 s, 4 s e 2 s.

  1. Introduzir uma pilha de filtros entre o objetivo 40x e PD para remover os pulsos da bomba (ti: SA) e adquirir apenas o sinal Stokes (OPO).
  2. Ajuste o sinal da bomba a 810 nanômetro com uma potência focalizada de 8 mW e o sinal da ponta de prova a 1076 nanômetro com uma potência focalizada de 8 mW para investigar uma ligação típica de C-H do poliestireno (deslocamento de Raman de 3054 cm− 1).
  3. Conecte o detector com a leitura LIA e LIA ao cartão de aquisição de dados.
  4. Defina o formato de pixel de aquisição de imagem como por requisito e defina o tempo de aquisição.
  5. Execute o programa que controla o controlador de microscópio.
  6. Execute o programa de algoritmo dedicado que atua como sincronização entre o controlador de microscópio, o sistema de detecção e o DAQ (consulte a Figura 4).
  7. Salve o arquivo de matriz quando a aquisição for concluída.
  8. Importe o arquivo de dados brutos e salve a imagem no formato necessário (normalmente salvo no formato. tif) usando o software ImageJ. A imagem é mostrada na Figura 10.

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Representative Results

Um exemplo de medida SRS (i.e., medida SRS em um único ponto da amostra) é relatado na Figura 7. Quando as vigas não são sobrepostas no tempo ou no espaço, o resultado obtido é relatado na figura 8a. Em off-Resonance, a amplitude do sinal medido pela LIA é zero, enquanto a fase de sinal medido pela LIA salta entre valores negativos e positivos. Enquanto que, quando as vigas são sobrepostas no espaço, movendo a linha de atraso em um intervalo apropriado, os resultados obtidos são relatados na Figura 8B. O sinal medido pela LIA aumenta e atinge o seu máximo quando as vigas são perfeitamente sobrepostas no tempo, enquanto a fase começa a atingir um valor fixo durante o tempo em que as vigas são sobrepostas no tempo.

As imagens de absorção obtidas por meio de um único feixe (ti: SA ou OPO) das mesmas esferas de poliestireno são representadas na Figura 9A, b com barras de escala de 6 μm. Para adquirir as imagens de SRS, a linha de atraso é definida para a posição alcançada na Figura 7B, uma imagem SRG típica é mostrada na Figura 10 com uma barra de escala de 6 μm.

Figure 1
Figura 1: esquema esquemático do sistema de microscópio f-Srs. OPO = oscilador óptico paramétrico; Ti: SA = laser Titanium-Sapphire; M1-M7 = espelhos de banda larga femtossegundo; FFM/AM = espelho flip-flop/espelho Autocorrelator;  DM1, DM2 = espelhos dichroic; DL = linha de atraso; AC = autocorrelator; EOM = modulador eletroóptico; FG = gerador de função; GM = espelho Galvo; Obj1, obj2 = objetivos do microscópio; DP = fotodiodo; DAQ = sistema de aquisição de dados; PC = computador pessoal. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: esquema de método de transferência de modulação de alta frequência. Na figura Inset, os dois feixes de lasers antes da interação dentro da amostra e da sonda modificada devido às interações da sonda e da bomba dentro da amostra são representados. O tempo é representado em NS. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: representação da montagem do fotodiodo com sistema de montagem mecânica. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: esquema do sistema de aquisição de dados. PD = fotodiodo, LIA = amplificador de bloqueio, DS = sistema de detecção, MC = controle de microscópio, DAQ = sistema de aquisição de dados, PC = computador pessoal. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: função Autocorrelator de opo (a) e ti: SA (b). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: função de correlação cruzada de opo e ti: SA. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 7: imagem CCD de grânulos de poliestireno.

Figure 7
Figura 8: amplitude e fase do sinal SRS medido pelo amplificador de bloqueio: fora de ressonância (à esquerda) e em ressonância (à direita) . Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 9
Figura 9: imagens de transmissão de grânulos de poliestireno obtidos por opo (a) e ti: SA (b). Barra de escala = 16 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 10
Figura 10: imagem SRS de grânulos de poliestireno. Barra de escala = 12 μm.

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Discussion

A microscopia de SRS tomou a imagem latente Label-Free às alturas novas, especial nos estudos de estruturas biológicas complexas tais como lipídios, que são fundamentais às pilhas e à arquitetura celular. Os lipídios estão envolvidos em múltiplas vias fisiológicas, como a produção de membranas biológicas, e servem como precursores biossintéticos e Transdutores de sinal10. Os lipídios são embalados em organelas intracelulares especializadas, também denominadas gotículas lipídicas (LDs). Seus diâmetros variam de dezenas de nanômetros a dezenas de micrômetros11,12. LDs não só participam abundantemente em células de produção de esteroides e adipose, mas também estão presentes em outras linhas celulares. Os LDs cooperam em vários processos fisiológicos, como o armazenamento lipídico. Eles são caracterizados proeminentemente em patologias comuns (por exemplo, metabolismo do colesterol alterado)13,14.

Tradicionalmente, a visualização de lipídios é conseguida utilizando-se microscopia de fluorescência e células fixas lipídicas específicas de corante neutro10. Deve-se notar que, como lipídios são menores de tamanho em comparação com proteínas e DNA, mudanças estruturais e funcionais e artefatos indesejados podem ocorrer ao adicionar fluoróforos15,16. O SRS demonstrou ser poderoso para estudar estruturas ricas em lipídios. Os lipídios são abundantes em grupos C-H2 . Conseqüentemente, os picos relativamente isolados associados com os Estados vibracional da ligação de C-H em 2845 cm-1 em seus espectros de Raman fornecem uma assinatura original para lipídios dentro de uma pilha. Infelizmente, uma vez que as assinaturas vibracionais diferenciáveis são finitas, é bastante difícil distinguir uma biomolécula alvo de outras espécies relacionadas dentro de células que compartilham ligações químicas semelhantes. No entanto, é possível adicionar pequenas sondas vibracionais Raman-ativas (por exemplo, alquínes e isótopos estáveis) para obter a especificidade para a imagem de pequenos biomoléculas17.

Para aplicações biológicas e biomédicas in vivo, o mapeamento simultâneo de várias espécies químicas em uma determinada amostra é necessário para investir a codistribuição e correlações dinâmicas entre pares de biomoléculas18,19. Portanto, muitos esforços foram feitos para obter múltiplos contrastes químicos. Na opção a mais simples da imagem latente multicolor, para dar forma a diferentes modos de Raman de uma amostra, a freqüência do feixe da bomba ou do feixe de Stokes é ajustada em varreduras seqüenciais18. No entanto, usar a abordagem de ajuste de comprimento de onda pode causar perda de informações de colocalização de diferentes modos Raman, especialmente quando a amostra está em um ambiente dinâmico18.

Como consequência da excitação não linear, o SRS oferece capacidades de resolução 3D intrínsecas da ligação química selecionada dentro de amostras biológicas20. A reconstrução do volume da ligação química selecionada e suas distribuições espaciais podem simplesmente ser conseguidas coletando imagens de SRS no plano focal diferente ao longo do z-axis. Uma vez que as imagens são adquiridas com altas resoluções espaciais e temporais, podem ser obtidas outras peças de informação-chave (i.e., estrutura 3D, composição química, etc.) sobre a amostra biológica.

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Disclosures

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Acknowledgments

Agradecemos a V. Tufano do IMM CNR por sua valiosa assistência técnica e Giacomo Cozzi, especialista de produtos da Nikon Instruments, para discussões úteis e suporte contínuo. Este trabalho foi parcialmente apoiado pelos programas operativos nacionais italianos PONa3 00025 (BIOforIU) e pelo euro-BioImaging projeto de infra-estrutura de investigação panEuropean em grande escala.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acquisation tool Nikon Nikon C2Tool Acquisation supported tool
APE Pulse link control software APE- APE Pulse link control software software control
Autocorrelator APE APE PulseCheck USB 50 Autocorrelator
Detector Thorlabs Thorlabs DET10A Photodiode
Detector card Thorlabs Thorlabs VRC IR detector Card
Dichroic mirror Semrock Semrock FF875-Di01-25X36 Dichroic mirror
Dichroic mirror Semrock FF875-Di01-25x36 Dichroic mirror
EOM Conoptics (EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P). Pockels cell
Fast detector Thorlabs Thorlabs DET025AL/M Photodiode
Fast mirror scanning unit Nikon C2 Microscpe scanning head
Femtosecond laser Ti:SA Coherent Coherent Chameleon Ultra II Chameleon Ultra II
Function generator TTi TG5011 AIM – TTi Function generator
Inverted optical microscope Nikon Eclipse TE-2000-E, Nikon Eclipse TE-2000-E, Nikon
Lock-in Amplifier Standford Research System SR844-200 MHz dual phase A lock-in amplifier from Stanford Research Systems
Notch filter, Semrock NF03-808E-25 Notch filter
Optical delay line Newport Newport M-ILS200CC Tunable optical delay line
Optical Parametric Oscillator Coherent Coherent Compact OPO Coherent Compact OPO
Oscilloscope WaveRunner 640Zi 4GHz OSC/LeCroy Digital Oscilloscope
PCI Card National instrument NI PCIe 6363 Data acquisation card
Position Sensors Detectors Newport Newport Conex PSD9 Position detector sensor
Power meter head Coherent PowerMax PM10, Laser power detector
Translation Stages Thorlabs Thorlabs PT1/M Meachnical Translation Stage with Standard Micrometer

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References

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