Brug af et trådløst video-EEG-system til overvågning af Epileptiform udledninger efter lateral Fluid-percussion induceret traumatisk hjerneskade

Behavior
 

Summary

Her præsenterer vi en protokol til at fremkalde svær TBI med lateral Fluid percussion skade (FPI) model i voksne, mandlige Wistar rotter. Vi demonstrerer også brugen af et trådløst telemetri system til at indsamle kontinuerlige video-EEG-optagelser og Monitor for epileptiforme udledninger i overensstemmelse med post-traumatisk epileptogenesis.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

McGuire, M. J., Gertz, S. M., McCutcheon, J. D., Richardson, C. R., Poulsen, D. J. Use of a Wireless Video-EEG System to Monitor Epileptiform Discharges Following Lateral Fluid-Percussion Induced Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (148), e59637, doi:10.3791/59637 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Den laterale Fluid percussion skade (FPI) model er veletableret og er blevet brugt til at studere TBI og post-traumatisk epilepsi (PTE). Der er imidlertid rapporteret om en betydelig variation i de specifikke parametre, der anvendes i forskellige undersøgelser, som har anvendt denne model, hvilket gør det vanskeligt at harmonisere og fortolke resultaterne mellem laboratorierne. For eksempel er variabilitet blevet rapporteret med hensyn til størrelse og placering af kraniektomi, hvordan luer Lock hub er placeret i forhold til kraniektomi, det atmosfæriske tryk anvendes på Dura og varigheden af tryk pulsen. Hver af disse parametre kan påvirke skade sværhedsgraden, som direkte korrelerer med forekomsten af PTE. Dette er blevet manifesteret som en bred vifte af dødelighed, oprettende refleks gange og hyppigheden af krampeanfald rapporteret. Her giver vi en detaljeret protokol for den metode, vi har brugt til at hjælpe med at lette harmoniseringen mellem undersøgelser. Vi brugte FPI i kombination med et trådløst EEG-telemetri system til kontinuerligt at overvåge for elektro grafiske ændringer og detektere beslaglæggelse aktivitet.  FPI induceres ved at skabe en 5 mm craniektomi over den venstre halvkugle mellem Bregma og lambda og ved siden af den laterale højderyg. En luer lås hub er sikret på kraniet over craniektomi. Denne hub er forbundet til FPI-enheden, og en 20-millisekunders tryk puls leveres direkte til den intakte Dura gennem tryk slange, der er forbundet til hubben via et twist lock stik. Efter helbredelse, rotter er re-bedøvet at fjerne hubben. Fem 0,5 mm, rustfrit stål EEG elektrode skruer er placeret i kontakt med Dura gennem kraniet og fungere som fire optagelse elektroder og en referenceelektrode. Elektrode ledningerne opsamles i en sokkel stik, som er sikret på plads med knoglecement. Kontinuerlige video/EEG-optagelser indsamles i op til 4 uger efter TBI.

Introduction

I en 2015 rapport til Kongressen, centre for Disease Control rapporterede, at ca 2.500.000 mennesker om året lider traumatisk hjerneskade (TBI) i USA1. Det anslås, at TBI forårsager 20% af symptomatiske epilepsier og 5% af alle epilepsier2,3,4. Desuden udvikler ca. 20% af TBI-patienterne posttraumatisk epilepsi5. Vigtigt, kronisk, tilbagevendende anfald, der opstår som følge af TBI er ofte farmakoresistant, øge byrden af sygdommen6. De nøjagtige mekanismer, der fører til posttraumatisk epilepsi (PTE), er fortsat uklare. Flere af de vigtigste epidemiologiske studier har imidlertid undersøgt incidensen og den potentielle risiko for at udvikle posttraumatisk epilepsi (Pte)2,4,7,8,9 ,10,11. Disse epidemiologiske undersøgelser har hver især forstærket korrelationen mellem skadens sværhedsgrad og risikoen for epileptogenese.

De nuværende metoder, der i udstrakt grad er blevet anvendt til at identificere nye antiepileptika, har været stærkt afhængige af modeller, der anvender kemo krampe eller elektrisk optændings midler til at fremkalde epilepsi12. I betragtning af den høje forekomst af farmako-resistens over for lægemidler, der er udviklet i disse modeller af TBI-patienter, antager vi, at TBI-induceret krampeanfald kan være forskellige fra kemo kramper eller optændings induceret krampeanfald og kan involvere forskellige veje eller processer af epileptogenese. Derfor kan en TBI model være bedre egnet til udvikling af behandlinger, der er mere effektive til at forhindre post-traumatisk epileptogenesis.

Den flydende percussion skade (FPI) model af TBI har været anvendt i årtier og er en veletableret metode til at undersøge både TBI og Pte13,14,15,16,17, 18. som vi for nylig gennemgik, er der imidlertid en høj grad af variation i de FPI-metoder, der rapporteres på tværs af laboratorier19,20. Denne manglende sammenhæng mellem laboratorierne forhindrer reproducerbarhed af prækliniske fund og gør fortolkningen af resultaterne til en udfordring. Som følge heraf er der blevet anvendt øget interesse og indsats for at opnå en større harmonisering af disse typer undersøgelser21,22,23,24.

I et forsøg på yderligere at øge sammenhængen og harmoniseringen mellem laboratorier, der fokuserer på at studere posttraumatisk epileptogenesis, giver vi her en detaljeret metodologi for vores tilgang. Vi har tidligere rapporteret en 60% forekomst af krampeanfald inden for seks uger efter svær TBI20. Vi bruger nu denne tilgang til at overvåge rotter begynder dagen for skade og løbende følge dem 24 timer i døgnet i op til 4 uger. Vi har valgt at bruge et trådløst telemetri system, som giver flere fordele. For det første, rotter er i stand til frit at bevæge sig omkring deres bur, og dermed reducerer stress. For det andet en reduktion i signal støj som rotten tjener som jorden. Derudover anvender vores nuværende system et accelerometer, som registrerer hurtige bevægelser i alle tre planer (X, Y og Z) og kan være nyttige til at identificere krampeanfald. Endelig, den trådløse telemetri system giver mulighed for lettere forvaltning af rotter såsom supplerende saltvands injektioner, vejning og gennemføre neurologiske sværhedsgrad scores, hvilket er kompliceret, når rotter er knyttet til en tether. Denne fremgangsmåde har imidlertid også flere begrænsninger. Første, de oprindelige omkostninger ved et system til at registrere fra op til otte rotter samtidig kan være i intervallet $60.000. For det andet, strøm er begrænset af en batteri kilde. Dette kræver daglig overvågning og udskiftning af batterier. Den tid, der skal bruges mellem batteriskift, kan påvirkes af samplingfrekvensen. For en prøvetagnings hastighed på 1000 Hz skiftes batterierne dog typisk en gang om ugen. Den begrænsede strømforsyning begrænser også systemet til kun at optage fra fire EEG-signaler. Endelig er signal Drop out begrænset, men forekommer lejlighedsvis. Men denne tilgang giver en konsekvent og pålidelig metode til at overvåge post-traumatisk epileptogenesis og kan støtte i identifikationen af nye terapeutiske behandlinger.

Protocol

Alle procedurer blev godkendt af og fulgt retningslinjer fra universitetet i Buffalo institutionel Animal Care og use udvalg.

1. væske slagtøjs skade

  1. Bær en lab coat eller kirurgisk kjole, kirurgisk maske, kirurgiske handsker, og hovedbeklædning og Steriliser alle værktøjer og materialer, der kontakter det kirurgiske sted.
  2. Anæstetize en 10-12-ugers, mandlig, Wistar rotte (350-400 g) med 3% isofluran og 1 L/min ilt i et induktions kammer af passende størrelse til rotter. Fjern rotten fra induktions kammeret og Flyt den til forberedelses området, når den er bevidstløs. Sæt den sterile oftalmiske salve i begge øjne.
  3. Barber håret på rottets hoved med elektriske klippemaskiner med en #40 klinge fra lige over øjnene til hale bunden af ørerne til at producere nok kirurgisk felt. Fjern eventuelle løse, klippede hår fra stedet.
  4. Rengør det kirurgiske sted ved at anvende 2% chlorohexidin scrub til den barberede hovedbund efterfulgt af 70% ethanol. Start i centrum og gå udad i koncentriske cirkler væk fra indsnit site. Gentag denne proces 3 gange. Anvend betadine-opløsningen på stedet på samme måde, og få lov til at tørre.
  5. Placer den bedøvede rotte i den stereotaxoniske ramme og opretholde anæstesi på 2-3% isoflurane-1 L/min ilt via nosecone. Kontroller for tab af tilbagetrækning refleks af bagekstremitet og tab af øjen refleks for at sikre, at rotten er i et kirurgisk plan af anæstesi.
  6. Overvåg respirationshastigheden, hjertefrekvensen, kropstemperaturen og iltmætning gennem hele operationen. Vedligehold pulsen mellem 300-400 BPM og SpO2 over 90%.
    Bemærk: et pulsoximeter fastgjort til en bageste fod kan bruges til at give den konstante aflæsning af puls og SpO2. En puls over 400 BPM indikerer, at rotten ikke er tilstrækkeligt bedøvet. En selvregulerende opvarmning pad, koblet til en rektal termometer, indstillet til 37 °C, kan placeres under rotten under hele operationen for at opretholde kropstemperaturen. En stereo mikroskopi med en lyskilde i kombination med en optisk fiber lampe er nyttige til at visualisere proceduren.
  7. Brug en 23 g nål til at injicere 0,5% bupivacain hydrochlorid intradermalt i hovedbunden på indsnit stedet for lokal analgetika 10-15 minutter før du foretager et snit.
  8. Lav et 1,5-2,5 cm midtersnit gennem huden og musklen i hovedbunden ved hjælp af en #10 skalpel klinge. Træk huden og musklen tilbage for at afsløre kraniet og give et klart kirurgisk felt. Afspejler den underliggende fascia og fedtvæv væk fra knoglen med sterile vatpinde.
    Bemærk: en elektrisk kauteri enhed er nyttig til at opnå hurtig hæmostase.
  9. Barbere den laterale højderyg af venstre parietale knogle ved hjælp af en kirurgisk curette til at producere en glat flad overflade, således at bunden af kvinde-kvinde luer lås hub kan hvile flush med kraniet.
  10. Skyl kraniets overflade og omgivende væv med 2,0 mg/mL gentamicin opløsning i sterilt saltvand. Blot overskydende opløsning med en steril svaber.
  11. Påfør 3% hydrogenperoxid til kraniet for at tørre knoglen.
    Bemærk: Hvis knoglen ikke er tilstrækkeligt tørt, vil tand cementen ikke holde sig korrekt og danne en solid forsegling.
  12. Opret en 5 mm diameter craniektomi sted gennem den venstre parietale knogle.
    Bemærk: en trefin-bit placeret i en effekt øvelse, der er fastgjort til den stereo forebyggende ramme, kan være nyttig til at initiere craniektomi. Brug en hånd øvelse med en trefin med en diameter på 5 mm til langsomt at afslutte kraniektomi gennem den resterende knogle. Når du er tæt på at fuldføre kraniektomi, skal du rotere trephin i omvendt række for at forhindre brud på det underliggende dura mater. Der vil være en udtynding af kraniet omkring omkredsen af disken og kraniet flap vil føle sig løs, når presset let.
  13. Fjern knogle klappen med den kirurgiske curette og glatte væv pincet.
    Bemærk: nogle blødninger kan forekomme, men hæmostase kan hurtigt opnås ved at anvende forsigtigt tryk med sterile vatpinde.
  14. Brug en stereo mikroskopi og belysning til visuelt at inspicere Dura for tegn på ruptur.  En tynd rand af knoglen vil forblive omkring omkredsen af kraniektomi stedet.  Forsigtigt fjerne denne fælg med glatte væv pincet at passe på ikke at sprænge Dura.
  15. Svaber kraniet med 70% ethanol for at fjerne knogle støv og tørre kraniet.
  16. Påfør et tyndt lag cyanoacrylat gel lim omkring den nederste kant af luer lås hub og fastgør den til kraniet over craniektomi uden at hæmme åbningen. Vær forsigtig med ikke at bringe limen i kontakt med Dura. Yderligere, forsegle luer låsen på plads med et ekstra tyndt lag lim omkring den udvendige base af hubben.
  17. Forbered en gylle af tand cement. Påfør cementen på overfladen af kraniet omkring og over bunden af luer lås hub for at sikre det på plads.
  18. Fyld luer-låse hubben med en steril, gratis, kunstig cereberal spinalvæske (CSF) opløsning (pH 7,4) ved hjælp af en sprøjte og nål, således at en konveks bolt af saltvand kan ses over toppen af fælgen.
    Bemærk: opløsningen vil holde Dura fugtig som tand cementen tørrer samt tjener som en indikation af integriteten af forseglingen. Hvis opløsningens niveau overhovedet falder, er det en indikation på en lækage i systemet, og luer-låsen skal fjernes og udskiftes.
  19. Når tand cementen er fuldstændig helbredt, ophøre med gasanæstesi og fjerne rotten fra den stereotaxiske ramme.
  20. Anbring rotten på en platform ved siden af FPI-enheden.
  21. FPI-enheden har en buet metalspids, der strækker sig fra tryk transduceren i enden af væskebeholderen. Fastgør en 12 cm lang tryk slange til enden af den buede spids med den modsatte ende, der slutter i en 2 cm mandlig luer lås twist stik. Fastgør rotten til FPI-enheden ved at forbinde den kvindelige ende af hubben på rottets kraniet med det mandlige stik.
    Bemærk: Sørg for, at tilslutningen er tæt sikret, og at alle luftbobler er blevet fjernet fra systemet.
  22. Placer dyret i brystbenet tilbøjelighed og gentagne gange kontrollere for tilbagevenden af tilbagetrækning refleks. Så snart rotten genvinder tilbagetrækning refleks, men er stadig sedated, frigive pendul af FPI enhed til at forårsage en enkelt 20 MS tryk puls og fremkalde skade.
    Bemærk: det er vigtigt ikke at fremkalde skaden, mens dyret er dybt bedøvet, da dette har tendens til at forårsage øget dødelighed på grund af Neuro GENIC-induceret lungeødem. Alle enheder viser variabilitet. Men på den enhed, der anvendes til dette eksperiment, en 17 ° vinkel placering af hammeren giver en 2,2-2,3 atmosfærisk tryk puls. Uskadede, Skin dyr gennemgår alle de samme procedurer med undtagelse af den faktiske væske puls til fremkalde skade.
  23. Afbryd straks rotten fra FPI-enheden efter skade, Anbring den i brystbenet recumbency, og giv supplerende ilt (1 L/min) via en næse kegle, indtil spontan vejrtrækning vender tilbage. Apnea er en forventet konsekvens af skaden. Hvis det er nødvendigt, give periodiske manuelle vejrtrækninger via en pose ventil maske, indtil rotten begynder at spontant trække vejret på sin egen.
    Bemærk: apnø varer typisk mindre end 2 min. En forbigående hurtig stigning i hjertefrekvensen (> 500 bpm) observeres umiddelbart efter administration af tryk pulsen på grund af en catecholamin briste. Dette kan overvåges med et pulsoximeter fastgjort til rotte foden og kan tjene som en mulig indikator for, at der er sket en alvorlig skade.
  24. Overvåg rotten kontinuerligt og Registrer tidspunktet for tilbagevenden af den oprettende refleks (stabil mobilitet på alle fire lemmer).
  25. Størrelsen af den atmosfæriske tryk puls for hver rotte skal være inden for ± 0,05 atmosfærens atmosfære. Bekræft, at hver af tryk pulsen giver et jævnt signal på oscilloskopet med ensartet amplitude og varighed.
    Bemærk: et støjende signal kan indikere luftbobler i systemet, som skal fjernes inden levering af skades pulsen. Atmosfærisk tryk pulser, der producerer en alvorlig skade, i dette eksperiment, er dem, der typisk resulterer i dyrs oprettende tider på 30-60 min. Denne række af oprettende tider er forbundet med en dødelighed på ca. 40-50%).
  26. Giv 10 mL forvarmet saltvand subkutant som en støttende behandling.
  27. Returner rotten til sit hjem bur og lad den komme sig i mindst 4 timer.
    Bemærk: øget dødelighed er blevet observeret, når rotterne er placeret umiddelbart tilbage under anæstesi.

2. implantation af kortikale EEG-elektroder og video-EEG-optagelse

  1. Ved 4 h efter tilskadekomst anæstetiserer du rotten som tidligere beskrevet og placerer den tilbage i den stereo forebyggende ramme for at fjerne luer-låse navet og tand cementen.
    Bemærk: hub'en og cementen vil nemt kunne afsnappe med moderat tryk. Når du fjerner hubben, skal du omhyggeligt kontrollere, om der er brud eller beskadigelse af Dura. Umiddelbart aflive ethvert dyr med beskadigelse af Dura.
  2. Anvend et lille fald på 0,5% bupivacain hydrochlorid på kraniet på hvert af de steder, hvor der skal bores 5 pilot huller (Se figur 1).
  3. Bore pilot huller gennem kraniet med en håndholdt 0,1 mm borekrone.
  4. Fastgør en elektrode af rustfrit stål i hvert pilot hul på følgende steder: en reference skrue er placeret hale til lambda over cerebellum. Optagelse elektroder er placeret: 1) over halvkugle ipsilaterale og rostral til craniektomi; 2) over halvkugle ipsilaterale og caudal til craniektomi; 3) over halvkugle kontralateral og rostral til craniektomi; 4) over halvkugle kontralateral og caudal til kraniektomi.
  5. Svaber kraniet med 70% ethanol for at fjerne knogle støv.
  6. Dæk craniektomi-stedet med et tyndt lag sterilt knogle voks til at dække den eksponerede Dura.
  7. Tilslut en elektrode matrix til de 5 EEG-elektroder ved at indpakke den eksponerede ende af en farvekodet elektrode tråd tæt omkring dens udpegede rustfri-stål elektrode skrue.
    Bemærk: de modsatte ender af hver elektrode ledning er placeret i en specifik, udpeget placering i sokkel stikket.
  8. Forbered en gylle af knoglecement.
  9. Saml elektrode ledningerne i en spole under piedestalen og fastgør ledningerne og piedestalen på plads med knoglecement. Hold piedestal i position, indtil knoglecementen er helbredt.
    Bemærk: knoglen skal være særlig tør og ugyldig af eventuel rest blod for at opnå korrekt vedhæftning og forhindre for tidlig fjernelse af senderen.
  10. Fastgør den trådløse sender med nye batterier til piedestal, før du fjerner dyret fra den stereo forebyggende ramme.
  11. Anbring dyret i dets hjem bur og Anbring buret i nærheden af modtageren og i lyset af et bestemt videokamera. Start video/EEG-optagelse.

3. samling af video-EEG optagelser

  1. Før du indsamler EEG-signaler, skal du foretage en frekvens Sweep i det rum, hvor rotter skal anbringes i EEG-samlingen for at identificere eventuelle interfererende frekvenser for at forhindre indsamlingen af EEG-optagelse med enhver hyppighed, der har baggrundsstøj.
  2. Indstil alle sendere til specifikke frekvenser, der er fri for interferens.
  3. Indstil prøvetagnings frekvensen og inputområdet for hver programmerbar sender.
    Bemærk: Dette kan gøres ved hjælp af et smart værktøj, der leveres af systemproducenten. Sendere kan prøve med en maksimal hastighed på 1000 Hz og et maksimalt indgangsområde på ± 10 mV. I dette eksperiment blev EEG-optagelser mellem 0,5 Hz og 30 Hz analyseret. Derfor blev prøvehastigheden sat til 250 Hz. Vi observerer typisk amplituder på mindre end 1 mV. Derfor var det fastsatte indgangsområde på ± 2 mV.
  4. Brug EEG-indsamlings software fra producenten til løbende at optage video-EEG, der starter på den dag, skaden forbinder hver trådløs sender via en unik frekvens til en bestemt modtager.
    Bemærk: hver sender receiver parret er i stand til at overvåge 4 monopolar EEG kanaler, og acceleration i X, Y og Z fly. EEG-data kan skrives til en Storage Server. Video dataene skal gemmes på en NAS-enhed, der er knyttet til lagrings serveren. EEG-analysesoftwaren synkroniserer video-og EEG-optagelsen baseret på den tid, der vedligeholdes af lagrings serveren.
  5. Brug videosamling software til at optage video af hver rotte med sin egen 2 MP opløsning kamera (1920 x 1080) konfigureret til at optage ved 30 frames/s.
    Bemærk: hvert kamera har sin egen infrarøde belysning til videosamling om natten.
  6. Konfigurer systemet til automatisk at gemme alle video-og EEG-optagelser på en Storage Server hver 24. Videoerne producerer temmelig store filer.

4. video/EEG-analyse

  1. Synkroniser videoen med hver EEG-optagelse ved 1/10 s opløsning. Gør dette ved at bruge system producenterne video/EEG analyse software, der skaber en metafil med stempel af den nøjagtige tid af både EEG og video.
  2. Screene manuelt via EEG-optagelser for at identificere indeks hændelser, der definerer beslaglæggelses aktivitet.
  3. Ved hjælp af video/EEG analyse software og indeks EEG begivenheder, oprette en konfigurationsfil, der bruger centrale parametre (dvs., magt i specifikke frekvensbånd, forholdet mellemfrekvens bånd til den samlede effekt, acceleration tærskel, osv.) til at definere de egenskaber af de potentielle anfald.
  4. Kør EEG-analysesoftwaren for at identificere potentielle regioner af EEG-optagelse, der kvalificerer sig ud fra de parametre, der er valgt i konfigurationsfilen.
    Bemærk: EEG-analysesoftwaren giver mulighed for automatisk registrering af beslaglæggelser og fremhæver interesseområder i EEG-signalerne og giver FFT-effekt spektrum-analyse på tværs af signalet.
  5. Bekræft potentielle krampeanfald ved at bruge videooptagelser indsamlet under købet, som er synkroniseret med hver rotte respektive EEG optagelser.

Representative Results

Med denne model, inducerede vi svær TBI til voksne, mandlige, Wistar rotter. Under de betingelser, vi beskriver her, vi typisk observere dødelighed på 40-50%, og oprettende refleks gange på 30-60 min som tidligere beskrevet20. Vi var i stand til at indsamle video/EEG optagelser 24 h/dag begynder på dagen for skaden. Et diagram, der viser placeringen af fire monopolær EEG-elektroder og en enkelt referenceelektrode, er vist i figur 1a. Billeder, der viser placeringen og udseendet af de forventede TBI-læsioner med de betingelser, der er beskrevet her, er vist i figur 1B-D. Under de betingelser, der er beskrevet her, vi konsekvent observere Delta opbremsning inden for de første tre dage efter TBI. Mindre alvorligt tilskadekomne rotter udviser ensidig, intermitterende Delta opbremsning (tal 2c-D). I modsætning hertil observeres kontinuerlig, bilateral Delta opbremsning efter mere alvorlige kvæstelser (figur 3C-D). En vis grad af Delta opbremsning blev konsekvent observeret hos alle TBI rotter, men blev ikke påvist i nogen form for falsk opereret (kun craniektomi) kontrol rotter (figur 2a-b; 3a-b). Omfattende Delta opbremsning blev konsekvent observeret i de første tre dage efter skaden i de fleste TBI rotter. Interessant, rotter typisk vise udtalt vægttab i de første tre dage efter skade. Ikke-krampeanfald observeres lejlighedsvis inden for den første uge efter TBI (figur 4 C-D). Kliniske anfald, der præsenterer som Spike klynger forbundet med opdræt og faldende samt under armen klonus kan observeres efter 1-uge efter TBI (figur 5C-D). Endelig præsenterer figur 6 repræsentative billeder af lejlighedsvis forbigående signal frafald og tab af signal på grund af batterisvigt.

Figure 1
Figur 1 . Placering af craniektomi, elektrodeplacering og læsion. (A) viser et skematisk diagram af rotte kraniet med placeringen af kraniektomi (grå cirkel i den venstre halvkugle), fire monopolære elektroder (sorte prikker; 1, 2, 3, 4) placeret mellem Bregma og lambda og en referenceelektrode (sort prik, R) placeret midterlinjen, posterior til lambda; B) viser koronale post mortem-MRI-scanninger med placeringen af læsionen identificeret ved en rød cirkel (C) viser en 2-D kort over cortex, hvor placeringen og størrelsen af læsionen er identificeret (blå region). (D) viser en Nissl farvet koronal sektion med læsion boksede, læsion er 100x forstørret i billedet til højre. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 . Ensidig, intermitterende Delta opbremsning indsamlet på dagen for en moderat TBI. (A) viser en 90 s EEG-spor fra en falsk betjent, uskadet kontrol rotte på operationsdagen. Alle fire kanaler er præsenteret. En 10 s lang spor (taget fra den boxed region) blev udvundet fra 3rd kanal for bedre at visualisere baseline EEG mønster. En 2048 MS EPOC sektion af dette blev derefter udvalgt til at blive analyseret i den tilsvarende FFT. (B) FFT analyse af 2048 MS udvalgte EPOC fra det uskadede fingerede dyr på operationsdagen. C) viser en 90 s EEG-spor, som viser det forbigående, unilaterale Delta-aftagende mønster for et moderat såret dyr på skades dagen. En 10 s lang spor (taget fra den boxed region) blev udvundet fra 3rd kanal for bedre at visualisere Delta bremse EEG mønster. En 2048 MS EPOC sektion af dette blev derefter udvalgt til at blive analyseret i den tilsvarende FFT. (D) FFT-analyse af 2048 MS udvalgte EPOC fra det moderate TBI-dyr på skades dagen. 90 s EEG-spor, fra top til bund er biopotentialer 1, 2, 3, 4, svarende til deres placering omkring kraniektomi stedet som vist i figur 1. Grå lodrette mærker definerer 1 s intervaller på EEG spor. Alle EEG-spor er vist på en skala fra (± 500 μV).  Inden for FFT-analyse grafer var det samlede analyserede frekvensområde 0,5-30 Hz. Dette blev yderligere opdelt i 4 separate frekvensbånd af Delta (gul, 0,5-4 Hz), theta (lilla, 4-8 Hz), alpha (rød, 8-12 Hz) og beta (grøn, 12-30 Hz).  % (Power) graf vist i FFT analyse fortæller, hvilken procentdel af den samlede effekt i den analyserede EPOC kommer fra hvert tidligere specificerede frekvensbånd, hvilket giver mulighed for yderligere matematisk karakterisering af EEG bølgeform mønstre. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 . Bilateral, kontinuerlig Delta opbremsning indsamlet på dagen for en svær TBI. (A) viser en 90 s EEG-spor fra en falsk betjent, uskadet kontrol rotte på operationsdagen. Alle fire kanaler er præsenteret.  En 10 s lang spor (taget fra den boxed region) blev udvundet fra 3rd kanal for bedre at visualisere baseline EEG mønster. En 2048 MS EPOC sektion af dette blev derefter udvalgt til at blive analyseret i den tilsvarende FFT. (B) FFT analyse af 2048 MS udvalgte EPOC fra det uskadede fingerede dyr på operationsdagen. C) viser en 90 s EEG-spor, som viser det vedvarende, bilaterale Delta-aftagende mønster for et alvorligt såret dyr på skades dagen.  En 10 s lang spor (taget fra den boxed region) blev udvundet fra 3rd kanal for bedre at visualisere Delta bremse EEG mønster. En 2048 MS EPOC sektion af dette blev derefter udvalgt til at blive analyseret i den tilsvarende FFT. (D) FFT-analyse af 2048 MS valgte EPOC fra det svære TBI-dyr på skades dagen. 90 s EEG-spor, fra top til bund er biopotentialer 1, 2, 3, 4, svarende til deres placering omkring kraniektomi stedet som vist i figur 1. Grå lodrette mærker definerer 1 s intervaller på EEG spor. Alle EEG-spor er vist på en skala fra (± 500 μV).  Inden for FFT-analyse grafer var det samlede analyserede frekvensområde 0,5-30 Hz.  Dette blev yderligere opdelt i 4 separate frekvensbånd af Delta (gul, 0,5-4 Hz), theta (lilla, 4-8 Hz), alpha (rød, 8-12 Hz) og beta (grøn, 12-30 Hz). % (Power) graf vist i FFT analyse fortæller, hvilken procentdel af den samlede effekt i den analyserede EPOC kommer fra hvert tidligere specificerede frekvensbånd, hvilket giver mulighed for yderligere matematisk karakterisering af EEG bølgeform mønstre. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 . Ikke-konvulsiv elektro grafisk krampeanfald 3 dage efter svær TBI. (A) viser en 90 s EEG-spor fra en falsk betjent, uskadt kontrol rotte 3 dage25 efter operationen. Alle fire kanaler er præsenteret. En 10 s lang spor (taget fra den boxed region) blev udvundet fra 3rd kanal for bedre at visualisere baseline EEG mønster. En 2048 MS EPOC sektion af dette blev derefter udvalgt til at blive analyseret i den tilsvarende FFT. (B) FFT analyse af 2048 MS udvalgte EPOC fra det uskadede fingerede dyr på dagen tre25 efter operationen. (C) viser en 90 s EEG-spor tre 25 dage efter alvorlig skade.  Dette show bygning, hurtigt spiking mønster til stede bilateralt og på tværs af alle 4 indsamling kanaler.  En 10 s lang spor (taget fra den boxed region) blev udvundet fra 3rd kanal for bedre at visualisere spiking EEG mønster. En 2048 MS EPOC sektion af dette blev derefter udvalgt til at blive analyseret i den tilsvarende FFT. (D) FFT-analyse af 2048 MS valgte EPOC fra det svære TBI-dyr på skades dagen.  90 s EEG-spor, fra top til bund er biopotentialer 1, 2, 3, 4, svarende til deres placering omkring kraniektomi stedet som vist i figur 1. Grå lodrette mærker definerer 1 s intervaller på EEG spor. Alle EEG-spor er vist på en skala fra (± 500 μV).  Inden for FFT-analyse grafer var det samlede analyserede frekvensområde 0,5-30 Hz.  Dette blev yderligere opdelt i 4 separate frekvensbånd af Delta (gul, 0,5-4 Hz), theta (lilla, 4-8 Hz), alpha (rød, 8-12 Hz) og beta (grøn, 12-30 Hz).  % (Power) graf vist i FFT analyse fortæller, hvilken procentdel af den samlede effekt i den analyserede EPOC kommer fra hvert tidligere specificerede frekvensbånd, hvilket giver mulighed for yderligere matematisk karakterisering af EEG bølgeform mønstre. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 . Konvulsiv elektro grafisk beslaglæggelse indsamlet 9 dage efter TBI. (A) viser en 90 s EEG-spor fra en falsk betjent, uskadet kontrol rotte ni (9) dage efter operationen. Alle fire kanaler er præsenteret. En 10 s lang spor (taget fra den boxed region) blev udvundet fra 3rd kanal for bedre at visualisere baseline EEG mønster. En 2048 MS EPOC sektion af dette blev derefter udvalgt til at blive analyseret i den tilsvarende FFT. (B) FFT analyse af 2048 MS udvalgte EPOC fra det uskadede fingerede dyr på dag ni (9) efter operationen. C) viser en 90 s EEG-spor ni (9) dage efter alvorlig skade. Dette show bygning, hurtigt spiking mønster til stede bilateralt og på tværs af alle 4 indsamling kanaler. En 10 s lang spor (taget fra den boxed region) blev udvundet fra 3rd kanal for bedre at visualisere spiking EEG mønster.  En 2048 MS EPOC sektion af dette blev derefter udvalgt til at blive analyseret i den tilsvarende FFT. (D) FFT analyse af 2048 MS udvalgte EPOC fra svær TBI dyr ni (9) dage efter skade. 90 s EEG-spor, fra top til bund er biopotentialer 1, 2, 3, 4, svarende til deres placering omkring kraniektomi stedet som vist i figur 1. Grå lodrette mærker definerer 1 s intervaller på EEG spor. Alle EEG-spor er vist på en skala fra (± 500 μV). Inden for FFT-analyse grafer var det samlede analyserede frekvensområde 0,5-30 Hz. Dette blev yderligere opdelt i 4 separate frekvensbånd af Delta (gul, 0,5-4 Hz), theta (lilla, 4-8 Hz), alpha (rød, 8-12 Hz) og beta (grøn, 12-30 Hz).  % (Power) graf vist i FFT analyse fortæller, hvilken procentdel af den samlede effekt i den analyserede EPOC kommer fra hvert tidligere specificerede frekvensbånd, hvilket giver mulighed for yderligere matematisk karakterisering af EEG bølgeform mønstre. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 . Signal Drop out. Disse er 3 separate eksempler på, hvad signal drop ud på grund af senderen eller modtager problemer vises som på EEG optagelse. (A) Dette er et eksempel på periodisk frafald af EEG-signalet på en optagelse.  (B) Dette er et eksempel på frafald på grund af batterifejl under kontinuerlig trådløs telemetri vises som på en EEG-sporing.  (C) i området omkring cirkled kan det ses, at når signal kvaliteten (QoS) falder fra 100 til 0, bliver EEG-opsporingen udjævnet og stagnerende ved 0 μV.  Grå lodrette mærker definerer 1 s intervaller på EEG spor. Alle EEG-spor er vist på en skala fra (± 500 μV). Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Der er rapporteret om betydelig variation mellem laboratorierne med hensyn til de specifikke parametre og metoder, der anvendes til FPI TBI model 14,26,27,28. Disse uoverensstemmelser har resulteret i modstridende resultater og gør det vanskeligt at harmonisere indsatsen og resultaterne mellem laboratorierne. Her har vi præsenteret en detaljeret metodologi, der beskriver vores tilgang til langsigtet, kontinuerlig optagelse af video/EEG til at overvåge for post-traumatisk epileptiforme aktivitet. En række trin er afgørende for at generere reproducerbare resultater med den beskrevne metode.

For det første, da forekomsten af post-traumatisk epilepsi korrelerer med skade sværhedsgrad, anvende betingelser, der resulterer i den mest alvorlige TBI. Specifikt, brug en 5 mm craniektomi for at sikre, at et tilstrækkeligt stort område af Dura er udsat. Desuden sikres en kvindelig-kvindelig luer lås enhed på overfladen af kraniet, med åbningen placeret direkte over kraniektomi. Dette adskiller sig fra andre laboratorier, der har brugt en mindre kraniektomi (3 mm) og/eller placeret en modificeret nåle hub inde i kraniektomi, som effektivt reducerer åbnings størrelsen. Ved at placere luer-låsen uden for craniektomi, opretholdes 5mm åbningen. Disse specifikke parametre påvirker den samlede kraft anvendt på Dura. Det atmosfæriske tryk, der påføres Dura, har også stor indflydelse på alvoren af den observerede skade. Desværre, atmosfærisk tryk er meget varierende og synes at være enhed afhængig. Nogle laboratorier har rapporteret at anvende en Tryk puls på 8-10 MS18. I modsætning hertil resulterer den beskrevne metode i en 20 MS tryk puls. Dette er i overensstemmelse med andre laboratorier, der synes at generere mere alvorlig skade 14,28. Det er klart, at den skade inducerende tryk impuls er en parameter, der udviser betydelig variation mellem laboratorierne og skal være empirisk defineret. Sværhedsgraden af skader kan dog bestemmes ud fra en kombination af dødelighedsrater (40-50%), oprettende refleks tider (> 30 min)26. Det er også vigtigt, at kun dyr med en intakt Dura medtages i studiet. Hertil kommer, at hvis kraniektomi er tilstoppet med lim eller cement, således at en del af Dura under kraniektomi ikke udsættes for den fulde kraft af væsketryk pulsen, skal dyret elimineres fra studiet.  Desuden kan overskydende lim under luer låsen overholde dura og fjerne den med cement hætten selv efter en vellykket skade.  Endelig giver den glatte form af tryk impuls kurven på oscilloskop-sporet indikation af, at der ikke er luftbobler i væske kammeret, og indikerer, at stemplet bevæger sig uden impedans.

Anæstesi er en anden kritisk faktor, der skal kontrolleres. Isoflurane eksponering skal holdes på det lavest mulige niveau for at opretholde et kirurgisk plan for anæstesi. Rotter eksponeret for højere niveauer af isofluran eller for lange varigheder er mere tilbøjelige til at udvikle Neuro GENIC-induceret lungeødem. Fremstilling af kraniet repræsenterer et andet kritisk aspekt af metoden. Især tørring af kraniet og fjernelse af knogle støv hjælper med at forhindre rotter i at fjerne senderen for tidligt.

Placering af skruer og tilslutning af EEG ledninger er naturligvis afgørende for at producere konsekvent reproducerbare optagelser. Det er vigtigt, at skruerne ikke er placeret for dybt til at inducere en læsion på hjernen. Knogle klap genvundet fra craniektomi af voksne (12 uger gamle) mandlige Wistar rotter er konsekvent 2 mm tyk. Brug EEG-elektrode skruer med en 2,5 mm aksel. Det er nyttigt at bruge spidsen af buede mygge hæmostatisk pincet som en spacer at sikre, at skruerne kun strækker sig til bunden af knoglen og ikke rager ind i hjernen.

Den fremgangsmåde, der præsenteres her, har nogle begrænsninger. Batterierne skal udskiftes med jævne mellemrum. Hyppigheden af batteriskift afhænger af samplingfrekvensen. Batterierne skiftes typisk en gang om ugen til en prøvetagnings hastighed på 1000 Hz. Denne tidsramme kan forlænges ved at reducere samplingfrekvensen. Systemet er også begrænset til optagelse fra fire monopolar EEG-elektroder. Men dette giver to kanaler pr. halvkugle og kan skelne mellem fokale og generaliserede begivenheder og kan skelne mellem forreste og posterior ændringer. På trods af disse begrænsninger giver denne fremgangsmåde en fornuftig metode til at gennemføre kontinuerlig video/EEG-overvågning og detektion af epileptiforme ændringer efter svær TBI.

Den metode, der er beskrevet her, resulterer i både elektro grafiske og krampeanfald inden for en måned efter TBI. Derfor giver denne fremgangsmåde en rimelig tidsramme til at studere potentielle behandlingsmetoder til forebyggelse af epileptogenesis efter svær TBI. Denne fremgangsmåde giver også en metode til at undersøge de molekylære mekanismer, der er forbundet med PTE, og kan føre til identificering af potentielle biomarkører, der kan bruges til at identificere patienter, der er mest udsatte for at udvikle PTE.

Disclosures

Chelasea R Richardson er en medarbejder i Emka Scientific, leverandøren af dette trådløse telemetri system beskrevet.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Paul Dressel for hans uvurderlige støtte i grafisk design og udarbejdelse af figurer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.00 mm Drill Bits Drill Bit City: New Carbide Tools 05M200
3M ESPE Durelon Carboxylate Cement 3M , Neuss Germany 38019 Dental Cement
4-0 Suture Ethicon, Sommerville, NJ K831H 4-0 Ethicon Perma-hand Silk, 26mm 1/2c Taperpoint, 30" (75cm), Black Braided non-absorbable suture 
5 mm outer diameter trephine Fine Science Tools 18004-50
Bonewax Medline Industries, Mendelcin, IL REF DYNJBW25
Buprenorphine HCL, Injection (0.3 mg/mL) 1 mL vial Par Pharmalogical, Chestnut Ridge NY 3003706 NDC 42023-179-01
Dumont #6 Forceps Fine Science Tools 11260-20
Dumont #7b Forceps Fine Science Tools 11270-20
ecgAUTO EMKA Technologies, Falls Church, VA
Female Luer Thread Style Coupler Clear Polycarbonare   Cole-Palmer instrument SKO#45501-22 Order lot #214271
Foot Power Drill Grobet USA, Carlstadt, NJ Model C-300
GentaMax 100 (Gentamicin, Sulfate Solution) Phoenix, Manufactured by Clipper Distributing Company LLC, St. Joseph, MO NDC 57319-520-05
Hill's Prescription Diet a/d Canine/Feline  Hill's Pet Nutrition, Inc. , Topeka, KS
IOX2 Software  EMKA Technologies, Falls Church, VA
Isoflorane, USP Piramal Enterprise Limited, Andhra, India NDC 66794-013-25
IsoTech Anesthesia machine SurgiVet WWV9000
Lateral FPI device AmScien 302 curved tip, with pressure tubing extension. connected via screw lock connector (Cole-Palmer; #4550-22)
Leica A60 Stereomicroscope Leica Biosystems, Richmond, VA PN: 10 450 488
Marcaine (0.5%) Bupivacaine hcl injection usp 5 mg/mL Hospira, Lake Forest, IL CA-3627 50mL multiple dose vial; NDC 0409-1610-50
Micro-Adson Forceps Fine Science Tools 11018-12
Olsen-Hegar Needle Holders with Suture Cutters Fine Science Tools 12002-14
PALACOS R+G bone cement with gentamicin Heraeus,  REF: 5036964 Radiopaque bone cement containing 1 x 0.5g Gentamicin
Physio Suite Kent Scientific, Terrington, CT
Povidone-iodine solution Betadine 
Puralube Vet Ointment Dechra Veterinary Products, Overland Park KS NDC 17033-211-38
Scalpel blade (#10) and holder Integra Miltex, York, PA REF: 4-110
Scalpel Handle - #4 Fine Science Tools 10004-13
Sickle Knife Bausch + Lomb Storz Instruments N1705 HM 5mm curved blade. Round handle. Overall length 168mm, 6.6 inches.
Silverstein Micro Mirror Bausch + Lomb Storz Instruments N1706 S8 3mm diameter. Angled 45 degrees. Overall length 180mm, 7.2 inches
Storage NAS Synology Inc.  DS3615xs
Synology Assistant  Synology Inc. 
Thermal Cautery Unit Geiger Medical Technology, Delasco Council Bluffs, IA Model NO: 150
Vetivex Dechra Veterinary Products, Overland Park KS Veterinary pHyLyteTM Injection pH 7.4 (Multiple Electrolytes Injection, Type 1, USP)
Video Cameras TRENDnet, Torrance, CA TV-IP314PI Indoor/Outdoor 4MP H.265 WDR PoE IR Bullet Network Cameral
Video NAS Synology Inc.  DS916
Wistar IGS rats  Charles River strain code 003 12 wk old at the time of injury
Wullstein Retractor Fine Science Tools 17018-11

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Flanagan, S. R. Invited Commentary on Centers for Disease Control and Prevention Report to Congress: Traumatic Brain Injury in the United States: Epidemiology and Rehabilitation. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 96, 1753-1755 (2015).
  2. Annegers, J. F., Coan, S. P., Hauser, W. A., Leestma, J., Duffell, W., Tarver, B. Epilepsy, vagal nerve stimulation by the NCP system, mortality, and sudden, unexpected, unexplained death. Epilepsia. 39, 206-212 (1998).
  3. Lowenstein, D. H. Epilepsy after head injury: an overview. Epilepsia. 50, Suppl 2 4-9 (2009).
  4. Englander, J., et al. Analyzing risk factors for late posttraumatic seizures: a prospective, multicenter investigation. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 84, 365-373 (2003).
  5. Faul, M. X. L., Wald, M. M., Coronado, V. G. Traumatic Brain Injury in the United States: Emergency Department Visits, Hospitalizations and Deaths 2002-2006. Centers for Disease Control and Prevention, National Center for Injury Prevention and Control. Atlanta (GA). (2010).
  6. Herman, S. T. Epilepsy after brain insult: targeting epileptogenesis. Neurology. 59, 21-26 (2002).
  7. Annegers, J. F., Coan, S. P. The risks of epilepsy after traumatic brain injury. Seizure. 9, 453-457 (2000).
  8. Christensen, J., Pedersen, M. G., Pedersen, C. B., Sidenius, P., Olsen, J., Vestergaard, M. Long-term risk of epilepsy after traumatic brain injury in children and young adults: a population-based cohort study. Lancet. 373, 1105-1110 (2009).
  9. Webb, T. S., Whitehead, C. R., Wells, T. S., Gore, R. K., Otte, C. N. Neurologically-related sequelae associated with mild traumatic brain injury. Brain Injury. 29, 430-437 (2015).
  10. Mahler, B., Carlsson, S., Andersson, T., Adelow, C., Ahlbom, A., Tomson, T. Unprovoked seizures after traumatic brain injury: A population-based case-control study. Epilepsia. 56, 1438-1444 (2015).
  11. Wang, H., et al. Post-traumatic seizures--a prospective, multicenter, large case study after head injury in China. Epilepsy Research. 107, 272-278 (2013).
  12. Simonato, M., French, J. A., Galanopoulou, A. S., O'Brien, T. J. Issues for new antiepilepsy drug development. Current Opinion in Neurology. 26, 195-200 (2013).
  13. Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M. Animal models of traumatic brain injury. Nature Review Neuroscience. 14, 128-142 (2013).
  14. Kharatishvili, I., Nissinen, J. P., McIntosh, T. K., Pitkanen, A. A model of posttraumatic epilepsy induced by lateral fluid-percussion brain injury in rats. Neuroscienc. 140, 685-697 (2006).
  15. McIntosh, T. K., et al. Traumatic brain injury in the rat: characterization of a lateral fluid-percussion model. Neuroscience. 28, 233-244 (1989).
  16. Thompson, H. J., et al. Lateral fluid percussion brain injury: a 15-year review and evaluation. Journal of Neurotrauma. 22, 42-75 (2005).
  17. Curia, G., Eastman, C. L., Miller, J. W., D'Ambrosio, R. Modeling Post-Traumatic Epilepsy for Therapy Development. Translational Research in Traumatic Brain Injury. Laskowitz, D., Grant, G. Boca Raton (FL). (2016).
  18. D'Ambrosio, R., Fairbanks, J. P., Fender, J. S., Born, D. E., Doyle, D. L., Miller, J. W. Post-traumatic epilepsy following fluid percussion injury in the rat. Brain. 127, 304-314 (2004).
  19. Saatman, K. E., et al. Classification of traumatic brain injury for targeted therapies. Journal of Neurotrauma. 25, 719-738 (2008).
  20. Smith, D., Brooke, D., Wohlgehagen, E., Rau, T., Poulsen, D. Temporal and Spatial Changes in the Pattern of Iba1 and CD68 Staining in the Rat Brain Following Severe Traumatic Brain Injury. Modern Research in Inflammation. 4, 9-23 (2015).
  21. Ndode-Ekane, X. E., et al. Harmonization of lateral fluid-percussion injury model production and post-injury monitoring in a preclinical multicenter biomarker discovery study on post-traumatic epileptogenesis. Epilepsy Research. 151, 7-16 (2019).
  22. Ciszek, R., et al. Informatics tools to assess the success of procedural harmonization in preclinical multicenter biomarker discovery study on post-traumatic epileptogenesis. Epilepsy Research. 150, 17-26 (2019).
  23. Immonen, R., et al. Harmonization of pipeline for preclinical multicenter MRI biomarker discovery in a rat model of post-traumatic epileptogenesis. Epilepsy Research. 150, 46-57 (2019).
  24. Kamnaksh, A., et al. Harmonization of pipeline for preclinical multicenter plasma protein and miRNA biomarker discovery in a rat model of post-traumatic epileptogenesis. Epilepsy Research. 149, 92-101 (2019).
  25. Redell, J. B., Moore, A. N., Ward, N. H., Hergenroeder, G. W., Dash, P. K. Human traumatic brain injury alters plasma microRNA levels. Journal of Neurotrauma. 27, 2147-2156 (2010).
  26. Smith, D., et al. Convulsive seizures and EEG spikes after lateral fluid-percussion injury in the rat. Epilepsy Research. 147, 87-94 (2018).
  27. Eastman, C. L., Fender, J. S., Temkin, N. R., D'Ambrosio, R. Optimized methods for epilepsy therapy development using an etiologically realistic model of focal epilepsy in the rat. Experimental Neurology. 264, 150-162 (2015).
  28. Shultz, S. R., et al. Can structural or functional changes following traumatic brain injury in the rat predict epileptic outcome. Epilepsia. 54, 1240-1250 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics