التعبير السريع والفعال عن البروتينات المتعددة في أجنة الطيور باستخدام الكهربة mRNA

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

نحن نبلغ رسول RNA (mRNA) الكهربائي كوسيلة تسمح للتعبير السريع والفعال من البروتينات المتعددة في نظام نموذج الجنين السمان. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتسمية الخلايا الفلورية وتسجيل ها في الحركات الحية عن طريق المجهر الفاصل الزمني بعد وقت قصير من الكهربائي.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Tran, M., Dave, M., Lansford, R. Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation. J. Vis. Exp. (148), e59664, doi:10.3791/59664 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

نبلغ أن الكهرباء mRNA يسمح البروتينات الفلورية لتسمية الخلايا في الأجنة السمان الحية بسرعة أكبر وعلى نطاق واسع من الكهرباء الحمض النووي. كفاءة الانف بنسبة عالية يسمح ما لا يقل عن 4 mRNAs متميزة لتكون مشتركة مع كفاءة ~ 87٪. وتتحلل معظم الMRNAs الكهربائي خلال أول 2 ساعة بعد الكهرباء، مما يسمح بإجراء تجارب حساسة للوقت في الجنين النامي. وأخيرا، نحن نصف كيفية صورة دينامية الأجنة الحية الكهربائي مع mRNAs التي ترميز مختلف البروتينات الفلورية المستهدفة دون الخلوية.

Introduction

الكهربائي هو طريقة التغوط المادي الذي يستخدم نبض كهربائي لخلق المسام العابرة في غشاء البلازما، مما يسمح لمواد مثل الأحماض النووية أو المواد الكيميائية لتمرير في السيتوسول. يستخدم على نطاق واسع الكهربائي لتسليم الحمض النووي في البكتيريا والخميرة والنباتات وخلايا الثدييات3. يتم استخدامه بشكل روتيني لإدخال الحمولات الوراثية في الخلايا والأنسجة المستهدفة داخل جنين الطيور النامية لدراسة الرقابة الوراثية على التنمية أو تسمية السكان المهاجرين من الخلايا4،5،6، 7. ومع ذلك، توجد عدة قيود تجريبية أيضا مع الكهربة الحمض النووي8. على سبيل المثال، غالباً ما يقدم الكهربة الحمض النووي أرقام متغيرة للغاية من ناقلات التعبير لكل خلية، وبالتالي mRNAs والبروتينات التي ترمز. هذا التباين يمكن أن يؤدي إلى عدم تجانس الخلية الكبيرة التي تعقدكل من تحليل الصورة وتفسير البيانات 9،10. بالإضافة إلى ذلك، البروتينات من الحمض النووي الكهربائي تبدأ فقط للتعبير عن ~ 3 ساعة بعد الكهربائي ولا تصل إلى أقصى قدر من الكفاءة في عدد الخلايا وكثافة الفلورة حتى 12 ساعة، على الأرجح بسبب الوقت اللازم لنقل إلى النواة وكاملة كل من النسخ والترجمة في الجسم الحي11.

وعلى النقيض من ذلك، تم استخدام التغوط mRNA بشكل فعال في مجموعة متنوعة من النظم النموذجية، بما في ذلك الخلايا الدهنية Xenopus laevis عن طريق الحقن المجهري12،13، إعادة برمجة الخلايا الجذعية البشرية عن طريق الانقبح lipofectamine mRNA14 ، والخلايا الجذعية العصبية المتمردة الكهربائي في الفئران الكبار15. اختبرنا قدرة الكهرباء mRNA لتسمية الخلايا بكفاءة أثناء التطور الجنيني في وقت مبكر من الطيور باستخدام mRNAs في المختبر توليفها التي ترميز البروتينات الفلورية المتميزة (FPs). لدراساتنا, استخدمنا ناقلات pCS2 + , ناقلات التعبير متعددة الأغراض التي تستخدم عادة للتعبير عن البروتينات في Xenopus وحمار وحشي الأجنة. يسمح المروجون للبوليميراز من نوع SP6 وT7 RNA في pCS2+ بتوليف الحمض النووي الريبي والبروتين من أي جين مستنسخ عند استخدامه في نظام النسخ/الترجمة في المختبر.

هنا، نثبت أن الكهربة mRNA يسمح التعبير السريع والفعال من البروتينات الفلورية (FPs) في أجنة السمان الغاز. قمنا بتصميم وإنشاء العديد من ناقلات التعبير المستخدمة في هذه الدراسات. على سبيل المثال، نحن subcloned الجينات LifeAct-eGFP16 في ناقلات pCS2 +17 للتعبير من المروج CMV والمروج SP6. الجين المدرج يكمن المصب من المروج SP6 والمنبع من SV40 بولي (A) الذيل18. في الأجنة التي تم تحويلها إلى كهرباء مشتركة مع الحمض النووي الريبي والحمض النووي، تم الكشف لأول مرة عن الملوثات العضوية الثابتة المرمزة من الـ mRNAs في المختبر في غضون 20 دقيقة من الكهربة، في حين تم الكشف عن الـ FPs من ناقلات تعبير الحمض النووي فقط بعد 3 ح. ترميز mRNAs متعددة للنووي، غولجي، و يمكن أن تكون البروتينات الغشاء الكهربائي في الجنين في وقت واحد، مما أدى إلى التعبير السريع والفعال من البروتينات المتعددة في الخلايا الفردية. وأخيرا، باستخدام انتعاش الفلورة في الجسم الحي بعد حقن الصور (FRAP) ، ونحن نظهر أن غالبية mRNAs الكهربائي الاضمحلال في غضون 2 ساعة. وهكذا، فإن إنتاج البروتين الأولي السريع جنبا إلى جنب مع ترجمة بروتين جديدة محدودة يجعل mRNA الكهربائي تقنية قيمة عندما يكون التحكم الزمني في التعبير ضروريا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد نُفذت جميع الإجراءات الحيوانية وفقاً للمبادئ التوجيهية المعتمدة من مستشفى الأطفال في لوس أنجلوس ولجان الرعاية والاستخدام المؤسسية للحيوانية التابعة لجامعة جنوب كاليفورنيا.

1. توليد ناقلات التعبير المستندة إلى pCS2

  1. لاستنساخ pCS2.Lifeact-eGFP، وإعداد العمود الفقري ناقلات عن طريق هضم 2 ميكروغرام من pCS2.CycB1-GFP (بناء يحتوي على إدراج مختلف) مع BamHI (10 U) و BsrGI (10 U) في المخزن المؤقت الهضم المناسب (انظر جدول المواد) المخففة إلى 1X في رد فعل إجمالي حجم 50 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية (انظر الشكل 1 للاطلاع على مخطط إجراء الاستنساخ).
    1. Dephosphorylate الحرة 3'OH ينتهي من العمود الفقري ناقلات من رد فعل إنزيم تقييد عن طريق إضافة الجمبري القلوية الفوسفاتيز (1 U). حضانة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    2. تشغيل الخليط كله في هلام أغاروز 1٪ / 1X تريس خلات EDTA (TAE) العازلة في 90 V لمدة 50 دقيقة ~ ثم وصمة عار هلام في حل 0.5 ميكروغرام / مل من بروميد الإهيديوم في 1X TAE العازلة لمدة 15 دقيقة مع هزاز لطيف. أيضا، تأكد من تحميل علامات الوزن الجزيئي في حارة حرة للمساعدة في تحديد أحجام الحمض النووي.
    3. باستخدام الحمض النووي آمنة الأشعة فوق البنفسجية Transilluminator لتجنب شق DNAs، وقطع العمود الفقري ناقلات (حجم الفرقة المتوقعة من 4kb) من هلام أغاروز بسرعة وعزل جزء الحمض النووي من قطعة هلام باستخدام مجموعة تنقية هلام باستخدام تعليمات الشركة المصنعة.
  2. في وقت واحد مع الخطوة 1.1، وإعداد إدراج عن طريق هضم 2 ميكروغرام من pEGFP-N1-Lifeact مع BglII (10 U) و BsrGI (10 U) في العازلة الهضم المناسب المخفف إلى 1X في حجم التفاعل الكلي من 50 ميكرولتر لمدة ساعة 1 في 37 درجة مئوية. قم بتشغيل الخليط بأكمله في جل أغاروز بنسبة 1% لعزل النطاق 800 نقطة أساس كما سبق شرحه في الخطوة 1.1.2-1.1.3.
  3. بعد كل من يتم تنقية كل من المتجه وإدراجه وكمية على مقياس الطيف، والجمع بين 50 نانوغرام من المتجه و 38 نانوغرام من إدراج (1:3 نسبة الأضراس من ناقلات لإدراج) في T4 الحمض النووي ligase العازلة قبل إضافة T4 الحمض النووي ligase لتحفيز رد فعل الربط. بالإضافة إلى ذلك، قم بإعداد أي تحكم الحمض النووي، والسيطرة على ناقلات فقط، وإدراج عنصر تحكم فقط. احتضان جميع ردود الفعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
    1. تحويل 1 ميكرولتر من خليط (ق) الربط إلى المختصة E. القولونية DH10. أيضا، تحويل المياه فقط السيطرة السلبية و 20 pg من التحكم الإيجابي pUC19. نشر البكتيريا على المرق لوريا (LB) لوحات أجار تحتوي على 50 ميكروغرام / مل أمبيسيلين وحضانة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
    2. في صباح اليوم التالي، عد المستعمرات على كل لوحة.
      ملاحظة: من الناحية المثالية، لا ينبغي أن تكون هناك مستعمرات على لوحات التحكم السلبية، > 100 مستعمرات على لوحات الربط vector+insert، ومستعمرات أقل على لوحة المتجه فقط.
    3. اختيار ما لا يقل عن 8 مستعمرات بكتيرية من لوحة أجار تحولت مع ناقلات + إدراج خليط الربط وتلقيح لهم باستخدام مسواك معقمة أو نصائح pipet في 2 مل من مرق LB السائل الذي يحتوي على 50 ميكروغرام / مل أمبيسيلين.
    4. استخراج الحمض النووي من كل من الحيوانات المستنسخة باستخدام مجموعات miniprep بلازميد التجارية.
    5. تشغيل ملخص تقييد التشخيص باستخدام 500 نانوغرام من الحمض النووي من كل استنساخ باستخدام نوتي (10 U) وBamHI (10 U) في العازلة الهضم المناسب المخفف إلى 1X لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية وتشغيل الحمض النووي المهضوم على هلام أغاروز 1٪ في 1X TAE العازلة. أحجام الفرقة المتوقعة لاستنساخ pCS2.Lifeact-eGFP إيجابية هي 3.9 كيلو بايت و 978 نقطة أساس.
    6. تحويل 1 pg-100 ng من الحمض النووي من استنساخ إيجابي إلى المختصة E. القولونية DH10، وإعداد 3-4 ردود الفعل miniprep كما هو مفصل في الخطوات السابقة للحصول على كمية كافية من الحمض النووي لرد الفعل النسخ في المختبر (10 ميكروغرام الحد الأدنى).

2. إعداد الحمض النووي الريبي عن طريق النسخ في المختبر

  1. خطي 10 ميكروغرام من pCS2.LifeAct-eGFP على نهاية 3 ' من إدراج مع نوتي (10 U) في المخزن المؤقت الهضم المناسب المخفف إلى 1X في حجم التفاعل الكلي من 50 درجة مئوية في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: لمنع التلوث RNase والحد من تدهور الحمض النووي الريبي، وارتداء القفازات أثناء التعامل مع عينات mRNA.
  2. تنقية الحمض النووي باستخدام خليط من الفينول: الكلوروفورم: كحول isoamyl (25:24:1، v/v).
    1. إضافة 150 درجة مئوية من المياه الخالية من RNase لجعل الحجم الإجمالي لرد فعل الهضم يساوي 200 درجة مئوية. ثم، إضافة 200 ميكرولتر من الفينول: الكلوروفورم: الكحول isoamyl ودوامة الخليط لمدة 20 ثانية.
    2. الطرد المركزي في ميكروفوج في السرعة القصوى (18,400 × ز)لمدة 2 دقيقة. كرر هذه الخطوة لإزالة شوائب إضافية والحرص على عدم تعطيل الترسيب الأبيض الذي قد يشكل بين مراحل السائل السفلي والعلوي.
  3. يعجل الحمض النووي الخطي عن طريق إضافة 1/10 حجم 3M خلات الصوديوم (RNase خالية) و 2.5 كميات من الإيثانول 100٪. ترك الخليط في -20 درجة مئوية ل > 30 دقيقة، ثم بيليه الحمض النووي عن طريق الطرد المركزي في السرعة القصوى (18400 × ز).
    1. غسل بيليه الحمض النووي مع الإيثانول 70٪، ثم الهواء الجاف بيليه ل > 5 دقيقة.
    2. إذابة بيليه الحمض النووي في 5 ميكرولتر من المياه الخالية من RNase. قياس الحمض النووي بواسطة مقياس الطيف الضوئي.
      ملاحظة: التركيز المتوقع للحمض النووي هو ~ 0.5-1 ميكروغرام / ميكرولتر مع نسبة A260/A280 بين 1.7-2.0.
  4. استخدام 1 ميكروغرام من الحمض النووي الخطي pCS2.LifeAct-eGFP للنسخ في المختبر (IVT). اتبع تعليمات الشركة المصنعة في المجموعة التجارية (انظر جدول المواد) لتشمل 10 ميكرولتر من الغطاء التناظري (التركيز النهائي 0.8 mM) وNTPs (التركيز النهائي 1 mM لATP وCTP وTTP؛ 0.2 mM لGTP)، 2 ميكرولتر من المخزن المؤقت للرد 10x (التركيز النهائي 1x)، 2 ميكرولتر من بوليميراز الحمض النووي الريبي SP6، والمياه الخالية من RNase تصل إلى 20 ميكرولتر.
    1. احتضان خليط IVT لحوالي 2 ساعة أو أكثر، اعتمادا على حجم النص.
      ملاحظة: 2 ح الحضانة يعمل بشكل جيد لنسخة 3 كيلو بايت، ولكن الحضانة بين عشية وضحاها يعمل بشكل أفضل للنصوص التي هي أكبر من 5 كيلو بايت.
    2. لإزالة النيوكليوتيدات الحرة من رد فعل النسخ، إضافة 30 درجة مئوية من محلول هطول الأمطار الحمض النووي الريبي LiCl (7.5 M كلوريد الليثيوم، 50 MM EDTA) لتسريع mRNA. دوامة الخليط لفترة وجيزة وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  5. حل mRNA توليفها في 15 درجة مئوية من المياه الخالية من RNase. الاستغناء عن mRNA توليفها في 5 ميكرولتر / أنبوب (3 أنابيب المجموع) ووضعها في -80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل. تحديد الكمية mRNA مع مقياس الطيف الضوئي.
    ملاحظة: العائد المتوقع هو 15-20 ميكروغرام من mRNA (~ 1 ميكروغرام / ميكرولتر). 1 ميكرولتر (1 ميكروغرام/ميكرولتر) يكفي لإجراء تجربة مع حوالي 10 أجنة، على افتراض أن الحمض النووي الريبي يتم تخفيفه من 1 ميكروغرام/ميكرولتر إلى 500 نانوغرام/ميكرولتر وأن كل جنين يحقن بحوالي 200 نانوغرام. ولذلك، ينبغي أن يحتوي كل أنبوب على ما يكفي من mRNA لتجارب ~ 5.
  6. تشغيل ~ 300 نانوغرام من mRNA على هلام أغاروز 1٪ في 1X TAE العازلة بعد تنظيف جميع معدات هلام مع حل إزالة التلوث RNase (على سبيل المثال، RNase بعيدا) وضمان أن mRNA يظهر كنطاق واحد (نطاقات متعددة قد تكون موجودة إذا شكل الهياكل الثانوية) وأنه لا تشويه ppears في حارة هلام، مما يشير إلى تدهور الحمض النووي الريبي.

3. إعداد مزيج الكهربائي mRNA

  1. ذوبان وتخفيف mRNA في التركيز المطلوب (250-500 نانوغرام / ميكرولتر في المياه الخالية من RNase يعمل بشكل جيد لجميع mRNAs اختبارها في هذا العمل). إضافة 1/10 حجم من صبغ الملونة (انظر جدول المواد، RNAse خالية، 0.1٪ التركيز النهائي) للمساعدة في تصور موقع حقن mRNA ووضع الأقطاب الكهربائية بشكل صحيح.
    ملاحظة:
    إذا تم الجمع بين الحمض النووي والحمض النووي الريبي لإجراء الكهرباء المشتركة، تأكد من أن الحمض النووي خال من تلوث RNases باستخدام استخراج الفينول كلوروفورم وهطول الأمطار الإيثانول قبل MRNA وخليط الحمض النووي الريبي.
    1. تأكد من إعداد عنصر تحكم سلبي باستخدام حل الكهربائي وهمية (لا يضيف الحمض النووي الريبي). إذا كان ذلك ممكناً، قم بإعداد عنصر تحكم إيجابي باستخدام mRNA (mRNA معتمد مسبقًا) الذي ثبت أنه ينتج FP بنجاح في التجارب السابقة).
      ملاحظة: والسيطرة السلبية ضرورية لجميع تجارب التصوير لتحديد مستويات الفلورة الخلفية لتطبيع البيانات. التحكم الإيجابي مهم بشكل خاص عند العمل مع mRNA المنقولة حديثا من خلال المساعدة على التأكد من أن إعدادات الكهربائي عملت.
  2. تخزين محلول الكهربائي mRNA على الطين الجليد لمنع التدهور حتى على استعداد للمضي قدما مع الكهربائي.

4. الكهروبويرات mRNAs في أجنة السمان الحية

  1. جمع بيض السمان المخصبة الطازجة يوميا وتخزينها في 13 درجة مئوية في ثلاجة رطبة لمدة لا تزيد عن أسبوع واحد. حضانة بيض السمان عند 38 درجة مئوية حتى مراحل النمو الجنينية المطلوبة19و20و21.
    ملاحظة: تم استخدام HH3 إلى HH5 في هذه الدراسة لكل من التصوير الثابت والديناميكي. بالنسبة للأجنة HH3، فإن ترك البيض في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة قبل الحصاد يجعل عملية العزل أسهل بكثير حيث أن الأجنة عادة ما تكون أكثر مقاومة للتلاعب البدني عند تبريده.
  2. عزل وإعداد الأجنة وفقا لنظام الثقافة EC22. جمع ما لا يقل عن 5 أجنة لكل حالة، بما في ذلك واحد على الأقل لتكون بمثابة السيطرة السلبية (وليس الكهربائي).
    1. يُكسر البيض برفق ويُسكب في طبق بيتري بحجم 10 سم. إزالة غالبية الزلال سميكة مع ماصة نقل وإزالة الزلال سميكة المتبقية حول الجنين عن طريق مسح بلطف سطح صفار مع مسح الأنسجة لضمان أن الجنين العصي بإحكام على حلقة الورق.
    2. وضع ورقة مرشح precut (انظر جدولالمواد) على الجنين واستخدام مقص لقطع بسلاسة حول محيط الجنين.
    3. استخدام ماصة باستور لتكمن تحت الجنين مع PBS، وذلك باستخدام تيارات لطيف لإخلاء أي صفار التمسك الجنين.
      ملاحظة: هذه الخطوة حاسمة عند العمل مع الأجنة الأصغر سنا (
    4. سحب ببطء الجنين / ورقة حلقة في زاوية مائلة صعودا وإيقاف صفار في طبق بيتري مليئة PBS لمزيد من التنظيف. مرة واحدة وقد تم إزالة معظم صفار، وضع الجانب البطيني الجنين حتى على طبق بيتري 35 ملم مغطاة خليط شبه صلب من أجار / الألبومين.
  3. إعداد 6-8 10 سم الشعيرات الزجاجية طويلة (O.D. = 1.2 مم) باستخدام آلة سحب ميكروسبيت الزجاج.
  4. ضع الجانب البطني الجنيني في غرفة الكهرباء المليئة بPBS. باستخدام الشعيرات الدقيقة الزجاجية، حقن بولوس من 200 نمل من الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي / الحمض النووي / mRNA مزيج الكهربائي في تجويف بين الغشاء إبيبلاست وفيتيلين تغطي المنطقة المطلوبة.
    ملاحظة: تم تخطيط المنطقة الأمامية بأكملها لpellucida وبعض المناطق لopaca في معظم التجارب المبينة في هذه المخطوطة.
  5. ضع الأقطاب الكهربائية الإيجابية والسلبية (قطب مربع مسطح بلاتينيوم؛ طول جانبي قدره 5 مم) على أعلى وأسفل الجنين على التوالي والكهربائي باستخدام تسلسل النبض التالي: خمس نبضات كهربائية مربعة من 5 فولت، مدة 50 مللي ثانية مع فواصل زمنية تبلغ 100 مللي ثانية باستخدام الكهربائي في الجسم الحي. تأكد من أن المسافة بين الأقطاب الكهربائية هي ~ 5 ملم.
    ملاحظة: تحسين معلمات الكهرباء أمر بالغ الأهمية لتجنب الظروف التي يمكن أن تقتل الخلايا الجنينية الهشة. وينبغي النظر في بارامترات الجهد، وطول النبض، وفترات النبض، وعدد النبضات للحمض النووي والحمض النووي الريبي (DNA) لمختلف أجهزة الكهرباء.
  6. احتضان الأجنة الكهربائي في 38 درجة مئوية إلى مرحلة النمو المطلوب.
    ملاحظة: يساعد منظار الاستريو الفلوري (انظر جدولالمواد) على فحص الأجنة غير المنقولة.
  7. إذا كانت الأجنة ليتم تصويرها بشكل ثابت، قم بإصلاحها في 4٪ بارافورمالدهايد في PBS لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
    1. إزالة الأجنة من غشاء vitelline عن طريق قطع بسلاسة حول محيط ورقة فلتر مع مقص وتقشير قبالة الغشاء لامعة على السطح الظهري مع ملقط حاد بلطف.
    2. غسل الأجنة الثابتة في PBS / تريتون (0.1٪) 2x لمدة 5 دقائق والاستمرار في التهجين في الموقع أو تلطيخ المناعة إذا رغبت في ذلك.
    3. وأخيراً، وصمة عار الجنين في 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر DAPI في PBS / تريتون (0.1٪) لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. غسل الأجنة في PBS / تريتون 2X لمدة 5 دقائق ومسح الجنين في حل SCALE-U223 بين عشية وضحاها.
  8. لتحليل كفاءة الكهربة (انظر الشكل2)، استخدم أداة تحليل ثنائي والجسيمات وقناة DAPI على ImageJ للحصول على الخطوط العريضة النووية من جميع الخلايا في الصورة.
    1. لاستخدام الأداة الثنائية على ImageJ، استخدم شريحة z واحدة في قناة DAPI التي تحتوي على غالبية الخلايا وانقر فوق عملية > ثنائي > جعل ثنائي. لفصل الخلايا القريبة، انقر فوق معالجة > ثنائي > مستجمعات المياه. الحصول على الخطوط العريضة للخلية عن طريق النقر تحليل > تحليل الجسيمات، حجم تعيين إلى 100-500 (ميكروم2).
    2. تأكد من أن معظم الخلايا موضحة في قناة DAPI وحفظ الخطوط العريضة للخلية بالنقر فوق المزيد > حفظ على النافذة المنبثقة مدير عائد الاستثمار.
    3. استخدم هذه المخططات التفصيلية للحصول على قيم شدة الفلورة لقناة mRNA وDNA عن طريق فتح الملف المحفوظ ة مسبقًا على شريحة z واحدة في قناة mRNA أو DNA ثم انقر فوق قياس على مدير عائد الاستثمار.
    4. وأخيراً، قم بتصفية قيم الكثافة هذه، وحساب الخلايا مع <6,000 كثافة الفلورة كخلايا غير متسربة وخلايا مع > 6,000 كثافة الفلورة كما transfected.

5. صورة FPs ترميز من قبل mRNAs الكهربائي

  1. اختيار الجنين الأكثر صحة وأفضل الكهربائي لتجارب التصوير الديناميكي بعد النظر في جميع الأجنة الكهربائي تحت منظار مجسم تشريح الفلورسنت.
    1. الاستمرار في احتضان الأجنة الكهربائية الأخرى والجنين غير الكهربائي (السيطرة السلبية) في حاضنة منفصلة أثناء تصوير الجنين المختار في حالة وفاة هذا الجنين أثناء التجربة.
  2. للتصوير الديناميكي، استخدم ثقافة جنين الطيور ذات التركيب الكامل كما سبق وصفهافي 24و25و26 مع مجهر مقلوب.
    ملاحظة:
    تم تجهيز المجهر مع حاضنة على خشبة المسرح (انظر جدولالمواد) التي تحافظ على درجة الحرارة في 36 درجة مئوية أثناء التصوير. وقد لوحظ أثناء إعداد المجهر أن الأجنة الحاضنة عند 36 درجة مئوية تعيش لفترة أطول مما هي عليه في درجات حرارة أعلى، ربما لأن الليزر قد يسبب التدفئة المحلية على الجنين. يجب على القراء تحديد درجة حرارة الحضانة المثلى على خشبة المسرح لإعداد المجهر الخاصة بهم.
    1. صورة ديناميكية وتصور تكوين الجنين، وتنظيف الجنين الكهربائي لفترة وجيزة مع PBS لإزالة أي فقاعات قد تشكل على الجانب الدسير من الجنين أثناء عملية الكهربائي عن طريق تحريك الجنين حول استخدام ملقط في PBS نظيفة حل.
    2. ضع الجنين النظيف مباشرة على طبق تصوير يحتوي على طبق رفيع من الزلال-أجار (~ 150 ميكرولتر) مع التأكد من عدم توليد أي فقاعات على السطح الظهري للجنين22.
    3. لضمان البقاء على قيد الحياة للتصوير على المدى الطويل، إضافة قطعة رطبة صغيرة توالت المتابعة من ورقالأنسجة في الحواف الداخلية لطبق التصوير وختم الطبق باستخدام فيلم البارافين للحد من التبخر أثناء التصوير والحضانة.
    4. نقل هذا الطبق بسرعة إلى مرحلة ما قبل تسخين المجهر البؤري وتحديد موقع الصبغة الملونة في الجنين باستخدام قناة brightfield (PMT الليزر 20٪)، والتي تحدد المنطقة حقن والكهربائي.
  3. تعيين برنامج التصوير إلى الهدف المطلوب (10 أو 20X)، مرآة ثنائية الأبعاد (488 نانومتر لGFP نانومتر، 561 لRFP)، أطياف الانبعاثات (499-562 نانومتر لGFP، 570-695 نانومتر لRFP)، وبدوره على الليزر المناسب (488 نانومتر لGFP، 561 نانومتر لRFP).
    ملاحظة:
    تمت ترجمة mRNA الكهربائي إلى بروتينات شوهدت في غضون 20 دقيقة (انظر الشكل3). وكانت البيانات الوصفية التصوير المستخدمة لمعظم الصور في هذه الورقة: مجهر مقلوب مع هدف 20X (انظر جدولالمواد)؛ بكسل يسكن الوقت، ~ 1.5 μs؛ يعني من 4-خط المسح الضوئي.
    1. انقر فوق Live على برنامج التصوير وضبط قوة الليزر إلى إعداد مناسب لشدة الفلورة اعتمادا ً على كل قوة ليزر مجهر. ابدأ بتصوير الجنين باستخدام قوة الليزر بنسبة 1%، وربح 800، وزيادة قوة الليزر ببطء بنسبة 1% حتى يتم رؤية البيكسلات المشبعة.
    2. اتبع هذا عن طريق خفض قوة الليزر قليلا حتى لا ينظر إلى بكسل المشبعة بعد الآن.
      ملاحظة: قد تكون قوة الليزر التي تم اختيارها لبداية جلسة تصوير الجنين جيدة لنقاط زمنية سابقة ولكنها ليست مثالية في نقاط وقت لاحق إذا أصبحت الفلورة في الخلايا أكثر إشراقاً أو باهتة مع مرور الوقت. ولمعالجة هذا الأمر، يمكنك تصوير الجنين في إعدادات طاقة أقل قليلاً في البداية لأن الخلايا الكهروية عادة ما تصبح أكثر إشراقاً خلال الساعات الست الأولى بعد الكهربة (انظر الشكل 3A-E للاطلاع على التحديد الكمي لزيادة الإشارة). إذا كانت الصور اللاحقة مشبعة، فاستمر في التصوير باستخدام إعدادات التصوير الأصلية، ولكن خذ صورة إضافية بعد ذلك مباشرة باستخدام إعدادات التصوير الأضعف (ثقب أصغر أو قوة ليزر أضعف).
    3. صورة الجنين كل 3-5 دقيقة من أجل تتبع هجرة الخلايا الفردية عبر نقاط زمنية مختلفة. لهذا العمل، كانت الصور z-مكدسات (~ 50 ميكرومتر سميكة) من المنطقة الكهربائية بأكملها، بالإضافة إلى بعض غرفة إضافية نحو الجزء السفلي من كومة z في حالة غرق الجنين في سرير أغاروز طوال جلسة التصوير.
    4. لاحظ مدى سرعة تحرك الخلايا عن طريق التحقق من النقاط الزمنية القليلة الأولى من الفيلم الأول. إذا كانت الخلايا تتحرك بمعدل سريع (بمعنى أنها سوف تخرج من منطقة المنطقة المصورة في غضون بضع نقاط زمنية إضافية)، والنظر في توسيع نطاق التكبير من المنطقة المصورة (1x à 0.8x) أو تصوير منطقة مختلفة.
      ملاحظة: المناطق الجنينية في منطقة pellucida تتحرك بسرعة أكبر بكثير من تلك الموجودة في منطقة opaca. بالإضافة إلى ذلك، غالباً ما تحتوي الأجنة الأصغر سناً (HH3، HH5) على خلايا تمر بحركة أسرع مقارنة بالأجنة القديمة (>HH7).
    5. بعد تصوير المنطقة الكهربائية للجنين، صورة منطقة غير كهربائية من نفس الجنين لتحديد مستويات الفلورة الذاتية (يجب أن تكون ضئيلة إذا تم استخدام قوة الليزر المنخفضة <10٪ لتصوير الجنين).

6. الفلورة الانتعاش بعد تبييض الصور (FRAP) لـ Asay mRNA النزاهة

ملاحظة: يمكن استخدام الانتعاش الفلوري في الجسم الحي بعد حقن الصور (FRAP) لتحديد المدة التي يمكن أن تترجم فيها mRNA المنقولة إلى FPs. يحدد البروتوكول التالي تجربة FRAP للكشف عن نصف عمر H2B. السترين ميرنا في جنين كهربائي.

  1. إجراء تجارب FRAP على المجهر المقلوب باستخدام هدف 20x 0.8 NA وفتح ثقب مفتوح تماما.
    1. بعد التأكد من الكهربائي من H2B-السترين على المجهر المجسم ووضع الجنين على مرحلة ما قبل ساخنة على المجهر البؤري المقلوب (انظر الخطوة 5.2.4)، تبييض الصور معظم الفلورة الخلوية من H2B-السترين في مجموعة متنوعة من الوقت نقاط (45 دقيقة، 2 ساعة، و 5 ح بعد الكهربائي) باستخدام الليزر 405 نانومتر مع قوة الليزر 70٪، 100 التكرارات، سرعة المسح الضوئي 4، مما يترك فقط 5٪ من الفلورة المتبقية.
      ملاحظة: وينبغي أن تستغرق هذه العملية بضع دقائق.
    2. الاستمرار في احتضان الأجنة على خشبة المسرح في 36 درجة مئوية بعد تبييض الصور.
  2. تأكد من الانتباه إلى تقسيم الخلايا بنشاط داخل المنطقة ذات التبييض الضوئي، والتي تشير إلى أن الخلايا المبيضة ضوئيا لم يمت تماما بعد العلاج.
  3. الحصول على صور ما بعد التبييض (z-مكدسات من المنطقة الكهربائي) لمدة تصل إلى 30 دقيقة على فترات زمنية منتظمة (3 أو 5 دقائق) باستخدام المجهر البؤري.
    ملاحظة: إذا كان متوفراً، استخدم خط H2B-XFP المعدل وراثياً كتحكم إيجابي لضمان بقاء الخلية في المنطقة ذات التبييض الضوئي. يجب أن ينخفض معدل استرداد الفلورة لFP المشفرة بواسطة mRNA الكهربائي، ولكن أن FP ترميز عن طريق transgene ينبغي أن تبقى متسقة طوال الفيلم بأكمله.
  4. للتأكد من أن ظروف التصوير لا تؤثر بشكل محذف على بقاء الجنين، في نفس الوقت احتضان الأجنة الكهربائية التي لا تبيض ضوئيا، والتي قد تكون بمثابة عنصر تحكم في التصوير.
  5. لتكميم نتائج ابيضاض الصور لتسوس mRNA بعد الكهربة، وتتبع الفلورة الخلية مع مرور الوقت (3 أو 5 دقائق) عن طريق قياس شدة الفلورة للمركز (دائرة 7.5 ميكرومتر) من كل خلية باستخدام ImageJ. قياس هذا لجميع الخلايا داخل المنطقة الضوئية التي لا تخضع للميثوس وقد تم تبييضها تماما.
    ملاحظة: النظر في حذف الخلايا الميتوتيكية من الكم منذ النوى الميتوتيكية لديها الفلورة أقوى من النوى بين المراحل بسبب تكاثف الكروماتين.
  6. رسم كثافة الفلورة مع مرور الوقت بعد التبييض في مجموعة متنوعة من النقاط الزمنية (45 دقيقة، 2 ساعة، و 5 ح).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

mRNA الكهربائي هو أكثر كفاءة من الكهرباء الحمض النووي

استخدمنا pCS2 +. H2B-السترين لإعداد في المختبر منقولة mRNA. وبما أن الإلكتروبورات الحمض النووي عادة ما يتم تنفيذها عند 1-2 ميكروغرام/ميكرولتر، استخدمنا تركيز ًا متساويًا من mRNA (محسوبًا على أنه حوالي 0.25-0.5 ميكروغرام/ميكرولتر لـ H2B-Citrine) للكهرباء mRNA. اختبرنا أولا كفاءة الكهربائي من pCS2 +. H2B-السترين الحمض النووي مقارنة مع H2B-سيترين ميرنا (في المختبر منقولة من المروج SP6 من pCS2 +. H2B-السترين) عن طريق الكهربائي الحمض النووي أو mRNA بشكل منفصل في أجنة السمان HH5 ثم فحص كفاءة الكهربائي في 12 ح بعد الكهربائي. على الرغم من أن الكهربة الحمض النووي يؤدي إلى الفلورة أكثر إشراقا في بعض الخلايا الكهربائي، كانت كفاءة الكهربائي الحمض النووي أقل بشكل واضح بالمقارنة مع MRNA مشفرة على نطاق واسع FPs (الشكل2A و B).

لحساب التباين المتأصل بين الجنين والجنين في بروتوكول الكهرباء، تم إضفاء الكهربائي على مزيج من التتناسب مع الحمض النووي الريبي (MRNA) H2B-السترين والحمض النووي الذي يعبر عن H2B-mKate2 في الإكتودرم من أجنة HH5 ولاحظ 12 ساعة ما بعد الكهربائي. عند مقارنة الحمض النووي وmRNA الكهربة المشتركة في نفس الجنين، وكان الحمض النووي التعبير عن FP أيضا بشكل ملحوظ وباستمرار أقل كفاءة من أن من الحمض النووي الريبي (الشكل2C). من خلال قياس جميع الأجنة الكهربائي مع الحمض النووي الريبي فقط، الحمض النووي، أو مزيج من الاثنين، وجدنا أن mRNA transfects ~ 75٪ من الخلايا في منطقة معينة، في حين الحمض النووي فقط transfects ~ 25٪ من الخلايا في منطقة معينة (الشكل2D). لم يكن انتشار في التعبير عن البروتينات الفلورية المشفرة من قبل mRNA أو الحمض النووي مختلفة بشكل ملحوظ في جميع الأجنة الكهروبورة المشتركة (الشكل2E).

التعبير البروتين هو أسرع في الكهربائي mRNA من الكهرباء الحمض النووي

وينبغي أن يؤدي mRNA transfected إلى إنتاج البروتين أسرع لأنه يمكن التعرف عليها على الفور من قبل آلات الترجمة السيتوسالية كما رأينا في الشكل 3. يجب نقل الحمض النووي إلى النواة، وتدوينها، ونقل الحمض النووي الريبي مرة أخرى إلى السيتوسول حيث يتم التعرف عليه من قبل آلات الترجمة السيتوسولية، من المتوقع أن يستغرق المزيد من الوقت. لمقارنة مباشرة معدلات التعبير الحمض النووي الريبي مقابل الحمض النووي لإنتاج البروتين، قمنا بتنفيذ سلسلة من التجارب بالطبع الوقت الذي شاركنا في الكهربائي مزيج متساوي من الحمض النووي (pCMV.H2B-mKate2) وmRNA (H2B-السترين) في ectoderm من الأجنة HH5. اكتشفنا تعبير FP مشفر بـ mRNA حوالي 22 دقيقة بعد الكهرباء، والذي يستمر في الزيادة في كثافة الفلورة النسبية لحوالي 6 ساعة (الشكل3A-E، التكميلية. فيلم S1b). وعلى النقيض من ذلك، يُرى تعبير FP المرمز للحمض النووي لأول مرة عند حوالي 1.5 ساعة بعد الكهرباء (الشكل3A'-E'، التكميلية. فيلم S1c) ويستمر في زيادة في السطوع حتى 6 ح عندما تم إيقاف الفيلم. لأن الخلايا الكهربائية الحمض النووي كانت مشبعة بعلامة 6 ح، قمنا بإعادة تصوير هذا الشرط مع ظروف التصوير الأضعف (الشكل3F-F''). عبر كل ّ وقت نقطات من هذا وقت فاصلة (22 [مين تو] 6 [ه]), [مرنا] [ترنسّفيتس] عدّة أوقات كثير خلايا من [دنا](إضافيّة. فيلم S1a، لا تظهر الكفاءة الكلية للكهرباء من خلال brightfield وDAPI لأن هذه الصور مأخوذة من الفاصل الزمني للجنين السمان نوع البرية). وبناء على ذلك، نستنتج أن الكهرباء mRNA يؤدي إلى البروتين أعرب في وقت سابق.

الكهرباء المشتركة من mRNAs متعددة هي ذات كفاءة عالية

بعد ذلك، سعينا إلى مزيد من اختبار كفاءة الكهربائي mRNA عن طريق الكهربائي mRNAs متعددة في منطقة ذات أهمية. وقد ثبت في السابق أن التقوية بالكهرباء المشتركة لعدة السلطات الوطنية المعينة غير فعالة نسبياً، حيث تبين أن عدد الأشخاص المتعددي العلامات هو 25 في المائة و14 في المائة و10 في المائة بالنسبة للحمض النووي 2 و3 و4 منشآت للحمض النووي الكهربائي، محسوبة كنسبة من العدد الإجمالي للخلايا11 . نحن أول الكهربائي اثنين من mRNAs التي ترميز FPs متميزة طيفيا (Turquoise2-Golgi/H2B-Citrine) في أجنة HH5 وحصلت على كفاءة عالية في الانعترا في جميع المناطق الكهربائي. استخدمنا هذا الإلكتروبوريشن المزدوج لالتقاط أفلام التوسع شعاعي بين منطقة pellucida وopaca في جنين gastrulating HH4، صورة 2 ح بعد electroporation (الفيلمالتكميلي S2a، ب،ج). يتم توطين H2B-السترين داخل نواة الخلية ويسمح بتتبع انتشار الخلايا27. يظهر الTurquoise2-Golgi FP لإظهار القطبية دون الخلوية داخل الخلايا الجنينية ولكن لا يبدو أن ترتبط مع سرعة أو اتجاه نقل الخلايا ectoderm في الجسم الحي28. هذا الفيلم (الفيلمالتكميلي S2) يظهر أن الخلايا الكهربائي مع mRNAs متعددة يمكن أن تستمر النشاط الخلوي العادي دون أي عيوب واضحة.

وعلاوة على ذلك، شارك في الكهرباء من 4 mRNAs - Turquoise2-Golgi (لتصور جهاز غولجي)، LifeAct-eGFP (لتصور F-actin)، H2B-السترين (لتصور نواة)، وغشاء الكرز FP (لتصور الأغشية) - أدى إلى 87٪ الانتراب كفاءة جميع 4 mRNAs في جميعالمناطق الكهربائية (الشكل 4). تم فصل LifeAct-EGFP وH2B-Citrine بواسطة أداة معالجة غير الاختلاط الخطية في البرنامج التجاري.

يظهر فحص FRAP التدهور السريع لـ mRNA الكهربائي خلال الساعتين الأوليين بعد الكهرباء.

ومن المعروف أن mRNAs عارية تتحلل بسرعة من قبل RNAases الخلوية29. افترضنا أن الكهربة mRNA قد تكون مفيدة للخسارة أو كسب التجارب من وظيفة من خلال السماح للتعبير السريع والفعال من البروتينات في الجنين النامية. لذلك، سيكون من المفيد أن تكميم معدل تسوس ميرنا بعد الكهربائي mRNA، منذ mRNA يتحلل أسرع من الحمض النووي في الخلايا. في التقارير السابقة من الكهرباء mRNA في الخلايا الجذعية العصبية الماوس الكبار، تم تحديد حوالي 80٪ mRNA 2 ح بعد الكهربائي من قبل qRT-PCR، ولكن تم الكشف عن القليل إلى أي mRNA من قبل 24 ح بعد الكهربائي15. سعينا إلى زيادة قياس التعبير mRNA بعد الكهربائي عن طريق تصميم في الجسم الحي FRAP فحص للكشف عن مستويات mRNA في الخلايا الكهربائية.

تبييض الصور هو تدمير لا رجعة فيه من الفلوروفور التي يمكن أن تحدث عندما الفلوروفور (البروتينات الفلورية في حالتنا) هو في حالة متحمس، والذي يلغي الفلورة أثناء المراقبة30،31. ولذلك فإن أي ضوء منبعث من بروتينات الفلورسنت (FPs) يمكن اكتشافه في الخلايا المُبيضة ضوئياً فوق مستويات خط الأساس ينبغي أن يمثل الملوثات الاصطناعية المترجمة حديثاً والمشفرة بواسطة mRNAs سليمة وعابرة. لذلك، سعينا إلى تبييض الخلايا الكهربائية للقضاء على جميع الفلورة المستمدة من FP الموجودة في مجموعة متنوعة من النقاط الزمنية وتتبع الانتعاش الفلوري اللاحقة.

باستخدام إعدادات تبييض الصور الأمثل كما هو موضح في قسم البروتوكول، وجدنا أن تبييض الصور يقلل في البداية من شدة الفلورة في جميع الخلايا المبيضة ضوئيًا بنسبة 95% تقريبًا عند إجراء عملية تبييض الصور مباشرةً. وقد تم ذلك في 45 دقيقة، 2 ساعة، و 5 ح بعد الكهربائي (الشكل5A-C). تم تتبع استعادة الفلورة في كل خلية داخل المنطقة ذات التبييض الضوئي على مدى فترة زمنية 30 دقيقة بعد تبييض الصور في كل نقطة زمنية عن طريق تصوير نفس المنطقة في فترات زمنية منتظمة (3 أو 5 دقائق). تشير بياناتنا إلى أن هناك انخفاضا كبيرا في مستويات mRNA المنقولة بين 45 دقيقة و 5 ساعة بعد الكهربائي. ويتجلى ذلك من خلال الانخفاض الكبير في FRAP تقاس في 5 ح مقارنة مع 45 دقيقة بعد الكهربائي. لتسليط الضوء على الانتعاش الفلوري في الخلايا المبيضة وخاصة في نقطة زمنية 5 ح، عززنا السطوع في الشكل 5A-C باستخدام أداة السطوع / التباين في ImageJ وتظهر هذه الصور المعدلة في الشكل 5D-F. ومن المثير للاهتمام، هناك تباين كبير في الانتعاش الفلوري ة من خلية إلى خلية داخل المنطقة الضوئية في 2 ساعة لأن بعض الخلايا استرداد الفلورة أسرع من الخلايا الأخرى (الشكل5E''، انظر رؤوس الأسهم). ومع ذلك، فإن جميع الخلايا داخل منطقة 5 ح photobleached استرداد الفلورة أبطأ (الشكل5F '') من الخلايا الضوئية في 2 ح. كما نكتشف الخلايا المنقسمة بنشاط داخل منطقتنا ذات التبييض الضوئي، مما يشير إلى أن الخلايا لم تمت نتيجة لعملية تبييض الصور (الشكل5E'').

نقوم بتحديد هذه النتائج في الشكل 6A من خلال إظهار كثافة الإشارة الطبيعية لكل خلية داخل المناطق ذات التبييض الضوئي على مدى فترة 30 دقيقة بعد حدث تبييض الصور. بالنسبة لكل خلية، تم تطبيع قيم الفلورة ضد شدة إشارة تلك الخلية مباشرة بعد تبييض الصور. وقد تم هذا التطبيع لجميع الخلايا عبر جميع النقاط الزمنية المصورة (45 دقيقة، 2 ساعة، 5 ح). ثم تم تجميع القيم الطبيعية لاستعادة الفلورة للخلايا داخل نفس المنطقة المبيضة الصورة معا ورسم بياني على مر الزمن بعد حدث تبييض الصور؛ لذلك، كل نقطة في الرسم البياني يمثل ~ 35 خلية. وترد البيانات غير الطبيعية أيضاً في الشكل 6B، الذي يمثل فيه كل خط خلية مع استعادة شدة إشارة الفلورة مباشرة بعد تبييض الصور. وتشير هذه البيانات عموما إلى أنه بحلول 5 ح، وقد استنفدت جميع الخلايا معظم الحمض النووي الريبي، مع جزء كبير من هذا الانخفاض يحدث بين 45 دقيقة و 2 ساعة بعد الكهربائي.

Figure 1
الشكل 1: مخطط إجراء الاستنساخ لجعل pCS2 + LifeAct-eGFP البناء. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: الكهربة mRNA هو أكثر كفاءة من الكهرباء الحمض النووي. (أ-أ') الحمض النووي الذي يعبر عن pCS2.H2B-السترين تم الكهربائي في ectoderm من الأجنة HH5. ولوحظ الفلورة 12 ساعة بعد الكهربائي. شريط مقياس = 50 درجة مئوية (B-B'') mRNA التعبير عن H2B-السترين تم الكهربائي في ectoderm من الأجنة HH5. وقد لوحظ الفلورة بعد 12 ساعة من الكهرباء. شريط مقياس = 50 درجة مئوية(C-C''مزيج Equimolar من الحمض النووي (pCMV.H2B-mKate2) وmRNA (H2B-السترين) تم الكهربائي في أجنة HH5 ولاحظ 12 ساعة بعد الكهربائي. تم اختبار ثلاثة أجنة لكل حالة (n = 2 تجارب). شريط مقياس = 50 ميكرومتر (D) تم تحديد ثلاثة أجنة من A و B و C (9 مجموع الأجنة) لكفاءة الكهرباء باستخدام أداة تحليل الجسيمات على ImageJ. تم تحديد منطقة 200 ميكرومتر من كل جنين (تم حساب ما لا يقل عن 150 خلية لكل منطقة). يمثل اندفاعة الأوسط المتوسط، في حين أن الأشرطة العلوية والسفلية تمثل الانحراف المعياري عن المتوسط. (هـ)يتم تحليل ثلاثة أجنة كهربائية مشتركة (الحمض النووي والحمض النووي الريبي) لنشر الإشارة عبر جميع الخلايا الكهربائية في منطقة معينة تبلغ مساحتها 200 درجة مئوية. وكان لكل جنين حوالي 100 خلية إيجابية لالكهربائي mRNA و 30 خلية إيجابية للكهرباء الحمض النووي. يمثل اندفاعة الأوسط المتوسط، في حين أن الأشرطة العلوية والسفلية تمثل الانحراف المعياري عن المتوسط. لا يوجد فرق كبير بين انتشار mRNA مقابل الكهربة الحمض النووي، ولكن الكهرباء mRNA هو أكثر كفاءة بكثير من الحمض النووي. (A-C) الأبعاد = 425.10 × 425.10 × 55 ميكرومتر. بت لكل بكسل = 16. البيانات الوصفية المجهر = مجهر مقلوب، 20X الهدف (انظر جدولالمواد) (A) السابق: 488 نانومتر (0.05٪)، الانبعاثات المسار S1 = 508-579 نانومتر؛ (ب) Ex = 488 nm (5.0٪)، مسار الانبعاثات S1 = 508-579 نانومتر؛ (ج) Ex = 488 nm (5.0%) 561 nm (5.0%), Emission Track S1 = 508-579 nm; S2 = 606-695 نانومتر الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: يظهر الكهرباء mRNA التعبير من قبل 22 دقيقة بعد الكهربائي وأسرع بكثير من الكهرباء الحمض النووي. الصور التمثيلية للمسار الزمني بعد mRNA (H2B-السترين) والحمض النووي (pCMV.H2B-mKate2) الكهربائي مع تحليل ملف المؤامرة في 22 دقيقة(A-A''و 45 دقيقة(B-B''و 1.5 h(C-C''و 3 h(D-D'') و 6 ح(E-E''في بداية التصوير (n = 1). يتم توفير تحليل ملف تعريف الرسم لكل نقطة زمنية تظهر عبر السهم المسحوب في الصورة المدمجة. كل ذروة في ملف تعريف المؤامرة يمثل نواة خلية الكهربائي. الخلايا عموما تصبح أكثر إشراقا على مدى الفاصل الزمني 6 ح من الفيلم، مما يدل على أن mRNA لا يزال يترجم إلى بروتين فلورسنت جديد. لنقطة زمنية 6 ساعات، يتم عرض صور من نفس المنطقة التي تم التقاطها باستخدام ظروف التصوير متطابقة(E-E''وظروف التصوير الأضعف(F-F''لأن صور الخلايا الكهربائية الحمض النووي كانت مشبعة للغاية باستخدام الأولي ظروف التصوير. شريط المقياس = 20 ميكرومتر الأبعاد: 425.10 × 425.10 × 55 درجة مئوية. بكسل يسكن 2.55 μs. متوسط خط 4. بت لكل بكسل = 16. بيانات تعريفية مجهر = مجهر مقلوب، هدف 20x (انظر جدولالمواد) Ex = 488 nm (15%)، 594 nm (5.0%) للحرف الأولى ، وعندما كان هناك السابق = 488 نانومتر (7.5٪)، 594 نانومتر (0.5٪) لنقطة الوقت الأخير (الشكل2F)،مسار الانبعاثات S1 = 499-562 نانومتر؛ S2 = 605-661 نانومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: الكهربة المشتركة لأربعة mRNAs تستهدف هياكل فرعية خلوية مختلفة هي ذات كفاءة عالية. تم الكهربائي ectoderm من جنين HH3 مع mRNAs التي ترميز mTurquoise2-Golgi، LifeAct-eGFP، H2B-السترين، وغشاء الكرز. تم إصلاح الجنين وصورته في 4 ساعات بعد الكهرباء. يتم تخطيط معظم الخلايا الكهربائية داخل المنطقة المستهدفة القطب مع جميع mRNAs الأربعة (87٪). الأرقام التمثيلية المبينة (3 أجنة لكل منها، ن = تجربتين). شريط مقياس = 50 درجة مئوية (أ) دمج جميع mRNAs الأربعة (mTurquoise2-Golgi، LifeAct-eGFP، H2B-السترين، وغشاء الكرز). (ب) فقط قناة H2B-السترين (السابقين = 488 نانومتر (0.7٪)، Em = 455-499 نانومتر). (C) فقط mTurquoise2-Golgi قناة (السابقين = 458 نانومتر (22.0٪)، Em = 455-499 نانومتر). (D) دمج H2B-السترين وmTurquoise2-Golgi يظهر أن Golgi المغلفات جانب واحد من النواة في معظم الخلايا. (E) فقط قناة LifeAct-eGFP (السابقين = 488 نانومتر (0.7٪)، م: 455-499 نانومتر). (F) فقط قناة غشاء الكرز (السابقين = 594 نانومتر (37.1٪)، Em = S2: 570-695 نانومتر). (G) دمج LifeAct-eGFP وغشاء الكرز يظهر التداخل في معظم الخلايا. الأبعاد = 425.10 × 425.10. بكسل يسكن 1.58 μs. متوسط خط 4. بت لكل بكسل = 16. البيانات الوصفية المجهر = مجهر مقلوب، 20X الهدف (انظر جدولالمواد) السابقين = 405 نانومتر (2.4٪)، 458 نانومتر (22.0٪)، 488 نانومتر (0.7٪)، 594 نانومتر (37.1٪)، مسار الانبعاثات S1 = 455-499 نانومتر؛ S2 = 570-695 نانومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: يظهر فحص ابيضاض ضوئي التدهور السريع لـ mRNA الكهربائي خلال الساعات الخمس الأولى بعد الكهرباء. يتم إجراء تبييض الصور من منطقة 100 ميكرومتر مربع تحتوي على خلايا كهربائية مع mRNA التعبير عن H2B-السترين في 45 دقيقة، 2 ساعة، و 5 ساعة بعد الكهربائي. تم تصوير الجنين على فترات زمنية منتظمة بعد تبييض الصور (3 أو 5 دقائق). ظروف تبييض الصور هي كما يلي: 70٪ 405 نانومتر الليزر، 100 التكرارات، حوالي 5 دقائق مدة للمنطقة بأكملها. شريط مقياس 50 = ميكروم.(A-A'') 45 دقيقة قبل وبعد التبييض. B يظهر الجنين مباشرة بعد تبييض الصور وC يظهر الجنين 30 دقيقة بعد التبييض. شريط مقياس = 50درجة مئوية . يتم تغيير محيط الساحة لأن الخلايا داخل المنطقة ذات التبييض الضوئي انتقلت قليلا خلال فترة التبييض. (C-C''5 ح قبل وبعد التبييض. (D-D') نفس الصور مثل A-A'' مع سطوع محسن (القيمة القصوى المعدلة إلى 11550 لتعزيز السطوع بعد جمع). (E-E'') نفس الصور مثل B-B'' مع سطوع محسن (القيمة القصوى المعدلة إلى 11550 لتعزيز السطوع بعد جمع). تشير رؤوس الأسهم البيضاء إلى الخلايا التي تحتوي على استرداد الفلورة أعلى من الخلايا المحيطة. يشير رأس السهم السماوي إلى خلية مبيضة ضوئيًا خضعت مؤخرًا لـ mitosis. (F-F'') نفس الصور مثل C-C'' مع سطوع محسن (القيمة القصوى المعدلة إلى 11550 لتعزيز السطوع بعد جمع). الأبعاد = 425.10 × 425.10 × 42 درجة مئوية. بكسل يسكن 1.58 μs. متوسط خط 4. بت لكل بكسل = 16. البيانات الوصفية المجهر = مجهر مقلوب، 20X الهدف (انظر جدولالمواد) السابقين = 488nm (1.5٪)، الانبعاثات المسار S1 = 508-553 نانومتر الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: التحديد الكمي لانتعاش الفلورة في الخلايا المبيضة ضوئياً. (أ) تم تتبع كثافة الفلورة لجميع الخلايا داخل المناطق المبيضة (~ 35 خلية) لكل خلية واحدة خلال كل فترة بعد التبييض. هناك انخفاض كبير في معدل كثافة الإشارة المستردة من 45 دقيقة إلى 2 ساعة، تليها انخفاض أصغر من 2 ساعة إلى 5 ح. يتم عرض شريط الخطأ العلوي لكل نقطة، والذي يمثل الانحراف المعياري عن المتوسط. الخط المعروض هو خط انحدار خطي. R² لمدة 45 دقيقة و2 ساعة و5 ح هي 0.83 و0.58 و0.84 على التوالي. يظهر النصف العلوي من شريط الخطأ لكل نقطة. (ب) تم تتبع كثافة الفلورة لجميع الخلايا داخل المناطق المبيضة (~ 35 خلية) لكل خلية واحدة خلال كل فترة بعد التبييض ورسم بياني دون تطبيع. هناك انخفاض كبير في معدل كثافة الإشارة المستردة من 45 دقيقة إلى 2 ساعة، تليها انخفاض أصغر من 2 ساعة إلى 5 ح. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيلم تكميلي 1: mRNA الكهربائي يؤدي إلى التعبير البروتين في وقت سابق من dna electroporation. H2B-سيترين ميرنا وH2B-mKate2 الحمض النووي الكهربائي في ectoderm من الجنين HH5. المنطقة المصورة هي على حدود الأنسجة الجنينية والجنينية. شريط مقياس = 50درجة مئوية (أ) كل من H2B-السترين وH2B-mKate2 قناة تظهر (السابقين = 488 نانومتر (15٪)، 594 نانومتر (5.0٪)، Em: 499-562 نانومتر؛ S2: 605-661 نانومتر). (ب) فقط قناة mRNA H2B-السترين المعروضة (السابقين = 488 نانومتر (15٪)، Em = 499-562 نانومتر). (ج) فقط H2B-mKate2 قناة الحمض النووي المعروضة (السابقين = 594 نانومتر (5.0٪)، Em = 605-661 نانومتر). الأبعاد = 850.19 × 850.19 × 110 درجة مئوية. بكسل يسكن 2.55 μs. متوسط خط 4. بت لكل بكسل = 16. البيانات الوصفية المجهر: مجهر مقلوب، 20X الهدف (انظر جدولالمواد) السابقين = 488 نانومتر (15٪)، 594 نانومتر (5.0٪)، الانبعاثات المسار S1 = 499-562 نانومتر؛ S2 = 605-661 نانومتر. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الفيلم التكميلي 2: الكهروبورة المشتركة من mRNAs يسمح سلوكيات الخلية متميزة لدراستها ديناميكيا. التوسع شعاعي للخلايا بين الحدود الجنينية وغير الجنينية يتم الكهربائي مع mRNA (H2B-السترين وmTurquoise2-Golgi) وتصور أثناء الهجرة إلى الخارج. تم تصوير هذا الفيلم بواسطة الفحص المجهري البؤري من 2 إلى 5 ساعات بعد الكهرباء عن طريق التصوير كل 6 دقائق.  (أ) كل من H2B-السترين وmTurquoise2-Golgi القنوات المعروضة (السابقين = 458 نانومتر (28٪)، 488 نانومتر (5.0٪)، Em = 446-526 نانومتر؛ S2: 508-553 نانومتر). (ب) فقط قناة H2B-السترين المعروضة (السابقين = 488 نانومتر (5.0٪)، Em = S2: 508-553 نانومتر). (ج) فقط mTurquoise2-Golgi قناة تظهر (السابقين = 458 نانومتر (28٪)، Em = 446-526 نانومتر). الأبعاد = 425.10 × 425.10 × 32.5 درجة مئوية. بكسل يسكن 0.79 μs. متوسط خط 4. بت لكل بكسل = 16. بيانات تعريفية مجهر = مجهر مقلوب، هدف 20x (انظر جدولالمواد) السابقين = 458 نانومتر (28٪)، 488 نانومتر (5.0٪)، مسار الانبعاثات S1 = 446-526 نانومتر؛ S2 = 508-553 نانومتر. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذا البروتوكول، قدمنا تعليمات خطوة بخطوة حول كيفية الحقن المجهري على وجه التحديد وmRNA الكهربائي في خلايا أجنة السمان الغاز. لقد أثبتنا أن الكهربة المركبة في المختبر تسمح بالتعبير السريع والفعال عن بروتينات الفلورسنت (FPs) في أجنة السمان الغازية(الشكلان 2 و3). ويمكن الكشف عن الفلورة من بروتين H2B-السترين المترجمة من mRNAs الكهربائي عن طريق الفحص المجهري البؤري في غضون حوالي 20 دقيقة وزيادة في الفلورة FP لساعات (الشكل3، الفيلم التكميلي 1). هذا هو سريع من المستغرب وعلى مقربة من الوقت النضج المفترض للسترين32،33. تم الكشف عن FPs معبرا عنها من ناقلات الحمض النووي بعد 2-3 ح (الشكل3، تكميلية. الفيلم1)، وهو مماثل للتقارير السابقة8،34،35. العديد من الملوثات الحرة لها أوقات النضج فريدة من نوعها، لذلك فإن التخطيط المتقدم سوف يضمن أن يتم اختيار FP المثالي من حيث التمييز الطيفي وحركية النضج المطلوبة للتجربة. بالإضافة إلى ذلك، فإن mRNAs توليفها أكثر كفاءة الخلايا الجنينية المشتركة عبر من ناقلات الحمض النووي11. وينتج عن زيادة كفاءة التغوط في المقاطعات نقل المزيدمن الخلايا في المنطقة ذات الأهمية مع واحد (الشكل 2) أو مجموعات متعددة من mRNAs (الشكل4).

الاستقرار من mRNA هو منظم للغاية ويمكن أن تتأثر تعدد الإنكار، الربط، والترجمة، والهيكل الثانوي، والمناطق غير المترجمة على سبيل المثال لا الحصر36،37. نصف عمر كل من الرنا الذاتية وتوليفها داخل الخلايا يمكن أن تختلف من دقائق إلى أيام36،38. استخدمنا في انتعاش الفلورة في الجسم الحي بعد تبييض الصور (FRAP) لتبييض البروتينات الموجودة MRNA ترميز H2B-السترين ولاحظنا الانتعاش الفلوري H2B-السترين الأكثر وضوحا خلال أول 2 ساعة بعد الكهربائي (الشكل5 و 6).سوف mRNAs مختلفة بلا شك لها نصف عمر مختلفة على أساس طولها، والتسلسلالداخلي، 5 ' و 3 ' التعديلات36،37، لذلك يجب أن يكون كل مكتوما إذا رغبت في ذلك.

التصوير الحيوي يتطلب عادة المفاضلة بين الظروف المثلى للتصوير عالي الجودة والتصوير السريع الأقل سمية39،40. عند التصوير، من المستحسن استخدام قدرة الليزر المنخفضة قدر الإمكان لتقليل ابيضاض الصور والتلف الضوئي للخلايا الجنينية (انظر الملاحظات للخطوة 5.3 من البروتوكول)40. تغيير إعداد المجهر لمجموعات سريعة (على سبيل المثال، أسرع سرعات المسح الضوئي، أقل متوسط) في كثير من الأحيان يمكن أن تساعد دون فقدان دقة الصورة اللازمة41. وأخيراً، ينبغي توخي الحذر في التعامل مع الأجنة ومعالجتها أثناء الحصاد والكهرباء والتصوير (انظر الخطوة 4). الأجنة في مرحلة مبكرة حساسة ويمكن أن تتلف بسهولة.

بشكل عام، يسمح التوقيت الدقيق والتوطين الدقيق لـ mRNA بالكهرباء بتجارب الاضطراب التي تستفيد من التعبير السريع، وكفاءة الانسياق المشترك، والاضمحلال السريع لنصوص mRNA. ويمكن تحقيق الإفراط في التعبير أو سوء التعبير عن جين ذي أهمية من خلال الكهربة لـ mRNAs المركبة. المعايرة بالتركيز لكل ميرنا أمر بالغ الأهمية، كما الكهربائي أكثر من اللازم mRNA قد يسبب سمية خلوية غير محددة، في حين أن القليل جدا ً من الحمض النووي الريبي قد لا تسمية الخلايا المطلوبة أو التغيرات الفينوتية بشكل كاف. وهناك عدد كبير من النواقل المتولدة للتوليف في المختبر من mRNAs التي ترميز علامات الانصهار FP للتصور أو تغيير المنتجات الجينية لاضطرابات العمليات البيولوجية المتنوعة موجودة بالفعل من مختلف نظم النماذج الحيوانية. العديد من هذه المنشآت المصممة لتوليف mRNA في المختبر يمكن الحصول عليها بسرعة وبتكلفة زهيدة من مستودعات بلازميد غير ربحية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح ليعلنوا عنها.

Acknowledgments

نشكر ديفيد هاس على أفكاره المفيدة في هذا العمل. وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل مؤسسة روز هيلز زمالة البحوث الصيفية (2016-2018) وزمالة البحوث تحت التخرج USC لM.T.، وجائزة التدريب الداخلي معهد سابان للبحوث ما قبل الدكتوراه إلى دكتوراه، وجامعة جائزة برنامج شركاء البحوث الجامعية في جنوب كاليفورنيا إلى R.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BamHI-HF New England Biolabs R3136L
BglII New England Biolabs R0144S
BsrG1-HF New England Biolabs R3575S
NotI-HF New England Biolabs R3189L
SalI-HF New England Biolabs R3138L
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol Thermo Fisher 15593031
SP6 mMessage Machine in vitro transcription kit Thermo Fisher AM1340
Fast Green FCF Sigma Aldrich F7252
Triton X-100 Sigma Aldrich 93443 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether
DAPI Sigma Aldrich D9542 2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride, 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI dihydrochloride
Whatman No.1 filter paper Sigma Aldrich WHA1001125
glycerol Sigma Aldrich G9012
Urea Sigma Aldrich 51457
pmTurquoise2-Golgi Addgene 36205 pmTurquoise2-Golgi was a gift from Dorus Gadella (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205)
pmEGFP-N1-LifeAct Nat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722
pCS2.Lifeact-mGFP Addgene This paper
pCS.H2B-citrine Addgene 53752 pCS-H2B-citrine was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752)
pCS.memb-mCherry Addgene #53750 pCS-memb-mCherry was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750)
Zeiss LSM-780 inverted microscope Carl Zeiss Microscopy GmbH The LSM-780 is a confocal and multi-photon microscope that offers the sensitivity required for vital imaging work. Equipped with a motorized stage, an autofocus device, and a full stage-top blackout incubator, the 780 is an excellent microscope for high-end live cell/embryo imaging. The high-sensitivity 32-channel Quasar detector allows for spectral imaging, linear unmixing, and high color count (>4) image acquisition. Excitation can be performed with 6 lines single photon lasers (405, 458, 488, 514, 564 and 633 nm), Chameleon (Coherent) 2-photon laser (range from 690nm to 1000nm), and run with ZEN 2011 SP7 (Black) system software.
CUY-21 EDIT in vivo electroporator Bex Co., Ltd.
Platinum flat square electrode, side length 5 mm Bex Co., Ltd. LF701P5E
Olympus MVX10 FL Stereo Microscope Olympus LifeScience
XM10 Monochrome camera Olympus LifeScience
Phosphate-Buffered Saline (PBS) for HCR (10×, pH 7.4) To prepare 1 L of a 10× stock solution, combine 80 g of NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g of KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4 g of Na2HPO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich S3264), and 2.7 g of KH2PO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich P9791). Adjust the pH to 7.4 with HCl, and bring the final volume to 1 L with ultrapure H2O. Avoid using CaCl2 and MgCl2 in PBS for HCR. It is important that the PBS for HCR is prepared as an RNase-free solution (e.g., via diethylpyrocarbonate [DEPC] treatment).
1.37 M NaCl
27 mM KCl
80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4
PBS/Triton Add 1 mL of Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) and 100 mL of 10× PBS to 890 mL of ultrapure distilled H2O. Filter the solution through a 0.2 μm filter and store it at 4 ?C until use.
1× phosphate-buffered saline (PBS) (DEPC-treated; pH 7.4)
0.1% Triton X-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO Journal. 1, (7), 841-845 (1982).
  2. Potter, H. Electroporation in biology: methods, applications, and instrumentation. Analytical Biochemistry. 174, (2), 361-373 (1988).
  3. Shillito, R. D., Saul, M. W., Paszkowski, J., Muller, M., Potrykus, I. High-Efficiency Direct Gene-Transfer to Plants. Bio-Technology. 3, (12), 1099-1103 (1985).
  4. Cui, C., Rongish, B., Little, C., Lansford, R. Ex Ovo Electroporation of DNA Vectors into Pre-gastrulation Avian Embryos. CSH Protocol. 2007, (24), 4894 (2007).
  5. Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nature Protocol. 3, (3), 419-426 (2008).
  6. Voiculescu, O., Stern, C. D. Manipulating Gene Expression in the Chick Embryo. Methods Molecular Biology. 105-114 (2017).
  7. Chuai, M., et al. Cell movement during chick primitive streak formation. Developmental Bioliogy. 296, (1), 137-149 (2006).
  8. Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Developmental Dynamics. 229, (3), 433-439 (2004).
  9. Momose, T., et al. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Developmental, Growth and Differentiation. 41, (3), 335-344 (1999).
  10. Nakamura, H., Watanabe, Y., Funahashi, J. Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation. Developmental, Growth and Differentiation. 42, (3), 199-201 (2000).
  11. Teddy, J. M., Lansford, R., Kulesa, P. M. Four-color, 4-D time-lapse confocal imaging of chick embryos. Biotechniques. 39, (5), 703-710 (2005).
  12. Green, M. R., Maniatis, T., Melton, D. A. Human beta-globin pre-mRNA synthesized in vitro is accurately spliced in Xenopus oocyte nuclei. Cell. 32, (3), 681-694 (1983).
  13. Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods in Molecular Biology. 770, 55-75 (2011).
  14. Luni, C., et al. High-efficiency cellular reprogramming with microfluidics. Nature Methods. 13, (5), 446-452 (2016).
  15. Bugeon, S., et al. Direct and efficient transfection of mouse neural stem cells and mature neurons by in vivo mRNA electroporation. Development. 144, (21), 3968-3977 (2017).
  16. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5, (7), 605-607 (2008).
  17. Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes and Development. 8, (12), 1434-1447 (1994).
  18. Krieg, P. A., Melton, D. A. Functional messenger RNAs are produced by SP6 in vitro transcription of cloned cDNAs. Nucleic Acids Research. 12, (18), 7057-7070 (1984).
  19. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, (1), 49-92 (1951).
  20. Eyal-Giladi, H., Kochav, S. From cleavage to primitive streak formation: a complementary normal table and a new look at the first stage of the development of the chick. I. General morphology. Developmental Biology. 49, 321-337 (1976).
  21. Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. Developmental stages of the Japanese quail. Journal of Anatomy. 216, (1), 3-15 (2010).
  22. Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental Dynamics. 220, (3), 284-289 (2001).
  23. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neurosciences. 14, (11), 1481-1488 (2011).
  24. New, D. A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 3, 320-331 (1955).
  25. Drake, C. J., Davis, L. A., Hungerford, J. E., Little, C. D. Perturbation of beta 1 integrin-mediated adhesions results in altered somite cell shape and behavior. Developmental Biology. 149, (2), 327-338 (1992).
  26. Sato, Y., et al. Dynamic analysis of vascular morphogenesis using transgenic quail embryos. PLoS ONE. 5, (9), e12674 (2010).
  27. Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Current Biology. 8, (7), 377-385 (1998).
  28. Uetrecht, A. C., Bear, J. E. Golgi polarity does not correlate with speed or persistence of freely migrating fibroblasts. European Journal of Cell Biology. 88, (12), 711-717 (2009).
  29. Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell. 5th edition, Garland Science. (2007).
  30. Arndt-Jovin, D. J., Jovin, T. M. Fluorescence labeling and microscopy of DNA. Methods Cell Biol. 30, 417-448 (1989).
  31. Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Luminescence digital imaging microscopy. Annu Rev Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).
  32. Heikal, A. A., Hess, S. T., Baird, G. S., Tsien, R. Y., Webb, W. W. Molecular spectroscopy and dynamics of intrinsically fluorescent proteins: coral red (dsRed) and yellow (Citrine). Proceedings of the National Academy of Science U S A. 97, (22), 11996-12001 (2000).
  33. Iizuka, R., Yamagishi-Shirasaki, M., Funatsu, T. Kinetic study of de novo chromophore maturation of fluorescent proteins. Analytical Biochemistry. 414, (2), 173-178 (2011).
  34. Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mechanism of Development. 121, (9), 1137-1143 (2004).
  35. Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations. Developmental Biology. 233, (1), 13-21 (2001).
  36. Meyer, S., Temme, C., Wahle, E. Messenger RNA turnover in eukaryotes: pathways and enzymes. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 39, (4), 197-216 (2004).
  37. Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure. Annual Review in Genetics. 50, 235-266 (2016).
  38. Harland, R., Misher, L. Stability of RNA in developing Xenopus embryos and identification of a destabilizing sequence in TFIIIA messenger RNA. Development. 102, (4), 837-852 (1988).
  39. Lippincott-Schwartz, J. The long road: peering into live cells. Nature Cell Biology. 12, (10), 918 (2010).
  40. Sato, Y., Lansford, R. Transgenesis and imaging in birds, and available transgenic reporter lines. Development Growth & Differentiation. 55, (4), 406-421 (2013).
  41. Goldman, R. D., Spector, D. L. Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics