Login processing...

JoVE Journal
Developmental Biology

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Developmental Biology

Snabb och effektiv uttryck av flera proteiner i aviär embryon med hjälp av mRNA elektroporation

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Journal (Developmental Biology)

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Journal (Developmental Biology)

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using Chick^GFPNeural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Click here for the English version

Snabb och effektiv uttryck av flera proteiner i aviär embryon med hjälp av mRNA elektroporation

Article DOI: 10.3791/59664-v

June 7th, 2019 •

Martin Tran¹, Mohit Dave^2,3, Rusty Lansford^1,2,3

¹Department of Biological Sciences, University of Southern California, Los Angeles, ²Department of Radiology and Developmental Neuroscience Program, Saban Research Institute, Children's Hospital Los Angeles, ³Keck School of Medicine, Department of Radiology, University of Southern California, Los Angeles

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

June 7th, 2019

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Vi rapporterar Messenger RNA (mRNA) elektroporation som en metod som möjliggör snabb och effektiv uttryck för flera proteiner i vaktel embryo modellsystem. Denna metod kan användas för att fluorescerande etikettceller och registrera deras in vivo rörelser av Time-lapse mikroskopi kort efter elektroporation.

Transcript

mRNA-elektroporation ger ett snabbt, effektivt, och rumsligt och tidsmässigt kontrollerat uttryck av flera proteiner inom aviär modellsystemet. Denna metod möjliggör ett bredare och snabbare uttryck för fluorescerande proteiner än den märkning som uppnås genom standard-DNA-elektroporation. Elektroporation underlättar övergående öppning av porer i plasmamembranet som fungerar som ledningar för överföring av genetiska nyttolaster som RNA och DNA till cellerna i många modellorganismer.

För de inledande experimenten arbetar med embryon som är äldre än en dag gammal eftersom de är härdigare och mer motståndskraftiga mot yttre manipulationer som elektroporation. Vid lämpligt embryonalt utvecklingsstadium försiktigt bryta och häll vaktel ägg innehållet i en 10 centimeter Petriskål. Använd en överföringspipett för att ta bort majoriteten av det tjocka albumet.

Använd ett labb vävnad för att försiktigt torka ytan av oket för att ta bort de återstående tjocka albumen runt embryot för att säkerställa att embryot kommer att hålla tätt till pappersringen. Låg precut filterpapper över embryot och använda sax för att smidigt skära runt omkretsen av embryot. Använd en Pasteur pipetter för att lager PPS under embryot med hjälp av mjuka strömmar för att utrymma något ok som fastnar på vävnaden.

Dra långsamt embryot papper ringen i en sned vinkel upp och av oket. Placera papperet i en petriskål fylld med PBS för vidare rengöring. När de flesta av oket har tagits bort, placera embryot ventrala sidan upp i en 35 millimeter Petriskål täckt med en halvsammad blandning av agar och albumen.

Förbered elektroporationskammaren genom att ansluta den svarta elektroden som fyller den med PBS och placera embryot inuti. Använd en mikrokapillär av glas för att injicera en bolus av 200 nanoliter mRNA i hålrummet mellan epiblast och vitellinemembranet som täcker den önskade regionen. Och sedan använda den röda elektroden för att elektroportera embryot.

Placera det elektroporerade embryot tillbaka till agar-albumen-blandningen och inkubera i 38 grader Celsius tills det önskade utvecklingsstadiet. För avbildning av elektroporation-kodade fluorescent proteiner observera alla elektroporerade embryon under en fluorescerande dissekera stereoscope att välja den friskaste och bästa elektroporerade embryot för den dynamiska imaging experiment. Fortsätt att ruva de andra elektropläterade embryona och icke-elektropläterade embryon i en separat inkubator.

Skölj kortfattat det valda embryot med PBS för att avlägsna eventuella bubblor som kan ha bildats på embryots ryggsida under elektroporationen. Placera det rengjorda embryot direkt i en avbildningsskål som innehåller ett tunt lager av cirka 150 mikroliter albumen-agar och är noga med att inte generera några bubblor på embryots ryggyta. Lägg till en liten fuktig hoprullad bit av mjukpapper längs insidan kanterna av avbildning skålen.

Täta skålen med paraffinfilm för att minimera avdunstning under bildtagningen och inkubationen. Flytta skålen snabbt till det förkrigstidens stadium av ett konfokalmikroskop och använd brightfield-kanalen för att lokalisera det färgade färgämnet i embryot. Ställ in bildhanteringsprogrammet till det önskade målet, dikroisk spegel och emissionsspektra, och slå på en lämplig laser.

Var försiktig så att cellerna kommer att förbli i bilden vision för hela filmen. Använd en tillräckligt hög bildåtergivningsupplösning, och se till att bildförhållandena inte kommer att orsaka fototoxicitet. Klicka på Live i bildhanteringsprogrammet och justera lasereffekten till en inställning som är lämplig för fluorescensintensiteten beroende på varje mikroskoplaserkraft.

Börja avbilda embryot med 1%laserkraft och en 800 vinst, öka lasereffekten långsamt med 1%steg tills mättade pixlar ses. När mättade pixlar observeras minska lasereffekten något tills inga mättade pixlar kan visualiseras. Bild embryot var tredje till femte minut för att kontrollera migrationen av enskilda celler över olika tidpunkter med hjälp av fem mikrometer Z-stackar av hela elektropläterade området med lite extra utrymme mot botten av Z-stacken om embryot sjunker in i agarosbädden under bildbehandlingssessionen.

För att observera hur snabbt cellerna rör sig kontrollera de första tidpunkterna i den första filmen. Om cellerna rör sig i snabb takt kan du överväga att utöka zoomen för det avbildade området eller avbilda en annan region. När hela elektropläterade regionen av embryot har avbildats, bild i unelectroplated regionen av samma embryot att bestämma autofluorescens nivåer.

För att bestämma hur länge transfekterad mRNA kan översättas till fluorescerande proteiner efter att ha bekräftat elektroporation av genen av intresse på stereomikroskopet, placera embryot på ett förvärmt stadium av det inverterade konfokalmikroskopet och använd 405 nanometerlasern med en 70%lasereffekt, 100 iterationer, och en skanningshastighet på fyra till fotobleach större delen av den cellulära fluorescensen från den galvaniserade genen vid en mängd olika tidpunkter. Fortsätt att ruva embryona på scenen i 36 grader Celsius efter foto blekning, var noga med att uppmärksamma de aktivt dela celler inom den fotoblekta regionen som vanligtvis bara ses i friska embryon och därmed visar att elektroporationen inte skada embryonala celler. Förvärva post-bleka Z-stack bilder av den elektropläterade regionen för en önskad tid på regelbundna tre till fem minuters tidsintervall.

För att säkerställa att bildförhållandena inte skadligt påverkar embryots överlevnad samtidigt inkubera elektropläterade embryon som inte är fotobleached att fungera som en kontroll för bildåtergivningen. För att kvantifiera fotoblekningsresultaten för mRNA-sönderfallsanledningsanvationen Användning ImageJ för att mäta fluorescensintensiteten hos en 7,5 mikrometercirkel i mitten av det elektropläterade området i varje cell för att spåra cellens fluorescens över varje tre till fem minuters intervall. När alla celler i den fotoblekta regionen som inte genomgår mitos och har varit helt fotobleached har mätts, rita fluorescens intensitet över tiden post-blekmedel vid varje tidpunkter embryot var fotobleached.

Även om DNA-elektroporation leder till en ljusare fluorescens i vissa elektropläterade celler, är effektiviteten hos DNA-elektroporation synbart lägre jämfört med de allmänt uttryckta mRNA-kodade fluorescerande proteiner. Vid jämförelse av DNA och mRNA co-electroporation inom samma embryo är dna som uttrycker fluorescerande proteineffektivitet också betydligt och konsekvent mindre effektivt än det hos det mRNA som uttrycker fluorescerande protein. Kvantifiering av alla embryon som elektroplats med endast mRNA, DNA eller en kombination av de två, avslöjar att mRNA-transfekter cirka 75%av cellerna i en viss region, medan DNA endast transfects cirka 25%av cellerna.

Den transfekterade mRNA bör leda till en snabbare proteinproduktion jämfört med transfekterat DNA eftersom mRNA omedelbart kan kännas igen av cytosolic översättningsmaskineri. Även om co-electroporation av flera DNAs har tidigare visat sig vara relativt ineffektiva, co-electroporation av fyra mRNAs i detta experiment resulterade i en 87%transfection effektivitet av alla fyra mRNAs inom alla de galvaniserade regionerna. Även om photobleaching minskar initialt fluorescens intensiteten i de photobleached cellerna med ca 95%vissa celler kvar som återvinner deras förmåga att dela och uttrycka fluorescerande proteiner strax efter elektroporation.

Denna kapacitet minskar över fem timmar post-electroporation emellertid. Ta dig tid att optimera de bästa bildförhållandena och fortsätt att mixtra även efter att ha startat filmen är redo att göra några justeringar om det behövs.

X

Simple Hit Counter