胸腔内注射治疗成年斑马鱼心脏的研究

Biology
 

Summary

这种方法依赖于在成年斑马鱼的胸部注射0.5-3Μl 溶液。该程序有效地将蛋白质和化合物输送到斑马鱼心脏附近, 而不会损害器官。该方法适用于检测外源因素对心脏各组织的影响。

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Bise, T., Jaźwińska, A. Intrathoracic Injection for the Study of Adult Zebrafish Heart. J. Vis. Exp. (147), e59724, doi:10.3791/59724 (2019).

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Abstract

成年斑马鱼心脏为心脏再生研究提供了一个强有力的模型。虽然该系统的强度是基于转基因方法, 外源因素的快速传递提供了一个互补的技术, 在功能研究。在这里, 我们提出了一种方法, 依靠给药几个微升的溶液到心包腔, 而不造成心肌损伤。胸腔内 (IT) 注射可以有效地将蛋白质和化合物直接输送到心脏表面。注射物质通过心外膜扩散到底层心脏组织中。与腹腔注射 (IP) 相比, 胸腔内注射的主要优势是在目标器官上集中给药检测因子。将分子直接输送到心包是研究成虫斑马鱼心脏预处理和再生的合适策略。

Introduction

在脊椎动物中, 斑马鱼拥有显著的能力再生他们的心脏1,2。这种能力已在几个损伤模型中被报道, 即心室先端切除, 细胞损伤 (ci) 和基因心肌细胞消融3,4,5,6, 7.侵入性损伤后, 受损的心室壁被纤维化组织短暂愈合, 并逐渐被新的心肌8,9,10,11所取代。早期伤口愈合反应包括心外膜激活和免疫细胞的吸收12,13, 14,15。同时, 受伤心肌附近的心肌细胞在30-90天内被激活、分化、增殖并逐步取代受伤区域161718,19. 由于有遗传工具, 如细胞谱系追踪分析、诱导基因过度表达, 在破译心脏再生的分子和细胞机制方面取得了重大进展,荧光组织记者行, 和 crispr/cas9 基因诱变20,21

我们最近建立了一个模型的心脏预处理成人斑马鱼胸腹 22,23。预处理增加了心脏保护基因的表达, 并提升了完整和再生心脏中重新进入细胞周期的能力。这些过程与免疫细胞的招募和基质重塑 22,24有关。对预处理的机制了解甚少, 需要建立新技术来促进这一研究领域。特别是, 优化管理分泌信号蛋白或其他化合物是必不可少的进一步研究这一主题。

斑马鱼是水生动物, 通过它们的刺和皮肤自然地吸收溶解在水中的各种物质。这为通过将鱼浸泡在具有多种化学物质的溶液中进行非侵入性药物输送提供了可能性, 如药理抑制剂、类固醇激素、他莫西芬、BrdU 和抗生素。事实上, 来自包括我们的 252627实验室在内的各种实验室的许多研究都利用了这种方法, 这种方法在再生生物学领域特别有价值。28. 然而, 这种方法不适合提供具有有限组织渗透性的多肽、dna、rna、吗啡或分子。在这些情况下, 通过微注射到体内实现更有效的分娩, 例如, 将毛细血管插入眼眶后静脉窦, 插入腹腔内或腹腔内的腹腔或腹腔内腔 29,30, 31岁在这里, 我们描述了胸腔内注射少量溶液的程序, 作为研究成年斑马鱼心脏再生和预处理的合适方法。

Protocol

瑞士弗里堡州兽医办公室批准了以下议定书中描述的动物护理和所有动物程序。

1. 注射工具和解决方案

  1. 根据图 1A, 使用针拉器拉适应微注射的硼硅酸盐玻璃毛细血管。存放在一个9厘米的培养皿与模拟粘土或胶带的铁轨毛细血管。
  2. 使用普通剪刀, 切一块海绵 (7 厘米 x 3 厘米 x 1 厘米), 并雕刻在它的中间像鱼一样的轮廓。
  3. 用测试的蛋白质或其他化合物制备注射溶液的小等价物。根据测定结果调整其浓度, 稀释 1x Hanks 平衡盐溶液 (HBSS) 中的物质, 辅以10% 的苯酚红。
    请注意:在这里, 检测的蛋白质浓度为 100 ngml。
  4. 制备缓冲毛胺麻醉剂的库存溶液, 在980毫升蒸馏水中溶解4克毛滴虫。使用 1 M Tris-HCl ph 值9将 pH 值调整为 7.0-7.4, 并将水灌满 1, 000 毫升。将溶液存放在4°c 的黑暗中。
  5. 为了获得麻醉剂的工作浓度, 在烧杯中加入 1-2 mL 的滴虫溶液, 加入50毫升的鱼水。
    请注意:三胺麻醉剂的工作浓度应在使用前新鲜制备。

2. 注塑站的准备工作

  1. 使用顶部的光线打开立体显微镜, 并将放大倍率调整为16x。
  2. 用鱼水浸泡海绵, 将其放置在显微镜舞台上的9厘米培养皿上, 并调整对焦。
  3. 在立体显微镜下, 使用虹膜切除剪刀将微毛细管的末端切割在离基础 ~ 7 毫米的地方, 如图 1a 所示。理想的尖端直径为 ~ 20μm。
    请注意:以斜切毛细血管的尖端是最好的插入组织。
  4. 将微毛细管插入微喷射器装置的针座。
  5. 使用微装载机尖端, 加载控制溶液 (例如, 1x HBSS) 来设置注射压力, 以获得适当的流量范围在0.3Μls/s 和0.5Μls/s 之间。
  6. 将注射溶液的选定体积 (例如, 在 1x HBSS 中稀释的睫毛神经营养因子 [CNTF]) 加载到毛细血管的尖端 (图 1 b)。毛细管中不应该有气泡。
    请注意:注射溶液的最大体积取决于鱼的大小。对于 2.5-3 厘米的标准长度 (从鼻孔到尾花梗的距离), 防止胸腔外露肿胀和出血的最大注射量被确定为 5μl (图 1F)。更大的体积可以注射到更大的鱼身上。

3. 胸腔内注射鱼的制备

  1. 用渔网捕捉成年斑马鱼 (dadio rerio), 并将其转移到麻醉液中。
  2. 1-2分钟后, 当鱼停止游泳, 并减少了的运动, 用塑料勺子触摸鱼, 以确保它不会对任何接触反应。
  3. 快速, 仔细地将鱼与勺子转移到湿海绵的凹槽, 与腹侧向上。鱼的头应该指向远离操作人员的主导手。

4. 微注射心包

  1. 在立体显微镜下, 仔细观察跳动的心脏在鱼的皮肤下的运动。直观地确定跳动的心脏上方和腹侧软骨板所定义的三角形中间的注射点 (图 1D)。在相对于身体轴的30-45°角插入毛细管的尖端 (图 1e)。用微毛细血管的尖端轻轻地将皮肤穿透心包 (图 1c)。一个最佳的入口点更接近腹部, 而不是头部。
    请注意:不要将毛细血管插入身体和心脏太深, 因为这会对器官造成伤害。在心脏穿刺的情况下, 针头通常充满血液。如果发生这种情况, 去除毛细管, 并排除从实验中的鱼。
  2. 一旦针头在心包内, 通过按微喷射器装置的踏板完成注射。
    请注意:注意不要把空气注入胸腔。
  3. 注射后, 轻轻地从胸腔中取出毛细管, 并立即将鱼转移到装有系统水的水箱中进行回收。
  4. 监测鱼, 直到从麻醉完全恢复。
  5. 在所需的时间点收集心脏, 并为进一步分析做好准备。
    请注意:如果鱼在30秒内没有恢复鱼的运动, 用塑料移液器将水挤压到子中, 使鱼复活。

Representative Results

胸腔内注射后, 可以分析外源性溶液的效果。为此, 根据先前公布的协议32,33, 鱼应该被安乐死, 心脏应该被收集、固定和组织学处理。

为了验证该方法, 我们首先通过注入彩色染料和荧光染料进行了两个测试实验。首先, 我们对鱼类进行安乐死, 死后将3Μl 墨水注入胸腔。5分钟后收集心脏, 用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 清洗, 固定在2% 福尔马林, 用 PBS 清洗, 并在显微镜下拍照。其次, 我们在体内注射3μgl 为 1μml 4 ', 6-二胺-2-苯基 (DAPI), 并在2小时后固定心脏。在这两种检测中, 全身性分析都显示了整个心脏的标签, 包括心室、心房和动脉统膜 (图 2a,b)。这些结果揭示了注射溶液在心脏表面的有效传播。

将外源物质输送到成年鱼体内注射的常用方案是腹腔内 (IP) 注射。为了比较 IT 与 IP 注射对心脏研究的适用性, 我们使用这两种方法注射了类似数量的 DAPI, 并在5分钟和120分钟后固定心脏 (图 3 a)。用在心肌中贴上 f-肌动蛋白标签的 Phalloidin alsea fluor (AF) 568 对心脏进行切片和染色。在两个时间点, IP 注射后的心脏中没有观察到 dapi 阳性细胞 (图 3b)。相比之下, IT 注射导致心肌中存在 dapi 标记的细胞核 (图 3B)。这些结果表明, 与 IP 注射相比, IT 注射改善了化合物在心脏的传递。

为了测试这种方法是否适合心脏再生研究, 我们对心室进行了损伤 8, 并在冷冻损伤后3天和 7天 (DPCI) 进行了 3ΜML dpci 和 1μgml phalloidin AF649 的 it 注射 (图 4a)。在注射后 1小时, 用 phalloidin AF568 采集、固定、切片和染色, 以显示完整的心肌。我们发现, 心肌和受伤的组织都含有大量的 DAPI 阳性细胞, 这表明这种染料有效地渗透到完整的心脏和纤维化组织 (图 4b)。此外, 注射的脂肪素 AF649 也加入心肌细胞的伤害周围区和一些招募成纤维细胞的损伤区。本实验表明, 这些药物可以穿过心外膜, 渗透到下心肌。

在测试了使用染料进行 IT 注射的效率后, 我们分析了注射蛋白对心脏的影响。我们合成了一种名为 CNTF 的细胞因子, 它在开胸24后被切开术。我们研究了外源 CNTF 对各种过程的影响, 即心肌细胞增殖、细胞外基质沉积、免疫细胞招募和心肌保护基因表达。我们发现, 所有这些生物方面都是通过 CNTF 的 it 注射激活的, 与控制免疫球蛋白 (图 5)24相比。这些结果表明, 胸腔内注射的方法为有针对性地传递蛋白质提供了一个合适的策略, 以研究它们在各种检测中对不同心脏组织的影响。

Figure 1
图 1: 成年斑马鱼的胸腔内注射.(A) 带长丝 (6 ", 直径 1.0 mm) 的拉微注射毛细管的照片和所使用的针拉器程序的值。(B) 用含有10% 苯酚红的2.5 微米溶液填充的长丝 (6 ", 直径 1.0 mm) 的拉微注射毛细管的照片。针的拉扯的尖端是最大地7毫米长。(C) it 注射程序的原理图表示。(D) 资讯科技注射程序的照片。对这一数字已由 Bise 等人 24人修改。C 和 D 面板中的数字与程序的相同步骤相对应: (1) 鱼被放置在加湿海绵上的腹侧。穿刺部位 (三角形中的红点) 位于胸部中心, 靠近刺。(2) 将针头浸入心包。红点表示穿刺部位。(3) 通过观察红色溶液在心包腔中的扩散情况来监测注射情况。(E) 资讯科技注射计划。注射毛细管与体轴之间的角度应在30°至45°之间, 以避免心脏穿刺。(F) 资讯科技注射指定体积后1小时内的鱼胸照片。白色箭头指向再连接组织, 这可能表明内出血。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: it 注入的解决方案几乎均匀地分布在心脏表面.(A) 使用 2.5μl HBSS 或2.5μl 墨水进行尸检信息技术注射的鱼整个心脏的立体显微镜图像。墨水染色的心室 (V), 心房 (A) 和球状动脉 (Ba) 的表面。刻度棒 = 300μm. (b) 使用 HBSS 和 3ΜGML dapi 注射的鱼的整个心脏的明亮场和荧光立体显微镜图像。IT 注射后不久, 心脏部位就检测到 DAPI 荧光。刻度栏 = 300μm. 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 将 DAPI 传递到心脏的两种注入方法的比较.(A) 实验设计方案。腹腔内 (IP) 和胸腔内 (IT) 注射的剂量相同, 为 1μml DAPI (3Μl)。注射后5分钟和120分钟收集心脏。(B) 用荧光法洛伊丁 (红色) 染色的心脏部分的共聚焦显微镜图像, 这些图像可以标记肌肉纤维。注入的 DAPI 在以绿色显示的适当通道中可视化。IP 注入后, 在任何时间点都不会在心脏中检测到 DAPI。IT 注射后, DAPI 阳性细胞在两个时间点后都存在于心室中。刻度栏 = 500μm. 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: it 注射研究心脏再生.(A) 实验设计方案。在冷冻损伤后3天和 7天, DAPI 和 phalloidin AF649 的混合物被 it 注射 (3μl 的 1μgml)。在 IT 注射1小时后收集心脏, 用 phalloidin AF568 (红色) 固定、切片和染色。(B) 3 和 7 dpci 纵向心脏切片的共聚焦显微镜图像。注入 DAPI (绿色) 和 phalloidin AF649 (蓝色) 标记细胞的受伤区域 (由白色虚线分隔) 和完整的心肌 (红色染色)。白色箭头指向 DAPI (绿色) 分布通过完整的紧凑和小梁肌膜和心外膜。刻度栏 = 500μm. 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5: 外源性信息注射 CNTF 刺激心脏的几个生物过程.(A) 实验设计方案。首先, 将含有 250 ng 斑马鱼 CNTF 或控制免疫球蛋白 (hIgG) 的溶液2.5Μl 注射到表达心肌细胞中核 DsRed2 的转基因鱼类的心包中。在注射后7天和1天采集心脏, 并分别用免疫荧光和原位杂交进行分析。(B-D)控制室切片和 cntf 注射心脏的共聚焦显微镜图像。(B) 对细胞周期标记、微染色体维持复合物 5 (MCM5; 绿色) 进行免疫染色, 显示出更多的增生心肌细胞对外源性 CNTF 的反应。标度棒 = 500μm. (c) 对胶原蛋白的免疫染色 xii 显示 CNTF 注射后心肌中胶原蛋白的沉积十二增加。在控制心脏, 胶原蛋白十二仅限于心外膜34。标度棒 = 500μm. (d) 对免疫细胞标记 l-类质蛋白进行免疫染色, 检测到 CNTF 注射鱼体内免疫细胞的招募增强。用反义 mRNA 探针对心脏保护因子囊抑素进行原位杂交后的心室横截面的明亮场显微镜图像显示这种基因在心脏中的转录性上化注射 cnt 的鱼。刻度杆 = 500μm。对这一数字已由 Bise 等人 24人修改。请点击这里查看此图的较大版本.

Discussion

在这里, 我们描述了一种将外源化合物和蛋白质输送到心包腔的方法, 以研究它们对成年斑马鱼心脏的影响。这个过程是基于胸腔内注射, 导致在器官附近提供少量的溶液。该技术是为研究心脏预处理和再生而开发和描述的。

这个过程中的关键步骤是玻璃毛细血管进入胸腔。这一步取决于三个参数, 即: 毛细管尖端的刚性和锐度、穿透角度和穿刺部位。为了优化通过皮肤的渗透, 毛细血管的拉部分不应该太长, 因为这样的针头太灵活, 与皮肤接触弯曲。为了避免这种情况, 可以通过减少与虹膜切除剪刀的尖端大小来调整刚性。虽然穿透角度可以在30°和45°之间变化, 但它可以适应尖端的刚度。事实上, 一个薄的尖端将穿透皮肤更好地与一个较窄的角度。

为了优化针头的穿透, 插入部位应紧邻跳动的心脏上方。心脏穿刺的风险通常在5% 至8% 之间。针插入心脏后部会增加心脏穿刺的风险, 如强化出血所示。在这种情况下, 应该将动物从实验中删除。

IT 注射过程中的另一个问题发生在毛细管水平。的确, 当侧向力施加在毛细管时, 毛细管就会断裂。为了避免这种情况, 针头必须沿注射轴直线移动。有时, 毛细血管会被阻止液体流动的组织残留物阻断。注射时轻轻拔下针头, 可将针头解开。如果这不能改善流量, 我们建议将针头完全从胸腔中取出, 更换针头。

病变可能是由心包插入太深的针引起的。为了避免心包囊的病变, 针头不得插入过多 (1-2 毫米) 到胸腔。当注射量大于8μl 时, 观察到一些泄漏。

在斑马鱼中, 心包液的确切成分尚不清楚。然而, 心包腔的体积估计为 ~ 10μl31。鉴于成年斑马鱼心室的体积约为1-2 毫米3, 我们假设心包腔相应地具有微小的体积, 这必须在注射前考虑。从我们的初步研究中, 我们确定, 对于 2.5-2.8 厘米 (从鼻子到尾端花梗的距离) 的鱼类, 注入体积的最佳范围在0.5 至3Μl 之间。此体积可根据鱼的大小进行调整。注射高达5μl 不会在这种大小的鱼身上引起任何病变。然而, 从8μl 的体积足以引起鼓胀和内出血, 如图1F 所示。根据这些数据, 我们估计超过3μl 的溶液量可能会对器官造成物理和生理压力。这种限制推断需要选择更高浓度的分子, 而不是增加注入溶液的量。

另一个重要因素是注入溶液的渗透特性, 应在生理范围内。事实上, 为了避免渗透压力的风险, 我们建议 HBSS 作为注射介质。

在斑马鱼中, 常用的药物输送方法是通过水处理和腹腔注射30,35。尽管这两种技术都适用于许多应用, 但 IT 注射通过降低不想要的系统性副作用的风险和减少昂贵分子的使用, 分别提供了实验和经济优势。该方法适用于应用他莫西芬激活用于细胞谱系追踪分析的 CRE-ERT2 转基因系统, 并指导改进后的 Rna 在再生研究中的功能研究。

斑马鱼的 it 注射方法已被描述为31,36。在这些报告中, 胸腔内注射是用胰岛素针进行的, 从前面刺穿。相反, 我们的协议提出了一个替代策略与拉玻璃毛细血管插入后向。具体而言, 我们的方法考虑到鱼心包的解剖结构, 以优化注射与降低心脏穿刺的风险。此外, 在手术过程中, 鱼不是用金属钳固定的, 而是用潮湿柔软的海绵固定的, 这是一种更合适的方法, 可以避免鱼受到任何外部伤害。因此, 该方法可能更适合于研究成虫的心脏稳态、预处理和再生。

已经在哺乳动物模型生物中建立了信息技术注射。事实上, 这种方法也已应用于猪的实验和人类的临床研究 37,38。在小鼠中, 超声引导下的经胸心肌内注射已被用来挑战他们的心脏39。在本文中, 我们提出了一个详细的协议, 以方便使用 IT 注射斑马鱼。这将是特别有价值的领域, 以补充遗传方法在心脏稳态, 预处理和再生研究。

Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

我们感谢 V. ZCNTF 提供的出色技术援助和对鱼类护理的努力, D. König (弗里堡大学) 对手稿的批判性解读, D. Kressler (弗里堡大学) 感谢对 zCNTF 蛋白质合成的帮助, F. Ruggiero (Génomique 研究所)用于提供 ColXII 抗体的 fontionnelle de lyon) 和 P. Martin (布里斯托尔大学) 的 l-血浆抗体。我们感谢弗里堡大学的成像核心设施和蛋白质组学平台。这项工作得到了瑞士国家科学基金会 (赠款编号 310030 _ 179213) 和瑞士心脏基金会 (Schweizerische Herzstiftung) 的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hanks Balanced Salt Solution Gibco by Life technology 14065-056
Iridectomy scissor Roboz Surgical Instruments Co RS-5602
Macroscope (binocular) M400 with Apozoom
Micro-injector femtojet Eppendorf 5247 0034 77
Microloaders femtotips Eppendorf 5242 956.003
Micropipette glass needles type C WPI TW100F-6 thin-wall capillary
Micropipette puller model P-87 Flaming/Brown 20081016 filament box 2.5 mm x 4.5 mm
Sponge any any dim. carved sponge 7cm x 3 cm x 1 cm
Tricaine (Anestethic) Sigma E10521
Dyes and Antibodies Company Catalog Number Comments
anti-Chicken Cy5 Jackson ImmunoResearch Laboratories Concentration: 1/500
anti-Guinea pig Cy5 Jackson ImmunoResearch Laboratories Concentration: 1/500
anti-Rabbit Cy5 Jackson ImmunoResearch Laboratories Concentration: 1/500
Chicken l-plastin gift from P. Martin, Bristol Concentration: 1/1,000
DAPI Sigma 10236276001 Concentration: 1/2,000 (1µg/ml); 1/100 IT injected
Guinea pig anti-ColXII gift from Florence Ruggerio, Lyon Concentration: 1/500
Phalloidin-Atto-565 (F-actin) Sigma 94072 Concentration: 1/500
Phalloidin-Atto-647 (F-actin) Sigma 95906 Concentration: 1/50 IT injected
Rabbit anti-MCM5 gift from Soojin Ryu, Heidelberg Concentration: 1/500
Stamping Ink 4K Pelikan 1 4k 351 197 Concentration: 1/1
ISH probe primers
Cystatin gene number: ENSDARG00000074425
fw primer: GATTCACTGTCGGGTTTGGG
Rev primer: ATTGGGTCCATGGTGACCTC

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