Mätning av spermie vägledning och motilitet inom Caenorhabditis elegans hermaphrodite reproduktions organen

Developmental Biology
 

Summary

Spermier måste framgångs rikt navigera genom utväxande att gödsla en oocyte. Här beskriver vi ett test för att mäta spermie migration i C. elegans hermafrodit livmodern. Denna analys kan ge kvantitativa uppgifter om spermie distribution i livmodern efter parning, liksom på hastighet, riktnings hastighet, och återföring frekvens.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Hu, M., Legg, S., Miller, M. A. Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract. J. Vis. Exp. (148), e59783, doi:10.3791/59783 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Framgångs rik befruktning är grundläggande för sexuell reproduktion, men lite är känt om de mekanismer som vägleder spermier till oocyter inom den kvinnliga fortplantnings organen. Medan in vitro-studier tyder på att spermier av internt gödande djur kan reagera på olika led trådar från sin omgivning, oförmågan att visualisera sitt beteende i den kvinnliga fortplantnings organen skapar en utmaning för att förstå spermier migration och mobilitet i den egna miljön. Här, vi beskriver en metod med C. elegans som övervinner denna begränsning och drar nytta av deras transparenta epidermis. C. elegans hanar färgade med ett mitokondriskt färg ämne paras med vuxna hermafroditer, som fungerar som modifierade Honor, och insättning fluorescensmarkerade märkt sperma i hermafrodit livmodern. Migrationen och motiliteten hos de märkta spermierna kan sedan spåras direkt med hjälp av ett Epi-fluorescensmikroskop i en levande hermafrodit. I vild-typ djur, cirka 90% av den märkta spermier krypa genom livmodern och nå befruktningen platsen, eller spermatheca. Bilder av livmodern kan tas 1 h efter parning för att bedöma fördelningen av spermier i livmodern och andelen spermier som har nått spermatheca. Alternativt kan tids fördröjnings bilder tas omedelbart efter parning för att bedöma spermie hastighet, riktnings hastighet och återförings frekvens. Denna metod kan kombineras med andra genetiska och molekyl ära verktyg tillgängliga för C. elegans för att identifiera nya genetiska och molekyl ära mekanismer som är viktiga för att reglera spermie vägledning och motilitet inom den kvinnliga fortplantnings organen.

Introduction

De molekyl ära mekanismer genom vilka spermier (kallas spermier) navigera genom den kvinnliga fortplantnings organen mot oocyt är inte väl förstått, men är grundläggande för sexuell reproduktion. Spermie motilitet är mycket dynamisk och beror på robusta kommunikations signaler som förändrar spermie hastighet och riktad motilitet1,2,3,4,5,6 , 7 för att , 8 , 9 för att , 10 , 11 för att , 12. C. elegans har blivit en kraftfull modell för att studera spermie rörelse in vivo eftersom hermafrodit är transparent epidermis tillåter spårning av levande spermier vid encellig upplösning2,3, 8,10. Syftet med detta dokument är att tillhandahålla metoder för att bedöma spermie rörelser inom C. elegans hermafrodit livmodern.

I djur arter där sperma och äggcell möts i den yttre miljön (dvs., acquatiska miljöer), reagerar spermier på kemotaktiska signaler som utsöndras av oocyter. Dessa signaler styra riktningen av spermie rörelse, föra dem närmare signal källa4,6,11. Men mycket mindre är känt om spermie rörelse hos arter som gödsla internt. En stor utmaning är uppbyggnaden av den kvinnliga fortplantnings organen, som är otillgänglig för mikroskopi i de flesta arter. In vitro-studier på människor, möss och svin, till exempel, ge belägg för att subpopulationer av spermier kan reagera på chemoattractants, vätske flöde, och termiska gradienter1,5,7,9, med 12. Med dessa system, oförmåga att visualisera och spåra spermie rörelse in vivo platser allvarliga begränsningar på strategier för att upptäcka de viktigaste mekanismerna som reglerar dessa funktioner.

För att övervinna dessa begränsningar har vi utvecklat metoder som använder Nematoden C. elegans för att direkt visualisera spermier efter insemination, för att mäta individuella spermie migration parametrar in vivo, och för att mäta förmågan hos en spermie population att rikta gödsel platsen. Dessa metoder, tillsammans med C. elegans molekylär och genetisk verktygs låda, under lätta upptäckten av kemiska signal molekyler och molekyl ära maskiner som reglerar spermie motilitet beteenden. Till exempel kan genetiska skärmar utföras i hermafroditer eller hanar för att identifiera gener som är nödvändiga för effektiv spermie rörelse in vivo13. Molekyler kan injiceras i hermafrodit gonaden att testa för effekter på spermier aktivering, migration hastighet, och riktad motilitet3. Dessutom kan de beskrivna metoderna användas för att övervaka oseriösa spermier migration till ektopisk organ platser och för att utvärdera spermier konkurrens10,14.

C. elegans finns i naturen som hermafroditer och hanar (se figur 1). Den hermafrodit gonaden har två U-formade armar som är spegel bilder av varandra. De mest proximala köns cellerna (dvs. cellerna nära spermatheca) genomgår en spermatogenes under det larvstadium L4. Varje primär spermatocyter går in i meios och producerar fyra haploida spermatider. Dessa spermatider skjuts in i nektar tillsammans med den första mogna äggcell och genomgå spermiogenesis15. Adult hermafroditer byta från spermatogenes till oogenesis. Oocyter mogna i en monterings linje mode längs gonaden, med de mest mogna äggcell i proximala änden av gonaden, bredvid spermatheca. MSP signaler från spermier behövs för att utlösa meiotiska mognad och ägg lossning16,17. Hane C. elegans, å andra sidan, har en J-formad gonad som producerar endast spermier. Spermatiderna lagras i sävvesikeln. Vid parning med hermafrodit eller hona, infogar hanen balkar nära svansen i vulva. Spermatider aktive ras under utlösning, när de kommer i kontakt med sädesvätskan18. C. elegans spermier simma inte eftersom de inte flagellated. Istället, de krypa genom fortplantnings organen, med hjälp av pseudopod för förflyttning. Det är väl etablerat att manliga spermier, som är större i storlek, har en konkurrens för del över hermafrodit spermier14.

I denna metod, hane C. elegans fungera som spermie donator och paras till vuxna hermaprhodites. Vuxna män är färgade med en fluorescerande mitokondriell färg till producerade märkta spermier. När de har deponerats genom hermafrodit vulva måste sperman krypa runt embryona i livmodern mot spermatheca, eller befruktning plats. Den genomskinliga epidermis av C. elegans modellen möjliggör direkt visualisering av varje enskild sperma som navigerar genom kvinnliga fortplantnings organen. Under de senaste åren har vårt labb framgångs rikt använt denna metod för att demonstrera vikten av en klass av F-seriens prostaglandiner i väg LED ande spermier från vulva till nektar19,20. De molekyl ära mechansierna som styr dess syntes av hermafrodit och reaktionen från sperman är fortfarande under utredning. Men denna metod för att bedöma spermie rörlighet och migration underlättar avsevärt identifieringen av de viktigaste aktörerna som kontrollerar spermier och äggcell kommunikation i internt befruktande djur. Följande protokoll beskriver steg för steg hur du utför denna analys.

Protocol

Obs: alla steg i detta protokoll utförs vid rums temperatur (~ 20-22 ° c) eller i konstanta temperaturinkubatorer inställda på 16 ° c eller 20 ° c. Man och hermafrodit C. elegans odlas med hjälp av standard odlings förhållanden och NA22 eller OP50 E. coli som födo källa21,22. Vildtyps-N2 hermafroditer och fog-2 (Q71) hanar används i proceduren nedan.

1. dag 1: plockning L4 steg hermaphrodites för parning

  1. För att uppnå konsekventa resultat bör alla hermafroditer synkroniseras som aktivt reproducera vuxna. Plocka 20-30 L4 steg hermafroditer till en 6 cm seedade tallvedsnematoden tillväxt medium (NGM) tallrik. Inkubera hermafroditerna vid 20 ° c för 28-30 h.
    Anmärkning: Endast 12-15 hermafroditer kommer att användas för parning. De resterande hermaphroditesna är överskott.

2. dag 1: färgning av hanar med fluorescerande mitokondriell färg ämne (Mito-Dye)

  1. Gör en manlig färgning plattan genom att placera en prick av E. coli (mat prick) i mitten av en oseedade NGM plattan. För att göra maten prick, Använd slutet av ett glas omrörning stav att skrapa E. coli från bakterier gräs mattan av en seedad tallrik och deponera den på oseedade plattan. Pricken ska vara ~ 5-7 mm i diameter.
  2. Blanda 2 μL 1 mM Mito-Dye (se material tabell) i DMSO och 10 μl M9-buffert (3 g av KH2Po4, 6 g av na2HPO4,5g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O till 1 L. Lägg till MgSO4 efter autoklavering). Pipettera hela Mito-färglösningen på mat punkten på den manliga Färgnings plattan. Låt plattan torka i mörker (~ 30 min).
    Anmärkning: Mito-Dye är ljus känsligt. Skydda alla lösningar, plåtar och maskar som innehåller Mito-Dye från ljus. Förvara 1 mM lager vid-20 ° c.
  3. Välj ~ 100 1-3 dag gamla vuxna män23 till Mito-Dye fläckig mat prick på den manliga färgning plattan. Linda plattan i aluminiumfolie och inkubera över natten vid 16 ° c. För parning, Använd ~ 50-60 hanar per 12-15 hermaphrodites. Om mer än ~ 100 hanar behövs, göra mer infärgning plattor för att förhindra överbeläggning av hanar.
    Anmärkning: Hanar kan också färgas genom inkubering i en 10 μM Mito-färglösning i M9 buffert för 3 h på ett urglas. Håll maskarna täckta för att förhindra avdunstning och ljus exponering. Efter 3 h, Använd en Pasteur Pipettera att överföra hanar på en 10 cm seedade NGM tallrik. Överför så lite av Mito-färglösningen som möjligt. Linda plattan i aluminiumfolie och inkubera över natten i 16 ° c.

3. dag 2: parning

  1. Plocka färgade hanar från dag 1 på en ny, seedade NGM plattan. Lämna plattan i mörkret tills parning. Detta steg säkerställer att överskott Mito-Dye färgade bakterier runt hanarna avlägsnas. Carryover av överdriven Mito-Dye färgade bakterier på parnings plattan kan färga hermafrodit vävnad.
  2. Gör en parnings platta genom att släppa 2 μL av en tjock E. coli -blandning på en oseedad NGM-platta. Låt de tjocka bakterierna torka för att göra parnings punkten. Hanar och hermafroditer kommer att överföras till denna punkt för parning. För att göra tjocka e. coli, snurra ner 3 ml över natten e. coli och återsuspendera bakterien pellet i 1 ml M9. Denna blandning kan förvaras vid 4 ° c och återanvändas i upp till 6 månader.
    Anmärkning: E. coli -lösningens tjocklek kan justeras. Om lösningen är för tunn, kan hanar krypa bort från parnings punkten i stället för att aggreera på den för parning. Parnings punkter gjorda av en E. coli soluton som är för tjock kan minska parnings effektiviteten.
  3. Medan parnings plattan från steg 3,2 torkar, blanda 300 μL av 1% (w/v) Tricaine (Tri), 300 μL av 0,1% (w/v) Tetramisole (tet), och 900 μL av M9.
    Anmärkning: Lagra 1% (vikt/volym) Tricaine och 0,1% (w/v) Tetramisole som alicitationstecken vid-20 ° c. Undvik upprepad frysning Tina.
  4. Överför 600 μL av tet/Tri-lösningen till ett urglas.
  5. Överför 12-15 hermafroditer som plockats på dag 1 till tet/Tri-lösningen i klock glaset. Inkubera i 30 min för att immobilisera hermafroditerna. Håll klock glaset täckt för att förhindra att tet/Tri-lösningen avdunser.
    Anmärkning: Det är viktigt att hermafroditer bedövas i minst 30 min. mindre tid kan resultera i en rörlig mask under bild förvärv, som kan stör med avbildning.
  6. Medan hermafroditer är inkuberande, plocka 50-60 färgade hanar från steg 3,1 på parnings punkten (steg 3,2). Förvara plattan i mörker tills steg 3,8.
  7. Efter 30 min inkubation i tet/Tri lösning, Använd ett glas Pasteur Pipettera att överföra immobiliserade hermafroditer från klock glaset på en oseedade NGM tallrik. Ta bort så mycket vätska som möjligt och låt överskotts vätskan torka.
    Anmärkning: Låt inte hermaphroditerna torka överdrivet. Så snart all synlig vätska har avdunsta, börja nästa steg.
  8. Överför de sövda hermafroditerna från den oseedade NGM-plattan till parnings punkten med de färgade hanarna. Inkubera i mörkret i 30 minuter så att hanarna kan para sig med hermaphroditerna.
  9. Efter parning i 30 min, montera hermafroditer omedelbart för Time-lapse Imaging eller överföra hermafroditer på en ny, seedade NGM plattan för att vila i 1 h före avbildning.
    Anmärkning: Time-lapse videor av hermafrodit livmodern används för att kvantifiera spermie hastighet och återföring frekvens. Stillbilder av livmodern tas 1 h efter parning används för att kvantifiera spermie distribution, eller Spem vägledning.

4. dag 2: montering maskar för visualisering

  1. Skapa en monterings platta med 2% AGA ros i H2O
    Anmärkning: 2% AGA ros kan göras i bulk, aliciteras i provrör av glas och förvaras vid 4 ° c. Vid behov kan varje alikvot vara mikrad före varje användning och lagras i en värme block för att förhindra att den stelnade.
    1. För att göra monterings plattan, rikta tre glas Mikroskop glider sida vid sida med långa kanter röra. Placera två stycken maskeringstejp ovanpå varandra på båda de yttre glasen. Dessa yttre glas rutsch banor med tejp kommer att fungera som stöd så tjock leken på den resulterande AGA ros pad kommer att vara "två band djup".
    2. Placera ~ 75 μl smält 2% AGA ros på mitten bilden (detta är bilden utan tejp). Placera omedelbart en ny glas Mikroskop glida ovanpå agarose. Denna översta glas rutsch bana bör vara vinkel rät mot de andra bilderna, med varje ände vilar på tejpen av de två stöd bilderna.
    3. Låt AGA ros hårdnar (~ 30 s). Ta försiktigt bort den övre glas bilden genom att skjuta den från Aga ros pad.
  2. Placera 10-15 μl av tet/Tri-lösningen på 2% AGA ros pad. Överför de Parade hermaphroditerna på plattan. Var noga med att överföra så lite bakterier som möjligt.
  3. Placera en täckslip över maskar på AGA ros pad.

5. dag 2: inställning av bild förvärv

Anmärkning: Varje upprätt Mikroskop utrustad med epi-fluorescens, 10x och 60x mål, och en digitalkamera kan användas för att förvärva bilder för spermie distribution. Program vara som kan förvärva tids förfallna bilder krävs för att bedöma spermie hastighet, riktnings hastighet, och återföring frekvens.

  1. Bild förvärv 1 h efter parning
    1. Montera bilden på Mikroskop stadiet. Titta igenom ögat bitar att söka efter maskar på AGA ros pad med 10x mål med den röda fluorescens utsläpp filter (TRITC filter). När en mask har hittats, slå snabbt på fluorescensljuset för att se om masken har parat. Om spermier är synlig i livmodern, växla till 60x mål.
      Anmärkning: Trycket som skapas av 60x mål på täckglasen kan skada vissa ömtåliga maskar, vilket gör att tarmen eller gonaden att extrudera från djuret. Scanning för lyckad parning med hjälp av 10x mål kan minimera maskarnas exponering för det extra trycket. Utsätt inte de Parade maskarna för längre perioder av fluorescerande ljus.
    2. Med differential interferens kontrast Microscopy (dic), placera masken så att både vulva och en nektar är i bild. Fokusera bilden genom att fokusera på spermathecas mitt. Kontrol lera exponeringen för både DIC-och TRITC-kanaler. I DIC bör interna mask strukturer vara tydligt synliga. I TRITC ska enskilda spermier synas som distinkta puncta.
      Anmärkning: Varje bild bör fånga livmodern från vulva till en av spermatheca. Om livmodern är för lång för att få plats på en bild, kan två separata bilder tas. Det är inte nödvändigt att alla bilder tas på samma exponerings nivå. Det är dock viktigt att enskilda spermier kan särskiljas och kvantifieras i fluorescensbilderna.
    3. Förvärva DIC och fluorescens bilder för varje livmoder.
    4. Upprepa steg 5.1.1-5.1.3 tills alla Parade hermafroditer har avbildats.
  2. Spela in video med tids fördröjning
    1. Skanna AGA ros pad och lokalisera hermafroditer som innehåller märkta spermier i livmodern, som beskrivs i steg 5.1.1 och 5.1.2
    2. Konfigurera program varan för att hämta tids fördröjnings bilder i DIC-och TRITC-kanaler. I allmänhet tas tids fördröjnings bilder med 15-30 s intervall för 10-20 min per livmoder.

6. kvantifiering

  1. Kvantifiering av spermie fördelningen på livmoder bilder tagna 1 h efter parning
    1. Börjar med vulva i ena änden och nektar på den andra, dela livmodern i tredjedelar. Dessa kommer att representera de tre zonerna. Zon 1 (Z1) innehåller vulva och Zone 3 (Z3) innehåller spermatheca.
    2. Räkna manuellt antalet spermier i varje tredjedel av livmodern, och rapportera antalet i varje zon som en procent av den totala spermier i hela livmodern. Nedan följer ett exempel.
      Equation
      Obs: ibland måste signalintensiteten för TRITC-kanalbilden justeras så att varje spermie som har fångats i bilden kan vara synlig och kvantifierad.
  2. Spåra spermier i tids fördröjnings bilder
    Anmärkning: I det här dokumentet använde vi NIS-Elements-programvaran för analys. I avsnitten nedan ger vi instruktioner för manuell spårning av spermier med hjälp av denna program vara (steg 6.2.1) samt program varan ImageJ/Fiji med öppen källkod (steg 6.2.2).
    1. Spåra spermier med NIS-element
      1. Öppna filen. nd2 med tids fördröjnings serien som ska spåras. För att börja spåra, öppna spårnings panelen genom att högerklicka i program varan och välja analys kontroller | Och spårning.
      2. Välj definiera ny ROIi spårnings panelen. Definiera varje intresse område (ROI) genom att klicka över varje spermie som ska spåras. En färgad markering visas över den valda spermierna. Klicka på Slutför när alla Rois har valts.
      3. När ROIs har identifierats flyttar du till nästa bild ruta i tids fördröjnings serien. Dra ROI-markören till den nya positionen för spermierna i bilden. Fortsätt att göra detta tills sperman inte längre kan spåras. Streckade linjer visas som förbinder var och en av de platser som ROI-markören har placerats genom alla bild rutor i tids fördröjnings bilden.
        Anmärkning: Endast spermier i zon 2 bör spåras som spermier i zonerna 1 och 3 tenderar att röra sig i ett cirkulärt mönster även hos vildtyp djur.
      4. Exportera alla kvantifierbara data (t. ex. Sök vägens längd, tid, XY-position osv.) från den spårade sperman till ett Excel-dokument genom att klicka på Exportera på spårnings panelen.
    2. Spåra spermier med Fiji
      1. Konvertera TRITC-kanalbilderna i tids fördröjnings serien till TIF-filer. Spara alla filer från en serie till en mapp.
      2. Importera bilderna till Fiji med hjälp av import funktionen BioFormats. Importera bilder från en tids fördröjnings serie som en hyperstack.
      3. Öppna TrackMate i Fiji24 via plugins | Spårning | Manuell spårning med TrackMate. En diaglogue låda kommer att öppnas.
      4. Välj verktyget TrackMate i Fiji verktygsfält. Dubbelklicka på spermier som kommer att spåras. En grön cirkel med streckade linjer visas. Denna cirkel kan flyttas genom att klicka innanför cirkeln och dra till önskad position. Storleken på denna cirkel kan ändras genom att samtidigt trycka på Alt -tangenten och rulla musen.
      5. När spårarens storlek och position har ställts in klickar du på cirkeln igen. De streckade gröna linjerna kommer att förvandlas till en fast grön linje. Tryck samtidigt på SKIFT -och L -tangenterna för att aktivera spårnings läget. Detta kommer att anges i Fiji verktygsfält.
      6. Flytta till nästa bild ruta i tids fördröjnings serien. Om du vill ställa in den nya platsen för den spårade spermierna i den nya ramen håller du mus pekaren över den nya punkten och trycker på A -tangenten. Tracker kommer nu att visas på den nya platsen, och en linje kommer att visas ansluter de platser där tracker har placerats i föregående bild rutor.
      7. När spåren har slutförts klickar du på analysera i dialog rutan trackmate för att generera de data som behövs.
    3. För att beräkna hastigheten, dividera den totala väg längden för spermierna med förfluten tid.
    4. För att beräkna vectorial hastighet, dra en linje genom livmodern med början från vulva pekar mot spermatheca. Mät avståndet som sperman har migrerat längs denna linje från början till slutet av spåret. Dividera detta avstånd med förfluten tid. Negativa värden indikerar att spermierna har migrerat bort från spermatheca.
    5. För att registrera återförings frekvens, räkna antalet gånger under vilka spermie spårningen har genererat en vinkel som är mindre än 90 ° under tre på varandra följande tid-lapse ramar.

Representative Results

För att generera de resultat som skildras i detta papper, var dimma-2 (Q71) hanar fläckade med Mito-Dye och parad med vildtyp, N2 hermaphrodites. Figur 2 innehåller ett övergripande system för metoden, inklusive mask beredning, parning och analys. Som Movie 1 visar, den vuxna hermafrodit reproduktiva tarm kanalen har två armar som är spegel bilder av varandra. Vid parning, märkta spermier deponeras i hermafrodit livmodern genom vulva. Spermierna röra sig runt utveckla embryon i livmodern mot spermatheca, där de lagras tills befruktningen. Som köns celler i den vuxna hermafrodit utvecklas till oocyter, skjuts den proximala, mest mogna äggcell in i nektar via skida cell contrations. Befruktning sker medan äggcell är i spermatheca.

För att kvantifiera spermie distribution och migration genom kvinnliga fortplantnings organen, är hermafrodit livmodern uppdelad i tre zoner (film 1, figur 3a). Zon 1 spänner över den första tredjedelen av livmodern, med början från vulvan. Zon 2 spänner över den mellersta tredjedelen av livmodern, och Zone 3 spänner över den sista tredjedelen av livmodern och inkluderar spermatheca. Ordentlig spermie vägledning med vildtyp, N2 hermafroditer och fog-2 (Q71) hanar bör resultera i cirka 90% av den märkta spermier når spermatheca, eller zon 3 (figur 3b).  Matings som resulterar i för få (figur 3c, mindre än 10-15 spermier) eller för många (figur 3D, livmoder fylld med spermier) spermier i livmodern bör inte räknas. I matningar som resulterar i mindre än 10-15 spermier, 3-4 oseriösa spermier kan kraftigt skeva data. På samma sätt, när livmodern fylls helt med spermier, spermier kan inte migrera på lämpligt sätt. Spermier kan tyckas spridda över hela livmödrar av vissa mutanter som visar dålig spermie vägledning fenotyp. Men i detta fall, spermier bör inte fylla varje skreva i livmodern, som kan ses i figur 3D. Kvantifiering av varje arm i gonaden anses vara ett prov, eller ett n.

Tids fördröjnings bilder tas för att kvantifiera spermie hastighet och återförings frekvens. Endast spermier i zon 2 ska spåras (figur 4a) eftersom spermierna i zonerna 1 och 3 (film 1) tenderar att röra sig i ett cirkulärt mönster även inom djur av vildtyp. Tid-laspe bilder tagna på 15-30 s intervall används vanligt vis för att spåra spermier. Endast spermier som kan följas i följd ramar för mer än 2.5-3 min kvantifieras. I figur 4b-Muppfyller spermierna markerade med de röda och blå prickarna detta kriterium, medan spermierna markerade med den gröna pricken inte. Därför kvantifieras de värden som definieras i figur 4N för spermierna markerade med de röda och blå prickarna (figur 4o), medan de för spermiernas markerade med den gröna pricken inte kvantifierades.

Figure 1
Figur 1: tecknad av den vuxna C. elegans hermafrodit och manliga. Stora reproduktiva strukturer är märkta i figuren. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: schematiska diagram över prov beredning och data insamling. Hanar färgade med Mito-Dye är Parade till synkroniserade vuxna hermaphrodites. Time-lapse bilder av Parade hermafroditer tas omedelbart efter parning att fånga data för spermie hastighet och återföring frekvens. Stillbilder av Parade hermafroditer tas 1 h efter parning för att bedöma spermie distributionen i livmodern. Se texten för mer information. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: kvantifiera spermie distributionen inom hermafrodit livmodern. (A). Schematisk av C. elegans hermafrodit livmodern. V = vulva, E = embryo, S = spermatheca, O = oocyt, Z1-Z3 = zoner 1-3 används för att mäta spermie utbredning. (B-D). DIC + TRITC slås samman (vänster paneler) och TRITC endast (höger panel) bilder av vildtyp hermafrodit livmödrar 1 h efter parning till fog-2 (Q71) hanar färgas med Mito-Dye. Spermier verkar rött. Gula konturer anger placeringen av spermatheca. Skalbar: 20 μm. Z1, Z2, Z3 kvantifiering i B representerar procent spermier i varje zon ± standard avvikelse. Bilder i C och D representerar matningar som har resulterat i för få (c) eller för många (D) spermier för kvantifiering. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: kvantifiera spermie hastighet och reversering frekvens under migration genom livmodern. (A). dic + TRITC-sammanfogad bild av en hermafrodit livmoder som innehåller fluorescerande spermier (röd). V = vulva, gul = spermatheca, Z1-Z3 = tre zoner i livmodern, svart låda: zon 2. (B-M). TRITC-kanalbilder med tids fördröjning inzoomade i zon 2 (svart ruta i A). Bilder förvärvades med 20-intervaller. 3 enskilda spermier spårades i varje bild (röd, grön och blå prickar). Färgade prickar i panelen M representerar sökvägen till varje sperma från B-L. Skalbar = 20 μm. (N). ekvationer och definitioner för spermie hastighet, vektor hastighet och återförings frekvens. (O). hastighet, vectorial hastighet och återföring frekvens av spermier spåras i panelerna B-L av röda och blå prickar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Movie 1
Film 1: film av spermie rörelse och migration. En vildtyp hermafrodit parades med dimma-2 (Q71) hanar färgas med Mito-Dye. Filmen är en sammansatt av tids fördröjnings bilder tagna med varierande tidsintervall. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)

Discussion

Möjligheten för spermier att navigera den invecklade kvinnliga fortplantnings organen och hitta oocyter är avgörande för sexuell reproduktion. Nyligen genomförda studier med hjälp av sperma från internt befruktande djur tyder på att de aktivt reagera på olika miljömässiga signaler, inklusive kemiska signaler, vätske flöde och temperaturgradienter1,5,7, 9 för att , 12. dessa observationer har dock till stor del resulterat från in vitro-experiment och lite är känt om spermie beteende och kommunikation inom fortplantnings organen. Ett av de största hindren för att förvärva in vivo data om spermie migration och motilitet är bristen på synlighet inom de flesta kvinnliga reproduktiva Tracts. Den metod som vi har beskrivit här med hjälp av C. elegans övervinner denna begränsning. Som representativa resultat visar, möjliggör den transparenta epidermis för direkt visualisering och spårning av varje sperma vid enkel cell upplösning i en levande, intakt organism.

C. elegans har två kön. Hanarna, med en XO genotyp, producerar endast spermier, och i denna metod, används som spermie donatorer. Hermafrodit, med en XX genotyp, är modifierade Honor. Deras gonader först genomgå spermatogenes under den fjärde larv scenen och byta till oogenesen i vuxen ålder25. Denna analys använder vuxna hermaphrodites, vars reproduktiva vävnader ger en modell för den kvinnliga fortplantnings organen. Utnyttjandet av båda könen i denna analys gör att vi kan identifiera genetiska och molekyl ära vägar i både manliga och kvinnliga som kan reglera spermie vägledning och motilitet. Kombinerat med hela den mängd genetiska och molekyl ära tekniker som finns tillgängliga för C. elegans, kan denna metod leda till nya insikter i spermie migration och motilitet samt sperma-och oocytkommunikation.

Några viktiga steg i detta protokoll motiverar ytterligare överväganden, utöver de uppgifter som anges i avsnittet protokoll.

Maskar
fog-2 (Q71), him-5 (e1490), eller honom-8 (e1489) Mutant hanar kan användas i stället för N2 hanar. Dessa mutationer ökar frekvensen av män i kulturer, men påverkar inte manliga parning eller spermier funktioner13. Honor, såsom fog-2 (Q71) Honor, kan användas i stället för hermaphrodites. Emellertid, Honor måste vara pre-Parade med män för att möjliggöra korrekt äggcell utveckling. Närvaron av befruktade embryon från denna pre-parning garanterar också att livmodern är tillräckligt lång för att korrekt bedöma spermie distributionen. Om muterade eller experimentella hermaphroditer bedöms, inkludera en kontroll grupp (er). Till exempel bör muterade hermafroditer paras ihop med vildtyp N2 hermafroditer som en kontroll för andra variabler i analysen. Hermaphrodites som har utfodrats med bakterier som innehåller plasmider för RNA interferens analyser bör också matas med bakterier som innehåller Tom vektor kontroll. Avståndet från vulva, där spermier insemineras, till spermatheca, befruktningen platsen, kan variera beroende på antalet ägg i livmodern (dvs. livmodern expanderar med ökande ägg nummer). Om jämförelser mellan genotyper görs, Välj hermafroditer vars livmödrar innehåller liknande antal ägg. Välj inte hermafroditer som innehåller kläcknings embryon eller rörliga larver. En tids kurs kan utföras för att identifiera den optimala ålder vid vilken hermafroditer bör analyseras.

Plockning hermafroditer och hanar
Det är viktigt att hermafroditer plockas för denna analys är inte från igenväxtas eller svalt tallrikar. Mat och feromon Cues modulera uttrycket av DAF-7, en TGFß homolog. DAF-7 vägen har visats reglera syntesen av F-serien prostaglandiner som spelar viktiga roller i att vägleda spermier till nektar20. Plocka hermafroditer från överfulla eller svalt plattor kan resultera i dålig spermie vägledning inte relaterade till målet av intresse. Tätheten av plattorna verkar inte påverka den manliga spermier. Men, män som är för unga eller för gamla kan resultera i minskad parnings effektivitet (dvs, den procent av hermafroditerna på parnings plattan som har tillräckligt med spermier i sin livmödrar att kvantifiera). 1-3 dag gamla vuxna män är optimala för denna analys23.

Anesthetizing hermafroditer
I våra händer, den Tetramisole och Tricaine kombinationen säkerställer att maskar är immobiliserade, och förbli vid liv under parning och bild förvärv. Andra anestetika, såsom natriumazid, kan också användas. Emellertid, natriumazid är mycket giftigt och tillstånd måste standardiseras. Immobilisering tekniker med hjälp av Mikrokulor, agarose, och mikrofluidik kammare rekommenderas inte eftersom de stör parning.

Utvändig färgning
Mito-Dye som används i detta manuskript, MitoTrackerCMXRos, har i stor utsträckning använts för märkning av spermier, liksom andra mitokondrier, i C. elegans. Sperman märkt med detta Mito-Dye är fullt funktionell, behåller sin förmåga att aktive ras, migrera, gödsla oocyter, och producera livskraftiga avkomma26,27. Andra mitokondriella färg ämnen, såsom rodamin 6G och DiOC6 har använts för att färga C. elegans mitokondrier28,29. Emellertid, villkor för dessa färg ämnen måste standardiseras för märkning spermier i denna analys. Förutom mitochrondrial etiketteringsmekanismer, DNA fläckar, såsom Syto17, kan också användas för att märka spermier för migration analyser30. Även om dessa märknings tekniker är relativt enkla och snabba att utföra, kan transgena strategier också användas för att generera spermier som uttrycker fluorescerande Taggar under spermie specifika initiativtagare31,32.

Parning
Parnings punkter som är för tjocka kan minska parnings effektiviteten. Försiktighet bör iakttas för att överföra så lite bakterier som möjligt vid överföring av män och sövda hermafroditer på parnings punkten.

Att göra AGA ros kuddar och placera täckglasen
Luft bubblor kan genereras i AGA ros kuddar. De kan bryta ljus under Bild insamling eller, när tillräckligt stor, orsaka maskar att falla igenom, vilket gör det omöjligt att förvärva bilden (s). Likaså kan luft bubblor skapas längs hermafroditer när täckglasen placeras över dem på AGA ros pad. Dessa bubblor bryter ljuset och leder till minskad bild kvalitet. Övning kommer att bidra till att minska förekomsten av luft bubblor.

Kvantifiering
Vid kvantifiering av spermie fördelningen kan olika z-plan genom livmodern hos en mask ha små skillnader i spermie distributionen. Vi finner att ta en enda bild fokuserad på nektar ger oss reproducerbara resultat som liknar resultat som erhållits genom genomsnitt flera z-sektioner. Vi rekommenderar att fokusera bilden på mitten av spermatheca, men fokalplan kan ändras något baserat på experimenterarens behov. Det är dock viktigt att alla bilder tas på samma sätt. Dessutom är det viktigt att endast spermier som är i fokus räknas. Det är räknarens diskretion när det gäller att fastställa kriterierna för spermier i fokus. Det är dock viktigt att kriterierna tillämpas systematiskt på varje mask som kvantifieras. För spermie spårning, många program erbjuder automatisk spårning kapacitet. Men vi tycker att manuell spårning överträffar program varans automatiska spårningsalgoritm av två huvudsakliga skäl: 1) överflödet av liknande stora kärnor inom det trånga utrymmet gör det svårt för program varan att skilja mellan enskilda spermier och skapa definierade ROIs för varje sperma. 2) som spermier gå in och ut ur fokus, deras intensitet SKIFT, vilket gör det svårt för program varan att hålla koll på spermier under längre tids perioder.

Disclosures

Författarna har inga intresse konflikter.

Acknowledgments

Vi tackar uppriktigt vår sena mentor, Dr Michael Miller, för hans inspirerande och osjälviska mentors Kap och skapandet av denna metod som ett verktyg för att bättre förstå spermier och äggcell kommunikation. Hans plötsliga bortgång har varit en oerhörd förlust för hans familj, hans labb och vetenskaps samfundet. Denna studie stöddes av NIH (R01GM085105 till MAM och F30HD094446 till MH). Innehållet är helt och hållet författarens ansvar och representerar inte nödvändigt vis de officiella åsikterna hos de nationella hälso instituten.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents and Material
60 mm x 15 mm Petri dish Fisher FB0875713A
Agar Fisher BP1423-500
Sodium Chloride Fisher S671-3
Peptone Fisher BP1420-500
Cholesterol Sigma-Aldrich C8667
LB broth, Miller Fisher 1426-2
Escherichia coli strain NA22 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) NA22 Either this or OP50 E. coli can be used for C. elegans maintenance and assay. Both may be purchased at the CGC
N2 CGC N2
fog-2(q71) CGC CB4108
Platinum wire 0.25 mm dia Alfa Aesar 10288
5 3/4" Disposable Pasteur pipet Fisher 13-678-20A
Watch glass Fisher 02-612A
5 mm Dia. Glass rod Fisher 50-121-5269
MitoTracker CMXRos (Mito-dye) Fisher M7512 Shield from light, store at -20 °C
Monopostassium phosphate Fisher P285-500
Disodium phosphate Fisher S374-1
Magnesium sulfate Fisher M63-500
Dimethyl sulfoxide Fisher BP231-1 DMSO
Aluminum foil Fisher 01-213-102
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate Sigma E10521-10G Tricaine is the common name. Store in aliquotes at -20 °C.
Tetramisole hydrochloride Sigma L9756-5G Store in aliquotes at -20 °C
Agarose Fisher BP1356-100
Coverslips Fisher 12-548-A 18 x 18-1
Frosted microscope slides Fisher 12-552-3
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
16 °C and 20 °C incubators Fisher 97-990E Same model, set at different temperatures.
Upright Microscope with epi-fluorescence illuminator, camera, and 10x and 60x objectives Nikon
Software with image acquisition and tracking capabilities Nikon NIS-elements AR
Stereo-microscope Nikon SMZ800N Any stereo-microscope that can be used to visualize C. elegans may be used with this protocol

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boryshpolets, S., Perez-Cerezales, S., Eisenbach, M. Behavioral mechanism of human sperm in thermotaxis: a role for hyperactivation. Human Reproduction. 30, (4), 884-892 (2015).
  2. Edmonds, J. W., McKinney, S. L., Prasain, J. K., Miller, M. A. The gap junctional protein INX-14 functions in oocyte precursors to promote C. elegans sperm guidance. Developmental Biology. 359, (1), 47-58 (2011).
  3. Edmonds, J. W., et al. Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction. Developmental Cell. 19, (6), 858-871 (2010).
  4. Espinal-Enriquez, J., Priego-Espinosa, D. A., Darszon, A., Beltran, C., Martinez-Mekler, G. Network model predicts that CatSper is the main Ca(2+) channel in the regulation of sea urchin sperm motility. Scientific Reports. 7, (1), 4236 (2017).
  5. Hunter, R. H., Nichol, R. A preovulatory temperature gradient between the isthmus and ampulla of pig oviducts during the phase of sperm storage. Journal of Reproduction and Fertility. 77, (2), 599-606 (1986).
  6. Hussain, Y. H., Guasto, J. S., Zimmer, R. K., Stocker, R., Riffell, J. A. Sperm chemotaxis promotes individual fertilization success in sea urchins. Journal of Experimental Biology. 219, (Pt 10), 1458-1466 (2016).
  7. Kantsler, V., Dunkel, J., Blayney, M., Goldstein, R. E. Rheotaxis facilitates upstream navigation of mammalian sperm cells. Elife. 3, e02403 (2014).
  8. Kubagawa, H. M., et al. Oocyte signals derived from polyunsaturated fatty acids control sperm recruitment in vivo. Nature Cell Biology. 8, (10), 1143-1148 (2006).
  9. Miki, K., Clapham, D. E. Rheotaxis guides mammalian sperm. Current Biology. 23, (6), 443-452 (2013).
  10. Ting, J. J., Tsai, C. N., Schalkowski, R., Cutter, A. D. Genetic Contributions to Ectopic Sperm Cell Migration in Caenorhabditis Nematodes. G3. 8, (12), Bethesda. 3891-3902 (2018).
  11. Yanagimachi, R., et al. Chemical and physical guidance of fish spermatozoa into the egg through the micropyledagger, double dagger. Biology of Reproduction. 96, (4), 780-799 (2017).
  12. Zhang, Y., et al. Generation of Gradients on a Microfluidic Device: Toward a High-Throughput Investigation of Spermatozoa Chemotaxis. PloS One. 10, (11), e0142555 (2015).
  13. Hoang, H. D., Miller, M. A. Chemosensory and hyperoxia circuits in C. elegans males influence sperm navigational capacity. PLoS Biology. 15, (6), e2002047 (2017).
  14. Hansen, J. M., Chavez, D. R., Stanfield, G. M. COMP-1 promotes competitive advantage of nematode sperm. Elife. 4, (2015).
  15. L'Hernault, S. W. Spermatogenesis. WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. 1-14 (2006).
  16. Miller, M. A., et al. A sperm cytoskeletal protein that signals oocyte meiotic maturation and ovulation. Science. 291, (5511), 2144-2147 (2001).
  17. Greenstein, D. Control of oocyte meiotic maturation and fertilization. WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. 1-12 (2005).
  18. O'Hagan, R., Wang, J., Barr, M. M. Mating behavior, male sensory cilia, and polycystins in Caenorhabditis elegans. Seminars in Cell & Developmental Biology. 33, 25-33 (2014).
  19. Hoang, H. D., Prasain, J. K., Dorand, D., Miller, M. A. A heterogeneous mixture of F-series prostaglandins promotes sperm guidance in the Caenorhabditis elegans reproductive tract. PLoS Genetics. 9, (1), e1003271 (2013).
  20. McKnight, K., et al. Neurosensory perception of environmental cues modulates sperm motility critical for fertilization. Science. 344, (6185), 754-757 (2014).
  21. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments. (47), (2011).
  22. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. 1-11 (2006).
  23. Chatterjee, I., et al. Dramatic fertility decline in aging C. elegans males is associated with mating execution deficits rather than diminished sperm quality. Experimental Gerontology. 48, (11), 1156-1166 (2013).
  24. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 80-90 (2017).
  25. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200, (2), 387-407 (2015).
  26. Sato, M., Sato, K. Degradation of paternal mitochondria by fertilization-triggered autophagy in C. elegans embryos. Science. 334, (6059), 1141-1144 (2011).
  27. Wang, Y., et al. Kinetics and specificity of paternal mitochondrial elimination in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 7, 12569 (2016).
  28. Wolke, U., Jezuit, E. A., Priess, J. R. Actin-dependent cytoplasmic streaming in C. elegans oogenesis. Development. 134, (12), 2227-2236 (2007).
  29. Mottram, L. F., Forbes, S., Ackley, B. D., Peterson, B. R. Hydrophobic analogues of rhodamine B and rhodamine 101: potent fluorescent probes of mitochondria in living C. elegans. Beilstein Journal of Organic Chemistry. 8, 2156-2165 (2012).
  30. Singson, A., Hill, K. L., L'Hernault, S. W. Sperm competition in the absence of fertilization in Caenorhabditis elegans. Genetics. 152, (1), 201-208 (1999).
  31. Wu, J. C., et al. Sperm development and motility are regulated by PP1 phosphatases in Caenorhabditis elegans. Genetics. 190, (1), 143-157 (2012).
  32. Seidel, H. S., et al. A novel sperm-delivered toxin causes late-stage embryo lethality and transmission ratio distortion in C. elegans. PLoS Biology. 9, (7), e1001115 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics