Caracterizar a los mutantes relacionados con enfermedades de los kinases familiares de la RAF mediante el uso de un conjunto de métodos prácticos y factibles

Cancer Research

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Summary

En este artículo, presentamos un conjunto de métodos prácticos y factibles para caracterizar mutantes relacionados con enfermedades de quinasas familiares de la RAF, que incluyen el ensayo de quinasa in vitro, el ensayo de coactivación de la RAF y el ensayo complementario de luciferasa dividida.

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Yap, J., Yuan, J., Tee, Z. H., Huang, X., Ng, W. H., Hu, J. Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods. J. Vis. Exp. (149), e59795, doi:10.3791/59795 (2019).

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Abstract

Las quinasas familiares de fibrosarcoma (RAF) aceleradas rápidamente desempeñan un papel central en la biología celular y su disfunción conduce a cánceres y trastornos del desarrollo. Una caracterización de los mutantes de la RAF relacionados con la enfermedad nos ayudará a seleccionar estrategias terapéuticas adecuadas para el tratamiento de estas enfermedades. Estudios recientes han demostrado que las quinasas familiares de la RAF tienen actividades catalíticas y alostéricas, que están estrictamente reguladas por la dmerización. Aquí, construimos un conjunto de métodos prácticos y factibles para determinar las actividades catalíticas y alostéricas y la relativa afinidad/estabilidad de la familia de la RAF y sus mutantes. En primer lugar, modificamos el ensayo clásico de quinasa in vitro reduciendo la concentración de detergente en tampones, utilizando un procedimiento de lavado rápido suave y empleando una fusión de glutatión S-transferasa (GST) para evitar que los dimers de la RAF se disocieran durante Purificación. Esto nos permite medir la actividad catalítica de los mutantes constitutivamente activos de la RAF apropiadamente. En segundo lugar, desarrollamos un nuevo ensayo de coactivación de la RAF para evaluar la actividad alostérica de los mutantes de la RAF muertos de quinasa mediante el uso de proteínas de la RAF truncadas en Terminal N, eliminando el requisito de Ras activo en los protocolos actuales y logrando así un mayor Sensibilidad. Por último, generamos un ensayo complementario único de luciferasa dividida para medir cuantitativamente la afinidad/estabilidad relativa de dimer de varios mutantes de la RAF, que es más confiable y sensible en comparación con el ensayo tradicional de coinmunoprecipitación. En resumen, estos métodos tienen las siguientes ventajas: (1) fácil de usar; 2) capaz de llevar a cabo eficazmente sin equipos avanzados; 3) rentable; (4) altamente sensible y reproducible.

Introduction

Las quinasas de la familia RAF son un componente clave de la cascada de señalización RAS/RAF/MEK/ERK, que transmiten una señal de RAS para activar la proteína quinasa activada por mitogeno (MEK)1,2,3,4. Esta familia de quinasas juega un papel crucial en el crecimiento celular, supervivencia ydiferenciación, y sus alteraciones inducen muchas enfermedades, en particular el cáncer 5,6,7,8. Recientemente, las secuenciaciones genómicas han identificado muchos mutantes de la RAF relacionados con enfermedades que exhiben diferentes propiedades en la transmisión de señal de LA cascada RAS/RAF/MEK/ERK9,10,11. Una caracterización cuidadosa de los mutantes de la RAF nos ayudará a entender los mecanismos moleculares de cómo los mutantes de la RAF alteran la salida de señal de la cascada RAS/RAF/MEK/ERK, eventualmente seleccionar enfoques apropiados para tratar varias enfermedades impulsadas por mutantes de la RAF.

Las quinasas de la familia RAF incluyen tres miembros, CRAF, BRAF y ARAF, que tienen estructuras moleculares similares pero diferentes capacidades para activar la señalización aguas abajo1,2,3,4. Entre estos paralogs, BRAF tiene la actividad más alta en virtud de su constitutivamente fosforilado NtA (N-terminal a cidic) motivo12,13,14, mientras que ARAF tiene el más bajo actividad derivada de su motivo APE no canónico15. Esto puede explicar las diferentes frecuencias de mutación de los paralogos de la RAF en enfermedades: BRAF>CRAF>ARAF. Además, dentro del mismo paralog de la RAF, las mutaciones en diferentes sitios pueden desencadenar la señalización aguas abajo de maneras distintas, lo que añade otra capa de complejidad a la regulación de las quinasas familiares de la RAF. Estudios recientes han demostrado que todas las quinasas de la RAF tienen actividades catalíticas y alostéricas13,14,16,17,18. Los mutantes de la RAF constitutivamente activos activan la señalización aguas abajo directamente mediante el fósforo MEK, mientras que los mutantes de la RAF muertos de quinasa pueden transactivar sus contrapartes de tipo salvaje a través de la dimerización de lado a lado y activar la señalización MEK-ERK16 ,19,20. La afinidad/estabilidad dimer es un parámetro clave que no sólo determina la actividad alostérica de los mutantes de la RAF muertos de quinasa, sino que también afecta a la actividad catalítica de los mutantes constitutivamente activos de la RAF15,21, 22. Los mutantes de la RAF muertos de quinasa con alta afinidad/estabilidad dimer pueden transactivar los RAF endógenos directamente15,mientras que aquellos con afinidad/estabilidad dimer intermedia requiere una coordinación de Ras activo o un nivel elevado de moléculas de tipo salvaje de la RAF para funcionar13,15,20,21,23. Del mismo modo, los mutantes constitutivamente activos de la RAF fosforilan MEK de una manera dimer-dependiente, y aquellos con baja afinidad/estabilidad dimer pierden su actividad catalítica in vitro tras la inmunoprecipitación que rompe los débiles atenuadores de la RAF15, 21,22. La afinidad/estabilidad dimer también determina la sensibilidad de los mutantes de la RAF a sus inhibidores, y se correlaciona positivamente con la resistencia de los inhibidores de la RAF24. Por lo tanto, para caracterizar a los mutantes de la RAF relacionados con la enfermedad, es necesario medir sus actividades catalíticas y alostéricas, y la afinidad/estabilidad del dimer.

En los últimos años, nuestro laboratorio y otros han desarrollado varios métodos para caracterizar a las quinasas familiares de la RAF y sus mutantes. Según nuestro laboratorio y la experiencia de otros, creemos que los siguientes tres ensayos tienen ventajas en la definición de mutantes de la RAF relacionados con la enfermedad: (1) el ensayo de quinasa in vitro que se puede llevar a cabo con facilidad para detectar la actividad catalítica de la mutantes activos de la RAF15; (2) el ensayo de coactivación de la RAF que es un método fiable y conveniente para medir la actividad alostérica de los mutantes de la RAF muertos de quinasa13,15,21,22,23, 25; (3) el ensayo gratuito de luciferasa dividida que tiene una sensibilidad mucho mayor en la medición de la afinidad/estabilidad relativa de los mutantes de la RAF en contraste con el ensayo tradicional de coinmunoprecipitación, y es capaz de llevar a cabo sin equipo avanzado en en contraste con los métodos analíticoscuantitativos como el análisis SPR (S urface Plasmon Resonance)15,22. Combinando estos tres ensayos, podemos entender fácilmente cómo un mutante de la RAF relacionado con la enfermedad altera la señalización aguas abajo y así utilizar una estrategia terapéutica apropiada para tratar la enfermedad causada por esta mutación de la RAF.

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Protocol

1. Ensayo In Vitro Kinase para medir la actividad catalítica de los mutantes de la RAF

  1. Construir vectores que codifican mutantes de la RAF (Figura1A) con la etiqueta FLAG(DYKDDDDK) en C-terminus mediante el uso de Gibson Assembly o métodos tradicionales de clonación molecular.
    1. Introducir la etiqueta FLAG y las mutaciones en las secuencias de codificación de la RAF por PCRs, y luego insertar secuencias enteras en el vector pCDNA3.1(+) utilizando el ensamblaje Gibson o la ligadura de ADN T4 y siguiendo los protocolos de la fabricación. Utilice las siguientes condiciones para las reacciones de PCR: (1) 95 oC, 2 min; (2) 95 oC, 30 s; (3) 59 oC, 30 s; (4) 68 oC, 3 min; (5) 20 ciclos de (2 a 4); (6) Retención de 4 oC.
      NOTA: Las imprimaciones PCR para clonación: 5- AAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCC-3 y 5-CAGCGGGTTTAAACGCCCTCTA-3.
    2. Inserte la secuencia de codificación GST aguas arriba de las secuencias de codificación mutantes de la RAF para generar vectores que codifican mutantes de la RAF fusionados con GST utilizando los mismos métodos que se describen en el paso 1.1.1.
    3. Validar todos los vectores mediante secuenciaciones de ADN antes de la transfección.
  2. Placa 293T células en placas de 6 pocillos a una densidad de 5 x 105 células / bien un día antes de la transfección. Cuando la densidad celular alcanza una confluencia del 80-90% en el segundo día, transfect con vectores que codifican las quinasas RAF etiquetadas por FLAG o sus mutantes desde el paso 1.1 en las celdas siguiendo el protocolo de reactivación de la transfección de la fabricación (Tabla de materiales).
  3. Reemplace el medio de cultivo 24 h después de la transfección.
  4. Aspirar el medio de cultivo 48 h después de la transfección y añadir 400 l/pozo de tampón de lisis (25 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, 1 mM ácido etilendiaminetetraacético (EDTA), 0,25% NP-40, pH 7,2) complementado con inhibidores de la proteasa y la fosfatasa a las células de la lepíza en el hielo.
    NOTA: La concentración de NP-40 en el tampón de lisis es fundamental para detectar la actividad catalítica de los mutantes de la RAF con afinidad/estabilidad de dimer moderada in vitro. Una alta concentración de detergente o un detergente fuerte en el tampón de lisis puede romper los dimers de la RAF y así matar la actividad catalítica de las quinasas de la RAF o sus mutantes.
  5. Transfiera los lysates celulares a un tubo de 1,5 ml, y gire hacia abajo por 12.000 x g durante 10 minutos a 4 oC para agotar los desechos celulares.
  6. Transfiera 300 ml por muestra de lyalatos de células enteras limpias a tubos de 1,5 ml, agregue 20 ml por muestra de perlas de afinidad anti-FLAG y gire en una cámara fría (4 oC) durante 1 h. También tome a un lado 40 l por muestra de isladez de células enteras limpias para detectar la expresión y la actividad (fosfo-ERK1-2) de los mutantes de la RAF por inmunoblots como se describe a continuación.
  7. Lavar las perlas anti-FLAG una vez con tampón de lisis, luego una vez con tampón de reacción quinasa (20 mM HEPES, 10 mM MgCl2, 0,5 mM Na3VO4, 0,5 mM dTT, pH 7.2), y añadir 20 s de mezcla de reacción quinasa (2 g de MEK1(K97A) y 100M de ATP en 20 buffer de acción) por muestra.
    NOTA: El lavado de cuentas debe completarse suavemente y rápidamente, el tampón residual debe aspirarse completamente antes de añadir la mezcla de reacción quinasa, y todas las operaciones en este paso deben llevarse a cabo a 4 oC en una cámara fría.
  8. Incubar las reacciones de la quinasa a temperatura ambiente (25 oC) durante 10 minutos, y voltear los tubos que contienen reacciones de quinasa con los dedos cada dos minutos durante la incubación.
  9. Añadir 5 l de búfer de muestra SDS de 5x (375 mM Tris HCl, 9% sulfato de dodecilo sódico (SDS), 50% glicerol, 0.03% Bromofenol Blue) por muestra para detener las reacciones de quinasa, y luego calentar las muestras a 90 oC durante 5 min.
  10. Ejecuta las muestras en electroforesis de gel de poliacrilamida (PAGE) de 9-12% con 0,1% de SDS, transfiere las proteínas a la membrana de nitrocelulosa y detecta los niveles de fosfo-MEK y mutantes de la RAF en las muestras por inmunoblots.
    NOTA: El fosfo-MEK también se puedecuantificar mediante el uso de la incorporación de P-ATP 32. En resumen, se añaden 10 M a32P-ATP al búfer de reacción quinasa, y la cantidad de MEK fosforilado se cuantifica después de la separación de PAGE mediante el uso de autoradiografía estándar, fosforfación o técnicas de recuento de centelleo líquido como Apropiado.

2. Ensayo de coactivación de la RAF para evaluar la actividad alostérica de los mutantes de la RAF muertos por Kinase

  1. Construir vectores que codifican el receptor RAF (dominio de quinasa CRAF con motivo NtA no fosforilable, AAFF) o los activadores de la RAF muertos de quinasa (dominio de quinasa de la RAF con motivo NtA imitado por fosforilación, SSDD, DDEE o DGEE) (Figura1A) como descrito en el paso 1.1.
  2. Células 293T transfect con dos vectores que codifican tanto el receptor RAF como el activador RAF muerto de quinasa o un solo vector que codifica una de las proteínas como se describe en los pasos 1.2 y 1.3.
  3. Reemplazar el medio de cultivo a las 24 h después de la fecundidad, y cosechar 293T transfectantes a 48 h para preparar los lysates de células enteras como se describe en los pasos 1.4 y 1.5.
  4. Mezcle el lisado limpio de células enteras con 5 tampón de muestra SDS rápidamente a temperatura ambiente (25 oC) y luego hierva a 90 oC durante 5 min.
  5. Ejecuta las muestras de lisato de células enteras hervidas en una página de 9 a 12% con 0,1% de SDS, transfiere las proteínas a la membrana de nitrocelulosa y detecta los niveles de fosfo-ERK1/2 y controla las proteínas por inmunofunción.

3. Ensayo de Luciferasse dividido gratuito para medir la afinidad/estabilidad relativa del dimer de los mutantes de la RAF

  1. Construir vectores que codifican mutantes RAF etiquetados con FLAG fusionados con el Término N de Nluc (N-terminus de luciferasa de luciérnaga, aa2-416) o el Término C de Cluc (C-terminus de luciérnaga, aa398-550) como se describe en el paso 1.1.
  2. Células 293T transfectos con un par de vectores que codifican diferentes mutantes Nluc-RAF y mutantes Cluc-RAF como se describe en el paso 1.2.
  3. A las 24 h después de la transfección, replacar 293T transfectan de células en placas de imagen negra Krystal a la densidad celular de 2x105 por pozo con medio libre de color (es decir, DMEM sin rojo fenol).
  4. 24 h más tarde, añadir D-luciferina (0,2 mg/ml) a 293T transeftantes celulares, incubar durante 30 minutos y medir las señales de luciferasa utilizando un sistema de detección múltiple (Tablade materiales).
  5. Después de medir las señales de luciferasa, aspirar los transfectudores medio y de lise 293T con tampón de lisis para preparar los líticos de células enteras como se describe en los pasos 1.4 y 1.5.
  6. Ejecuta las muestras de lisados de células enteras en una página de 9 a 12% con 0,1% de SDS y detecta los niveles de expresión de mutantes Nluc-RAF y mutantes de Cluc-RAF mediante inmunoblot anti-FLAG como se describe en el paso 2.5. Los niveles de expresión relativos del mutante Nluc-RAF y del mutante Cluc-RAF en los transfectudores 293T se cuantifican mediante el uso de la imagen J de sus inmunoblots.
  7. Normalizar las señales de luciferasa de los transefectos celulares 293T de acuerdo con los niveles de expresión de los mutantes Nluc-RAF y Cluc-RAF mutantes. Brevemente, esto se logra dividiendo la señal de luciferasa cruda por los niveles de expresión relativa de los mutantes Nluc-RAF y los mutantes cluc-RAF del paso 3.6.

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Representative Results

Las quinasas de la familia RAF tienen actividades catalíticas y alostéricas, que permiten a sus mutantes relacionados con la enfermedad encender la señalización aguas abajo a través de diferentes mecanismos13,14,16,17 ,18. Los mutantes constitutivamente activos de la RAF fosforilan directamente sus sustratos, mientras que los mutantes de la RAF muertos de quinasa cumplen su función a través de la transactivación de contrapartes de tipo salvaje. Como se muestra en la Figura 1B, ambos mutantes constitutivamente activos de la RAF (como mutantes de la columna vertebral reguladora (R-espina) (BRAF(L505M), CRAF(DDEE/L397M) y ARAF(DGEE/L358M))13,23,25 , 26,BRAF (V600E) y BRAF (NVTAP)) y mutantes de la RAF muertos de quinasa (como LA columna espina catalítica (C-espina)-fusionado BRAF(-NVTAP/V471F)15) activan ERK cuando se expresa en células 293T. Por lo tanto, la capacidad de los mutantes de la RAF para activar la señalización ERK en las células no puede servir como un estándar para distinguir a un mutante constitutivamente activo de un mutante muerto en la quinasa, aunque algunos mutantes muertos por la quinasa con afinidad/estabilidad dimer moderada se enciende señalización aguas abajo sólo con la cooperación de ras activo. Tres métodos que presentamos aquí pueden ayudarnos a caracterizar eficazmente a todos los mutantes de la RAF relacionados con la enfermedad. Las propiedades biológicas de todos los mutantes de la RAF reveladas mediante el uso de estos ensayos en nuestros estudios anteriores se han resumido en la Tabla1.

El primer método que podemos usar para distinguir a los mutantes constitutivamente activos de la RAF de los mutantes de la RAF muertos de quinasa es el ensayo de quinasa in vitro. En este ensayo, los mutantes de la RAF fueron purificados por inmunoprecipitación y las reacciones catalíticas se llevaron a cabo in vitro con MEK1(K97A) y ATP muertos por quinasa como sustratos. La actividad catalítica de los mutantes de la RAF se midió como la AL(Activation Loop)-fosforilación de MEK1(K97A) en las mezclas de reacción de quinasa por inmunoblot. Como se muestra en la Figura 1C, este ensayo puede sondear eficazmente la actividad catalítica de los mutantes de r-espina de BRAF, CRAF y ARAF13,15,23, BRAF (V600E)9, y BRAF (NVTAP)15, pero no la de BRAF muerto de quinasa (V471F / NVTAP)15 que tiene una espina C fusionada. Sin embargo, la actividad catalítica de mutantes constitutivamente activos de la RAF con débil afinidad/estabilidad dimer como ARAF R-spine mutante (ARAF(DGEE/L358M)) (Figura1C, carril 4), CRAF y ARAF mutantes con interfaz de dimer alterada (CRAF(DDEE/ L397M/R401H), ARAF(DGEE/L358M/APE/R362H))15,22 (Figura1D,E) podrían no ser sondeados utilizando este ensayo, ya que sus atenuadores se rompieron durante la purificación, especialmente cuando la purificación fue con tampones que contienen detergentes fuertes o de alta concentración. Para evitar la pérdida de actividad catalítica de mutantes de la RAF con débil afinidad/estabilidaddimer, por lo general fusionamos estos mutantes con GST (g lutathione S-transferase), una proteína dimerica con fuerte afinidad/estabilidad antes de realización de un ensayo de quinasa in vitro, que puede rescatar la actividad catalítica de estos mutantes de la RAF15,22 (Figura1E). En general, la mayoría de los mutantes de la RAF podrían clasificarse como mutantes constitutivamente activos o muertos de quinasa mediante el uso de este ensayo.

El segundo método que describimos aquí es el ensayo de coactivación de la RAF que se puede utilizar para evaluar la actividad alostérica de los mutantes de la RAF muertos de quinasa13,15,21,22,23 , 25. Aunque algunos mutantes de la RAF muertos de quinasa con muy alta afinidad/estabilidad dimer como BRAF(V471F/ -NVTAP)15, pueden activar directamente moléculas endógenas de la RAF cuando se expresan en células (Figura1B, carril 7), la mayoría Los mutantes de la RAF muertos de quinasa requieren la cooperación de ras activo para transactivar los RAF de tipo salvaje. Sin embargo, Ras activo es un activador directo de la señalización ERK, cuya introducción aumentará el nivel basal de ERK activo. Para evitar la interferencia de Ras activo, usamos mutantes de la RAF truncados por N-terminus en este ensayo (Figura2A). Como se muestra en la Figura 2B, mutantes muertos de quinasa de BRAF, CRAF, y RAF con motivo nAT ácido y fusión C-spine (BRAF(V471F, aa431-766), CRAF(DDEE/V363F, aa323-648), y ARAF(DGEE/V324F, aa284-606)) funcionaban como activadores alostéricos desencadenar la actividad catalítica de CRAF con motivo NtA no fosforilable (receptor CRAF, CRAF(AAFF, aa323-648)) cuando se expresa co-expresado en células 293T. Por el contrario, el mutante BRAF muerto de quinasa (V471F / NVTAP, aa431-766) que tienen muy alta afinidad/estabilidad diminópica (ver más abajo) encendió la señalización ERK activando RAF endógenos, incluso sin la coexpresión del receptor CRAF. En general, este ensayo se puede utilizar para evaluar la capacidad de transactivación de todos los mutantes de la RAF muertos de quinasa.

La dimerización de las quinasas familiares de la RAF no sólo regula su capacidad para activar la señalización MEK-ERK aguas abajo, sino que también determina su sensibilidad a los inhibidores de la RAF15,16,20,22,24,27,28,29,30,31,32. En contraste con otras interacciones proteína-proteína entre esta vía33,34,35, la dimerización de las quinasas familiares de la RAF y sus mutantes es relativamente débil y difícil de evaluar mediante el uso de ensayos bioquímicos tradicionales como la coinmunoprecipitación. Para resolver este problema, recientemente desarrollamos un ensayo de luciferasa dividida gratuito para medir la afinidad/estabilidad relativa de la familia DE la RAF y sus mutantes15,22,36. Como se muestra enFigura 3Un, los dominios de quinasa RAF (aa431-766 para BRAF, aa323-648 para CRAF y aa284-606 para ARAF) se fusionaron respectivamente con N-terminus(aa2-416) o C-terminus(aa398-550) de lucilavil (Nluc y Cluc), que se reunirán para ensamblar luciferasa en la dimerización de la RAF. La actividad de la luciferasa en este ensayo se correlaciona directamente con la cantidad de dimers de la RAF. Este ensayo es muy sensible y puede detectar incluso una dimerización muy débil de los mutantes de la RAF. Como informamos antes15, el BRAF oncogénico (V600E) funciona como un dimer, y sólo una mutación compuesta con la mutación Arg-to-His(R509H) en la interfaz dimer y la alteración no canónica de APE (P622A en el motivo APE) puede abolir completamente su dimerización y así bloquear su catalítica actividad (Figura 3B). Mediante el uso de un ensayo de quinasa in vitro, encontramos además que la variante BRAF(V600E) con el motivo APE alterado, BRAF(V600E/AAE), pero no que con la mutación Arg-to-His en la interfaz de dimer, BRAF(V600E/R509H), perdió su actividad catalítica tras la purificación (Figura 3C), lo que sugiere que la variante anterior tiene mucha menos afinidad/estabilidad de dimer que la segunda. Para medir directamente la propensión de estas variantes BRAF(V600E) a formar dimers, llevamos a cabo un ensayo de luciferasa dividida de cortesía, y confirmamos que estas variantes tenían muy diferente afinidad dimer / estabilidad con BRAF (V600E) más alto que BRAF(V600E/ R509H) que BRAF(V600E/AAE) que BRAF(V600E/R509H/AAE) (Figura 3D). La señal de luciferasa producida por BRAF monomérico(V600E/R509H/AAE) fue comparable con la del control 293T no transotrórico (Figura 3D, carril 5 del panel izquierdo), lo que indica que este ensayo tiene un fondo muy bajo. Para determinar aún más la eficacia del ensayo gratuito de luciferasa dividida, medimos a continuación mediante el uso de este ensayo la afinidad/estabilidad de dimer relativo de un grupo de mutantes BRAF oncogénicos con eliminaciones en el marco del bucle de 3-C que fue identificado por nosotros y otros Grupos15,37,38. Como hemos sabido, aunque todos estos mutantes activaron la señalización ERK cuando se expresa en células 293T (Figura 3E), presentaron una actividad catalítica bastante diferencial in vitro (Figura 3F). El BRAF(MLN(aa484-486 del)) y el BRAF(-NVTAP(aa486-490 del)) fueron muy activos tras la purificación por inmunoprecipitación, mientras que el BRAF(aa486-491 del)) y EL BRAF(-QA(aa496-497 del)) perdieron su actividad catalítica podría ser rescatado por fusión GST. Además, la versión muerta de quinasa de BRAF (NVTAP), BRAF (V471F / NVTAP) exhibió una fuerte potencia para activar los RÁF endógenos cuando se expresa en células (Figura 1Bcarril 7). Estos datos sugieren que este grupo de mutantes braf tienen una afinidad/estabilidad de dimer muy diferente con BRAF (-NVTAP) más alto que BRAF (MLN) que BRAF (-NVTAPT) y BRAF(QA). De hecho, el resultado del ensayo gratuito de luciferasa dividida apoyó completamente nuestra inferencia (Figura 3G). En conjunto, nuestros datos indican que el ensayo gratuito de luciferasa dividida es un método confiable para medir la afinidad/estabilidad relativa del dimer de los mutantes de la RAF.

Figure 1
Figura 1 : Sondear la actividad catalítica de los mutantes de la RAF mediante el ensayo de quinasa in vitro. (A) Un diagrama esquemático para las mutaciones de la RAF utilizadas en este estudio. (B) Ambos mutantes de la RAF constitutivamente activos y muertos de quinasa pueden activar la señalización ERK cuando se expresa en células. Las células 293T fueron transcinfectadas con vectores que codifican diferentes mutantes de la RAF, y la actividad de ERK fue detectada por inmunoblot anti-fosfo-ERK1/2. (C) Los mutantes de la RAF constitutivamente activos con baja afinidad/estabilidad dimer, así como los mutantes de la RAF muertos por quinasa no pueden fosforilar MEK in vitro tras la purificación por inmunoprecipitación. Los mutantes de la RAF en B fueron purificados mediante el uso de cuentas anti-FLAG, y su actividad catalítica fue sondeada mediante el uso de un ensayo de quinasa in vitro como se describe en el protocolo. (D-E) La actividad catalítica in vitro de mutantes constitutivamente activos de la RAF con baja afinidad/estabilidad de dimer puede ser rescatada por la fusión GST. (D) Los mutantes constitutivamente activos de la RAF y sus homólogos fusionados con GST se expresaron en células 293T y su actividad se midió mediante inmunoblot antifosfo-ERK1/2. ( E ) Los mutantesdela RAF en D fueron purificados por inmunoprecipitación, y su actividad catalítica in vitro fue sondeada mediante el uso de un ensayo de quinasa in vitro como se describe en el protocolo. Mutantes de la R-espina dorsal de la RAF: BRAF(L505M), CRAF(DDEE/L397M) y ARAF(DGEE/L358M). "NVTAP" representa para la eliminación de aa486-490 en BRAF. La mutación APE de ARAF significa A475P que genera un motivo APE canónico en ARAF. "KD" representa "dominio de quinasa" en el texto completo. BRAF(KD) significa el fragmento aa431-766 de BRAF, mientras que CRAF(KD) y ARAF(KD) representan respectivamente para el fragmento aa323-648 de CRAF y el fragmento aa284-606 de ARAF. Los resultados de esta cifra se han notificado previamente15,22. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Evaluar la capacidad de los mutantes de la RAF para transactivar los RAF de tipo salvaje mediante el ensayo de coactivación de la RAF. (A) Un diagrama que ilustra el ensayo de coactivación de la RAF. (B) Los mutantes de la RAF muertos por Kinase con motivo santifico NtA fueron coexpresados con el receptor CRAF competente para la catálisis en células 293T, y la actividad de ERK1/2 en los transfectudores 293T se midió mediante inmunoblot anti-phosho-ERK1/2. La mayoría de los mutantes de la RAF muertos de quinasa excepto BRAF (V471F / NVTAP) que tiene una afinidad/estabilidad dimer muy alta requería la coexpresión del receptor exógeno de la RAF para activar la señalización ERK. Los resultados de esta cifra se han notificado previamente15,22. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Mida la afinidad/estabilidad relativa del dimer de los mutantes de la RAF utilizando el ensayo de luciferasa dividida decortesía. (A) Un diagrama que ilustra el ensayo de luciferasa dividida gratuito. (B-D) La dimerización de las variantes BRAF(V600E) es necesaria para su actividad catalítica in vivo e in vitro. (B) La variante monomérica BRAF(V600E), BRAF(V600E/R509H/AAE) no tiene actividad catalítica in vivo, que puede ser recuperada por fusión GST. Las variantes BRAF(V600E) y sus contrapartes fusionadas con GST se expresaron en células 293T, y su actividad se midió mediante antifosfo-ERK1-2. (C) La variante BRAF(V600E) con baja afinidad/estabilidad de dimer, BRAF(V600E/AAE) perdió su actividad catalítica in vitro tras la purificación, que puede ser rescatada por fusión GST. Las variantes BRAF(V600E) de B fueron purificadas por inmunoprecipitación y su actividad catalítica fue sondeada por el ensayo de quinasa in vitro como se describe en el protocolo. (D) La afinidad/estabilidad de dimer relativa de las variantes BRAF(V600E) se midió utilizando el ensayo de luciferasa dividida gratuito como se describe en el protocolo. (E-G) Los mutantes BRAF con la eliminación en el marco de la función de bucle de 3-C como dimers para activar la señalización ERK. (E) Los mutantes BRAF con la eliminación en trama del bucle c 3 activan la señalización ERK cuando se expresan en las células. Los mutantes BRAF se expresaron en células 293T y su actividad se midió como se describe en B. (F) Los mutantes BRAF con baja afinidad/estabilidad diminal de E perdieron su actividad catalítica in vitro, que puede ser rescatada por fusión GST. La actividad catalítica in vitro de los mutantes BRAF y sus contrapartes fusionadas con GST de E se midió como en C. (G) Los mutantes braF con la eliminación en el marco del bucle de la c 3 tienen una afinidad/estabilidad de dimer muy diferente. La afinidad/estabilidad relativa del dimer de los mutantes BRAF con la eliminación en el marco del bucle de c 3- se midió como en D. Las barras de error en D&G representan s.d. para mostrar la varianza entre experimentos independientes (n . 4). La mutación AAE de BRAF significa P622A en motivo APE que genera un motivo APE no canónico. Los "MLN", "NV-TAPT" y "QA" representan respectivamente para las eliminaciones de aa484-486, aa486-491, aa496-497 en el bucle de BRAF. Algunos resultados en esta cifra se han informado previamente15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Table 1
Tabla 1: La propiedad biológica de varios mutantes de la RAF. La actividad catalítica, la actividad alostérica y la afinidad/estabilidad relativa del dimer de todos los mutantes de la RAF utilizados en este estudio se han resumido en esta tabla. "Y" significa "Sí", mientras que "N" significa "No". "N*" indica que esos mutantes tienen actividad catalítica si se fusionan con gST. "++++", "++", "++", "+" y "-" representan respectivamente para "muy fuerte", "fuerte", "intermedio", "débil" y "ninguno".

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Discussion

En este artículo, presentamos tres métodos para caracterizar mutantes de la RAF relacionados con la enfermedad, que incluyen el ensayo de quinasa in vitro, el ensayo de coactivación de la RAF y el ensayo de luciferasa dividida de cortesía. Dado que las quinasas de la RAF tienen actividad catalítica y actividad alostérica, varios mutantes de la RAF pueden activar la señalización aguas abajo a través de dos mecanismos distintos13,14,16,17, 18. Los mutantes constitutivamente activos de la RAF fosforilan directamente el efector descendente MEK, mientras que los mutantes de la RAF muertos de quinasa activan la señalización aguas abajo a través de la transactivación de sus contrapartes de tipo salvaje. Sin embargo, ambos mutantes de la RAF constitutivamente activos y muertos de quinasa requieren la dimerización para cumplir su función15,16,17,19,20, y el dimer la propensión de los mutantes de la RAF determina no sólo la actividad catalítica o alostérica de los mutantes de la RAF, sino también su sensibilidad a los inhibidores de la RAF15,24. El ensayo de quinasa in vitro, el ensayo de coactivación de la RAF y el ensayo complementario de luciferasa dividida nos proporcionan un conjunto de métodos simples, eficaces y fiables para distinguir a los mutantes constitutivamente activos de los mutantes muertos de quinasa, así como evaluar sus capacidad de activar la señalización aguas abajo.

El ensayo de quinasa in vitro es un método clásico para detectar la actividad catalítica de las quinasas proteicas. Para adoptar este método para medir la actividad catalítica de los mutantes de la RAF, hemos realizado algunas revisiones significativas en los reactivos y procedimientos15,21,22. Dado que las quinasas de la familia RAF funcionan como tenues para fosforilar su sustrato, MEK, y su afinidad/estabilidad dimer es relativamente baja, hemos reducido la concentración de detergente NP-40 de 1% a 0.25% en tampones para purificar proteínas RAF con el fin de prevenir Los dimers de la RAF de la disociación. Del mismo modo, también hemos utilizado un suave procedimiento de lavado rápido para la purificación de proteínas raf. Estos cambios son críticos para detectar la actividad catalítica de mutantes constitutivamente activos de la RAF con muy débil afinidad/estabilidad dimer, que podrían ser identificados como mutantes de la RAF "muertos de quinasa" por el clásico ensayo de quinasa in vitro. Además, hemos demostrado que la fusión GST es una buena forma alternativa de evitar que los dimers de la RAF disocien durante la purificación en este ensayo15,21,22. En cuanto a los mutantes de la RAF muertos de quinasa, incluso si están fusionados con el GST, no exhiben ninguna actividad catalítica en este ensayo.

El ensayo de coactivación de la RAF ha sido desarrollado por nosotros para evaluar la capacidad de los mutantes de la RAF muertos de quinasa para transactivar sus contrapartes de tipo salvaje13,15,21,22,23 , 25. En este nuevo ensayo, utilizamos las proteínas RAF truncadas por N-terminus y por lo tanto no necesitamos la coexpresión de mutantes RAS activos o la activación de RAS, lo que hace que este ensayo sea muy sensible. Además, el activador alostérico (mutante de la RAF muerto de quinasa) y el receptor (mutante de la RAF competente en catálisis) en este ensayo pueden ser fácilmente aislados y purificados para investigar eventos moleculares en el proceso de transactivación impulsada por la dmerización 13.

Como mencionamos anteriormente, la dimer afinidad/estabilidad es un factor clave que regula la función de las quinasas familiares de la RAF y sus mutantes, y también determina su sensibilidad a los inhibidores de la RAF13,14,15, 16,17,18,24. Sin embargo, la afinidad/estabilidad dimer de las quinasas familiares de la RAF y sus mutantes más relacionados con la enfermedad es muy baja. Para medir este parámetro, los ensayos bioquímicos tradicionales requieren procedimientos experimentales complicados y equipos avanzados (como el ensayo SPR), o apenas producen datos fiables y reproducibles (como el ensayo de inmunoprecipitación). Por el contrario, el ensayo gratuito de luciferasa dividida es un método simple, sensible, consistente y rentable para medir la afinidad/estabilidad relativa de la familia DE la RAF y sus mutantes15,21, 22,36. Este ensayo puede sondear la sutil diferencia de afinidad/estabilidad de dimer entre varios mutantes de la RAF. Como informamos antesde 15, BRAF (V600E / AAE) tiene una afinidad/estabilidad dimer muy débil y sus dimers se romperán por completo al purificarse incluso si se utiliza un procedimiento muy suave. Usando este ensayo, podemos distinguir la débil afinidad/estabilidad de dimer de BRAF(V600E/AAE) de la de BRAF monomérico(V600E/AAE/R509H) (Figura3).

En resumen, este conjunto de métodos prácticos y factibles puede cumplir con los requisitos de definir todos los mutantes de la RAF relacionados con la enfermedad, y por lo tanto nos ayudan a seleccionar estrategias apropiadas para el tratamiento de varias enfermedades impulsadas por mutantes de la RAF.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

A los autores les gustaría reconocer la Beca de Leucemia de Células Peludas por el apoyo de Yuan Jimin. Este trabajo fue apoyado por el Fondo de Asia Cancer Research (AFCR2017/2019-JH), Duke-NUS Khoo Bridge Funding Award (Duke-NUS-KBrFA/2018/0014), NCCRF bridging grant (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), NCCRF pilot grant (NCCRF-YR2017-JUL-PG3), Beca de Investigación (AM/TP011/2018).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-phosphoERK1/2 Cell Signaling Technologies 4370
anti-phosphoMEK1/2 Cell Signaling Technologies 9154
anti-ERK1/2 AB clonal A0229
anti-MEK1/2 Cell Signaling Technologies 9124
anti-FLAG(mouse) Sigma-Aldrich F3165
anti-HA Novus Biologicals MAB6875
anti-FLAG(Rabbit) Cell Signaling Technologies 14793
anti-β-actin Sigma-Aldrich A2228
anti-FLAG beads(M2) Sigma-Aldrich A4596
HRP-conjugated anti-mouse IgG Jackson Laboratories 115-035-003
HRP-conjugated anti-Rabbit IgG Jackson Laboratories 111-035-144
pcDNA3.1(+) In vitrogen V79020
Gibson Assembly Cloning  Kit New England Biolabs E5510
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
Fugene 6 Roche 11 814 443 001
DMEM w/o phenol red Invitrogen 21063-029
D-luciferin  GoldBio LUCK-100
6xhis-tagged MEK1 (K97A)  prepared in our previous studies N.A. Reference 15.
GloMax-Multi Detection System. Promega E7041

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