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Construcción manual de un microarray de tejido utilizando el método de cinta y un microarrayer de mano
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Summary June 10th, 2022
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Este protocolo describe el método de cinta sobre cómo construir manualmente un microarray de tejido utilizando bloques de donantes FFPE de diferentes profundidades.
Transcript
El microarray tisular, o TMA, es una importante herramienta de investigación que ensambla pequeñas piezas ejemplares de tejido conocidas como núcleos de tejido a partir de bloques de tejido incrustados de parafina fijados en formalina, conocidos como bloques de donantes, en un solo bloque de parafina. El método de cinta es un método de construcción totalmente manual que invierte el proceso de construcción lanzando el bloque alrededor de núcleos verticales y, por lo tanto, es compatible con bloques donantes no ideales y utiliza microarrayers de tejido desechables de mano de bajo costo y ampliamente disponibles. El flujo de trabajo de varios pasos de este proceso será demostrado por el Sr. Lee Wisner y el Dr. Brandon Larsen.
Uno de los conceptos más importantes a recordar al construir bloques de TMA es el hecho de que los tejidos en bloques de tejido incrustados de parafina fijada en formalina son en realidad estructuras tridimensionales. Hemos desarrollado una animación aquí para ayudar a explicar este concepto. Lo que está viendo aquí es una animación que representa un bloque de tejido incrustado de parafina fijado en formalina que muestra la naturaleza tridimensional de ese tejido dentro del bloque.
Puede ver que el tejido es visible en la parte superior del bloque y esa área es bastante grande. Si pudiéramos tener visión de rayos X, por así decirlo, y ver a través del bloque, podríamos ver que el tejido no tiene una forma uniforme más profunda dentro de ese bloque, casi como un iceberg en el océano, donde lo que se ve en la superficie puede no representar realmente lo que está debajo. Dentro de ese bloque de tejido puede haber piezas de tejido adicionales que no son visibles en la superficie.
Puede haber áreas de necrosis o muerte tisular dentro del centro de ese tejido más profundo. Un patólogo debería revisar esa sección bidimensional de la parte superior de ese bloque de tejido y luego anotar esa diapositiva para mostrar las áreas que contienen el tejido de interés y excluyendo la necrosis u otros tipos de tejido que en realidad no son de interés. Para facilitar el muestreo adecuado del núcleo del tejido, el patólogo debe hacer tres cosas.
Primero, usando una pluma de marcado de diapositivas, el patólogo marcará el tejido de interés en el portaobjetos para que se puedan evitar otros tejidos. En segundo lugar, si hay áreas dentro de esa área de interés que deben evitarse, el patólogo puede usar la misma pluma de marcado para borrar aquellas áreas que no deben muestrearse. Y por último, preferiblemente usando un color diferente de pluma, el patólogo debe marcar aquellas áreas que son ideales dentro del área de interés para el muestreo de núcleos y la construcción de TMA.
Es importante tener en cuenta que cuando se realiza ese proceso, la composición del tejido puede cambiar más profundamente dentro de donde se obtiene una muestra de núcleo y lo mostraremos aquí en la animación, que la ubicación del núcleo determinará la composición de ese núcleo, que variará según la profundidad del tejido y lo que está presente dentro de ese bloque. Por ejemplo, aquí el primer núcleo que estamos ilustrando es capturar una porción del tejido en su mitad superior, pero más profundo dentro del bloque ya no hay ningún tejido presente de donde se obtiene ese núcleo, por lo que solo se ha muestreado cera de parafina. El segundo núcleo que hemos ilustrado aquí ha capturado tejido a lo largo de toda su longitud porque el tejido está presente en toda la profundidad de ese bloque en esa ubicación.
El tercer núcleo ha capturado una porción de tejido y luego ha capturado una porción de cera de parafina en el centro donde no había tejido presente y luego capturó un poco más de tejido en su extremo inferior donde había tejido en la parte inferior de ese bloque. Una vez que se complete la revisión de patología, compile la lista final de bloques de donantes que se utilizarán en la construcción de TMA, luego cree un mapa de TMA. El mapa de TMA es un esquema que describe dónde se ubicarán los núcleos en el TMA completado y las secciones de tejido montadas en diapositivas cortadas de la TMA resultante.
Para fines de orientación, asegúrese de que el mapa TMA evite colocar núcleos en una matriz uniforme, como una matriz de tres por tres o cuatro por cuatro e incluya al menos un marcador de orientación. Debido a que el método de cinta invierte el proceso de construcción vertiendo cera fundida alrededor de los núcleos invertidos, esto requiere la creación de un segundo mapa conocido como mapa de construcción, que es una imagen especular del mapa TMA. El mapa de construcción muestra dónde se debe colocar cada núcleo durante la construcción para aparecer en la ubicación correcta en el TMA completado.
Una vez creados los mapas, prepara el molde base TMA metálico. Para guiar la colocación del núcleo, use una rejilla de cuadros de papel desechable. Corte la rejilla a cuadros de papel a medida y coloque un trozo de cinta adhesiva de doble palo en la parte posterior de la rejilla.
Coloque la rejilla y la cinta en la bandeja de metal y agregue una segunda pieza de cinta de doble palo en la parte superior de la rejilla. Superponga la diapositiva de H&E revisada por patología en el bloque de tejido FFPE que se perforará y use las marcas del patólogo para identificar dónde se perforará el bloque de tejido. Usando un punzón manual de mano, desechable o reutilizable, perfore el bloque donante FFPE en la región apropiada.
Si usa un punzón de núcleo reutilizable, asegúrese de que se limpie antes y después de cada punzón de tejido. Expulse el núcleo del punzón del núcleo. Use un pico de aguja para colocar el núcleo expulsado en el punto de mira de la rejilla cubierta con cinta adhesiva de doble palo.
Asegúrese de que el núcleo se coloque de manera invertida y vertical de modo que el extremo de tejido del núcleo entre en contacto con la cinta y esté en la ubicación correcta como se indica en el mapa de construcción. Repita hasta que todos los bloques donantes estén agrupados y los núcleos se coloquen en sus posiciones apropiadas. Una vez que todos los núcleos estén en su lugar, etiquete un casete de plástico y colóquelo sobre la base de metal que contiene los núcleos.
La altura de los núcleos no debe exceder la profundidad de la bandeja de metal, ya que los núcleos altos se inclinarán o derribarán cuando se coloque el cassette en su lugar. Vierta suavemente parafina derretida a través del cassette en la bandeja de núcleos. Permita que la parafina fundida se desborde para asegurarse de que no haya burbujas de aire en el cuerpo de la TMA.
Asegúrese de que la parafina se llene en la parte superior del cassette de tal manera que el cassette esté incrustado y firmemente unido al bloque de parafina una vez que esté solidificado. Deje que el bloque se enfríe a temperatura ambiente durante 30 minutos y no mueva el bloque durante este tiempo. Refrigere el bloque a cuatro grados centígrados durante 30 minutos adicionales para solidificarse por completo.
Una vez completamente establecido, separe suavemente el molde de base metálica y retire la cinta de doble palo del bloque de parafina. Una vez que se construya el TMA, use un microtomo para seccionar el nuevo TMA. Una vez que el bloque se haya enfrentado adecuadamente, recoja las secciones de tejido de la cara completa.
Transfiera las secciones a un baño de agua precalentada y monte las secciones de tejido. Una vez seco, envíe secciones representativas para la tinción de H&E y cualquier tinción inmunohistoquímica adicional que pueda ser necesaria. Presentar las secciones de TMA teñidas para su revisión patológica.
Para la validación de TMA, el patólogo debe revisar la diapositiva de H&E del bloque de TMA y revisar cada punto circular bajo el microscopio para ver si el tejido de interés está presente. Un componente crítico del proceso de construcción es la identificación de tejidos de interés en un bloque donante dado de donde se debe obtener el núcleo de TMA. La primera columna de esta figura muestra H&Es de donante ejemplar con las marcas del patólogo.
La segunda columna muestra el área perforada de los tejidos teñidos de H&E. La tercera columna muestra el tejido teñido de H&E de los núcleos de TMA que se extrajeron de los bloques donantes en las áreas que se muestran en las columnas uno y dos. El patólogo puede ver el bloque de donante compatible y el núcleo de TMA H&Es juntos para validar que se recolectó el área de interés y que la composición del tejido es la misma.
Hay dos métricas principales para completar con éxito un TMA por el método de cinta. El primero es la presencia de puntos del núcleo de tejido en las posiciones esperadas y a la distancia entre sí, que se evalúa mediante inspección visual. Las imágenes que se muestran en A y B representan dos TMA de método de cinta completados con éxito y las diapositivas de H&E correspondientes.
Las inspecciones visuales de estos bloques de TMA muestran que los núcleos están presentes y espaciados regularmente en cada TMA y sus secciones correspondientes. Algunos de los principales problemas de construcción que pueden surgir durante el proceso de construcción del método de cinta incluyen la separación del bloque y el cassette debido a la eliminación prematura de la base metálica antes de la solidificación, como se muestra en la imagen C.El deslizamiento del núcleo y / o la deriva de colocación de los núcleos incrustados como se muestra en la imagen D puede ocurrir mientras que el vertido excesivamente turbulento de la parafina fundida, que puede empeorar por una cinta adhesiva de doble cara mal adhesiva. Esta figura muestra que la mancha de H&E para cada uno de los núcleos es un TMA ejemplar.
Todos menos uno de los puntos centrales están presentes en el H&E. La figura también muestra que algunos de los núcleos están presentes como puntos de tejido circulares completos, mientras que otros no están completamente presentes. Dicha pérdida de tejido no es infrecuente y puede deberse a una obstrucción insuficiente para revelar todos los núcleos en su totalidad.
Alternativamente, la presencia de tejido incompleto o total puede deberse a la mala calidad del tejido de ese núcleo, lo que puede provocar la pérdida de tejido durante el proceso de tinción. En esta siguiente figura se realizó inmunohistoquímica y tinción de ARN ISH en las secciones de TMA para validar aún más la TMA. Como se muestra aquí, se puede usar una variedad de manchas dependiendo del tejido utilizado para construir la TMA.
Vimentin se utiliza como un control de calidad. U6 es un indicador de la calidad del ARN. EBER se utiliza para determinar el estado de EBV.
Y CD20 es un marcador de células B para indicar la presencia de células B. Estas son algunas manchas que se pueden usar para ayudar a validar su TMA. Después de ver este video, debe comprender cómo hacer un microarray de tejido utilizando el método de cinta y por qué los TMA son herramientas de investigación importantes que ahorran tiempo y recursos.
También debe comprender que la construcción de TMA no es un proceso ideal y que la orientación patológica continua y la revisión son componentes críticos no solo durante el proceso de construcción, sino también para los estudios inmunohistoquímicos realizados en las secciones de TMA para garantizar que el tejido de interés esté de hecho presente en la sección de TMA.
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