Fabricación de la etapa del microscopio para la observación vertical con la función de control de temperatura

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Summary

Aquí se presenta un protocolo que utiliza una etapa de microscopio controlada por temperatura que permite montar un contenedor de muestras en un microscopio vertical.

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Matsukawa, Y., Ide, Y., Umemura, K. Fabrication of Microscope Stage for Vertical Observation with Temperature Control Function. J. Vis. Exp. (149), e59799, doi:10.3791/59799 (2019).

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Abstract

Por lo general, las muestras se colocan en una etapa horizontal del microscopio para la observación microscópica. Sin embargo, para observar la influencia de la gravedad en una muestra o estudiar el comportamiento a flote, es necesario hacer que la etapa del microscopio sea vertical. Para lograrlo, se ha ideado un microscopio invertido lateralmente inclinado en 90o. Para observar muestras con este microscopio, los recipientes de muestra como platos Petri o toboganes de vidrio deben fijarse al escenario verticalmente. Se ha desarrollado un dispositivo que puede asegurar los contenedores de muestras en su lugar en una etapa vertical del microscopio, que se describe aquí. La fijación de este dispositivo a la etapa permite la observación de la dinámica de la muestra en el plano vertical. La capacidad de regular la temperatura utilizando un calentador de caucho de silicona también permite la observación de comportamientos de muestra dependientes de la temperatura. Además, los datos de temperatura se transfieren a un servidor de Internet. Los ajustes de temperatura y la supervisión del registro se pueden controlar de forma remota desde un PC o smartphone.

Introduction

La microscopía óptica es una técnica empleada para aumentar los detalles observables mediante el aumento de una muestra con lentes y luz visible. En la microscopía óptica, la luz se dirige a una muestra y luego se transmite, refleja o fluorescente, la luz se captura mediante lentes de aumento para la observación. Hay varios tipos de microscopio disponibles que difieren en el diseño para adaptarse a diferentes usos y métodos de observación. Los diferentes diseños incluyen un microscopio vertical, que está estructurado para iluminar una muestra desde abajo para la observación desde arriba, y un microscopio invertido, que ilumina la muestra desde arriba para la observación desde abajo. Los microscopios verticales son el diseño más común y ampliamente utilizado. Los microscopios invertidos se utilizan a menudo para observar muestras que no pueden permitir que una lente se cierre a distancia desde arriba, como células cultivadas adherentes a la parte inferior de un recipiente. Muchos grupos de investigación han reportado observaciones en una amplia gama de campos utilizando microscopios invertidos1,2,3,4,5,6,7. También se han desarrollado muchos dispositivos adicionales que aprovechan las características de los microscopios invertidos8,9,10,11,12,13 .

Actualmente, en todos los diseños de microscopio convencionales, la etapa del microscopio es horizontal y por lo tanto no es adecuada para la observación de muestras que producen movimiento en el plano vertical, (debido a la gravedad, flotabilidad, movimiento, etc.). Para que estas observaciones sean posibles, la etapa del microscopio y la trayectoria de la luz deben girarse a vertical. La etapa vertical es necesaria para montar verticalmente diapositivas de vidrio o recipientes de muestra como un platos Petri al escenario. Para hacer frente a esto, ya se ha ideado un microscopio invertido lateralmente inclinado en 90o. Sin embargo, la fijación de muestras con cinta u otros adhesivos no produce la necesaria inmovilidad a largo plazo. Aquí se describe un dispositivo que puede lograr la estabilidad necesaria. Este dispositivo permite la observación en el tiempo del movimiento de la muestra en el plano vertical. El montaje de un calentador de caucho de silicio también ha hecho posible observar la influencia de la variación de temperatura en el comportamiento de la muestra. Los datos de temperatura se transfieren a un servidor de Internet mediante Wi-Fi, y los ajustes de temperatura y la supervisión de registros se pueden controlar de forma remota desde un PC o smartphone. Según nuestro conocimiento, la etapa unida a un microscopio inclinado lateralmente 90o aún no se ha reportado en estudios anteriores.

La etapa del microscopio se compone de tres placas de aluminio. La placa de aluminio central está montada en la placa de aluminio inferior que se une al escenario. El caucho de silicona que contiene el sensor de temperatura se une entre las placas de aluminio medio y superior. Las bandas de goma se utilizan para fijar la muestra. Las garras se fijan en los cuatro puntos izquierdo y derecho de la placa superior de aluminio para asegurar las bandas de goma. El circuito de control del regulador de temperatura recibe una señal del sensor de temperatura integrado en caucho de silicona y modula la energía eléctrica mediante el método de modulación de ancho de pulso (PWM). La temperatura se puede aumentar gradualmente a 50 oC en incrementos de 1 oC. Este dispositivo es útil para aplicaciones en las que los movimientos de muestra verticales pueden depender de la temperatura.

Este informe proporciona ejemplos de efectos de temperatura en el fenómeno flotante de las diatomeas. Como ejemplos de estudios de observación de la diatomea, mediciones de la velocidad de sedimentación de los cúmulos celulares, análisis de movimiento, estudios de estructura ultrafina, etc. se han reportado14,15,16,17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. La gravedad específica de las diatomeas que flotan en el agua con organismos fotosintéticos es ligeramente superior a la del agua, por lo que tienden a hundirse; sin embargo, se levantarán si incluso se está produciendo una ligera convección. Para estudiar este fenómeno, se fija un portaobjetos de vidrio verticalmente a una etapa del microscopio, y se observan los efectos del aumento de la temperatura en el movimiento vertical diatomea.

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Protocol

1. Diseño

  1. Fabricación de placas de aluminio
    1. Corte un orificio de 101 mm en el centro de una placa de aluminio de dimensiones 150 mm x 200 mm x 2 mm para ser utilizado como placa de vanguardia con una máquina de procesamiento láser. Garras de la máquina en ocho puntos para fijar dos bandas de goma a lo largo de la longitud, o dos a lo largo de la anchura de esta placa (ver Figura Suplementaria 1A y Figura Suplementaria 2A).
    2. Corte un orificio de 130 mm en el centro de otra placa de aluminio de 150 mm x 200 mm x 5 mm para ser utilizada como placa superior media con una máquina de procesamiento láser. Máquina ocho muescas para la fijación de bandas de goma en dos puntos a lo largo de la longitud, o dos a lo largo de la anchura de esta placa (ver Figura Suplementaria 1B y Figura Suplementaria 2B).
    3. Corte un orificio de 130 mm en el centro de una placa de aluminio de 150 mm x 200 mm x 4 mm para utilizarla como placa inferior media con una máquina de procesamiento láser (ver Figura Suplementaria 1C y Figura Suplementaria 2C).
    4. Corte un orificio de 30 mm en el centro de una placa de aluminio de 150 mm x 200 mm x 1,5 mm que se utilizará como placa base (véase Figura suplementaria 1D y Figura suplementaria 2D).
  2. Fabricación de dos pedestales de aluminio
    1. Corte un agujero de 30 mm en el centro de la placa de aluminio (100 mm de diámetro, 3 mm de espesor) y haga una muesca de un lado con las dimensiones de 42 mm de ancho x 30 mm de profundidad (ver Figura Suplementaria 3A).
    2. Corte un agujero de 30 mm en el centro de la placa en una placa de aluminio (100 mm de diámetro, 4 mm de espesor) y taladre tres orificios de 3 mm situados a 25 mm del centro, espaciados 120o entre sí (ver Figura Suplementaria 3B).
  3. Fabricación de tres discos de corcho prensado
    1. Corte un orificio de 20 mm en el centro del disco de corcho prensado (100 mm de diámetro, 2 mm de espesor) con una máquina de corte por chorro de agua. Haga un corte de 42 mm a lo largo de x 30 mm de profundidad, luego un corte de 4 mm de ancho x 5 mm de profundidad (ver Figura Suplementaria 4A).
    2. Corte un agujero de 20 mm en el centro del disco de corcho prensado de dimensiones de 100 mm de diámetro, 1 mm de espesor con una máquina de corte por chorro de agua. Haga un corte de 42 mm a lo largo de x 30 mm de profundidad, un corte de 4 mm de ancho x 40 mm de profundidad (ver Figura Suplementaria 4B).
    3. Corte una placa de corcho prensada de un disco de 100 mm de diámetro con una anchura de 42 mm y una profundidad de 30 mm. Se requieren dos láminas de 1 mm de espesor y una lámina de 2 mm de espesor (ver Figura Suplementaria 4C).
  4. Fabricación de calentador de caucho de silicona
    1. Fabricar un calentador utilizando un disco de 100 mm de diámetro de caucho de silicio de 2,5 mm de espesor con alambre Nichrome incorporado y cortar un agujero de 20 mm en el centro del disco (ver Figura Suplementaria 5).
  5. Ensamble las piezas descritas en los pasos 1.1–1.4 apilándolas como se muestra en la Figura Suplementaria 6.
  6. Para construir una etapa del microscopio, consulte figura suplementaria6, sección transversal de la etapa del microscopio. Fijar Equation 1 Equation 2 y Equation 3 , Equation 4 entonces y con tornillos. Fijar Equation 4 Equation 5 y con tornillos. Fijar Equation 2 Equation 3 y Equation 6 Equation 5 , Equation 6 Equation 7 y Equation 7 Equation 8 , Equation 5 y Equation 9 , y , y con adhesivo.

2. Esquemas de diseño de hardware

  1. Prepare un "circuito de alimentación y programación" como se muestra en la Figura suplementaria7. Suministre 12 V CC al controlador del calentador desde el terminal J4 conectado al adaptador de CA. Disminuya la tensión de 12 V CC a 3,3 V CC para la fuente de alimentación del circuito mediante un regulador porque la tensión de alimentación de la CPU es de 3,3 V CC.
    NOTA: USB 1 es un terminal para 5 V DC y señal serie de PC de desarrollo. Aunque 5 V DC no es esencial, se utiliza como fuente de alimentación para programar la CPU. Esto también se convierte en 3.3 V DC por el regulador. J1 es un terminal de señal de control en el momento de la programación. Este circuito se aloja en el caso del controlador que se muestra en la Figura suplementaria8.
  2. Prepare un "circuito de control del calentador" como se muestra en la Figura Suplementaria7. Cambie a 12 V CC con Q5 (canal P MOS FET) y suministrelo al calentador. Q5 es un elemento de conmutación que controla 12 V CC con PWM para ajustar la cantidad de energía suministrada al calentador.
    NOTA: El circuito incluye un LED para confirmar visualmente que se está suministrando tensión al calentador. Esta señal de accionamiento (HEATER_C) es una señal PWM de la CPU. Cuando el circuito de protección detecta una señal de sobrecalentamiento, la señal BREAKER cambia a LOW y el funcionamiento del MOS-FET se detiene. Este circuito se aloja en el caso del controlador que se muestra en la Figura suplementaria8.
  3. Prepare un "circuito conector para la unidad del calentador" como se muestra en la Figura Suplementaria7. Instale un conector USB para la conexión con la sección del calentador.
    NOTA: Este circuito se aloja en el caso del controlador que se muestra en la Figura suplementaria 8.
  4. Prepare un "circuito conector para el sensor de temperatura" como se muestra en la Figura suplementaria 7. Monte el conector (Euroblock receptacle 2P) para conectar el sensor de temperatura.
    NOTA: Este circuito se aloja en el caso del controlador que se muestra en la Figura suplementaria 8.
  5. Para un "convertidor A/D" como se muestra en la figura suplementaria7, utilice ADS 1015 como dispositivo de conversión AD.
    NOTA: El dispositivo de conversión AD convierte los valores del sensor de temperatura y del sensor de detección de sobrecalentamiento de voltaje a valores digitales. Este es un dispositivo de conversión AD del multiplexor de 12 bits y está conectado con la CPU con la interfaz I2C. Este circuito se aloja en el caso del controlador que se muestra en la Figura suplementaria8.
  6. Haga un "circuito de protección" como se muestra en la Figura Suplementaria 7 conectando la señal del sensor de detección de sobrecalentamiento (OHS) a la entrada de inversión del amplificador OP. Compare esta señal con la tensión de la resistencia de corte conectada a la entrada no invertida.
    1. Asegúrese de que cuando la tensión sea inferior a la tensión de la resistencia de corte, la salida del amplificador OP sea ALTA, el transistor NPN Q2 conectado se encienda y la señal BREAKER vaya BAJA.
    2. Asegúrese de que, al mismo tiempo, el Q4 se encienda y el indicador de sobrecalentamiento conectado LED D6 se encienda.
      NOTA: Este circuito se aloja en el caso del controlador que se muestra en la Figura suplementaria 8.
  7. Para una "sección de visualización" como se muestra en la Figura suplementaria7, utilice 192 x 64 puntos para OLED. Conéctese con la CPU a través de la interfaz I2C.
    1. Restablezca el OLED separando el GND del OLED por la señal de CPU IO0 utilizando un transistor NPN Q1 conectado al GND del OLED.
      NOTA: Este OLED muestra varios tipos de información. Este circuito se aloja en el caso del controlador que se muestra en la Figura suplementaria8.
  8. Para un "codificador LED y giratorio con interruptor push" en la Figura Suplementaria7, monte un codificador giratorio por soldadura que funcione como un interruptor de empuje e incorpore dos LED.
    1. Conecte un LED a VCC para usarlo como LED de alimentación. El otro está conectado a la CPU para su uso como indicador durante el funcionamiento del calentador.
    2. Utilice un contacto del interruptor de empuje para el calentador START/STOP que está conectado a la CPU. Conecte las salidas A y B del codificador giratorio al conjunto de entrada de E/S en la interrupción de la CPU.
      NOTA: Este circuito se aloja en el caso del controlador que se muestra en la Figura suplementaria 8.
  9. Para la CPU en la figura suplementaria7, utilice la CPU de WROOM - 02D.
    1. Salida de IO12, IO13 a la "unidad de visualización" porque la interfaz de la pantalla es estándar I2C. Conecte IO0 a la "unidad de visualización" y restablezca el OLED.
    2. Conecte IO15 a la "unidad de control del calentador" y controle la potencia suministrada al calentador mediante la salida PWM.
    3. Conecte IO2 a "LED y codificador giratorio con interruptor push" y encienda el LED START. Conecte IO4 e IO14 a "LED y encoder giratorio con interruptor push" y reciba las señales (REA y REB) del codificador giratorio para determinar la temperatura establecida. Conecte IO5 a "LED y codificador giratorio con interruptor pulsador" y inicie/detenga el calentador.

3. Esquema de diseño del software

  1. Utilice Arduino CORE para WROOM - 02D para la CPU como controlador para este sistema.
    NOTA: Como dispositivos de entrada, se utilizan el interruptor de arranque/parada, el codificador giratorio, el sensor de temperatura (termistor). Como dispositivos de salida, se utilizan un LED, una pantalla de caracteres (OLED) y un calentador. El dispositivo de comunicación utiliza Wi-Fi.
  2. Esquema de la operación
    1. Detecte el funcionamiento del codificador giratorio como se muestra en el codificador LED y giratorio con el interruptor de empuje en la Figura suplementaria7, guárdelo como la temperatura establecida y muéstreselo en el OLED. Ajuste el terminal de entrada de la CPU a la que están conectados los terminales de fase REA y REB como terminal de entrada de interrupción y procese la rotación (adelante y atrás) del codificador giratorio mediante interrupción. Establézalo en +1 para la rotación hacia delante y -1 para la rotación inversa. Escriba la temperatura establecida en la variable global y utilíquela para el control de temperatura del calentador. Al mismo tiempo, actualice la visualización de temperatura establecida del OLED.
    2. Identifique el comienzo y la parada por el CPU IO 5 por el Start/stop Switch (SW-S) tal y como se muestra en de la CPU del cuadro suplementario7. El estado del switch de inicio/parada es un proceso de interrupción del temporizador cada 50 ms.
      NOTA: Dado que el interruptor es un interruptor momentáneo, invierte el estado de inicio/parada cuando se empuja y suelta. Este estado se almacena en la variable global.
    3. Utilice un termistor para el sensor de temperatura. Lea los valores medidos del sensor de muestra (consulte "circuito conector para la conexión del calentador" en la Figura suplementaria 7) en la CPU después del convertidor A/D (consulte "Convertidor A/D" en la Figura suplementaria 7). Suministre la corriente al calentador encendiendo el puerto IO15 en la "CPU" de la Figura Suplementaria7.
      NOTA: Hay dos tipos de sensores de temperatura. Uno se utiliza para medir la temperatura de la muestra y controlar el calentador en la temperatura establecida, y el otro se une a un calentador y se utiliza para la prevención del calor. Conecte el termistor a 3,3 V a través de una resistencia y registre el cambio de resistencia como un cambio de voltaje. Elimine un ruido por el método de media móvil.
    4. Utilice un termistor para el sensor de temperatura de prevención de la temperatura. La detección de sobrecalentamiento se realiza utilizando un termistor (R2) ("circuito conector para la conexión del calentador" en la Figura Suplementaria 7), y cuando se supera el valor establecido, la corriente del calentador se apaga ("circuito de protección" en la Figura Suplementaria 7).
      NOTA: Este sensor se incorpora a un circuito y no a través de la CPU. Este sensor es independiente de la CPU y se compara con el valor de resistencia establecido por la recortadora de resistencia por un amplificador diferencial de forma analógica. Cuando detecta que la temperatura ha excedido el valor establecido, interviene en el interruptor FET, que controla la corriente al calentador y detiene por la fuerza el suministro de corriente. El propósito es evitar que la temperatura del calentador supere un cierto nivel incluso en una situación en la que la CPU no funciona correctamente.
    5. Encienda el LED en el "LED & encoder giratorio con interruptor push" de la Figura Suplementaria 7 por la CPU (en la "CPU" de la Figura Suplementaria 7), cuando el equipo esté en funcionamiento.
    6. Muestre la temperatura establecida y el valor medido a OLED en la "sección de visualización" de la Figura Suplementaria 7 por la CPU (en la "CPU" de la Figura Suplementaria 7).
    7. Conduzca el interruptor FET en el "circuito de control del calentador" de la Figura Suplementaria 7 con PWM de la CPU para controlar el calentador.
    8. Controle el calentador mediante PID, en función de las temperaturas medidas adquiridas por el sensor de temperatura. Utilice la biblioteca pid_v1.h de Arduino para el procesamiento de PID.
      NOTA: La CPU calibra la hora, se comunica con el servidor, transmite datos y recibe instrucciones del servidor. Cuando la temperatura del sensor supera la temperatura establecida, la corriente al calentador se establece en 0 y se suprime el rebasamiento.
    9. Utilice la función de conexión Wi-Fi integrada de la CPU y conéctese a Internet. Transmitir ajuste la temperatura, la temperatura del calentador, etc. al servidor designado por Wi-Fi.

4. Configuración del sistema

  1. Compile el sistema de acuerdo con la Figura Suplementaria 9.
  2. Equipa un Wi-Fi con el mando.
  3. Utilice un termistor como sensor para la medición de la temperatura. Conecte el cable del termistor al terminal "SENSOR" de la carcasa del controlador. Reciba la señal de temperatura medida por el termistor.
  4. Conecte una etapa del microscopio que incorpore el calentador de goma y el "HEATER" de la caja del controlador con un cable dedicado. Controle la corriente al calentador de goma.
  5. Cambie la temperatura establecida con la perilla del mando.
    NOTA: La supervisión del registro de temperatura, el ajuste de temperatura se puede operar de forma remota desde un PC o smartphone.
  6. Transfiera la temperatura medida, la temperatura establecida y la información de tiempo en la medición desde el controlador al servidor a través de Internet. El tiempo del ciclo de medición de datos es de 5 s y el tiempo de ciclo para la transferencia de datos al servidor es de 1 min.
  7. Acceda al servidor desde el lado del controlador a intervalos regulares y transfiera los datos de medición almacenados en la CPU del controlador al servidor para su análisis y gráficos.
  8. Consulte el material complementario para saber cómo operar el servidor.

5. Diseño del microscopio invertido lateralmente

  1. Fijar dos placas de aluminio de 15 mm de espesor verticalmente con tornillos para crear un montaje básico.
  2. Fije una plantilla (un lugar) a la parte horizontal del soporte base.
  3. Coloque la parte de la etapa del microscopio verticalmente, conecte las plantillas (dos lugares) a la parte vertical del soporte de base y fije la parte inferior del microscopio al soporte de base.
  4. Fije la etapa del microscopio con tornillos.

6. Método de funcionamiento

NOTA: Aquí, la muestra utilizada es una mezcla de bold Modified Basal Freshwater Nutrient Solution medio de cultivo líquido, metasilicato de sodio, vitaminas y agua estéril. 800 l de esta muestra se diluye en 10 ml de medio de agua dulce.

  1. Método de observación
    1. Inyectar 1.000 l de la muestra preparada en una cámara de vidrio autofabricada.
      NOTA: La cámara de vidrio autofabricada organiza dos gafas deslizantes en paralelo y las fija con un adhesivo. Un plato normal de Petri tiene un gran espesor y las células se escapan en la dirección de profundidad en la cámara, lo que dificulta su observación con un microscopio. Para evitar esto, se hace la cámara con una pequeña dirección de profundidad, lo que permite evitar que las células escapen en la dirección de profundidad en la cámara. Un adhesivo de resina epoxi curable a baja temperatura se utiliza para unirse alrededor del vidrio para evitar que la muestra caiga de la cámara.
    2. Conecte una cámara de vídeo preparada por separado al microscopio. Conecte una cámara de vídeo con el adaptador de lente dedicado del microscopio y tome la muestra.
    3. Utilice un microscopio con un ocular de 10x y un objetivo de 200x.
    4. Fije la etapa vertical del microscopio a un microscopio en cuatro ubicaciones con tornillos de 4 mm.
      NOTA: Consulte la Figura Suplementaria 1A y la Figura Suplementaria 2A para los dibujos de diseño de placas de aluminio. En este experimento, se utilizó un microscopio invertido. Esto se inclinó 90o, y la etapa del microscopio fabricado se fijó con tornillos. Refiera al cuadro1.
    5. Asegure la muestra con dos bandas de goma usando las cuatro garras hechas a lo largo. Coloque una muestra en una etapa del microscopio perpendicular a la superficie del suelo.
    6. Establezca la temperatura a 40 oC con el controlador que se muestra en la Figura suplementaria 8. Gire la perilla del controlador para ajustar la temperatura. Compruebe la temperatura establecida en la pantalla. Pulse la perilla para iniciar el control de temperatura y el LED azul se iluminará. Pulse la perilla de nuevo para apagar el LED y detener el control de temperatura.
      NOTA: La temperatura medida se muestra en tiempo real y el calentador se controla para alcanzar la temperatura establecida. Cuando se inicia el control de temperatura, el LED azul se ilumina y permanece así mientras el calentador está en funcionamiento. Cuando el calentador se sobrecalienta, el LED rojo se enciende y el calentador se detiene automáticamente.
    7. Consulte "El manual de operación del servidor" en la información adicional para el funcionamiento del servidor.
      NOTA: Se requiere un servidor para el almacenamiento de datos. La base de datos del servidor utiliza My-SQL.

7. Medición de la distribución de la temperatura superficial del calentador de caucho

  1. Mida la distribución de la temperatura de la superficie del calentador de caucho por termografía para comprobar la uniformidad de la temperatura.
  2. Coloque la etapa del microscopio que incorporó un calentador de goma con un soporte.
  3. Cambie la temperatura de ajuste de la superficie del calentador de caucho a 35 oC, 45 oC, 55 oC y 65 oC, y mida por la termografía desde la parte delantera (consulte la Figura suplementaria 10).

8. Prueba de respuesta de temperatura

  1. Inicie el control de temperatura ajustando la temperatura establecida de la muestra a 30 oC. Espere hasta que el valor de la medición alcance los 30 oC y se estabilice. Aumente la temperatura preestablecida paso a paso de 5 oC de 30 oC a 50 oC y espere hasta que el valor medido se estabilice siguiendo la temperatura preestablecida respectiva.
  2. Disminuya la temperatura preestablecida de forma escalonada en 5 oC de 50 oC a 30 oC y detecte la capacidad de seguimiento del valor medido.

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Representative Results

La Figura 2 muestra la distribución de la temperatura del calentador de caucho. La temperatura superficial del calentador de goma era uniforme a cada temperatura. La Figura 3 muestra la capacidad de respuesta de la temperatura medida para establecer los cambios de temperatura. La línea naranja muestra la temperatura establecida y la línea azul muestra el cambio de la temperatura de la muestra. El rebasamiento del valor medido al cambio de configuración es pequeño y el seguimiento es rápido.

Se observaron células Diatomeas para proporcionar un ejemplo específico del uso de este dispositivo. El análisis de trayectoria de las células diatomeas móviles es un enfoque útil para evaluar la motilidad de las células diatomeas. Sin embargo, aunque un microscopio invertido normal observa la muestra horizontalmente, no es adecuado para observar la influencia de la gravedad o el movimiento flotante en la dirección vertical.

En este experimento, la etapa del microscopio con el controlador de temperatura se unió a un microscopio invertido que había sido girado 90o. El movimiento vertical dependiente de la temperatura de las diatomeas se registró con éxito. Con este método, se detectó el locus de movimiento vertical de las diatomeas como se muestra en la Figura4. Como resultado de la observación con 100 individuos de diatomeas, la velocidad media fue de 7,01 m/s a temperatura ambiente y 470,1 m/s a 40 oC. Los efectos de la convección térmica en el fenómeno flotante vertical de las células diatomeas se visualizaron mediante observación directa.

Figure 1
Figura 1: Fotografía del dispositivo fijada a la etapa del microscopio. Apariencia del dispositivo fijado a la etapa del microscopio. El dispositivo se fija a la etapa del microscopio con cuatro tornillos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Distribución de la temperatura del calentador de goma. La distribución del calentador de goma medida por termografía. La temperatura del calentador se ha cambiado paso a paso de la temperatura ambiente a 35 oC, 45 oC, 55 oC y 65 oC. La temperatura se distribuyó uniformemente a través del calentador a cada temperatura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Capacidad de respuesta de la señal de temperatura. Esto muestra la respuesta cuando la temperatura de ajuste se eleva de 30 oC a 50 oC y se baja de 50 oC a 30 oC. La temperatura de ajuste se ha cambiado en incrementos de 5oC. En el estado estable, la temperatura medida se encuentra dentro de los 1,5 oC del valor establecido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: El locus del movimiento diatomea. Se han trazado las trayectorias verticales del movimiento diatomea debido a los cambios de temperatura. Las líneas azules muestran trayectorias de células diatomeas a 25 oC para 27.06 s y a 40 oC para 0.2 s. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 1
Figura suplementaria 1: Dibujo de diseño de placas de aluminio (con dimensiones). (A) La placa es de 2 mm de espesor x 150 mm de ancho x 200 mm de largo, con un orificio centrado de 101 mm de diámetro para permitir la inserción del calentador de goma. Cada borde de la placa tiene dos garras mecanizadas a las que se pueden unir bandas de goma para asegurar muestras en el escenario. Para fijar esta etapa vertical a un microscopio con tornillos de 4 mm, los orificios de tornillo de 4,2 mm se perforan en cuatro ubicaciones simétricamente que rodean el orificio central. (B) La placa es de 5 mm de espesor x 150 mm de ancho x 200 mm de largo, con un agujero centrado de 130 mm de diámetro. Ubicaciones de muescas de máquina para que coincidan con las ubicaciones de las garras en la placa de la parte superior para permitir la fijación de bandas de goma que aseguran muestras a través del escenario. Para la fijación de la etapa a un microscopio, se perforan cuatro orificios de tornillo de 4,2 mm en lugares coincidentes con los de la placa de vanguardia. (C) La placa es de 4 mm de espesor x 150 mm de ancho x 200 mm de largo, con un agujero centrado de 130 mm de diámetro. Un palmo de 30 mm se corta fuera del centro de la cara derecha de 200 mm de la placa, a la profundidad del agujero central. Este propósito del corte es permitir la fijación del conector del calentador en el lado derecho. En las mismas posiciones que en la placa de vanguardia, se perforan cuatro orificios de tornillo de 4,2 mm para la fijación del escenario a un microscopio. (D) La placa es de 1,5 mm de espesor x 150 mm de ancho x 200 mm de largo, con un orificio centrado de 30 mm de diámetro. En las mismas posiciones que en la placa de vanguardia, se perforan cuatro orificios de tornillo de 4,2 mm para la fijación del escenario a un microscopio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura suplementaria 2: Dibujo de diseño de placas de aluminio (sin dimensiones). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura suplementaria 3: Dibujo de diseño de pedestales de aluminio. (A) Para ser instalado en la parte superior: el diámetro es de 100 mm, el espesor es de 3 mm. Un orificio de 30 mm de diámetro se perfora en el centro y se hace un recorte de 42 mm de ancho x 30 mm de profundidad en un lado. (B) Para ser instalado en el lado inferior: el diámetro es de 100 mm, el espesor es de 4 mm. Se perfora un agujero de 30 mm de diámetro en el centro, y tres agujeros de 3 mm se han colocado a 120o uno al otro a una distancia de 25 mm del centro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura suplementaria 4: Dibujo de diseño de discos de corcho prensados. (A) Para ser instalado en el lado superior entre el calentador de caucho de silicio y el pedestal superior de aluminio: diámetro es de 100 mm, espesor es de 2 mm. Un orificio de 20 mm de diámetro se perfora en el centro, y dos cortes (42 mm de ancho x 30 mm de profundidad, 4 mm de ancho x 40 mm) se hacen en ángulo recto entre sí en los lados del disco. (B) Para ser instalado en el lado inferior entre el calentador de caucho de silicio y el pedestal de aluminio inferior: diámetro es de 100 mm, espesor es de 1 mm. Se perfora un orificio de 20 mm de diámetro en el centro. (C) Este soporte es de 42 mm de ancho a 30 mm de profundidad, y se corta a partir de la circunferencia de un disco de 100 mm de diámetro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura suplementaria 5: Especificación del calentador de goma de silicona. El diámetro es de 100 mm y el espesor es de 2,5 mm. Se perfora un orificio de 20 mm de diámetro en el centro. La fuente de alimentación es de 12 V, con una capacidad de carga de 18 W. El calentador consiste en alambre Nichrome, con un cable de plomo conectado al electrodo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura suplementaria 6: Sección transversal de la etapa del microscopio. Esta es una vista seccional de la etapa del microscopio. El pedestal de aluminio está unido a la placa de aluminio de la parte posterior y el calentador de goma se instala en la superficie más externa. El corcho prensado se instala para el aislamiento entre el calentador de goma y el pedestal de aluminio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura suplementaria 7: Detalles del diagrama de circuito. Esto indica el circuito construido en el regulador. El diagrama de circuito se divide en nueve partes según funciones individuales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura suplementaria 8: Diseño de dibujo de la caja del controlador de plástico. Las dimensiones son de 143,9 mm de longitud x 85,3 mm de profundidad x 25 mm de ancho. La perilla de ajuste de temperatura, la lámpara de funcionamiento/sobrecalentamiento y el indicador se encuentran en la caja del controlador de plástico. La temperatura se puede ajustar mientras se observa el indicador girando la perilla de ajuste. Al pulsar esta perilla se inicia el controlador de temperatura. La temperatura medida se muestra en tiempo real, y el calentador se controla de modo que alcanza y mantiene la temperatura establecida. Cuando el controlador de temperatura está encendido, el LED azul se ilumina y permanece encendido mientras el calentador está en funcionamiento. Cuando el calentador se sobrecalienta, el LED rojo se enciende y el calentador se detiene automáticamente. Al pulsar la perilla del controlador de temperatura de nuevo se detendrá. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura suplementaria 9: Configuración del sistema. La etapa del microscopio con un controlador incorporado está conectada al calentador de goma con un cable dedicado. Se reciben señales de temperatura de muestra medidas, y la corriente al calentador de goma es transmitida por el controlador. Las señales medidas del controlador se envían de forma inalámbrica al servidor a través del router de Internet. El servidor compila datos de medición para análisis y gráficos. La supervisión del registro de temperatura y los ajustes de temperatura se pueden controlar de forma remota a través de un PC o smartphone. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 10
Figura suplementaria 10: Medición de la distribución de la temperatura por termografía. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El análisis de trayectoria de las células diatomeas móviles es un enfoque útil para evaluar la motilidad del diatomea. Sin embargo, mientras que un microscopio invertido normal observa muestras horizontalmente, no es adecuado para observaciones de la influencia de la gravedad o el movimiento flotante en la dirección vertical. Desarrollado y descrito aquí es una etapa vertical del microscopio con control de temperatura y unido a un microscopio invertido, que ha sido girado 90o. Esta etapa del microscopio con control de temperatura permite la observación del movimiento vertical dependiente de la temperatura de las células diatomeas.

Un paso crítico dentro del protocolo es el diseño del circuito del controlador. Se implementó un circuito de disyuntores para garantizar la seguridad. Cuando el sensor está desconectado de la muestra o el microcontrolador no funciona correctamente, la corriente al calentador se corta mediante un circuito diferente del microcontrolador.

Dado que el sistema de control adoptó el sistema PID para controlar la corriente del calentador, se requiere una técnica para encontrar el parámetro óptimo del PID. En comparación con el método existente, la función Wi-Fi, la recopilación de datos en un servidor y la función de ajuste de temperatura son posibles mediante la función Wi-Fi, la recopilación de datos en un servidor y la función de ajuste de temperatura. Como la estructura de la parte escénica unida al microscopio es complicada, la simplificación de esta estructura justifica un estudio futuro.

Este equipo utiliza un calentador para elevar la temperatura, pero la refrigeración no funciona; por lo tanto, la temperatura establecida no puede estar por debajo de la temperatura ambiente. Las muestras de refrigeración a temperaturas inferiores a la temperatura ambiente requerirán un dispositivo de refrigeración complicado, que está en consideración para el trabajo futuro.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos que revelar.

Acknowledgments

Los autores no tienen reconocimientos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AC adapter 12V2A Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. AD-D120P200 Tokyo, Japan
ADS1015 Substrate Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. adafruit PRODUCT ID: 1083 Tokyo, Japan
Alminium Plate (Back Side Plate) Inoval Co., Ltd. W 150mm×L 200?×T 1.5mm Gifu, Japan
Alminium Plate (Forefront Plate) Inoval Co., Ltd. W 150mm×L 200?×T 2mm Gifu, Japan
Alminium Plate (Middle Lower Plate) Inoval Co., Ltd. W 150mm×L 200?×T 4mm Gifu, Japan
Alminium Plate (Middle Upper Plate) Inoval Co., Ltd. W 150mm×L 200?×T 5mm Gifu, Japan
Aluminum Pedestal (Lower Plate) Inoval Co., Ltd. D 100mm×T 3mm (30Φ) Gifu, Japan
Aluminum Pedestal (Upper Plate) Inoval Co., Ltd. D 100mm×T 3mm (30Φ) Gifu, Japan
Bold Modified Basal Freshwater Nutrient Solution Sigma-Aldrich Co. LLC B5282-500ML St. Louis, USA
Controller Case Marutsu Elec Co., Ltd. pff-13-3-9 Tokyo, Japan
CPU Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. ESP-WROOM-02D Tokyo, Japan
Inverted microscope Olympus Corporation CKX 53 Tokyo, Japan
Low temperature hardening epoxy resin adhesive ThreeBond Co., Ltd. TB2086M Tokyo, Japan
Multi-turn semi-fixed volume Vertical type 500 Ω Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. 3296W-1-501LF Tokyo, Japan
OLED module Akihabara Inc. M096P4W Tokyo, Japan
Pressed Cork (For supporting electrode ) Tera Co., Ltd. W 42mm×L 30? Ishikawa, Japan
Pressed Cork (Lower Disk) Tera Co., Ltd. D 100mm×T 0.5mm (20Φ) Ishikawa, Japan
Pressed Cork (Upper Disk) Tera Co., Ltd. D 100mm×T 2.5mm (20Φ) Ishikawa, Japan
Rotary encoder with switch with 2 color LED Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. P-05772 Tokyo, Japan
Silicone rubber heater Three High Co., Ltd. D 100mm×T 2.5mm (20Φ) Kanagawa, Japan
Substrate Seeed Technology Co., Ltd. mh5.0 Shenzhen, China
Temperature sensor Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. NXFT15XH103FA2B050 Tokyo, Japan
Three-terminal DC / DC regulator 3.3 V Marutsu Elec Co., Ltd. BR301 Tokyo, Japan
Universal Flexible Arm Banggood Technology Co., Ltd. YP-003-2 Hong Kong, China
USB cable USB-A - MicroUSB Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. USB CABLE A-MICROB Tokyo, Japan
Video Canera Sony Corporation HDR-CX590 Tokyo, Japan

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