Herstellung von Mikroskopbühne für vertikale Beobachtung mit Temperaturregelungsfunktion

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Summary

Hier wird ein Protokoll mit einer temperaturgesteuerten Mikroskopstufe vorgestellt, mit der ein Probenbehälter auf einem vertikalen Mikroskop montiert werden kann.

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Matsukawa, Y., Ide, Y., Umemura, K. Fabrication of Microscope Stage for Vertical Observation with Temperature Control Function. J. Vis. Exp. (149), e59799, doi:10.3791/59799 (2019).

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Abstract

Die Proben werden in der Regel zur mikroskopischen Beobachtung auf eine horizontale Mikroskopstufe gelegt. Um jedoch den Einfluss der Schwerkraft auf eine Probe oder das Verhalten der Studie über Wasser zu beobachten, ist es notwendig, das Mikroskop-Stadium vertikal zu machen. Dazu wurde ein seitlich um 90° geneigtes Mikroskop entwickelt. Um Proben mit diesem Mikroskop zu beobachten, müssen Probenbehälter wie Petrischalen oder Glasgweise vertikal auf der Bühne befestigt werden. Es wurde ein Gerät entwickelt, das Probenbehälter auf einer vertikalen Mikroskopbühne sichern kann und wird hier beschrieben. Die Befestigung dieses Geräts an der Bühne ermöglicht die Beobachtung der Probendynamik in der vertikalen Ebene. Die Möglichkeit, die Temperatur mit einem Silikonkautschukheizer zu regulieren, ermöglicht auch die Beobachtung temperaturabhängiger Probenverhalten. Darüber hinaus werden die Temperaturdaten an einen Internetserver übertragen. Temperatureinstellungen und Protokollüberwachung können von einem PC oder Smartphone aus der Ferne gesteuert werden.

Introduction

Optische Mikroskopie ist eine Technik, die verwendet wird, um beobachtbare Details durch Vergrößerung einer Probe mit Linsen und sichtbarem Licht zu erhöhen. In der optischen Mikroskopie wird das Licht auf eine Probe gerichtet und dann übertragenes, reflektiertes oder fluoreszierendes Licht von Vergrößerungslinsen zur Beobachtung erfasst. Es stehen verschiedene Mikroskoptypen zur Verfügung, die sich im Design unterscheiden, um unterschiedlichen Anwendungen und Beobachtungsmethoden gerecht zu werden. Zu den verschiedenen Ausführungen gehören ein aufrechtes Mikroskop, das so strukturiert ist, dass es eine Probe von unten zur Beobachtung von oben beleuchtet, und ein invertiertes Mikroskop, das die Probe von oben zur Beobachtung von unten beleuchtet. Aufrechte Mikroskope sind das am weitesten verbreitete und am weitesten verbreitete Design. Invertierte Mikroskope werden häufig verwendet, um Proben zu beobachten, die eine Linse nicht in der Nähe von oben zulassen können, wie z. B. kultivierte Zellen, die an der Unterseite eines Behälters haften. Viele Forschungsgruppen haben Beobachtungen in einer Vielzahl von Bereichen mit invertierten Mikroskopen1,2,3,4,5,6,7berichtet. Viele zusätzliche Geräte wurden auch entwickelt, die die Vorteile der invertierten Mikroskopenutzen 8,9,10,11,12,13 .

Derzeit ist die Mikroskopstufe in allen konventionellen Mikroskop-Designs horizontal und daher ungeeignet für die Beobachtung von Proben, die Bewegungen in der vertikalen Ebene erzeugen (aufgrund von Schwerkraft, Auftrieb, Bewegung usw.). Um diese Beobachtungen zu ermöglichen, müssen die Mikroskopstufe und der Lichtweg auf vertikal gedreht werden. Die vertikale Bühne ist erforderlich, um Glasschlitten oder Probenbehälter wie eine Petrischale vertikal auf die Bühne zu montieren. Um dem entgegenzuwirken, wurde bereits ein seitlich um 90° geneigtes Mikroskop entwickelt. Das Anbringen von Proben mit Klebeband oder anderen Klebstoffen führt jedoch nicht zu der notwendigen langfristigen Unbeweglichkeit. Hier wird ein Gerät beschrieben, das die notwendige Stabilität erreichen kann. Dieses Gerät ermöglicht die Beobachtung der Probenbewegung in der vertikalen Ebene über die Zeit. Die Montage einer Siliziumkautschukheizung hat es auch ermöglicht, den Einfluss von Temperaturschwankungen auf das Probenverhalten zu beobachten. Temperaturdaten werden per WI-Fi an einen Internetserver übertragen, temperatureinstellungen und Protokollüberwachung können von einem PC oder Smartphone aus der Ferne gesteuert werden. Unserer Kenntnis nach wurde die Bühne, die an einem seitlich geneigten Mikroskop befestigt ist, das um 90° geneigt ist, in früheren Studien noch nicht berichtet.

Die Mikroskopstufe besteht aus drei Aluminiumplatten. Die mittlere Aluminiumplatte ist an der unteren Aluminiumplatte befestigt, die an der Bühne befestigt ist. Der Silikonkautschuk, der den Temperatursensor enthält, wird zwischen der mittleren und oberen Aluminiumplatte befestigt. Gummibänder werden verwendet, um das Sample anzubringen. Krallen sind in der linken und rechten vier Punkte der oberen Aluminiumplatte befestigt, um die Gummibänder zu sichern. Der Regelkreis des Temperaturreglers empfängt ein Signal vom in Silikonkautschuk eingebetteten Temperatursensor und moduliert die elektrische Leistung durch die Pulsweitenmodulation (PWM). Die Temperatur kann schrittweise in Schritten von 1 °C auf 50 °C erhöht werden. Dieses Gerät ist nützlich für Anwendungen, bei denen vertikale Probenbewegungen temperaturabhängig sein können.

Dieser Bericht enthält Beispiele für Temperatureffekte auf das schwimmende Phänomen der Diatomeen. Als Beispiele für Diatomebeobachtungsstudien wurden Messungen der Sedimentationsgeschwindigkeit von Zellclustern, Bewegungsanalysen, ultrafeine Strukturstudien usw. berichtet14,15,16,17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. Die spezifische Schwerkraft von Diatomen, die im Wasser mit photosynthetischen Organismen schwimmen, ist etwas höher als die von Wasser, so dass sie tendenziell sinken; sie werden jedoch steigen, wenn auch nur eine leichte Konvektion auftritt. Um dieses Phänomen zu untersuchen, wird ein Glasschlitten vertikal auf einer Mikroskopstufe angebracht, und die Auswirkungen der steigenden Temperatur auf die vertikale Diabewegung werden beobachtet.

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Protocol

1. Design

  1. Herstellung von Aluminiumplatten
    1. Schneiden Sie ein 101 mm Loch in der Mitte einer Aluminiumplatte von den Abmessungen 150 mm x 200 mm x 2 mm, um als Vorderplatte mit einer Laserbearbeitungsmaschine verwendet zu werden. Maschinenklauen an acht Punkten, um zwei Gummibänder über die Länge oder zwei über die Breite dieser Platte zu befestigen (siehe Ergänzungsfigur 1A und Ergänzende Abbildung 2A).
    2. Schneiden Sie ein 130-mm-Loch in der Mitte einer weiteren 150 mm x 200 mm x 5 mm Aluminiumplatte, die als mittlere obere Platte mit einer Laserbearbeitungsmaschine verwendet werden soll. Maschine acht Kerben zum Anbringen von Gummibändern an zwei Punkten über die Länge oder zwei über die Breite dieser Platte (siehe Ergänzungsfigur 1B und Ergänzende Abbildung 2B).
    3. Schneiden Sie ein 130-mm-Loch in der Mitte einer 150 mm x 200 mm x 4 mm Aluminiumplatte, die als mittlere Unterplatte mit einer Laserbearbeitungsmaschine verwendet werden soll (siehe Ergänzungsfigur 1C und Ergänzende Abbildung 2C).
    4. Schneiden Sie eine 30-mm-Bohrung in der Mitte einer 150 mm x 200 mm x 1,5 mm Aluminiumplatte, die als Grundplatte verwendet werden soll (siehe Ergänzungsfigur 1D und Ergänzende Abbildung 2D).
  2. Herstellung von zwei Aluminiumsockel
    1. Schneiden Sie ein 30 mm Loch in der Mitte der Aluminiumplatte (100 mm Durchmesser, 3 mm Dicke) und machen Sie eine Kerbe von einer Seite mit den Abmessungen 42 mm breit x 30 mm tief (siehe Ergänzungsfigur 3A).
    2. Schneiden Sie ein 30-mm-Loch in der Mitte der Platte in eine Aluminiumplatte (100 mm Durchmesser, 4 mm Dicke) und bohren Sie drei 3 mm Löcher, die sich 25 mm von der Mitte entfernt befinden, 120° voneinander entfernt (siehe Ergänzungsfigur 3B).
  3. Herstellung von drei gepressten Korkscheiben
    1. Schneiden Sie ein 20 mm Loch in der Mitte der gepressten Korkscheibe (100 mm Durchmesser, 2 mm Dicke) mit einer Wasserstrahlschneidmaschine. Machen Sie einen Schnitt 42 mm über x 30 mm tief, dann einen Schnitt 4 mm breit x 5 mm tief (siehe Ergänzungsfigur 4A).
    2. Schneiden Sie ein 20 mm Loch in der Mitte der gepressten Korkscheibe mit den Abmessungen 100 mm Durchmesser, 1 mm Dicke mit einer Wasserstrahlschneidemaschine. Machen Sie einen Schnitt 42 mm über x 30 mm tief, einen Schnitt 4 mm breit x 40 mm tief (siehe Ergänzungsfigur 4B).
    3. Schneiden Sie eine gepresste Korkplatte aus einer Scheibe mit einem Durchmesser von 100 mm mit einer Breite von 42 mm und einer Tiefe von 30 mm. Es werden zwei Bleche mit einer Dicke von 1 mm und ein Blatt mit einer Dicke von 2 mm benötigt (siehe Zusatzabbildung 4C).
  4. Herstellung von Silikon-Kautschuk-Heizung
    1. Fertigen Sie eine Heizung mit einer Scheibe mit einem Durchmesser von 100 mm aus 2,5 mm starkem Siliziumkautschuk mit eingebautem Nichrome-Draht und schneiden Sie ein 20-mm-Loch in der Mitte der Scheibe (siehe Ergänzende Abbildung 5).
  5. Montieren Sie die in den Schritten 1.1–1.4 beschriebenen Teile, indem Sie sie stapeln, wie in ergänzender Abbildung 6 dargestellt.
  6. Um eine Mikroskopstufe zu konstruieren, siehe Ergänzungsfigur 6, Querschnitt der Mikroskopstufe. Fix Equation 1 Equation 2 und Equation 3 , Equation 4 dann und mit Schrauben. Fix Equation 4 Equation 5 und mit Schrauben. Fix Equation 2 Equation 3 und Equation 6 Equation 5 , Equation 6 Equation 7 und Equation 7 Equation 8 , Equation 5 und Equation 9 , und , und, und und mit Klebstoff.

2. Hardware-Design-Umrisse

  1. Bereiten Sie eine "Stromversorgungs- und Programmierschaltung" vor, wie in ergänzender Abbildung 7dargestellt. 12 V DC an den Heizregler von der J4-Klemme an den Netzadapter angeschlossen. Verringern Sie die Spannung von 12 V DC auf 3,3 V DC für die Stromleitung der Schaltung mit einem Regler, da die CPU-Versorgungsspannung 3,3 V DC ist.
    HINWEIS: USB 1 ist ein Terminal für 5 V DC und serielles Signal der Entwicklung PC. Obwohl 5 V DC nicht unbedingt erforderlich ist, wird es als Stromquelle verwendet, um die CPU zu programmieren. Dies wird auch durch den Regler auf 3,3 V DC umgestellt. J1 ist eine Steuersignalklemme zum Zeitpunkt der Programmierung. Diese Schaltung ist im Controller-Gehäuse untergebracht, das in der ergänzenden Abbildung 8dargestellt ist.
  2. Bereiten Sie einen "Heizsteuerungskreis" vor, wie in Der Zusatzabbildung 7dargestellt. Schalten Sie auf 12 V DC mit Q5 (P-Kanal MOS FET) und liefern Sie es an die Heizung. Q5 ist ein Schaltelement, das 12 V DC mit PWM steuert, um die Strommenge der Heizung einzustellen.
    HINWEIS: Die Schaltung enthält eine LED, um visuell zu bestätigen, dass die Spannung an die Heizung geliefert wird. Dieses Antriebssignal (HEATER_C) ist ein PWM-Signal von der CPU. Wenn ein Überhitzungssignal von der Schutzschaltung erkannt wird, schaltet das BREAKER-Signal auf LOW um und der Betrieb des MOS-FET stoppt. Diese Schaltung ist im Controller-Gehäuse untergebracht, das in der ergänzenden Abbildung 8dargestellt ist.
  3. Bereiten Sie eine "Verbindungsschaltung für Heizungseinheit" vor, wie in DerZusätzlichenabbildung 7dargestellt. Installieren Sie einen USB-Anschluss für den Anschluss an den Heizbereich.
    HINWEIS: Diese Schaltung ist im Controller-Gehäuse untergebracht, das in der ergänzenden Abbildung 8dargestellt ist.
  4. Bereiten Sie eine "Verbindungsschaltung für Temperatursensor" vor, wie in der ergänzenden Abbildung 7 dargestellt. Montieren Sie den Stecker (Euroblock-Buchse 2P), um den Temperatursensor anzuschließen.
    HINWEIS: Diese Schaltung ist im Controller-Gehäuse untergebracht, das in der ergänzenden Abbildung 8dargestellt ist.
  5. Verwenden Sie für einen "A/D-Wandler" wie in Ergänzender Abbildung 7dargestellt ADS 1015 als AD-Konvertierungsgerät.
    HINWEIS: Das AD-Konvertierungsgerät konvertiert die Werte des Temperatursensors und des Überhitzungserkennungssensors von Spannung in digitale Werte. Dies ist ein 12-Bit-Multiplexer AD-Konvertierungsgerät und ist mit der CPU über die I2C-Schnittstelle verbunden. Diese Schaltung ist im Controller-Gehäuse untergebracht, das in der ergänzenden Abbildung 8dargestellt ist.
  6. Machen Sie eine "Schutzschaltung", wie in Der ergänzungslegungsbild 7 dargestellt, indem Sie das OhS-Signal (Overheat Detection Sensor) an den invertierenden Eingang des OP-Amperdes anschließen. Vergleichen Sie dieses Signal mit der Spannung des Trimmerwiderstands, der an den nicht invertierenden Eingang angeschlossen ist.
    1. Stellen Sie sicher, dass, wenn die Spannung niedriger als die Spannung des Trimmerwiderstands wird, der Ausgang des OP-Verstärkers HIGH geht, der angeschlossene NPN-Transistor Q2 einschaltet und das BREAKER-Signal LOW wird.
    2. Stellen Sie sicher, dass gleichzeitig Q4 eingeschaltet wird und die angeschlossene Überhitzungsanzeige LED D6 leuchtet.
      HINWEIS: Diese Schaltung ist im Controller-Gehäuse untergebracht, das in der ergänzenden Abbildung 8dargestellt ist.
  7. Verwenden Sie für einen "Anzeigebereich" wie in Ergänzungsabbildung 7dargestellt 192 x 64 Punkte für OLED. Verbinden Sie sich mit der CPU über die I2C-Schnittstelle.
    1. Setzen Sie die OLED zurück, indem Sie die GND der OLED durch das CPU-Signal IO0 mit einem NPN-Transistor Q1 trennen, der mit dem GND der OLED verbunden ist.
      HINWEIS: Diese OLED zeigt verschiedene Arten von Informationen an. Diese Schaltung ist im Controller-Gehäuse untergebracht, das in der ergänzenden Abbildung 8dargestellt ist.
  8. Für einen "LED & Drehgeber mit Schiebeschalter" in Ergänzungsfigur 7montieren Sie einen Drehgeber durch Lötmittel, der als Schiebeschalter fungiert und zwei LEDs enthält.
    1. Schließen Sie eine LED an VCC an, um sie als Power-LED zu verwenden. Die andere ist an die CPU angeschlossen, um sie während des Heizbetriebs als Indikator zu verwenden.
    2. Verwenden Sie einen Push-Schalter-Kontakt für die Heizung START/STOP, die an die CPU angeschlossen ist. Schließen Sie die A- und B-Ausgänge des Drehgebers an den IM CPU-Interrupt eingestellten IO-Eingang an.
      HINWEIS: Diese Schaltung ist im Controller-Gehäuse untergebracht, das in der ergänzenden Abbildung 8dargestellt ist.
  9. Verwenden Sie für die CPU in Supplemental Figure 7die CPU von WROOM - 02D.
    1. Ausgabe von IO12, IO13 an die "Anzeigeeinheit", da die Schnittstelle des Displays I2C-Standard ist. Verbinden Sie IO0 mit "Anzeigeeinheit" und setzen Sie die OLED zurück.
    2. Verbinden Sie IO15 mit "Heizungssteuergerät" und steuern Sie die Stromversorgung der Heizung durch PWM-Ausgang.
    3. Verbinden Sie IO2 mit "LED & Drehgeber mit Push-Schalter" und leuchten Sie die START-LED. Verbinden Sie IO4 und IO14 mit "LED & Drehgeber mit Push-Schalter" und empfangen Sie die Signale (REA und REB) vom Drehgeber, um die eingestellte Temperatur zu bestimmen. Verbinden Sie IO5 mit "LED & Drehgeber mit Push-Schalter" und starten/stoppen Sie die Heizung.

3. Software-Design-Umriss

  1. Verwenden Sie Arduino CORE für WROOM - 02D für die CPU als Controller für dieses System.
    HINWEIS: Als Eingangsgeräte werden Start-/Stoppschalter, Drehgeber, Temperatursensor (Thermistor) verwendet. Als Ausgangsgeräte werden eine LED, eine Zeichenanzeige (OLED) und eine Heizung verwendet. Das Kommunikationsgerät verwendet Wi-Fi.
  2. Gliederung der Operation
    1. Erkennen Sie den Betrieb des Drehgebers, wie im LED-Und-Drehgeber mit dem Schiebeschalter in Supplemental Figure 7gezeigt, speichern Sie ihn als eingestellte Temperatur und zeigen Sie ihn auf der OLED an. Stellen Sie die Eingangsklemme der CPU ein, an die die Phasenklemmen REA und REB als Interrupt-Eingangsklemme angeschlossen sind, und verarbeiten Sie die Drehung (vorwärts und rückwärts) des Drehgebers durch Interrupt. Stellen Sie es auf +1 für vorwärts drehen und -1 für die Rückwärtsdrehung. Schreiben Sie die eingestellte Temperatur auf die globale Variable und verwenden Sie sie für die Heizungstemperaturregelung. Aktualisieren Sie gleichzeitig die eingestellte Temperaturanzeige der OLED.
    2. Identifizieren Sie Start und Stopp durch CPU IO 5 durch Start/Stop-Schalter (SW-S), wie in der CPU von Supplemental Abbildung 7gezeigt. Der Zustand des Start-Stopp-Schalters ist ein Timer-Interrupt-Prozess alle 50 ms.
      HINWEIS: Da der Schalter ein momentaner Schalter ist, kehrt er den Start-/Stopp-Zustand um, wenn er gedrückt und freigegeben wird. Dieser Status wird in der globalen Variablen gespeichert.
    3. Verwenden Sie einen Thermistor für den Temperatursensor. Lesen Sie die Messwerte des Probensensors (siehe "Verbindungsschaltung für Heizungsanschluss" in Ergänzungsabbildung 7) in die CPU nach A/D-Wandler (siehe "A/D-Wandler" in ergänzender Abbildung 7). Geben Sie den Strom an die Heizung an, indem Sie den IO15-Port in der "CPU" von Supplemental Figure 7einschalten.
      HINWEIS: Es gibt zwei Arten von Temperatursensoren. Eines wird verwendet, um die Temperatur der Probe zu messen und die Heizung auf der eingestellten Temperatur zu steuern, und das andere wird an einer Heizung befestigt und zur Hitzevermeidung verwendet. Schließen Sie den Thermistor über einen Widerstand an 3,3 V an und zeichnen Sie die Widerstandsänderung als Spannungsänderung auf. Entfernen Sie ein Rauschen durch die Methode des gleitenden Durchschnitts.
    4. Verwenden Sie einen Thermistor zur Temperaturvermeidung Temperatursensor. Die Überhitzungserkennung erfolgt mit einem Thermistor (R2) ("Steckverbinderschaltung für Heizungsanschluss" in Ergänzender Abbildung 7), und wenn der eingestellte Wert überschritten wird, wird der Heizstrom abgeschaltet ("Schutzschaltung" in ergänzender Abbildung 7).
      HINWEIS: Dieser Sensor wird in eine Schaltung integriert und nicht über die CPU. Dieser Sensor ist unabhängig von der CPU und wird analog mit dem Widerstandswert verglichen, den der Widerstandstrimmer durch einen Differentialverstärker setzt. Wenn er erkennt, dass die Temperatur den eingestellten Wert überschritten hat, greift er in den FET-Schalter ein, der den Strom zum Heizer steuert und die Stromzufuhr gewaltsam stoppt. Ziel ist es, zu verhindern, dass die Temperatur der Heizung ein bestimmtes Niveau überschreitet, selbst wenn die CPU nicht richtig funktioniert.
    5. Schalten Sie die LED im "LED & Drehgeber mit Schiebeschalter" der Zusatzfigur 7 durch die CPU ein (in der "CPU" der Zusatzabbildung 7), wenn das Gerät in Betrieb ist.
    6. Zeigen Sie die eingestellte Temperatur und den Messwert für OLED im "Anzeigebereich" der Zusatzfigur 7 durch die CPU an (in der "CPU" der ergänzenden Abbildung 7).
    7. Fahren Sie den FET-Schalter in den "Heizregelkreis" von Supplemental Figur 7 mit PWM von der CPU, um die Heizung zu steuern.
    8. Steuern Sie die Heizung durch PID, basierend auf den vom Temperatursensor erfassten Gemessenen Temperaturen. Verwenden Sie arduines pid_v1.h-Bibliothek für die PID-Verarbeitung.
      HINWEIS: Die CPU kalibriert die Zeit, kommuniziert mit dem Server, überträgt Daten und empfängt Anweisungen vom Server. Wenn die Sensortemperatur die eingestellte Temperatur überschreitet, wird der Strom zum Heizer auf 0 gesetzt, und die Überschreitung wird unterdrückt.
    9. Verwenden Sie die integrierte Wi-Fi-Verbindungsfunktion der CPU und stellen Sie eine Verbindung zum Internet her. Übertragen Sie die Temperatur, Die Heiztemperatur usw. per Wi-Fi an den angegebenen Server.

4. Systemkonfiguration

  1. Bauen Sie das System gemäß Ergänzende Abbildung 9.
  2. Rüsten Sie ein Wi-Fi mit dem Controller aus.
  3. Verwenden Sie einen Thermistor als Sensor für die Temperaturmessung. Schließen Sie den Thermistordraht an die Klemme "SENSOR" am Controllergehäuse an. Empfangen Sie das vom Thermistor gemessene Temperatursignal.
  4. Schließen Sie eine Mikroskopstufe mit der Gummiheizung und dem "HEATER" des Controllergehäuses mit einem speziellen Kabel an. Steuern Sie den Strom auf die Gummiheizung.
  5. Ändern Sie die eingestellte Temperatur mit dem Knopf am Controller.
    HINWEIS: Temperaturprotokollüberwachung, Temperatureinstellung kann aus der Ferne von einem PC oder Smartphone aus betrieben werden.
  6. Übertragen Sie die gemessene Temperatur, die eingestellte Temperatur und die Zeitinformationen bei der Messung vom Controller über das Internet auf den Server. Die Datenmesszykluszeit beträgt 5 s und die Zykluszeit für die Datenübertragung zum Server 1 min.
  7. Greifen Sie in regelmäßigen Abständen von der Controllerseite auf den Server zu und übertragen Sie die in der CPU des Controllers gespeicherten Messdaten zur Analyse und Graphik an den Server.
  8. Informationen zum Betrieb des Servers finden Sie im ergänzenden Material.

5. Design des seitlich invertierten Mikroskops

  1. Befestigen Sie zwei Aluminiumplatten von 15 mm Dicke vertikal mit Schrauben, um eine Basishalterung zu erstellen.
  2. Befestigen Sie eine Vorrichtung (eine Stelle) am horizontalen Teil der Basishalterung.
  3. Platzieren Sie das Mikroskop-Bühnenteil vertikal, befestigen Sie die Vorrichtungen (zwei Stellen) am vertikalen Teil des Basisständers und fixieren Sie den Boden des Mikroskops am Grundständer.
  4. Fixieren Sie die Mikroskopstufe mit Schrauben.

6. Arbeitsweise

HINWEIS: Hier bei der verwendeten Probe handelt es sich um eine Mischung aus Fett modifizierter Basal-Süßwasser-Nährstofflösung, Flüssigkulturmedium, Natriummetasilikat, Vitaminen und sterilem Wasser. 800 l dieser Probe werden in 10 ml Frischwassermedium verdünnt.

  1. Beobachtungsmethode
    1. In jizieren Sie 1.000 l der vorbereiteten Probe in eine selbstgebaute Glaskammer.
      HINWEIS: Die selbstgebaute Glaskammer ordnet zwei Gleitgläser parallel an und fixiert sie mit einem Klebstoff. Eine normale Petrischale hat eine große Dicke und Zellen entweichen in die Tiefe richtungsweisend in der Kammer, was die Beobachtung mit einem Mikroskop erschwert. Um dies zu verhindern, wird die Kammer mit einer kleinen Tiefenrichtung hergestellt, wodurch verhindert werden kann, dass die Zellen in tiefen Richtung in der Kammer entweichen. Ein niedertemperaturhärtender Epoxidharzkleber wird verwendet, um das Glas zu verkleben, um zu verhindern, dass die Probe aus der Kammer fällt.
    2. Befestigen Sie eine separat vorbereitete Videokamera am Mikroskop. Schließen Sie eine Videokamera mit dem speziellen Objektivadapter des Mikroskops an und schießen Sie die Probe.
    3. Verwenden Sie ein Mikroskop mit einem 10x Okular und 200x Objektiv.
    4. Befestigen Sie die vertikale Mikroskopstufe an vier Stellen mit 4 mm Schrauben an einem Mikroskop.
      HINWEIS: Siehe Ergänzende Abbildung 1A und Ergänzende Abbildung 2A für Konstruktionszeichnungen von Aluminiumplatten. In diesem Experiment wurde ein invertiertes Mikroskop verwendet. Diese wurde um 90° gekippt und die gefertigte Mikroskopbühne mit Schrauben befestigt. Siehe Abbildung 1.
    5. Sichern Sie die Probe mit zwei Gummibändern mit den vier Krallen, die in der Längsrichtung hergestellt werden. Legen Sie eine Probe senkrecht zur Bodenoberfläche auf eine Mikroskopbühne.
    6. Stellen Sie die Temperatur auf 40 °C mit dem in Der Zusatzabbildung 8dargestellten Regler ein. Drehen Sie den Reglerknopf, um die Temperatur einzustellen. Überprüfen Sie die eingestellte Temperatur auf dem Display. Drücken Sie den Knopf, um die Temperaturregelung zu starten, und die blaue LED leuchtet auf. Drücken Sie den Knopf erneut, um die LED auszuschalten und die Temperaturregelung zu stoppen.
      HINWEIS: Die gemessene Temperatur wird in Echtzeit angezeigt, und die Heizung wird gesteuert, um die eingestellte Temperatur zu erreichen. Wenn die Temperaturregelung gestartet wird, leuchtet die blaue LED auf und bleibt so, während die Heizung in Betrieb ist. Wenn die Heizung überhitzt, leuchtet die rote LED, und die Heizung stoppt automatisch.
    7. Weitere Informationen zum Serverbetrieb finden Sie unter "Serverbetriebshandbuch".
      HINWEIS: Ein Server für die Datenspeicherung ist erforderlich. Die Datenbank des Servers verwendet My-SQL.

7. Messung der Oberflächentemperaturverteilung von Kautschukheizungen

  1. Messen Sie die Verteilung der Gummiheizungsoberflächentemperatur durch Thermographie, um die Temperaturgleichmäßigkeit zu überprüfen.
  2. Befestigen Sie die Mikroskopstufe, die eine Gummiheizung mit einem Ständer eingebaut hat.
  3. Ändern Sie die Einstelltemperatur der Gummiheizungsoberfläche auf 35 °C, 45 °C, 55 °C und 65 °C, und messen Sie die Thermographie von vorne (siehe Ergänzende Abbildung 10).

8. Temperatur-Ansprech-Test

  1. Starten Sie die Temperaturregelung, indem Sie die Probetemperatur auf 30 °C einstellen. Warten Sie, bis der Messwert 30 °C erreicht und sich stabilisiert. Erhöhen Sie die voreingestellte Temperatur schrittweise um 5 °C von 30 °C auf 50 °C und warten Sie, bis sich der Messwert nach der jeweiligen voreingestellten Temperatur stabilisiert.
  2. Verringern Sie die voreingestellte Temperatur schrittweise um 5 °C von 50 °C auf 30 °C und erkennen Sie die Tracking-Fähigkeit des Messwertes.

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Representative Results

Abbildung 2 zeigt die Temperaturverteilung der Gummiheizung. Die Oberflächentemperatur des Gummiheizers war bei jeder Temperatur einheitlich. Abbildung 3 zeigt die Reaktionsfähigkeit der gemessenen Temperatur, um Temperaturänderungen einzustellen. Die orange Linie zeigt die eingestellte Temperatur und die blaue Linie zeigt die Änderung der Probentemperatur. Die Überschreitung des Messwerts auf die Einstellungsänderung ist klein und die Verfolgung ist schnell.

Diatomezellen wurden beobachtet, um ein spezifisches Beispiel für die Verwendung dieses Geräts zu liefern. Die Verlaufsanalyse sich bewegender Diatomenzellen ist ein nützlicher Ansatz zur Bewertung der Beweglichkeit von Diatomenzellen. Obwohl ein normales invertiertes Mikroskop die Probe horizontal beobachtet, ist es nicht für die Beobachtung des Einflusses der Schwerkraft oder schwebenden Bewegung in vertikaler Richtung geeignet.

In diesem Experiment wurde die Mikroskopstufe mit Temperaturregler an einem invertierten Mikroskop befestigt, das um 90° gedreht worden war. Die temperaturabhängige vertikale Bewegung von Diatomen wurde erfolgreich aufgezeichnet. Bei dieser Methode wurde der Ort der vertikalen Bewegung von Diatomen erkannt, wie in Abbildung 4dargestellt. Durch die Beobachtung von 100 Individuen von Diatomen lag die Durchschnittsgeschwindigkeit bei Raumtemperatur bei 7,01 m/s und bei 40 °C bei 470,1 m/s. Die Auswirkungen der thermischen Konvektion auf das vertikal schwebende Phänomen der Diatomezellen wurden durch direkte Beobachtung visualisiert.

Figure 1
Abbildung 1: Foto des geräts, das an der Mikroskopstufe befestigt ist. Aussehen des Geräts, das an der Mikroskopstufe befestigt ist. Das Gerät wird mit vier Schrauben an der Mikroskopstufe befestigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Temperaturverteilung der Gummiheizung. Die Verteilung der Gummiheizung gemessen durch Thermographie. Die Heiztemperatur wurde schrittweise von Umgebungstemperatur auf 35 °C, 45 °C, 55 °C und 65 °C geändert. Die Temperatur wurde gleichmäßig über die Heizung bei jeder Temperatur verteilt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Reaktionsfähigkeit des Temperatursignals. Dies zeigt die Reaktion, wenn die eingestellte Temperatur von 30 °C auf 50 °C angehoben und von 50 °C auf 30 °C gesenkt wird. Die eingestellte Temperatur wurde in Schritten von 5 °C geändert. Im stabilen Zustand liegt die gemessene Temperatur innerhalb von 1,5 °C des eingestellten Wertes. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Der Ort der Diatomenbewegung. Die vertikalen Bahnen der Diatomenbewegung aufgrund von Temperaturänderungen wurden dargestellt. Die blauen Linien zeigen Die Flugbahnen von Diatomenzellen bei 25 °C für 27,06 s und bei 40 °C für 0,2 s. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 1
Ergänzende Abbildung 1: Konstruktionszeichnung von Aluminiumplatten (mit Abmessungen). (A) Die Platte ist 2 mm dick x 150 mm breit x 200 mm lang, mit einem zentrierten Loch von 101 mm Durchmesser, um das Einführen der Gummiheizung zu ermöglichen. Jede Plattenkante hat zwei bearbeitete Krallen, an denen Gummibänder befestigt werden können, um Proben auf der Bühne zu sichern. Um diese vertikale Stufe mit 4 mm Schrauben an einem Mikroskop zu befestigen, werden 4,2 mm Schraublöcher an vier Stellen symmetrisch um das zentrale Loch gebohrt. (B) Die Platte ist 5 mm dick x 150 mm breit x 200 mm lang, mit einem zentrierten Loch von 130 mm Durchmesser. Maschinenkerb-Standorte, um Klauenpositionen auf der Frontplatte zu entsprechen, um das Anbringen von probensichernden Gummibändern über die Bühne zu ermöglichen. Zur Befestigung der Bühne an einem Mikroskop werden vier 4,2 mm Schraublöcher an passenden Stellen zu denen in der Frontplatte gebohrt. (C) Die Platte ist 4 mm dick x 150 mm breit x 200 mm lang, mit einem zentrierten Loch von 130 mm Durchmesser. Eine 30 mm Spannweite wird aus der Mitte der rechten 200 mm Fläche der Platte bis in die Tiefe des zentralen Lochs geschnitten. Dieser Zweck des Ausschnitts ist es, die Befestigung des Heizanschlusses auf der rechten Seite zu ermöglichen. In den gleichen Positionen wie in der Frontplatte werden vier 4,2 mm Schraublöcher gebohrt, um die Bühne an einem Mikroskop zu bestücken. (D) Die Platte ist 1,5 mm dick x 150 mm breit x 200 mm lang, mit einem zentrierten Loch von 30 mm Durchmesser. In den gleichen Positionen wie in der Frontplatte werden vier 4,2 mm Schraublöcher gebohrt, um die Bühne an einem Mikroskop zu bestücken. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Ergänzende Abbildung 2: Konstruktionszeichnung von Aluminiumplatten (ohne Abmessungen). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Ergänzende Abbildung 3: Designzeichnung von Aluminiumsockeln. (A) Auf der Oberseite zu installieren: Durchmesser ist 100 mm, Dicke 3 mm. In der Mitte wird ein Loch mit einem Durchmesser von 30 mm gebohrt und auf einer Seite ein Ausschnitt von 42 mm Breite x 30 mm Tiefe hergestellt. (B) Auf der Unterseite zu installieren: Durchmesser ist 100 mm, Dicke 4 mm. In der Mitte wird ein Loch mit einem Durchmesser von 30 mm gebohrt, und drei 3 mm Löcher wurden in einem Abstand von 25 mm von der Mitte zu 120° zueinander platziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Ergänzende Abbildung 4: Designzeichnung von gepressten Korkscheiben. (A) Auf der Oberseite zwischen der Silizium-Gummiheizung und dem oberen Aluminiumsockel zu installieren: Durchmesser ist 100 mm, Dicke 2 mm. In der Mitte wird ein Loch mit einem Durchmesser von 20 mm gebohrt, und zwei Schnitte (42 mm breit x 30 mm tief, 4 mm breit x 40 mm) werden im rechten Winkel zueinander in den Seiten der Scheibe hergestellt. (B) Auf der Unterseite zwischen dem Silizium-Gummi-Heizer und dem unteren Aluminiumsockel zu installieren: Durchmesser ist 100 mm, Dicke ist 1 mm. In der Mitte wird ein Loch mit einem Durchmesser von 20 mm gebohrt. (C) Diese Stütze ist 42 mm breit und 30 mm tief und wird aus dem Umfang einer Scheibe mit 100 mm Durchmesser geschnitten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Ergänzende Abbildung 5: Spezifikation der Silikonkautschukheizung. Der Durchmesser beträgt 100 mm und die Dicke 2,5 mm. In der Mitte wird ein Loch mit einem Durchmesser von 20 mm gebohrt. Das Netzteil ist 12 V, mit 18 W Tragfähigkeit. Die Heizung besteht aus Nichrome-Draht, mit einem Bleidraht, der mit der Elektrode verbunden ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Ergänzende Abbildung 6: Querschnitt der Mikroskopstufe. Dies ist eine Schnittansicht der Mikroskopstufe. Der Aluminiumsockel wird an der hinteren Aluminiumplatte befestigt und die Gummiheizung auf der äußersten Oberfläche installiert. Der gepresste Kork wird zur Isolierung zwischen Gummiheizung und Aluminiumsockel installiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Ergänzende Abbildung 7: Details des Schaltplans. Dies gibt die in der Steuerung eingebaute Schaltung an. Der Schaltplan ist nach individuellen Funktionen in neun Teile unterteilt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 8
Ergänzende Abbildung 8: Designzeichnung des Kunststoff-Controllergehäuses. Die Abmessungen sind 143,9 mm Länge x 85,3 mm Tiefe x 25 mm Breite. Der Temperaturregler, die Bedien-/Überhitzungslampe und die Anzeige befinden sich auf dem Gehäuse der Kunststoffsteuerung. Die Temperatur kann eingestellt werden, während Sie die Anzeige beobachten, indem Sie den eingestellten Knopf drehen. Wenn Sie diesen Knopf drücken, wird der Temperaturregler gestartet. Die gemessene Temperatur wird in Echtzeit angezeigt, und die Heizung wird so gesteuert, dass sie die eingestellte Temperatur erreicht und hält. Wenn der Temperaturregler eingeschaltet ist, leuchtet die blaue LED auf und bleibt beleuchtet, während die Heizung in Betrieb ist. Wenn die Heizung überhitzt, schaltet sich die rote LED ein und die Heizung stoppt automatisch. Wenn Sie den Temperaturregler erneut drücken, wird er angehalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 9
Ergänzende Abbildung 9: Systemkonfiguration. Die Mikroskopstufe mit eingebautem Controller ist mit einem speziellen Kabel an die Gummiheizung angeschlossen. Gemessene Probentemperatursignale werden empfangen und der Strom an die Gummiheizung wird vom Regler übertragen. Gemessene Signale vom Controller werden drahtlos über den Internetrouter an den Server gesendet. Der Server kompiliert Messdaten für die Analyse und Graphik. Temperaturprotokollüberwachung und Temperatureinstellungen können über einen PC oder ein Smartphone ferngesteuert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 10
Ergänzende Abbildung 10: Temperaturverteilungsmessung durch Thermographie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Die Verlaufsanalyse sich bewegender Diatomenzellen ist ein nützlicher Ansatz zur Bewertung der Ditomenmotilität. Während jedoch ein normales invertiertes Mikroskop Proben horizontal beobachtet, ist es nicht für Beobachtungen des Einflusses der Schwerkraft oder schwebender Bewegung in vertikaler Richtung geeignet. Entwickelt und beschrieben ist hier eine vertikale Mikroskopstufe mit Temperaturregelung und an einem invertierten Mikroskop befestigt, das um 90° gedreht wurde. Diese Mikroskopstufe mit Temperaturregelung ermöglicht die Beobachtung temperaturabhängiger vertikaler Bewegungen von Diatomenzellen.

Ein wichtiger Schritt innerhalb des Protokolls ist der Entwurf der Controllerschaltung. Um die Sicherheit zu gewährleisten, wurde ein Brecherkreis implementiert. Wenn der Sensor von der Probe getrennt wird oder der Mikrocontroller nicht richtig funktioniert, wird der Strom zur Heizung durch einen anderen Stromkreis als der Mikrocontroller abgeschnitten.

Da die Steuerung das PID-System zur Steuerung des Stroms der Heizung übernommen hat, ist eine Technik erforderlich, um den optimalen Parameter der PID zu finden. Im Vergleich zur bestehenden Methode sind Fernbedienung und Überwachung durch Wi-Fi-Funktion, Datenerfassung auf einem Server und die Temperatureinstellungsfunktion möglich. Da die Struktur des am Mikroskop befestigten Bühnenteils kompliziert ist, erfordert die Vereinfachung dieser Struktur eine zukünftige Untersuchung.

Dieses Gerät verwendet eine Heizung, um die Temperatur zu erhöhen, aber die Kühlung ist nicht mit Strom versorgt; Daher darf die eingestellte Temperatur nicht unter der Raumtemperatur liegen. Die Kühlung von Proben auf Temperaturen unter der Raumtemperatur erfordert ein kompliziertes Kühlgerät, das für zukünftige Arbeiten in Betracht gezogen wird.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Konflikte offenzulegen.

Acknowledgments

Die Autoren haben keine Bestätigungen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AC adapter 12V2A Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. AD-D120P200 Tokyo, Japan
ADS1015 Substrate Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. adafruit PRODUCT ID: 1083 Tokyo, Japan
Alminium Plate (Back Side Plate) Inoval Co., Ltd. W 150mm×L 200?×T 1.5mm Gifu, Japan
Alminium Plate (Forefront Plate) Inoval Co., Ltd. W 150mm×L 200?×T 2mm Gifu, Japan
Alminium Plate (Middle Lower Plate) Inoval Co., Ltd. W 150mm×L 200?×T 4mm Gifu, Japan
Alminium Plate (Middle Upper Plate) Inoval Co., Ltd. W 150mm×L 200?×T 5mm Gifu, Japan
Aluminum Pedestal (Lower Plate) Inoval Co., Ltd. D 100mm×T 3mm (30Φ) Gifu, Japan
Aluminum Pedestal (Upper Plate) Inoval Co., Ltd. D 100mm×T 3mm (30Φ) Gifu, Japan
Bold Modified Basal Freshwater Nutrient Solution Sigma-Aldrich Co. LLC B5282-500ML St. Louis, USA
Controller Case Marutsu Elec Co., Ltd. pff-13-3-9 Tokyo, Japan
CPU Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. ESP-WROOM-02D Tokyo, Japan
Inverted microscope Olympus Corporation CKX 53 Tokyo, Japan
Low temperature hardening epoxy resin adhesive ThreeBond Co., Ltd. TB2086M Tokyo, Japan
Multi-turn semi-fixed volume Vertical type 500 Ω Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. 3296W-1-501LF Tokyo, Japan
OLED module Akihabara Inc. M096P4W Tokyo, Japan
Pressed Cork (For supporting electrode ) Tera Co., Ltd. W 42mm×L 30? Ishikawa, Japan
Pressed Cork (Lower Disk) Tera Co., Ltd. D 100mm×T 0.5mm (20Φ) Ishikawa, Japan
Pressed Cork (Upper Disk) Tera Co., Ltd. D 100mm×T 2.5mm (20Φ) Ishikawa, Japan
Rotary encoder with switch with 2 color LED Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. P-05772 Tokyo, Japan
Silicone rubber heater Three High Co., Ltd. D 100mm×T 2.5mm (20Φ) Kanagawa, Japan
Substrate Seeed Technology Co., Ltd. mh5.0 Shenzhen, China
Temperature sensor Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. NXFT15XH103FA2B050 Tokyo, Japan
Three-terminal DC / DC regulator 3.3 V Marutsu Elec Co., Ltd. BR301 Tokyo, Japan
Universal Flexible Arm Banggood Technology Co., Ltd. YP-003-2 Hong Kong, China
USB cable USB-A - MicroUSB Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. USB CABLE A-MICROB Tokyo, Japan
Video Canera Sony Corporation HDR-CX590 Tokyo, Japan

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