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使用电梯垂直运动和摩天轮旋转评估大鼠被动运动的自主性和行为效应

Behavior

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Summary

提出了使用电梯垂直运动和摩天轮旋转来评估啮齿动物被动运动自主和行为影响的协议。

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Manno, F. A. M., Pan, L., Mao, Y., Su, Y., Manno, S. H. C., Cheng, S. H., Lau, C., Cai, Y. Assessing the Autonomic and Behavioral Effects of Passive Motion in Rats using Elevator Vertical Motion and Ferris-Wheel Rotation. J. Vis. Exp. (156), e59837, doi:10.3791/59837 (2020).

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Abstract

本研究的总体目标是利用电梯垂直运动和摩天轮旋转装置评估啮齿动物被动运动的自主和行为影响。这些测定有助于确认自主神经系统的完整性和正常功能。它们与基于排便计数、露天检查和平衡梁交叉的定量测量相结合。这些测定的优点是其简单性、可重复性和定量行为测量。这些测定的局限性是,自主反应可能是非庭面性疾病的表征,并且需要一个功能性前庭系统。这些测定的详细程序将大大有助于检查运动病等疾病。

Introduction

运动病(MS)由于异常的视庭刺激导致自主反应,引起症状,如胃外不适,恶心和/或呕吐1。根据目前的理论,运动病可能是由感觉冲突或神经元不匹配引起的,因为接收的综合运动信息不同于预期的环境内部模型2、3或姿势不稳定,就像在支航船上4、5。尽管在运动病和前庭自主功能6、7、8、9、10、11、12方面取得了重大进展,但未来的研究可以通过标准化评估协议加以帮助。评估标准被动运动的自主效应将大大有助于研究运动病的成因和预防。本研究的总体目标是评估啮齿动物被动运动的自主性和行为效应。动物模型,如啮齿动物,允许简单的实验操作(例如,被动运动和药物)和行为评估,可用于研究运动病的病因。在这里,我们提供了一个详细的电池,用于测试被动运动的影响和前庭功能的完整性。

本研究详细介绍了两种测定,即电梯垂直运动(EVM)和摩天轮旋转(FWR),这两种分析对被动运动有自主反应。测定与三个定量行为测量相结合,平衡梁(小鼠13和大鼠14,15,16,17),开场检查和排便计数。EVM(类似于遇到波浪的船舶的俯仰和滚动)通过刺激编码线性加速度的卵波感觉器官(即响应垂直平面运动中的运动的坐腔)18来评估前庭功能。FWR(离心旋转或正弦运动)装置通过线性加速度和半圆道以角加速度19、20刺激耳部器官。摩天轮/离心旋转装置在自主评估中独树一帜。迄今为止,文献中唯一类似的装置是离垂直轴旋转(OVAR)转盘,它用于检查前视反射(VOR)18,21,22,条件避免23,24和超重力25,26,27的影响。EVM测定和FWR设备测定诱导前庭刺激,导致自主反应。我们将 EVM 和 FWR 与平衡光束、排便计数和开场分析 28、29、30 等定量测量点进行耦合,以确保结果可靠且可重现。与之前在小鼠13和大鼠14、15、16、17中描述的类似,平衡梁测定是一个1.0米长的光束,悬挂在距地面0.75米的两个木凳之间,使用简单的黑匣子修改在目标末端(完成)。平衡梁已被用来评估焦虑(模糊的黑匣子)14,17,创伤性损伤15,16,17,在这里,影响平衡的自主反应。我们以前曾对运动病模型中的自主反应进行排便计数,它是一种可靠的定量测量,易于执行,并明确评估6、8、9、11。开场分析使用Ethovision28、盆景30Matlab29中的简单视频分析进行简单的黑盒开场行为评估,以量化运动等行为。在当前协议中,我们使用总距离,但我们注意到存在几种不同的范式(例如,伸长、运动区、速度等)。28,2930.总体而言,这些程序构成一个简短的评估电池,用于检查和评估对被动运动的自主反应,例如运动病6、7、8、9、10、11。目前的检测可以适应各种动物模型。

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Protocol

本研究和程序由第二军医大学动物实验伦理委员会(中国上海)根据《实验室动物护理和使用指南》(美国国家研究委员会、美国国家研究委员会、1996).

1. 动物

  1. 使用两个月的斯普拉格-道利(SD)大鼠(200~250克)。对于每个行为测定,使用一组单独的大鼠。始终使用单独的控制和实验组。
    注: 有两个自主测试:EVM 和 FWR。EVM除了一个对照组(=4)之外,还有三个条件,三个行为测定(平衡光束、排便计数和开场=3),每只大鼠8个,总共96只(4 x 3 x 8)。FWR除了一个对照组(=2)之外,还有一个条件,即三个行为测定(平衡光束、排便计数和开场=3),每只大鼠有8只,总共48只(2 x 3 x 8)。我们总共报告144只老鼠。
  2. 笼啮齿动物在恒定的25°C温度和60%~70%的湿度下。
  3. 房屋啮齿动物在12小时/12小时光/暗周期与获得食物和饮用水的解放。
    注:由于以下协议是行为实验,因此应轻柔地处理大鼠。处理动物时应用双手与身体和后背支撑,以免引起焦虑。
  4. 在黑暗中执行实验(EVM 和 FWR)和评估测定(平衡光束和开场评估),以尽量减少视觉提示。

2. 电梯垂直运动装置

  1. 在完全黑暗中执行电梯垂直运动程序,以尽量减少视觉提示。
  2. 将啮齿动物放入 Plexiglas 盒(22.5 厘米 x 26 厘米 x 20 厘米)。在这里,Plexiglas 盒可容纳四只啮齿动物(定制设备)。
  3. 确保将盒子固定并牢固关闭,以避免啮齿动物脱落。将玻璃盒放在电梯垂直运动装置的电梯垫上(定制设备)。
  4. 将电梯垂直运动装置打开到最低设置,以便适应。
  5. 将振幅设置为从中性值向上 22 厘米和向下 22 厘米。增量更改电梯垂直运动,如下所示:
    1. 将初始周期设置为 2,500 ms 5 分钟,2,000 毫秒为 5 分钟,1,500 毫秒为 5 分钟。
    2. 使用 1000 ms 的测试周期 2 小时。
    3. 使用 1500 ms 的周期 5 分钟、2000 ms 5 分钟和 2500 ms 5 分钟以反向速度减慢设备。

3. 摩天轮旋转装置

  1. 摩天轮旋转装置设置
    1. 将有机玻璃容器(22.5 厘米 x 26 厘米 x 20 厘米)放在木凳上(定制设备)。
    2. 将啮齿动物放置在有机玻璃容器中,其主体的长轴垂直于 Ferris-轮(定制设备)的水平旋转杆。
      注:与水平杆垂直的车身放置可确保在旋转过程中刺激卵泡器官(前-后和垂直方向)。
    3. 牢固地关闭有机玻璃盒。
    4. 将第二组啮齿动物放在有机玻璃容器中,其主体的长轴垂直于摩天轮旋转装置的第二臂上的水平旋转杆。使用第二组质量相似的啮齿动物来平衡摩天轮。
    5. 牢固地关闭有机玻璃盒,并放置在摩天轮旋转装置上。
  2. 摩天轮旋转程序
    1. 在完全黑暗中执行摩天轮旋转程序,以尽量减少视觉提示。
    2. 以 16°/s2顺时针方向旋转 Ferris 轮,达到 120°/s 的角速度,然后在 48°/s2处开始减速,达到 0°/s。暂停 1 秒后,让容器继续以与上述相同的方式逆时针方向旋转(在 16°/s2处加速,达到 120°/s 的角速度,然后在 48°/s2处减速,达到 0μ/s)。顺时针-暂停-逆时针循环大约需要 10 秒才能到达其初始位置。
    3. 继续顺时针逆时针旋转,每次旋转 2 小时,旋转约 720 次。

4. 评价EVM和FWR

注:摩天轮旋转装置和电梯垂直运动的评估通过三个程序完成:平衡光束测试、排便计数和露天检查。相同的程序用于评估电梯垂直运动。在摩天轮旋转或电梯垂直运动后,应尽快完成这些评估程序。

  1. 平衡梁
    1. 平衡梁设置
      1. 通过在实验场放置两个木凳(高度约0.75米),设置平衡梁10,11,12,相距约110厘米。
      2. 将黑色塑料盒(15 厘米 x 15 厘米 x 8 厘米)放在精加工凳上。
      3. 在两张凳子之间放置一根窄木梁(2.5 厘米 x 130 厘米),在凳子边缘之间留出 100 厘米的距离,从启动凳子到精干凳子。
        注:黑色塑料盒的入口应位于 100 厘米的终点线处。
      4. 在启动凳上放置一盏灯。打开灯。
      5. 关闭房间的灯,确保房间尽可能暗。这可确保啮齿动物沿着平衡光束的方向从被照亮的区域到模糊的区域。
    2. 平衡梁程序
      注:平衡梁的电机协调测定是通过测量穿越高架木梁所花的时间来评估的。
      1. 每天连续训练每只啮齿动物3天,在检查前,以达到平衡梁10的稳定性能。训练时,将大鼠引入灯角的光束,并提示它穿过光束。最终,老鼠会自愿穿越。本协议中的大鼠需要 3.6 ± 0.9 秒。
        注:有些啮齿动物在训练中无法达到稳定的表现,应排除。有些啮齿动物不执行任务,而另一些则缺乏跨越横梁的动力。稳定的性能是连续两次试验期,跨越时间小于4秒。如果大鼠在训练或评估过程中脱落,则应将其归类为大鼠"坠落",且不得进一步评估。
      2. 对于实际步骤,将经过训练的啮齿动物放在靠近灯的启动凳上,同时在秒表上按启动。啮齿动物应快速穿过平衡梁,进入完用品凳子上的黑匣子。
      3. 啮齿动物就位后,按秒表启动,当鼻子进入精加工凳上的暗盒时按停止。穿过横梁的时间是从开始凳子到完成凳子。
        注意:一旦啮齿动物被训练,你可以执行干预或操作,如诱导运动病,在评估之前。您还可以在干预之前使用时间遍历上次培训课程的时间进行基线测量。
  2. 排便计数
    1. 在摩天轮测试期后,将装有四只啮齿动物的有机玻璃容器放在长凳上。
    2. 取出啮齿动物,并放置在单独的露天盒中(下图)。
    3. 计算每个啮齿动物在有机玻璃盒中的粪便颗粒数。
      注:通过在接受电梯垂直运动之前计算粪便颗粒,可以进行基线测量,以便与电梯运动后的评估进行比较。
  3. 开场考试
    1. 将啮齿动物放入开场箱(40 厘米 x 40 厘米 x 45 厘米)。
    2. 使用红外摄像机记录打开的字段行为 3 分钟28,29,30
    3. 确定总行驶距离。
      注意:在电梯垂直运动之前,不要将啮齿动物放在开场箱中,这一点非常重要。环境对啮齿动物一定是新颖的。因此,不应进行基线测量,以进行露天检查。

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Representative Results

图 2显示了横向所用时间的代表性平衡光束结果。为了在平衡梁10上达到稳定性能,大鼠连续训练了3天。随后一天,对大鼠进行平衡光束性能评估。在图的 y 轴中,我们为啮齿动物穿越天轮平衡梁、电梯垂直运动和控制组以进行演示目的的秒数。

图 3显示了代表性的排便计数结果。对于电梯垂直运动,除了一个称为静态组的对照组外,大鼠处于三个不同的旋转组之一,分别为 0.8 Hz、0.4 Hz 和 0.2 Hz 垂直运动。我们运动周期的等价如下: 频率 = 0.8Hz = 1/0.8 = 0.1250s = 1250 ms, 频率 = 0.4Hz = 1/0.4 = 0.2500s = 2500 ms,频率 = 0.2Hz = 1/0.2 = 0.5000s = 5000 ms. EVM 的排便量显著增加(单向方差分析,F(3,31) = 20.2306,p <0.00001)。赫兹垂直运动的变化增加了0.4 Hz(t = 3.4064,df = 14,p = 0.0043)和0.8 Hz(t = 10.6895,df = 14,p < 0.0001)的排便量增加。 对于摩天轮旋转,大鼠以顺时针暂停逆时针循环旋转,持续约 10 秒,以达到其初始位置。整个轮调持续了2小时。将摩天轮旋转组与称为静态组的对照组进行比较。由 t 检验确定,摩天轮旋转组增加了排便量(t = 10.6895,df = 14,p < 0.0001)。

图 4显示了总距离行驶结果的开放式现场检验。这些数据是利用商业视频跟踪软件对开放场行为(材料表)28进行分析的,但存在一些用于行为视频分析的开源软件管道,如盆景30,我们集团根据Matlab29开发了一个。此外,此处将总行驶距离评估为度量,但逐帧差异可用于确定其他行为,如垂直运动。对于电梯垂直运动,除了一个称为静态组的对照组外,大鼠处于三个不同的旋转组之一,分别为 0.8 Hz、0.4 Hz 和 0.2 Hz 垂直运动。EVM 显著减少了开场距离行驶(单向方差分析,F(3,31) = 16.5994,p < 0.00001)。 Hz 垂直运动的变化减少了 0.4 Hz(t = 3.1354,df = 14,p = 0.0073)和 0.8 Hz(t = 5.8929,df = 14,p < 0.001)的开放场运动。 对于摩天轮旋转,大鼠以顺时针暂停逆时针循环旋转,持续约 10 秒,以达到其初始位置。整个轮调持续了2小时。将摩天轮旋转组与称为静态组的对照组进行比较。由 t 检验确定(t = 4.3341,df = 14,p = 0.0007)确定的 Ferris 轮旋转组减少了开场运动。

一些已发表的研究采用了这里描述的6,7,8,9,10,11,12的协议。我们小组的一个最近例子研究了抗胆原激素梅卡米胺和斯科波拉明缓解运动病引起的胃肠道症状12背后的机制。

Figure 1
图 1:使用的仪器。a) 平衡梁.平衡梁是两个凳子之间的窄木梁(2.5 厘米 x 130 厘米),两个凳子相距 100 厘米(高度约 0.75 米)。在起摆凳子上放置一盏灯,在精加工凳子上放置一个黑色塑料盒(15 厘米 x 15 厘米 x 8 厘米)。(b) 电梯垂直运动装置.电梯垂直运动装置的振幅设定为22厘米,从中性方向设定为22厘米。热身垂直运动包括 2500 毫秒周期 5 分钟、2000 毫秒 5 分钟和 1500 毫秒(5 分钟)。测试运动包括 1000 ms 周期 2 小时。电梯垂直运动装置倒转,使用1500ms周期5分钟,2000毫秒5分钟,2500毫秒5分钟。(c) 摩天轮旋转装置.Ferris-轮以顺时针方向旋转,速度为 16°/s2,加速至 120°/s,随后在 48°/s2处减速至 0°/s,暂停 1 秒,然后逆时针旋转(16°/s2加速至 120°/s,随后在 48°/s2时减速至 0°/s)。顺时针-暂停-逆时针循环需要 ±10 s 才能到达其初始位置。大鼠被放置在摩天轮旋转装置的中心。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图 2:平衡光束结果。横向光束(均值 = 标准偏差)所用的时间。y 轴表示横向光束的秒数。大鼠在评估前接受了三天的训练,以便在平衡梁10上达到稳定的性能。事先评估的电梯垂直运动或摩天轮装置可显著提高过路时间。统计测试由双尾t检验执行,Bonferroni在对照组和所有其他组之间进行校正。表示p < 0.001。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图 3:排便计数结果。电梯垂直运动结果(a) 左侧面板 = 除控制组外,除控制组外,除控制组(0 Hz 时称为静态组)外,除 0.8 Hz 和 0.4 Hz 所示的 0.8 Hz 和 0.4 Hz 的排便次数(均值 = 标准偏差)外,还有 0.8 Hz、0.2 Hz 的分排次数。摩天轮旋转结果 (b) 右侧面板 = 摩天轮旋转大鼠组(均值 = 标准偏差)的排便计数(均值 = 标准偏差)和称为静态组的对照组 (0 Hz)。请注意,如星号所示,旋转组的排便显著增加。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图 4:总行驶距离。a) 电梯垂直运动结果.除了控制(静态)组外,该面板还包括在开放场运动测试中按厘米(平均 = 标准偏差)按厘米进行的 0.8 Hz、0.4 Hz 和 0.2 Hz 垂直运动的总距离( 均值 = 标准偏差)。请注意,星号指示的 0.8 Hz 和 0.4 Hz 的总行驶距离显著减少。统计测试由双尾t检验执行,Bonferroni在对照组和所有其他组之间进行校正。* 指示p < 0.01 和 = 表示p < 0.001。(b) 摩天轮旋转结果.该面板由摩天轮旋转大鼠组的开场运动试验中的总行驶距离(均值 = 标准偏差)厘米和一个控制(静态)组组成。请注意,总距离显著减少,如星号所示。统计测试由控制组和摩天轮组之间的双尾 t 检验执行。表示p < 0.001。请点击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

本研究描述了使用电梯垂直运动和摩天轮旋转评估啮齿动物对被动运动的自主反应。这些设备和程序可以很容易地采用到其他啮齿动物和一些修改的测定存在,以确认前庭功能在不同的情况下,如在药理挑战或外科干预。前庭刺激引起的MS研究导致理论认为,感觉冲突或神经元不匹配引起的视觉信息,不同于预期的环境内部模型2,3导致自主反应导致症状,如外显不适,恶心和/或呕吐1。进一步的理论已经勾勒出姿势的不稳定性,就像发生在一艘支航船4,5上一样,会引起自主反应。尽管取得了这些重大进展,但评估协议(如电梯垂直运动和摩天轮旋转)仍能帮助这些问题。

平衡光束的关键步骤是训练。老鼠必须有动力,并有信心跨越横梁;否则,平衡(即前庭完整性)不会在评估期内衡量。对于有兴趣检查焦虑14、17创伤性损伤15、16、17的研究人员来说,在训练或平衡梁交叉期间的其他行为可能是相关的。例如,在焦虑研究中使用平衡光束,排便,排尿,跌倒和失误可以列举14。此外,在一些研究领域,缺乏穿越光束动机的啮齿动物可能以不同方式评估13、14、15、16、17。在电梯垂直运动和摩天轮旋转期间,确保箱体被固定并牢固关闭至关重要,因为不安全的箱中的啮齿动物可能会被推手和伤害。此外,确保啮齿动物在开场箱28、29、30只评估一次,并在电梯垂直运动和摩天轮之后立即进行,以确保快速评估前庭效应。

上述协议采用定量措施。因此,平衡光束的局限性包括缺乏过光束动机的啮齿动物,因为平衡是被评估的行为。电梯垂直运动和摩天轮旋转排便测试的限制包括要求吃饱的啮齿动物。这是必要的;否则,啮齿动物可能不会对前庭刺激有强烈的自主反应。出于比较目的,最好观察基线排便计数,正常/控制持续时间为 2.5 小时。

在使用协议和解释结果时,另一个重要考虑因素是不同物种的运动疾病反应的差异。在人类,以及其他物种,如猫和狗,抽搐和呕吐是两个常见的症状31,32,33,34。另一方面,老鼠不能呕吐。然而,大鼠表现出运动病症状,如皮卡35、36、排便反应37、自发运动减少35、38。此外,人类主要依靠视觉进行感官输入,运动病可能与前庭系统2,39的感官冲突有关。在大鼠,特别是白化鼠(如斯普拉格-道利)中,视力通常不是主要感觉,而是躯体感觉(胡须)。这可能导致不同感官投入对冲突的相对贡献的物种间差异。最后,运动病反应中存在间物种差异。例如,精明的小鼠(太阳鼠)能够有一个声光反应40,41。

在运动病6、7、8、9、10、11期间,对啮齿动物的自主反应进行检查和评估的程序集体形成一个简短的评估组。目前的技术结合更多的生理措施,如电生理学,以确定前庭刺激期间的皮质后果将非常感兴趣。

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Disclosures

提交人没有宣布任何财务或非财务利益冲突。FWR器件在中国拥有专利:ZL201120231912.1。

Acknowledgments

这项工作部分得到香港研究资助局、早期职业计划、#21201217项目与C.L.的部分支持。FWR器件在中国拥有专利:ZL201120231912.1。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Elevator vertical motion device Custom Custom-made Elevator vertical motion device to desired specifications
Ethovision Noldus Information Technology Video tracking software
Ferris-wheel rotation device Custom Custom-made Ferris-wheel rotation device to desired specifications
Latex, polyvinyl or nitrile gloves AMMEX Use unpowdered gloves 8-mil
Open field box Custom Darkened plexiglass box with IR camera
Rat or mouse JAX labs Any small rodent
Small rodent cage Tecniplast 1284L
Wooden beam and stools Custom Custom-made wooden beam and stools to specifications indicated

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