Caracterizando a carga mutacional e a composição clonal do sangue humano

Genetics
 

Summary

Os padrões de mutação somática nas células refletem a exposição mutagênica prévia e podem revelar relações de linhagem de desenvolvimento. Aqui apresentamos uma metodologia para catalogar e analisar mutações somáticas em células hematopoiéticas individuais e progenitoras.

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Huber, A. R., Manders, F., Oka, R., van Boxtel, R. Characterizing Mutational Load and Clonal Composition of Human Blood. J. Vis. Exp. (149), e59846, doi:10.3791/59846 (2019).

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Abstract

As pilhas hematopoietic da haste e do progenitor (HSPCs) acumulam gradualmente mutações do ADN durante um Lifespan, que possa contribuir às doenças idade-associadas tais como a leucemia. Caracterizar a acumulação da mutação pode melhorar a compreensão da etiologia de doenças idade-associadas. É apresentado aqui um método para catalogar mutações somáticas em HSPCs individuais, que é baseado no sequenciamento do todo-genoma (WGS) de culturas primárias clonais da pilha. As mutações que estão atuais na pilha original são compartilhadas por todas as pilhas na cultura clonal, visto que as mutações adquiridas in vitro após a classificação da pilha estão atuais em um subconjunto das pilhas. Conseqüentemente, este método permite a deteção exata das mutações somáticas atuais nos genomas de HSPCs individuais, que se acumulam durante a vida. Esses catálogos de mutações somáticas podem fornecer insights valiosos sobre processos mutacionais ativos no tecido hematopoiético e como esses processos contribuem para a leucoemogênese. Além, avaliando as mutações somáticas que são compartilhadas entre os HSPCs múltiplos do mesmo indivíduo, as relações clonal da linhagem e a dinâmica da população de populações do sangue podem ser determinadas. Como essa abordagem se baseia na expansão in vitro de células individuais, o método é limitado a células hematopoiéticas com potencial replicativo suficiente.

Introduction

A exposição da haste hematopoiética e das células progenitoras (HSPCs) a fontes mutagâmicas endógenas ou extrínmicas contribui para o acúmulo gradual de mutações no DNA durante uma vida útil1. A acumulação gradual da mutação em hspcs1 pode conduzir ao hematopoiese clonal idade-relacionado (arco)2,3, que é uma circunstância não-sintomática conduzida por hspcs que carreg mutações do leucemia-excitador. Inicialmente, pensava-se que indivíduos com arco têm um risco aumentado de leucemia2,3. No entanto, estudos recentes têm demonstrado uma incidência de 95% de ARCH em idosos4, tornando a associação com malignidades menos claras e levantando a questão de por que alguns indivíduos com Arch eventualmente fazer ou não desenvolver malignidades. No entanto, mutações somáticas em HSPCs podem representar sérios riscos à saúde, como distúrbios mielodisplásicos e leucemia são caracterizados pela presença de mutações específicas do condutor de cancro.

Para identificar os processos mutacionais e estudar a clonalidade sanguínea, a acumulação de mutações em HSPCs individuais precisa ser caracterizada. Os processos mutacionais deixam padrões característicos no genoma, as chamadas assinaturas mutacionais, que podem ser identificadas e quantificadas em coleções de mutações em todo o genoma5. Por exemplo, a exposição à luz UV, aos agentes alquilantes e aos defeitos nas vias de reparo do DNA tem sido associada a uma assinatura mutacional diferente6,7. Além, devido à natureza estocástico de acumulações da mutação, a maioria (se não todas) das mutações adquiridas são originais entre pilhas. Se as mutações forem compartilhadas entre várias células do mesmo indivíduo, ela indicará que essas células compartilham um ancestral comum8. Conseqüentemente, avaliando mutações compartilhadas, as relações da linhagem podem ser determinadas entre pilhas e uma árvore desenvolvente da linhagem pode ser filial construída pela filial. Entretanto, catalogar mutações somáticas raras em pilhas fisiologicamente normais é tecnicamente desafiante devido à natureza Polyclonal de tecidos saudáveis.

É apresentado aqui um método para identificar com precisão e determinar mutações somáticas nos genomas de HSPCs individuais. Isto envolve o isolamento e a expansão clonal de HSPCs in vitro. Essas culturas clonais refletem a composição genética da célula original (ou seja, mutações na célula original serão compartilhadas por todas as outras células da cultura). Esta aproximação permite que nós obtenhamos o ADN suficiente para arranjar em seqüência do genoma inteiro (WGS). Nós mostramos previamente que as mutações acumuladas in vitro durante a cultura clonal serão compartilhadas por um subconjunto das pilhas. Isto permite a filtração de todas as mutações in vitro, porque estas estarão atuais em uma fração menor das leituras comparadas às mutações in vivo adquiridas9. Os métodos precedentes obtiveram o ADN suficiente de uma única pilha para WGS usando a amplificação do inteiro-genoma (WGA)10. Entretanto, a desvantagem principal de WGA é sua amplificação relativamente erro-propensa e desequilibrada do genoma, que pode conduzir aos desistentes11do alelo. No entanto, como esta abordagem depende da expansão in vitro de células individuais, limita-se a células sanguíneas com potencial replicativo suficiente, o que não é o caso para os métodos dependentes de WGA. Os esforços mais adiantados que sequenciam culturas clonal confiaram em usar camadas do alimentador para assegurar a amplificação clonal de únicos HSPCs12. No entanto, o DNA das camadas do alimentador pode potencialmente contaminar o DNA das culturas clonais, confunde a chamada de mutação subsequente e filtragem. O método aqui apresentado depende unicamente do meio especificado para expandir clonalmente os HSPCs únicos e, portanto, evita a questão da contaminação do DNA. Até agora, temos aplicado com sucesso este método na medula óssea humana, sangue do cordão umbilical, viável congelado medula óssea, e sangue periférico.

Protocol

As amostras devem ser obtidas de acordo com os protocolos de ética apropriados, e os doadores devem dar o consentimento informado antes do procedimento.

1. preparação do material da amostra

Nota: Ao trabalhar com material recém-obtido, comece com a etapa 1,1. Ao trabalhar com material congelado, comece com a etapa 1,2.

  1. Preparando a medula óssea fresca, sangue do cordão umbilical ou sangue periférico
    1. Isole a fração mononucleares da amostra usando a separação de gradiente de densidade seguindo as instruções dos fabricantes (ver tabela de materiais) e conte as células mononucleares usando um hemociômetro. Após o isolamento das células mononucleares, continue com a etapa 1,3.
    2. OPCIONAL: o número recomendado de células necessárias para ordenar uma placa 384 bem completa de HSPCs é 1 – 2 x 107. Se mais células forem isoladas durante a centrifugação de gradiente de densidade, armazene o excedente de células em nitrogênio líquido.
    3. Reressuscitem as células em 500 μL de IMDM + 10% FBS por 1 x 107 células, e adicionar gota-a-gota um volume igual de imdm + 30% FBS + 20% DMSO para conseguir uma suspensão de 1 x 107 células em 1 ml de IMDM + 20% FBS + 10% DMSO.
    4. Transfira imediatamente as células mononucleares para 1 mL de frascos criogênicos e congele as células a-80 ° c em um recipiente de congelamento de células de taxa controlada durante a noite. Transfira as células no dia seguinte para um armazenamento de nitrogênio líquido após o processamento.
  2. Preparando células mononucleares congeladas da medula óssea, sangue do cordão umbilical ou sangue periférico
    1. Prepare 50 mL de meio de descongelar células contendo 45 mL de Iscove ' s Modified Eagle ' s Medium (IMDM) e 5 mL de soro bovino fetal (FBS) e aqueça em banho de água de 37 ° c.
    2. Tome o frasco contendo a amostra do armazenamento do nitrogênio líquido, transfira a amostra para o gelo seco, e descongele o mais rapidamente possível em um banho de água de 37 ° c.
    3. Quando a amostra é quase descongelada, limpe o frasco com 70% de etanol e transfira o seu conteúdo para um tubo cônico de 50 mL. Enxague o frasco com 1 ml de imdm pré-aquecido + 10% de FBS para recolher as restantes células e adicione esta solução gota gota (5 s por gota) à amostra descongelada enquanto roda suavemente o tubo.
    4. Adicionar um adicional pré-aquecido 15 ml de imdm + 10% FBS gota gota para a amostra, enquanto girando suavemente o tubo.
    5. Pellet as células por centrifugação por 5 min em 350 x g.
    6. Remover todos, mas ± 3 mL do sobrenadante. Ressuscitar as células no sobrenadante remanescente e diluir adicionando 20 mL de IMDM + 10% FBS drop-by-drop enquanto agitando suavemente o tubo.
    7. Tome 10 μL da suspensão celular para contagem de células. Diluir estes 10 μL adicionando 20 μL de solução de 0,4% de azul de Tripan e contar as células utilizando um hemociômetro. O número da célula pode diminuir após o descongelar, com até 50% de perda de células após a thawing. A viabilidade celular deve variar entre 70% e 90%.
  3. Se trabalhar com medula óssea ou células sanguíneas do cordão umbilical, pegue 5 x 106 células mononucleares para cultura MSC (etapa 2,1). Se estiver a trabalhar com sangue periférico, tome 2 – 5 x 106 células para isolamento de células T (passo 2,2)
  4. Células remanescentes da pelota 5 min a 350 x g e ressuscitem em 3 ml de tampão FACS (0, 5% BSA + 1 mm EDTA em PBS).
  5. Transferir 1 x 105 células para um microtubo preenchido com 200 μL de tampão FACS, que servirá como um controle negativo para a citometria de fluxo (passo 3,8), e manter no gelo.

2. cultura de células

Nota: Para obter catálogos de mutações adquiridas somaticamente, a variação do germline doador-específico precisa de ser filtrada para fora. Ao começar com biópsias de medula óssea ou sangue do cordão umbilical, as células estromais mesenquimais (MSCs) podem ser usadas como controle correspondente para filtrar a variação da linha germinal. Neste caso, siga a seção 2,1. Ao usar o sangue periférico (mobilizado) siga o passo 2,2 para isolar e usar células T como amostra de controle correspondente para filtrar a variação da linha germinal (Figura 1). A população de células T em massa compartilhará a mesma relação de linhagem que os HSPCs.

  1. Cultura MSC
    1. Prepare 50 mL de meio MSC contendo 45 mL de meio DMEM/F12, 10% FBS, 500 μL de tripsina ou tripsina alternativa, e 500 μL de solução de penicilina/estreptomicina.
    2. Placa de aproximadamente 5 x 105 células mononucleares em 1,5 ml de meio MSC por poço. Coloc as pilhas em uma incubadora humidificada em 37 ° c com 5% CO2.
    3. Substitua o meio após 24 h, e substitua subseqüentemente o meio cada 3 dias para assegurar-se de que todas as pilhas hematopoietic estejam lavadas fora. Continue até a cultura até que a confluência seja 100%.
    4. Se os MSCs forem confluentes, lave as células com 1 mL de PBS e colha os MSCs adicionando 200 μL de tripsina ou tripsina alternativa por poço. Incubar células por 5 min a 37 ° c. Adicione 800 μL de meio MSC e Pipet as células para cima e para baixo para soltar as células da placa de poço.
    5. Transfira MSCs ao tubo do microcentrifugador e pellet as pilhas pela centrifugação por 5 minutos em 350 x g. Retire o sobrenadante e continue com o isolamento do ADN ou guarde a pelota a-20 ° c para um isolamento posterior do ADN (secção 4).
  2. Isolamento de células T
    Nota: Se estiver usando sangue periférico (mobilizado), as células T podem ser isoladas e usadas como controle de germline.
    1. Ressuspender o pellet celular em 100 μL de solução de coloração anti-CD3 (1:100 diluição do anticorpo anti-CD no tampão FACS).
    2. Lave as células adicionando 1 mL de tampão FACS. Pellet as células por centrifugação por 5 min a 350 x g e ressuscitem em 300 μL de tampão FACS.
    3. Isolar pelo menos 5 x 105 células CD3 + usando um FACS-classificador em um tubo de poliestireno de 5 ml pré-preenchido com 1 ml de FBS.
    4. Pellet as células classificadas usando centrifugação por 5 min em 350 x g, retire o sobrenadante, e continuar diretamente com isolamento de DNA (seção 4) ou armazenar o pellet em-20 ° c para posterior isolamento de DNA.

3. isolamento, classificação e cultura do HSPC

  1. Gire para baixo em 1 – 2 x 107 células mononucleares por 5 min a 350 x g e ressuscite em 50 ΜL de tampão FACS (ver passo 2.2.1). Transfira as células para um tubo de microcentrífuga.
    Nota: Ao classificar com > 2 x 107 células, aumente a mistura de anticorpos e os volumes de buffer FACS de acordo.
  2. Prepare 50 μL de mistura de coloração de 2x HSC de acordo com a receita observada na tabela 1.
Anticorpo volume [μL]
BV421-CD34 5
FITC-linhagem Mix (CD3/14/19/20/56) 5
PE-CD38 2
APC-CD90 0,5
PerCP/Cy 5.5-CD45RA 5
PE/Cy7-CD49f 1
FITC-CD16 1
FITC-CD11 5
Tampão de FACS 25,5

Tabela 1: mistura de classificação de HSC. Mostrado é uma tabela que indica as diluições dos anticorpos usados para classificar os HSCs.

  1. Misturar 50 μL de solução celular com a mistura de coloração HSC preparada e incubar as células durante 15 min à temperatura ambiente (RT) ou por 1 h no gelo para que os anticorpos se liguem.
  2. Lave as células adicionando 1 mL de tampão FACS e pellet por centrifugação por 5 min a 350 x g.
  3. Ressuspender as células em 300 μL de tampão FACS e filtrar a suspensão celular através de um tubo de poliestireno de 5 mL com filtro de célula de 35 μm para remover os aglomerados celulares antes da triagem de células ativadas por fluorescência (FACS).
  4. Prepare 25 mL de meio de cultura HSPC, consistindo de 1x SFEM médio suplementado com 100 ng/mL SCF, 100 ng/mL Flt3, 50 ng/mL TPO, 10 ng/mL IL-3, 20 ng/mL IL-6, e 100 ng/mL formulação antibiótica (ver tabela de materiais).
  5. Encha uma placa da cultura da pilha de 384 poços com 75 μL do meio de cultura de HSPC em cada poço.
    Nota: Para evitar a evaporação do meio nos poços exteriores, encha os poços exteriores com 75 μL de água estéril ou PBS, e não utilize estes poços para a triagem celular.
  6. Classificando os HSPCs únicos
    1. Definir portões para a classificação de HSPC com base em um controle não manchado (etapa 1,9) e 10.000 células da amostra manchada. Um resultado representativo para A configuração de portões é representado na Figura 1. Porta células únicas desenhando uma porta ao redor da fração linear FSC-Height vs. FSC-Area. Use a fração de controle não manchada para desenhar a porta para linhagem- fração. Desenhe portões para células CD34+ e caracterize ainda mais este subconjunto definindo um portão específico para CD38- CD45RA- Cells.
    2. Carregue a placa 384 bem na máquina FACS e classifique as únicas células.
      Nota: Se aplicável ao FACS-Machine, alterne a opção para manter os dados de classificação do índice para habilitar o rerastreamento das células classificadas.
  7. Cultivando HSCs classificados isoladamente
    1. Transfira diretamente a placa de 384 poços para uma incubadora humidificada de 37 ° c com 5% de CO2.
      Nota: Para impedir a evaporação durante a cultura, enrole a placa da cultura do poço 384 (com tampa) no envoltório transparente do polietileno.
    2. Mantenha a placa 384 bem na incubadora por 3 – 4 semanas até que apareçam clones visíveis. As imagens representativas da cultura clonal são representadas na Figura 2. Com base na condição do material de entrada 5% – 30% das células classificadas irão clonalmente expandir.

4. colheita de clones de HSPC

  1. Após 4 semanas de cultivo, determinar quais os poços têm uma confluência de 30% ou superior.
  2. Pré-preenchimento (para cada outgrowth clonal) 1,5 mL microtubos com 1 mL de BSA 1% em PBS e rotular o tubo de acordo com o poço correspondente.
  3. Pré-molhe uma ponta de pipeta com 1% de BSA em PBS para minimizar o número de células aderindo à ponta da pipeta.
  4. Pipet para cima/para baixo o meio no poço ferozmente (pelo menos 5 vezes) com uma pipeta de 200 μl (ajustada em 75 μL) e raspe a parte inferior do poço para afrouxar pilhas no poço, e para recolher a suspensão da pilha no microtubo etiquetado que corresponde ao poço.
  5. Tome acima 75 μL de BSA fresco de 1% em PBS e repita a pipetagem no poço para assegurar a captação máxima das pilhas.
    Nota: As pilhas clonally cultivadas podem furar à parte inferior do poço. Inspecione os poços usando um microscópio de luz invertido padrão para garantir se todas as células foram coletadas.
  6. Se todos os poços com > 30% confluência foram colhidas, coloque o 384 bem placa de volta na incubadora. As culturas clonais podem proliferar por até 5 semanas.
  7. Gire para baixo a suspensão da pilha por 5 minutos em 350 x g. Um pequeno pellet deve ser visível.
  8. Retire cuidadosamente todos, mas cerca de 5 μL de sobrenadante. As pelotas da pilha podem ser congeladas em-20 ° c e armazenadas por meses múltiplos antes do isolamento do ADN.

5. isolação do ADN

  1. Isole o DNA de HSPC e MSC/célula T usando um kit de isolamento de DNA de microescala de acordo com a instrução do fabricante com os seguintes ajustes:
    1. Adicionar 2 μL de RNase A após adição de tampão AL durante A secção 2. Incubar por 2 min antes de adicionar proteinase K.
    2. Incubar por 30 min a 56 ° c em vez de 10 min.
    3. Elute o DNA carregando a coluna com 50 μL do tampão de TE com baixo EDTA (Tris de 10 milímetros, EDTA de 0,1 milímetros). Para a eluição óptima, recarregue o evate outra vez na coluna e gire-o outra vez.
  2. Determine a concentração de DNA usando um DNA medindo 2 μL por clone. O rendimento do DNA normalmente varia entre 0,5 – 3 ng/μL.

6. sequenciamento

  1. Executar sequenciamento de DNA conforme descrito por Jager et al.13

7. mapeamento e chamada de mutação somática

  1. Mapeie a saída do sequenciamento (arquivos FASTQ) para o genoma de referência e mutações de chamada, conforme descrito em Jager et al.13
  2. Inspecione os dados para alterações cariotípicas aberrantes em clones seqüenciados e dados em massa usando uma ferramenta de análise de número de cópia, como Control-FreeC14. Até agora, nós não relataram nenhuns HSPCs com aberrâncias karyotypic.
  3. Gere uma lista negra, que consiste em um painel de amostras normais sem correspondência para fins de filtragem de um próprio conjunto de amostras, conforme descrito anteriormente13, ou use a seguinte lista negra carregada: < https://Data.Mendeley.com/DataSets/9y4yhwt5rp/3 >.
  4. Filtre as variações de nucleotídeo único usando SNVFI < https://>.
    1. Arquivo SNVFI. config predefinido, de forma que todos os caminhos para funções auxiliares estão corretos.
    2. Execute o arquivo SNVFI com. ini configurado de acordo com as configurações vistas no arquivo suplementar 1 (snvfi. ini). Para excluir mutações in vitro induzidas, filtramos para uma VAF ≥ 0,39.
  5. Verifique a saída da fração de alelo variante (VAF) do SNVFI (Figura 4). Verifique se o pico do gráfico de densidade está perto de 0,5, indicando que a amostra é clonal.
  6. Opcional: Para determinar a parte do genoma que é coberta durante a filtração, determine as regiões callable ao longo do germline e controle usando CallableLoci de GATK (ToolKit da análise do genoma):
    Java-jar GenomeAnalysisTK. jar \ \
    -T CallableLoci \
    -R referência. FASTA \ \
    -Eu myreads. bam \ \
    -Sumário Table. txt \
    -o callable_status. Bed
  7. Opcional: Recupere as regiões callable da saída de CallableLoci e realize intersecções emparelhadas entre os exemplos e o volume usando o script Python CallableLoci_processor. py presente em https://github.com/ToolsVanBox/CallableLoci_processor . Os arquivos de leito resultantes podem ser usados para filtrar ainda mais a saída do SNVFI e para inspecionar o perfil mutacional na seção 9:
    CallableLoci_processor. py dir_in dir_out sample_name bulk_name – amostras Sample1 Sample2 sample3

8. Indel Calling

  1. Selecione todas as inserções e exclusões (indels) no arquivo raw_variants. vcf usando GATK SelectVariants:
    Java-Xmx12G \
    -jar GenomeAnalysisTK. jar \ \
    -T SelectVariants \
    -R reference_genome. FASTA \
    -V raw_variants. vcf \
    -o raw_INDELs. vcf \
    -selectType INDEL
  2. Filtrar raw_INDELS. vcf lista usando INDELFI < https://>. com/toolsvanbox/indelfi:
    Perl INDELFI.pl-i Input. vcf (da etapa 8,1) \
    -s coluna amostra de teste \
    -c amostra de controle de coluna

9. inspeção de perfil mutacional

  1. Use os arquivos. vcf resultantes da saída SNVFI da etapa 7,6 (ou da etapa 7,9 com a análise opcional de loci callable) para analisar o perfil mutacional genômica, tipos de mutação e análise de assinatura usando o pacote R MutationalPatterns15: < http://BioConductor.org/packages/Release/bioc/HTML/mutationalpatterns.html >. Para a saída representativa que pode ser produzida com o arquivo. vcf resultante, como um espectro mutacional 96-trinucleotídeo, consulte a Figura 5.

10. construção de uma árvore de linhagem de desenvolvimento usando substituições de base

  1. Para construir uma árvore de linhagem de desenvolvimento, detecte mutações compartilhadas entre clones. As mutações presentes nos primeiros ramos da árvore de linhagem também podem ser subclonalmente presentes na amostra em massa (MSCs/T-Cells). Linhagens de ramificação posteriores serão definidas por mutações compartilhadas apenas por clones de HSPC.
  2. Para identificar mutações que estão presentes em um subconjunto dos clones e subclonalmente presentes em massa, execute as etapas a seguir.
  3. Para filtrar mutações somáticas compartilhadas entre clones, execute o script filterSomatic.py em um terminal baseado em UNIX. O script pode ser encontrado em https://github.com/ToolsVanBox/filterSomatic. Antes de executar esse script, edite o arquivo Filtersomática. ini (consulte o arquivo suplementar 2) para definir os caminhos e ajustar os outros parâmetros.
  4. Execute filterSomatic.py (python3 filterSomatic.py-i Filtersomática. ini).
  5. Filtre para as mutações que são subclonally atuais no volume usando o Determine_lowVAF_bulk. Script R em um terminal baseado em UNIX. O script pode ser encontrado em https://github.com/ToolsVanBox/Identify_lowVAF_bulk_muts. Isso gerará arquivos. vcf separados para SNVs compartilhados e exclusivos:
    RSCRIPT Determine_lowVAF_bulk. R
    --vcf caminho/para/Filter_somatic_output. vcf
    --Bulk bulk_name
    --sample_name Sample-nome
    --sexo [M | F
    --out_dir out_dir
  6. Determine todas as mutações compartilhadas entre clones que não estão presentes na amostra em massa, sobrepondo todas as posições de mutação (concatenar a coluna 1 e 2 da saída SNVFI).
  7. Exclua falsos positivos obtidos durante as etapas 10,5 e 10,6 por inspeção manual usando IGV16. As mutações são consideradas falsas quando não presentes, quando a mutação está presente no germline ou quando presentes em regiões mal mapeadas, veja a Figura 7.
    Nota: É altamente recomendável resequenciar todos os loci compartilhados de forma independente usando sequenciamento direcionado ou Sanger.
  8. Use as mutações compartilhadas obtidas durante os passos 10,1 e 10,2 para construir uma tabela binária de mutações versus clones seqüenciados, com 0 indicando que a mutação não está presente e 1 indicando a presença da mutação.
  9. Output a tabela binária da mutação como em um heatmap junto com um dendrograma que indica relações da linhagem entre pilhas usando R. O heatmap indica o status de mutações para cada célula. Veja a saída desta função (Figura 6).
            
    Clones <-Read. Table ("caminho/para/BinaryTable")
            
    my_palette <-colorRampPalette (c ("#cccccc", "#333333")) (n = 2)
    col_breaks <-c (0, 0,5, 1)
            
    heatmap. 2 (clone, distfun = função (x) dist (x, method = ' binary '),
    hclustfun = função (x) hclust (x, Method = média),
    dendrograma = "coluna", Rowv = F,
    Col = my_palette, Breaks = col_breaks,
    Trace = "None", density. info = "None")

Representative Results

Procedimento experimental
O fluxo de trabalho experimental é representado na Figura 1. Com base no tipo de material de entrada, diferentes etapas devem ser seguidas. Na Figura 2 , uma saída citométrica de fluxo de uma espécie de célula de sangue do cordão umbilical é descrita. Em primeiro lugar, todas as células monocíticas são selecionadas vagamente desenhando uma porta em torno desta população. Em seguida, as singelas são isoladas selecionando-se para as células com uma relação FSC-H/FSC-A linear, uma relação FSC-H/FSC-a mais baixa inclui doublets ou aglomerantes de células. A amostra de controle não manchada é usada para definir os portões de classificação de células para Lineage-, CD34+, CD38-, CD45RA-. Adicionalmente, CD90 e CD49f podem ser usados para distinguir entre células progenitoras ou células-tronco autorenovadas17 (Figura 2). Classificação de índice habilita o re-Tracing de células individuais e as células classificadas são representadas como pontos marrons. Durante a cultura celular, clones individuais podem se expandir em um ritmo diferente, com alguns clones se expandindo dentro de 3 semanas, enquanto outros clones só são totalmente expandidos até a quinta semana de cultura. Ver Figura 3a, B para o crescimento representativo da colônia. Um retrato representativo é mostrado de uma cultura maioria quase confluente do MSC em 11 dias após o chapeamento (Figura 3C).

Verificando a qualidade após sequenciamento e análise de mutação
É mostrado um exemplo de saída da análise de número de cópia gerada pelo Control-FreeC14 para verificar as alterações de número de cópia (Figura 4). A informação de karyotypic pode indicar que cromossomas a excluir durante uma corrida de SNVFI (etapa 7,6). O gráfico VAF criado pelo SNVFI (Figura 5) é um histograma de frequências alélicas variantes na amostra. Um pico no gráfico de densidade em 0,5 indica que a amostra é clonal. Para obter mais informações sobre as causas biológicas subjacentes por trás de mutações, elas podem ser analisadas usando o pacote R MutationalPatterns15. Representado aqui é uma análise típica produzindo uma parcela de 96-trinucleotídeo (Figura 6). Além da quantificação de diferentes tipos de mutação, a extração de assinatura também pode ser realizada com esta ferramenta.

Construindo uma árvore de linhagem de desenvolvimento
Mutações compartilhadas entre clones ou presentes em um clone (e em baixo VAF) no controle de germline são validadas usando IGV. As mutações são consideradas verdadeiras quando presentes na amostra e não em níveis elevados de VAF na linha germinal (Figura 7a). As mutações são consideradas falsas quando não estão presentes na IGV, o que pode acontecer em regiões mal mapeadas (Figura 7B). Em outros casos, os eventos detectados pelo SNVFI são as mutações do germline perdidas (Figura 7C). O re-sequenciamento independente das mutações pelo re-seqüenciamento alvejado é altamente-recomendado para estas mutações em clones selecionados.  Após a detecção de mutações somáticas compartilhadas entre clones, uma matriz binária é gerada (etapa 10,8). Um heatmap é construído contendo células com e sem as mutações compartilhadas a-M. Acima deste mapa de calor é indicada a árvore de linhagem de desenvolvimento (Figura 8).

Figure 1
Figura 1: fluxograma representando o procedimento experimental baseado no material de entrada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: estratégia de classificação de células. Primeiro, a gating é realizada em pequenas células mononucleares. Em segundo lugar, as células individuais são bloqueadas por seleção da fração linear. Células negativas de linhagem são bloqueadas. Todos os CD34+ CD38- CD45- Cells são únicos Cell-Sorted. A fração de células em marrom deve ser anotada, que são as células classificadas destacadas pela opção "classificação do índice". Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: resultados representativos da cultura celular. Clones representativos de HSPC em uma placa do poço 384 em (a) 2 semanas após o chapeamento e (B) 4 semanas após o chapeamento. (C) cultura MSC após 2 semanas de reposição média. Barra de escala = 100 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: cariótipos. (A) cultura CLONAL hspc e (B) MSC Bulk Sample. Os karyotypes foram determinados pela análise da ler-profundidade. Ambos os gráficos indicam uma amostra karyotipicamente normal. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Histograma de frequências alélicas variantes. Histograma de frequências alélicas variantes das variações em um clone antes da última etapa de filtragem de SNVFI (VAF > 0,3). Um pico na VAF = 0,5 indica que a amostra é clonal. As mutações subclonais com baixo VAF são excluídas durante a última etapa de filtração de SNVFI (VAF > 0.3). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: análise do espectro mutacional representativo de mutações somáticas em uma amostra de HSPC. Representado é a contribuição relativa de cada mudança de trinucleotídeo (da qual a base média é mutada) para o espectro total. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: inspeção manual de mutações utilizando IGV16. (A) as mutações são consideradas verdadeiras quando presentes no clone e não na amostra a granel. (B) as mutações são consideradas como falsos positivos quando presentes em uma região mal mapeada. (C) as mutações são consideradas como falsos positivos quando presentes em um controle de germline. A linha vertical indica a posição de uma mutação chamada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: construção de uma árvore de linhagem de desenvolvimento. Representado é um dendrograma que indica linhagens de desenvolvimento que se separam durante o desenvolvimento. O mapa de calor o dendrograma indica a presença de mutações em diferentes clones. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

É apresentado aqui um método para detectar as mutações que acumularam durante a vida em HSPCs individuais e para construir uma árvore desenvolvente adiantada da linhagem usando estes dados da mutação.

Vários requisitos críticos devem ser atendidos para realizar esses ensaios com sucesso. Em primeiro lugar, a viabilidade da amostra deve ser assegurada. O manuseio rápido da amostra é fundamental para garantir a eficiência do procedimento. Em segundo lugar, a perda da potência do fator de crescimento afetará negativamente a expansão clonal dos HSPCs. Para garantir a alta potência do fator de crescimento, é importante evitar ciclos de congelamento e degelo e preparar alíquotas de uso único. Em terceiro lugar, após a realização de WGS, chamada de mutação e filtragem, é crucial validar a clonalidade da cultura clonal. Para confirmar o clonality da cultura, o VAF das mutações deve agrupar ao redor de 0,5 em uma amostra karyotipicamente normal (Figura 3). Nas células com baixa carga mutacional, como os HSPCs do sangue do cordão umbilical, é mais difícil determinar a clonalidade devido aos baixos números de mutação.

A nossa abordagem baseia-se na expansão in vitro de células individuais para permitir a WGS. Portanto, nossa abordagem é restrita a células que têm o potencial replicativo para expandir clonalmente, como HSPCs. Em nossas mãos, cerca de 5%-30% de todas as células simples-classificadas são capazes de expandir adequadamente. Taxas de crescimento reduzidas podem potencialmente resultar em um viés de seleção. Como discutido previamente, os métodos que usam WGA podem superar este viés da seleção porque esta técnica é não confia na expansão das pilhas. Entretanto, WGA tem suas próprias deficiências, e a amplificação clonal permanece o único método para determinar exatamente o número de mutações no genoma inteiro sem desistências alélicas e a cobertura igual ao longo do genoma, especial nas amostras com baixo somático verdadeiro números de mutação.

Os dados gerados com essa abordagem podem ser utilizados para determinar filogenias do sistema hematopoiético, pois as mutações detectadas em células simples podem ser utilizadas para dissecar linhagens celulares, como descrito na Figura 6. Tipicamente, uma ou dois mutações podem definir cada filial em um doador saudável1. Uma vez que as linhagens se ramificam precocemente após a concepção, mutações que definem esses primeiros ramos também estarão presentes com um baixo VAF na amostra normal combinada que foi utilizada para filtrar as variantes do germline1,18,19. Neste caso, o uso de células não hematopoiéticas, como os MSCs, é preferível, pois eles devem se separar muito cedo durante o desenvolvimento do sistema hematopoiético. Porque as T-pilhas são da origem hematopoietic, o uso destas pilhas como uma amostra normal combinada para filtrar variações do germline poderia conseqüentemente confundir a construção da ramificação a mais adiantada da árvore desenvolvente da linhagem. A presença subclonal de mutações Branch-specific em determinadas populações maduras do sangue, que pode ser medida pelo sequenciamento profundo alvejado, indicará que a progêia desse ramo pode dar origem a esse tipo maduro da pilha. Além disso, nossa abordagem permite avaliar as conseqüências mutacionais da exposição mutagênica in vivo e, em última análise, como isso pode contribuir para o desenvolvimento da leucemia.

Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este estudo foi apoiado por uma concessão de uma VIDI da organização dos Países Baixos para a investigação científica (NWO) (no. 016. Vidi. 171.023) para R. v. B.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.20 µm syringe filter Corning 431219
50 mL Syringe, Luer lock BD 613-3925
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A9647-50G
CD11c FITC BioLegend 301603 Clone 3.9
CD16 FITC BioLegend 302005 Clone 3G8
CD3 BV650 Biolegend 300467 Clone UCHT1
CD34 BV421 BioLegend 343609 561
CD38 PE BioLegend 303505 Clone HIT2
CD45RA PerCP/Cy5.5 BioLegend 304121 Clone HI100
CD49f PE/Cy7 BioLegend 313621 Clone GoH3
CD90 APC BioLegend 328113 Clone 5E10
Cell Strainer 5 mL tube Corning 352235
CELLSTAR plate, 384w, 130 µL, F-bottom, TC, cover Greiner 781182
Cryogenic vial Corning 430487
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650
DMEM/F12 ThermoFisher 61965059
EDTA Sigma-Aldrich E4884-500G
Fetal Bovine Serum ThermoFisher 10500
GlutaMAX ThermoFisher 25030081
Human Flt3-Ligand, premium grade Miltenyi Biotech 130-096-479 Reconsititute in single-use aliquots (25 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS
Human Recombinant IL-3 (E. coli-expressed) Stem Cell Technologies 78040.1 Reconsititute in single-use aliquots (2.5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS
Human Recombinant IL-6 (E. coli-expressed) Stem Cell Technologies 78050.1 Reconsititute in single-use aliquots (5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS
Human SCF, premium grade Miltenyi Biotech 130-096-695 Reconsititute in single-use aliquots (25 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS
Human TPO, premium grade Miltenyi Biotech 130-095-752 Reconsititute in single-use aliquots (12.5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS
Integrative Genomics Viewer 2.4 Broad Institute https://software.broadinstitute.org/software/igv/download
Iscove's Modified Eagle's Medium ThermoFisher 12440061
Lineage (CD3/14/19/20/56) FITC BioLegend 348701 Clones: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56
Lymphoprep Stem Cell Technologies #07861 Used for Density gradient separation
PBS Made in at Institute's facility. Commerically available PBS can also be used
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher 15140122
Primocin Invivogen ant-pm-1 Antibiotic formulation
QIAamp DNA Micro Kit Qiagen 56304
Qubit 2.0 fluorometer ThermoFisher Q32866
Qubit dsDNA HS Assay Kit ThermoFisher Q32854
RNAse A Qiagen 19101
SH800S Cell Sorter Sony SH800S
StemSpan SFEM, 500 mL Stem Cell Technologies 9650
TE BUFFER PH 8.0, LOW EDTA G-Biosciences 786-151
TrypLE Express ThermoFisher 12605-10

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References

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