अनुकूलन, डिजाइन और मैनुअल मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री में नुकसान से बचने

Cancer Research

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Summary

मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री एक उभरती हुई तकनीक है जो बरकरार फॉर्मेलिन-फिक्स्ड, पैराफिन एम्बेडेड (FFPE) ऊतक के भीतर कई सेल प्रकार के दृश्य को सक्षम बनाता है। प्रस्तुत एंटीबॉडी और अभिकर्मकों के अनुकूलन के लिए निर्देश के साथ एक सफल 7 रंग मल्टीप्लेक्स सुनिश्चित करने के लिए दिशानिर्देश हैं, स्लाइड, डिजाइन और आम समस्याओं से बचने के लिए सुझाव तैयार.

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Lazarus, J., Akiska, Y., Perusina Lanfranca, M., Delrosario, L., Sun, L., Long, D., Shi, J., Crawford, H., Di Magliano, M. P., Zou, W., Frankel, T. Optimization, Design and Avoiding Pitfalls in Manual Multiplex Fluorescent Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (149), e59915, doi:10.3791/59915 (2019).

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Abstract

कोशिका घुसपैठ और स्थानिक संगठन के विश्लेषण के लिए बरकरार ऊतक का सूक्ष्म पर्यावरण मूल्यांकन रोग प्रक्रियाओं की जटिलता को समझने के लिए आवश्यक है। अतीत में इस्तेमाल सिद्धांत तकनीक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) और इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) शामिल हैं जो 1 और 4 मार्करके बीच का उपयोग करके समय में स्नैपशॉट के रूप में कोशिकाओं के दृश्य को सक्षम करते हैं। दोनों तकनीकों खराब antigenic लक्ष्य और पार प्रजातियों प्रतिक्रिया से संबंधित सीमाओं धुंधला कठिनाई सहित कमियों है. IHC विश्वसनीय और reproduible है, लेकिन रसायन विज्ञान और दृश्य प्रकाश स्पेक्ट्रम पर निर्भरता की प्रकृति केवल कुछ मार्करों के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए अनुमति देता है और सह स्थानीयकरण चुनौतीपूर्ण बनाता है. IF का उपयोग संभावित मार्करों को व्यापक करता है लेकिन आम तौर पर औपचारिक निर्धारण के बाद व्यापक ऊतक autofluorscence के कारण जमे हुए ऊतक पर निर्भर करता है. फ्लो साइटोमेट्री, एक तकनीक है कि कई epitopes के एक साथ लेबलिंग सक्षम बनाता है, आईएफ और IHC की कमियों के कई abrogates, तथापि, एक एकल सेल निलंबन के रूप में कोशिकाओं की जांच करने की आवश्यकता महत्वपूर्ण जीवविज्ञान discarding कोशिकाओं के स्थानिक संदर्भ खो देता है संबंध. मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (mfIHC) समग्र microenvironment वास्तुकला और स्थानिक संरक्षण करते हुए औपचारिक रूप से फिक्स्ड पैराफिन एम्बेडेड (FFPE) ऊतक में बहु-एपिटोप सेलुलर phenotyping के लिए अनुमति देता है इन प्रौद्योगिकियों पुल अक्षुण्ण ऊतक के भीतर कोशिकाओं का संबंध. उच्च फ्लोरोसेंट तीव्रता फ्लोरोफोर्स कि ऊतक एपिटोप के लिए सहसंयोजक बंधन माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा प्रजातियों विशिष्ट पार प्रतिक्रिया की चिंता के बिना प्राथमिक एंटीबॉडी के कई अनुप्रयोगों के लिए सक्षम बनाता है। हालांकि इस तकनीक के लिए रोग के अध्ययन के लिए विश्वसनीय और सटीक छवियों का उत्पादन सिद्ध किया गया है, एक उपयोगी mfIHC धुंधला रणनीति बनाने की प्रक्रिया समय लगता है और व्यापक अनुकूलन और डिजाइन के कारण सटीक हो सकता है. स्थिति में सही सेलुलर बातचीत का प्रतिनिधित्व करने वाले मजबूत चित्र बनाने के लिए और मैन्युअल विश्लेषण के लिए ऑप्टिमाइज़ेशन अवधि को कम करने के लिए, यहां प्रस्तुत स्लाइड तैयारी के लिए तरीके हैं, एंटीबॉडी का अनुकूलन, मल्टीप्लेक्स डिजाइन के साथ-साथ त्रुटियों आमतौर पर धुंधला प्रक्रिया के दौरान सामना करना पड़ा.

Introduction

एक बरकरार ट्यूमर microenvironment के दृश्य (TME) ठोस द्रोह में न केवल सेलुलर घुसपैठ का मूल्यांकन करने में आवश्यक है, लेकिन सेल के रूप में अच्छी तरह से सेल बातचीत करने के लिए. मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (mfIHC) कैंसर और जुड़े रोगों के अध्ययन में कोशिकाओं के बहु-एंटीजन फीनोटाइपिंग के लिए एक प्रभावी उपकरण के रूप में उभरा है1,2,3,4, 5,6,7. यह, बड़े डेटा सेट का विश्लेषण करने के लिए डिज़ाइन किए गए उपन्यास सॉफ्टवेयर और प्रोग्राम के संयोजन में, कोशिकाओं1,2,4के बीच जटिल अन्योन्यक्रियाओं के अवलोकन में सक्षम बनाता है। डेटा अधिग्रहण में दर सीमित कारक अक्सर विश्लेषण से पहले दाग ऊतक की गुणवत्ता है.

TME में phenotype कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया पिछले तकनीक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (IHC), इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) और प्रवाह साइटोमेट्री सभी जो महत्वपूर्ण सीमाओं मौजूद शामिल हैं। IHC formalin निश्चित पैराफिन एम्बेडेड (FFPE) ऊतक वर्गों जो deparaffinized और सबसे अक्सर एक एंटीबॉडी द्वारा दाग जा रहा से पहले rehydrated का उपयोग करता है. एक घोड़े की तरह peroxidase (एचआरपी) बाध्य माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करें और एक रासायनिक प्रतिक्रिया एक विरोधी epitope8के दृश्य की अनुमति देता है. जबकि IHC विश्वसनीय है और FFPE ऊतक जो के साथ काम करने के लिए आसान है पर प्रदर्शन किया, दृश्य प्रकाश स्पेक्ट्रम के लिए सीमाओं का मतलब है केवल एक या दो मार्करों विश्वसनीय प्रतिष्ठित और एंटीजन के colocalization काफी मुश्किल8हो सकता है. उपलब्ध मार्करों का विस्तार करने के लिए एक रास्ता है और इसलिए प्रतिजन है कि एक एकल खंड पर जांच की जा सकती है फ्लोरोसेंट जो दृश्य स्पेक्ट्रम की एक व्यापक रेंज के उपयोग के लिए अनुमति देता है को बदलने के लिए है. यदि, जमे हुए या FFPE ऊतक स्लाइड और एंटीबॉडी है कि विभिन्न फ्लोरोफोर्स के लिए संयुग्मी हैं इस्तेमाल पर स्थानांतरित कर दिया है. हालांकि यह एंटीजन की संख्या बढ़ जाती है कि जांच की जा सकती है, वहाँ कई महत्वपूर्ण सीमाएं हैं. सबसे पहले, क्योंकि प्रत्येक एंटीबॉडी आम तौर पर केवल एक फ्लोरोफोर संलग्न है, चमक अक्सर ऊतक autofluorence को दूर करने के लिए पर्याप्त मजबूत नहीं है. यह इस कारण के लिए है, सबसे IF जमे हुए ऊतक जो स्टोर करने के लिए महंगा है और के साथ काम करने के लिए मुश्किल है पर किया जाता है. फ्लोरोसेंट टैग की एक सीमित संख्या वर्णक्रमीय ओवरलैप और पार प्रजातियों प्रतिक्रिया के कारण उपयोग के लिए उपलब्ध हैं, खासकर जब गैर संयोजित एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है. फ्लो साइटोमेट्री, जिसमें एक सेल निलंबन में नए ऊतक प्रसंस्करण होते हैं और फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ लेबलिंग9,10दशकों के लिए इम्यूनोफेनोटाइपिंग के लिए स्वर्ण मानक रहा है. प्रवाह साइटोमेट्री का एक लाभ प्रजातियों के लिए चिंता के बिना कई एंटीबॉडी लेबल करने की क्षमता है पार प्रतिक्रिया के रूप में सबसे संयुग्मी हैं. क्योंकि कोशिकाओं को एक मशीन और नहीं मानव आँखों द्वारा "दृश्य" कर रहे हैं, वहाँ कहीं अधिक fluorophores उपलब्ध हैं, लेकिन यह एक लागत के साथ आता है. मुआवजा मैन्युअल रूप से किया जाना चाहिए जो काफी झूठी सकारात्मक और नकारात्मक आबादी का उत्पादन परिणाम बदल सकते हैं. प्रवाह साइटोमेट्री का सबसे महत्वपूर्ण सीमा यह है कि ऊतक वास्तुकला और बाद में सभी स्थानिक जानकारी एकल कोशिकाओं के निलंबन के लिए आवश्यकता से खो जाती है।

मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (mfIHC) उपन्यास सॉफ्टवेयर के साथ संयोजन में एक स्वचालित फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर संकेत प्रवर्धन के साथ धुंधला बहु-एंटीजन ऊतक की अनुमति देकर IHC, IF और प्रवाह साइटोमेट्री के लाभों को जोड़ती है मुआवजे की आवश्यकता के बिना स्थानिक संबंधों का प्रतिधारण। FFPE ऊतक आरोप लगाया स्लाइड पर रखा गया है, जो, प्रतिजन पुनर्प्राप्ति के बाद, ब्याज के लक्ष्य प्रतिजन के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी आवेदन का एक दौर से गुजरना एक एचआरपी रासायनिक टैग के साथ एक माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा पीछा किया, IHC के समान. द्वितीयक एंटीबॉडी की नियुक्ति के बाद, एचआरपी विशिष्ट प्रतिक्रिया के परिणामस्वरूप फ्लोरोफोर सहसंयोजक रूप से ब्याज11के प्रतीक के लिए बाध्यकारी होता है। एक बार ऊतक लेबल है, स्लाइड हीटिंग का एक और दौर पहले से लागू प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी परिसर को हटाने पूरा हो गया है केवल फ्लोरोसेंट टैग ऊतक epitope11के लिए बाध्य छोड़ने. यह किसी भी प्रजाति के कई एंटीबॉडी के लिए पार प्रतिक्रिया11,12के लिए चिंता के बिना फिर से लागू करने के लिए अनुमति देता है. एकाधिक फ्लोरोसेंट रंगों के मैनुअल मुआवजे के लिए किसी भी जरूरत को कम करने के लिए, एक परमाणु काउंटर दाग सहित थोड़ा वर्णक्रमीय ओवरलैप के साथ फ्लोरोफोर का एक संग्रह mfIHC को पूरा करने के लिए प्रयोग किया जाता है. FFPE ऊतक के साथ सामना करना पड़ा autofluorscence के लिए खाते में, सॉफ्टवेयर एक खाली स्लाइड जो फ्लोरोफोर के बाद प्रतिजन विशिष्ट फ्लोरोसेंट की ताकत की वजह से संभव है से एक छवि का उपयोग कर अंतिम छवि से autofluorscence subtracts संकेत प्रवर्धन. बड़े डेटा सेट के लिए डिज़ाइन किए गए उपन्यास कार्यक्रमों का उपयोग करते हुए सेल स्थानों की पहचान की जा सकती है और स्थानिक संदर्भ1,2,4के लिए उनका विश्लेषण किया जा सकता है। इस तकनीक का सबसे महत्वपूर्ण सीमा अनुकूलन समय है. प्रयोगात्मक डिजाइन और धुंधला और इमेजिंग रणनीति के लिए निर्देशों के साथ एक विस्तृत पद्धति यहाँ पाया जाता है. mfIHC प्रयोगशालाओं है कि वर्तमान में एक अनुकूलित स्वचालित धुंधला प्रणाली है कि बेहतर मैनुअल तकनीक का उपयोग कर बरकरार FFPE ऊतक में सेल से सेल बातचीत के स्थानिक संदर्भ को समझने के लिए करना चाहते हैं नहीं है के लिए उपयोगी हो जाएगा.

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Protocol

सभी काम मिशिगन के आंतरिक समीक्षा बोर्ड के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया है.

1. प्राथमिक एंटीबॉडी और स्लाइड तैयारी को अनुकूलित करना

  1. पारंपरिक आईएचसी का उपयोग करके मल्टीप्लेक्स के लिए एंटीबॉडी की आदर्श एकाग्रता निर्धारित करें।
    1. मैनुअल पारंपरिक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी)13द्वारा मल्टीप्लेक्स के लिए एंटीबॉडी का परीक्षण करें।
    2. विशिष्ट ऊतकों का उपयोग करें जिनमें प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए प्रचुर मात्रा में सेल प्रकार का परीक्षण किया गया है जैसे CD3 एंटीबॉडी परीक्षण के लिए tonsil ऊतक का उपयोग करना.
    3. IHC कंपनी द्वारा सिफारिश के लिए संदर्भ एकाग्रता का उपयोग करें और फिर सिफारिश की सांद्रता पर एंटीबॉडी सांद्रता के साथ IHC पूरा के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ऊपर और सिफारिश की एकाग्रता से नीचे सांद्रता.
  2. स्लाइड पर औपचारिक रूप से स्थिर पैराफिन एम्बेडेड ऊतक तैयार करें।
    1. एक microtome का उपयोग करना, 4 और 6 डिग्री के बीच एक मोटाई पर FFPE ऊतक के ब्लॉक में कटौती और चार्ज स्लाइड करने के लिए लागू होते हैं.
      नोट: आसुत पानी का उपयोग कर मल्टीप्लेक्स भर में उचित ऊतक बढ़ते और पालन सुनिश्चित करता है।
    2. स्लाइड फ्लैट प्लेस, ऊतक पक्ष, और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सुखाने के लिए अनुमति देते हैं.
    3. स्लाइड बॉक्स में स्लाइड्स को चरम तापमान से दूर तब तक संग्रहीत करें जब तक कि मल्टीप्लेक्स को पूरा करने के लिए तैयार न हो जाए.

2. सामान्य धुंधला विधि

  1. धोने और प्रतिजन पुनर्प्राप्ति समाधान की तैयारी
    1. डीनीकृत पानी के 9 एल, ट्राइस बफर नमकीन (टीबीएस) के 1 एल और पॉलीसोर्बेट 20 के 10 एमएल को मिलाकर 0.1% टीबीएसटी का वॉश समाधान तैयार करें।
    2. दोनों प्रतिजन पुनर्प्राप्ति समाधान तैयार करें (पीएच 6 और पीएच 9; सामग्री की तालिका) deionized पानी के साथ 1x करने के लिए कम करके.
  2. Deparaffinization और पुनर्जलीकरण
    1. सेंकना स्लाइड, फ्लैट झूठ बोल रही है, एक संकरीकरण ओवन1में 1 एच के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर ऊतक पक्ष. ओवन से स्लाइड निकालें और कम से कम 5 " 10 मिनट के लिए शांत करने के लिए तो एक ऊर्ध्वाधर स्लाइड रैक में जगह की अनुमति देते हैं।
    2. आगे की स्लाइड्स में आगे की स्लाइड्स पर रखें: ट्रिप्लीट में xylene, उसके बाद 100% इथेनॉल, 95% इथेनॉल, और 10 मिनट के लिए 70% इथेनॉल का एक एकल उपचार किया जाता है जिसमें प्रत्येक स्लाइड धुंधला सेट1का उपयोग किया जाता है।
    3. स्लाइड के रैक को प्लास्टिक स्लाइड बॉक्स में पनडुब्बी से पानी के साथ 2 मिनट के लिए धोएं और उसके बाद 30 मिनट13के लिए तटस्थ बफर फॉर्मलिन से भरे प्लास्टिक स्लाइड बॉक्स में जलमग्न करके स्थिरीकरण किया गया . 2 मिनट के लिए deionized पानी में स्लाइड धो लें तो एंटीजन पुनः प्राप्ति के लिए आगे बढ़ना.
  3. एंटीजन पुनः प्राप्ति
    1. pH 6 या पीएच 9 प्रतिजन पुनर्प्राप्ति बफर के साथ आंतरिक रेखा (लगभग 300 एमएल) से भरे हुए गर्मी प्रतिरोधी बॉक्स में स्लाइड के रैक को रखें।
      नोट: Antigen पुनर्प्राप्ति बफर या तो पीएच 6 या पीएच 9 जो प्रति epitope अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है हो सकता है. हालांकि, एंटीबॉडी है कि परमाणु प्रतीक और अन्य सभी एंटीबॉडी के लिए पीएच 6 के लिए बाध्य के लिए पीएच 9 का उपयोग करके शुरू करते हैं।
    2. प्लास्टिक की चादर के साथ बॉक्स कवर और सुरक्षित करने के लिए एक रबर बैंड का उपयोग करें। घूर्णन प्लेट के किनारे पर माइक्रोवेव में बॉक्स प्लेस (माइक्रोवेव भी हीटिंग के लिए इनवर्टर प्रौद्योगिकी के साथ सुसज्जित किया जाना चाहिए). 100% पावर पर 45 एस के लिए स्लाइड गर्मी 20% बिजली13पर 15 मिनट के बाद .
      नोट: माइक्रोवेव उपचार इस्तेमाल माइक्रोवेव के आधार पर अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है.
    3. चलो स्लाइड्स के लिए शांत लगभग 15 -20 मिनट.
  4. स्लाइड ठंडा करते समय एंटीबॉडी और फ्लोरोफोर्स के कार्य समाधान तैयार करें।
    1. 0.5 ग्राम गोजातीय सीरम एल्बुमिन ग्रेन्युल्स को TBST के 50 एमएल में भंग करके प्राथमिक एंटीबॉडी को डिमूएंट तैयार करें। वैकल्पिक रूप से, कणिकाओं को भंग करने के लिए 1x फॉस्फेट बफरेड लवण (पीबीएस) के 50 एमएल का उपयोग करें।
    2. प्रत्येक प्राथमिक एंटीबॉडी कार्य समाधान करने के लिए अनुकूलित एकाग्रता अनुभाग 1 में निर्धारित करें, प्राथमिक एंटीबॉडी diluent में. प्रति स्लाइड लगभग 200 $L का अनुमान लगायें।
    3. 1:100 की एकाग्रता में फ्लोरोफोर में प्रत्येक फ्लोरोफोर को कम करके फ्लोरोफोर कार्य समाधान तैयार करें।
      नोट: यह एंटीबॉडी के आधार पर ऑप्टिमाइज़ किया जा करने के लिए आवश्यकता हो सकती है। प्रति स्लाइड लगभग 100 $L का अनुमान लगायें।
    4. धुंधला करने के अंतिम दिन, TBST के 1 एमएल में DAPI की 3 बूँदें जोड़कर 4 ", 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) काम कर समाधान तैयार.
  5. स्लाइड धुंधला (धोने और अवरुद्ध)
    1. डिब्बे को ठंडा करने के बाद माइक्रोवेव से निकालिये और प्लास्टिक की चादर उतार लीजिये, स्लाइडको 2 मिनिटके लिये डिओनीकृत पानी से धो इजाफ कीजिये, इसके बाद प्लास्टिक स्लाइड बॉक्स में 2 मिनट तक वॉश किया जाता है।
    2. एक नाजुक कार्य के साथ ऊतक के चारों ओर प्रत्येक स्लाइड सुखाने के बाद सावधान पोंछ ऊतक बाहर सूखी नहीं है, एक hydrophobic बाधा कलम का उपयोग कर ऊतक के बाहर के आसपास का पता लगाने. नाजुक कार्य पोंछ े या कलम के साथ ऊतक को मत छुओ।
    3. आर्द्र कक्ष में प्रत्येक स्लाइड रखें और ऊतक के लिए अवरुद्ध समाधान (लगभग 4 बूँदें) जोड़ें। कमरे के तापमान (आरटी) पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  6. स्लाइड धुंधला (प्राथमिक एंटीबॉडी आवेदन)
    1. प्रत्येक स्लाइड ले लो और कागज तौलिए के ढेर पर स्लाइड के पक्ष दोहन और ऊतक के आसपास से अतिरिक्त अवरुद्ध एजेंट को दूर करने के लिए एक नाजुक कार्य पोंछ का उपयोग करके अवरुद्ध समाधान को हटा दें।
    2. स्लाइड को आर्द्रित कक्ष में वापस लायें और कार्यशील प्राथमिक एंटीबॉडी के लगभग 200 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। आरटी में 1 एच के लिए आर्द्र कक्ष में इनक्यूबेट।
    3. TBST के साथ 2 मिनट के लिए tbst के साथ tlicate13में पनडुब्बी द्वारा धो लें .
      नोट: प्रत्येक धोने के कदम के बाद, TBST बदलने से एक क्लीनर छवि सुनिश्चित करने में मदद मिलेगी।
  7. स्लाइड धुंधला (माध्यमिक एंटीबॉडी आवेदन)
    1. प्रत्येक स्लाइड से शेष TBST बंद डब और माध्यमिक एंटीबॉडी के लगभग 3 से 4 बूँदें लागू होते हैं ( खरगोश और माउस माध्यमिक एचआरपी संयुग्मी एंटीबॉडी का मिश्रण). आरटी 13 में आर्द्र कक्ष में10मिनट के लिए इनक्यूबेट .
      नोट: यदि एक प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करने की योजना बना रहा है जिसके लिए माउस या खरगोश के अलावा किसी अन्य माध्यमिक एंटीबॉडी की आवश्यकता होती है या किसी वैकल्पिक द्वितीयक एंटीबॉडी का उपयोग करने का चयन करता है, तो स्लाइड्स के लिए उपयुक्त एचआरपी संयुग्मी द्वितीयक लागू करें और 45 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें। वैकल्पिक माध्यमिक14के लिए ऊष्मायन समय की आवश्यकता हो सकती है .
    2. इनक्यूबेशन के बाद, TBST के साथ 2 मिनट के लिए ttripleat13में धो लें.
  8. स्लाइड धुंधला (fluorophore आवेदन)
    1. 10 मिनट13के लिए आरटी में आर्द्र कक्ष में फ्लोरोफोर कार्य समाधान के लगभग 100 डिग्री सेल्सियल लागू करें और इनक्यूबेट करें .
    2. TBST के साथ 2 मिनट के लिए tlicate13में धो लें |
  9. एंटीबॉडी का हटाया जाना
    1. माइक्रोवेव स्लाइड (45 s पर 100% तो 15 मिनट पर 20%) गर्मी प्रतिरोधी बॉक्स में एंटीबॉडीकोहटाने के लिए चरण 2.3.2 देखें 13,14.
      नोट: यह मल्टीप्लेक्स का एक दौर पूरा करता है। यह एकमात्र बिंदु है जिस पर प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है। प्रोटोकॉल को थामने के लिए, कमरे के तापमान पर रात भर एंटीजन रिट्रीवल बफर में डूबी स्लाइड्स को छोड़ दें।
  10. धुंधला के अतिरिक्त दौर जारी रखें. बाकी एंटीबॉडी-फ्लोरोफोर युग्मों के लिए चरण 2.5.1 $2.9.1 दोहराएँ। एक बार सभी एंटीबॉडी और फ्लोरोफोर का उपयोग किया गया है, अनुभाग 2.11 के लिए आगे बढ़ें।
  11. DAPI आवेदन और बढ़ते
    1. मल्टीप्लेक्स में अंतिम धुंधला दौर के बाद, प्रतिजन पुनर्प्राप्ति समाधान पीएच 613के साथ अंतिम एंटीबॉडी आवेदन को हटा दें। deionized पानी के साथ धो दो मिनट प्रत्येक13के लिए TBST के बाद .
    2. स्लाइड के लिए काम कर रहे डीएपीआई समाधान के लगभग 150 डिग्री सेल्सियल लागू करें और आरटी1पर 10 मिनट के लिए आर्द्र कक्ष में इनक्यूबेट करें ।
    3. लगभग 30 s के लिए TBST के साथ धो लें और एक एंटीफैड माउंटेंट के साथ कवरलिप्स माउंट करें। बढ़ते मीडिया कवरस्लिप (वैकल्पिक) को सुरक्षित करने के लिए सूख गया है एक बार coverslip के चार कोनों पर स्पष्ट नाखून पॉलिश लागू करें।

3. पुस्तकालय, मोनोप्लेक्स, और मल्टीप्लेक्स के लिए विवरण

  1. फ्लोरोफोर लाइब्रेरी बनाने के लिए स्लाइड चुनें.
    1. एक 7 रंग मल्टीप्लेक्स के लिए इकट्ठा 7 प्रतिरक्षा सेल अमीर ऊतक स्लाइड (यानी, tonsil, तिल्ली, आदि) पुस्तकालय के लिए.
      नोट: मल्टीप्लेक्स में उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक अद्वितीय फ्लोरोफोर का प्रतिनिधित्व करने वाली प्रत्येक स्लाइड के साथ फ्लोरोफोर लाइब्रेरी के लिए उपयोग की जाने वाली नियंत्रण स्लाइड चुनें. नियंत्रण स्लाइड पसंद की एक प्रचुर मात्रा में epitope होना चाहिए और प्रत्येक फ्लोरोफोर के लिए ऊतक का एक ही प्रकार हो सकता है.
  2. मोनोप्लेक्स और मल्टीप्लेक्स के साथ उपयोग के लिए दाग और छवि लाइब्रेरी स्लाइड।
    1. नियंत्रण स्लाइड्स और पसंद के ऊतक स्लाइडों को नियंत्रित करने का उपयोग करके चरणों का पालन करें 2.1]2.9.1. 1:100 की एकाग्रता पर प्रत्येक स्लाइड पर एक अलग फ्लोरोफोर रखें; एक स्लाइड में केवल DAPI होना चाहिए.
    2. DAPI धुंधला छोड़ छोड़कर अनुभाग 2.11 के लिए आगे बढ़ें और इसके बजाय TBST का उपयोग करें और वर्णित के रूप में माउंट करें।
    3. स्लाइड सूखी रात भर देने के बाद, सभी चैनलों के साथ छवि DAPI, CY3, CY5, CY7, टेक्सास लाल, अर्धचालक क्वांटम डॉट्स, और fluoresceinisothiocyanate (FITC) संतृप्ति संरक्षण सुविधा 1 के साथ 250 एमएस के लिए जोखिम की स्थापना.
      नोट: जोखिम बार 50 डिग्री 250 एमएस13पर सेट किया जा सकता है।
    4. सॉफ्टवेयर पर पुस्तकालय छवियों अपलोड करें और monoplexes और मल्टीप्लेक्स के विश्लेषण में उपयोग करें.
  3. मोनोप्लेक्स के लिए स्लाइड चुनें.
    1. अनुकूलित एंटीबॉडी (अनुभाग 1) के आधार पर पसंद की प्रचुर मात्रा में एपिटोप वाली नियंत्रण स्लाइड चुनें। मल्टीप्लेक्स में किए जाने वाले दाग के हर दौर के लिए, मोनोप्लेक्स बनाने के लिए नियंत्रण स्लाइड्स की उस संख्या का चयन करें।
      नोट: मोनोप्लेक्स का उद्देश्य मल्टीप्लेक्स में उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए सर्वोत्तम स्थिति (क्रम) निर्धारित करना है।
  4. दाग मोनोप्लेक्स।
    1. प्रत्येक स्लाइड के लिए किसी भिन्न क्रम (स्थिति) पर प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके अनुभाग2.1$2.11 का अनुसरण करें. प्रत्येक स्लाइड में अन्य स्लाइड्स से भिन्न ऑर्डर (स्थिति) पर केवल एक प्राथमिक एंटीबॉडी लागू होना चाहिए.
      नोट: प्रत्येक स्लाइड के लिए जहां दौर कोई प्राथमिक एंटीबॉडी या फ्लोरोफोर के लिए कहता है, इसके बजाय प्राथमिक एंटीबॉडी diluent और फ्लोरोफोर diluent13का उपयोग करें.
  5. छवि स्लाइड और मोनोप्लेक्स का विश्लेषण करें।
    1. माइक्रोस्कोप का उपयोग करना और सभी चैनलों के लिए 250 एमएस करने के लिए जोखिम समय की स्थापना ध्यान केंद्रित करने के लिए DAPI का उपयोग प्रत्येक छवि पर कब्जा.
      नोट: जोखिम बार 50 डिग्री 250 एमएस14पर सेट किया जा सकता है।
    2. विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग दाग मार्कर के फ्लोरोसेंट तीव्रता को देखकर प्रत्येक मोनोप्लेक्स स्लाइड का मूल्यांकन.
    3. इस तीव्रता की तुलना पृष्ठभूमि से की जाइए। यदि यह पृष्ठभूमि से कम से कम 5-10 गुना अधिक है, तो उस स्लाइड की स्थिति अंतिम मल्टीप्लेक्स में उपयोग करने के लिए एक इष्टतम स्थिति है।
  6. मल्टीप्लेक्स के लिए स्लाइड्स चुनें.
    1. ब्याज की स्लाइड चुनें और धुंधला और इमेजिंग के बाद ऑटोफ्लोरेसींस के घटाव के लिए एक खाली स्लाइड के रूप में इस्तेमाल करने के लिए एक अतिरिक्त स्लाइड जोड़ें।
  7. मल्टीप्लेक्स दाग.
    1. मोनोप्लेक्स परिणामों के आधार पर, चरण 3.5.3 पर आधारित प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए उपयुक्त क्रम (स्थिति) चुनें। प्रत्येक फ्लोरोफोर को एंटीबॉडी को असाइन करें.
      नोट: यह अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है; हालांकि, कम प्रचुर मात्रा में मार्करों के लिए उज्ज्वल एंटीबॉडी का उपयोग करने की योजना1, सह-स्थानीयकरण एंटीबॉडी एक दूसरे से दूर स्पेक्ट्रम पर फ्लोरोफोर के साथ मिलान किया जाना चाहिए13, और स्पेक्ट्रम के साथ फ्लोरोफोर 540 और 570 सह स्थानीय कारण नहीं किया जाना चाहिए वर्णक्रमीय ओवरलैप मुद्दों1के लिए |
    2. इसके स्थान पर क्रमशः एंटीबॉडी, फ्लोरोफोर, या डीएपीआई का उपयोग करें, रिक्त स्लाइड को सुनिश्चित करने के लिए अनुभागों के साथ आगे बढ़ें।
  8. छवि मल्टीप्लेक्स और धुंधला की अखंडता के लिए विश्लेषण
    1. माइक्रोस्कोप का उपयोग करना और सभी चैनलों के लिए 250 एमएस करने के लिए जोखिम समय की स्थापना, ध्यान केंद्रित करने के लिए DAPI का उपयोग प्रत्येक छवि पर कब्जा.
    2. विश्लेषण सॉफ्टवेयर (सामग्री कीतालिका) का उपयोग कर, फ्लोरोसेंट झूठे रंग से प्रत्येक मल्टीप्लेक्स का मूल्यांकन.
      नोट: एक स्पष्ट छवि प्रत्येक मार्कर स्पष्ट रूप से प्रदर्शित करना चाहिए. यदि एक मार्कर फैलाना और दानेदार लग रहा है या न के बराबर है, यह संभावना है कि मार्कर काम नहीं किया है और फिर से अनुकूलित होने की जरूरत है.
    3. विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, पैथोलॉजी दृश्य द्वारा प्रत्येक मल्टीप्लेक्स का मूल्यांकन करें। पैथोलॉजी दृश्य प्रत्येक मार्कर की विशिष्टता की पुष्टि करेगा। IHC की तुलना पहले ऑप्टिमाइज़ किया गया (अनुभाग 1).

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Representative Results

एक 7 रंग मल्टीप्लेक्स परख प्राप्त करने की समग्र प्रक्रिया एक दोहराव पैटर्न इस प्रकार है. चित्र 1 आरेखीय रूप में प्रक्रिया का वर्णन करता है। एक बार स्लाइड में कटौती कर रहे हैं और सूखे या प्रयोगशाला से प्राप्त कर रहे हैं और 1 एच के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर एक संकरीकरण ओवन में पकाया जाता है, तो deparaffinization और पुनर्जलीकरण के लिए आगे बढ़ना, फॉर्मलिन में स्लाइड को ठीक फिर से एंटीजन पुनर्प्राप्ति के बाद. बहुसंकेतन का प्रत्येक दौर प्रतिजन पुनः प्राप्ति पर प्रारंभ होता है और एंटीबॉडी हटाने पर समाप्त होता है (चित्र 1) ।

इस प्रक्रिया में प्रत्येक चरण का अनुकूलन एक स्पष्ट और उपयोग योग्य छवि को प्राप्त करने के लिए सर्वोपरि है. Antibodies IHC द्वारा परीक्षण किया जाना चाहिए पहले पीएच 6 और पीएच 9 के साथ एंटीजन पुनर्प्राप्ति बफ़र्स का उपयोग कर प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए कल्पना करने के लिए जो प्रतिजन पुनर्प्राप्ति बफर कि विशेष एंटीबॉडी के साथ सबसे अच्छा काम करता है. आम तौर पर, परमाणु लक्ष्य बफर पीएच 9 के साथ एंटीजन पुनर्प्राप्ति के लिए प्रतिक्रिया करते हैं। उदाहरण के लिए, FOXP3 सबसे अच्छा काम करता है जब पी एच 9 के प्रतिजन पुनर्प्राप्ति बफर CD3 जो पीएच 6 के प्रतिजन पुनर्प्राप्ति बफर के साथ सबसे अच्छा काम करता है के रूप में प्रयोग किया जाता है. IHC प्रक्रिया से ली गई छवियों मल्टीप्लेक्स विश्लेषण की विशिष्टता को मान्य करने के लिए उपयोग किया जाना चाहिए।

मल्टीप्लेक्स में प्रत्येक एंटीबॉडी के क्रम को निर्धारित करने के लिए एक मोनोप्लेक्स आवश्यक है। या तो एक 4- या एक 7-रंग किट का उपयोग करते समय, प्रत्येक एंटीबॉडी सरणी में एक पसंदीदा क्रम होगा. एंटीबॉडी है कि इस्तेमाल किया जाएगा की संख्या के लिए, उपयुक्त नियंत्रण स्लाइड इकट्ठा (यानी, एक 7 रंग मल्टीप्लेक्स जहां एक रंग DAPI है के लिए, 6 अन्य फ्लोरोफोर्स के लिए 6 ऊतक विशिष्ट प्रतिनिधि नियंत्रण स्लाइड का चयन करें). चित्र 2 ए-सी FFPE बृहदान्त्र कैंसर के ऊतकों के साथ 3 स्लाइड का उपयोग कर एक monoplex परख का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व है. प्रत्येक स्लाइड अपने टैग के रूप में फ्लोरोफोर 570 का उपयोग कर सरणी में एक अलग स्थिति में FOXP3 है। DAPI पर्याप्त रूप से नाभिक कल्पना करने के लिए एक काउंटर दाग के रूप में प्रयोग किया जाता है। चित्र 3में, एक मोनोप्लेक्स और अलग-अलग FOXP3 स्थिति वाले मल्टीप्लेक्स के प्रतिनिधि चित्र दिखाए जाते हैं। चित्र 3ए,बी में जहां FOXP3 तीसरे स्थान पर है (चित्र 2Cमें दिखाए गए क्रम के अनुरूप), FOXP3 (लाल) के विशिष्ट और मजबूत दाग उज्ज्वल परमाणु धुंधला चित्रा 3A और सह-स्थानीयकरण द्वारा प्रदर्शन के रूप में देखा जाता है के साथ CD3 चित्रा 3B| फ्लोरोफोर संकेत तीव्रता ऊतक चित्र 3कमें कहीं और गैर विशिष्ट दाग के बिना FOXP3 की विशिष्टता की पुष्टि करता है। चित्रा 3Cमें, जहां FOXP3 पहले स्थान पर है (चित्र 2Aमें आदेश के अनुरूप), FOXP3 का गैर-विशिष्ट दाग है। इन क्षेत्रों में अधिकांश स्लाइड और फ्लोरोसेंट तीव्रता लाल कवर के दानेदार फैलाना क्षेत्रों में 1 से कम हैं। एक समान परिणाम में धुंधला परिणाम के क्रम का परीक्षण करने के लिए पहले एक मोनोप्लेक्स को पूरा किए बिना एक मल्टीप्लेक्स करने का प्रयास करना और अभिकर्मकों को बर्बाद कर देगा। एक अन्य महत्वपूर्ण कदम है कि मल्टीप्लेक्स प्रक्रिया में अनदेखी नहीं की जा सकती है DAPI धुंधला है. एक काम कर रहे DAPI counterstain विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर सेल पहचान और आगे स्थानिक विश्लेषण के लिए आधार है. एक महत्वपूर्ण कंट्रास्ट को समग्र छवि में चित्र 3E में कार्य DAPI (नीला) के साथ और चित्र 3 Fमें गैर-कार्य DAPI में देखा जा सकता है। चित्र 3F में छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में कक्षों की पहचान करने के लिए उपयोग नहीं किया जा सका. मल्टीप्लेक्स और ऊतक विश्लेषण को बचाने का प्रयास, कवरस्लिप शायद TBST में स्लाइड भिगोने से हटा दिया गया जिसके बाद डीएपीआई के अतिरिक्त आवेदन के साथ पीएच 6 एंटीजन रिट्रीवल बफर में एक माइक्रोवाविंग चरण था।

एक बार मोनोप्लेक्स परख पूरी हो जाने और इष्टतम एंटीबॉडी आदेश की पुष्टि हो जाने के बाद, एक मल्टीप्लेक्स रणनीति का निर्माण किया जा सकता है चित्र 4। हर लक्ष्य के लिए एक अलग फ्लोरोफोर चुना जाना चाहिए. प्रत्येक फ्लोरोफोर के साथ जुड़े संख्या मोटे तौर पर उत्तेजना के बाद उत्सर्जित वर्णक्रमीय फ्लोरोसेंट तरंगदैर्ध्य का प्रतिनिधित्व करता है, कोशिकामिति प्रवाह के समान. वर्णक्रमीय ओवरलैप और मार्करों के संभावित रक्तस्राव को सीमित करने के लिए फ्लोरोफोर्स के साथ प्रस्तावित एंटीबॉडी का मिलान करते समय सावधानी बरतनी चाहिए। एक अच्छी रणनीति अतिरिक्त वर्णक्रमीय ओवरलैप को कम करने के लिए एंटीबॉडी को सह-स्थानीयकरण के लिए एक दूसरे से दूर तरंगदैर्ध्य का चयन करना है जो एक कुरकुरा छवि और अधिक विश्वसनीय फीनोटाइपिंग13प्रदान करता है. उदाहरण के लिए, प्रदर्शित बहुसंकेतित रणनीति में (चित्र 4), CD8 को फ्लोरोफोर 570 के साथ जोड़ा जाता है जबकि CD3 को फ्लोरोफोर 520 के साथ जोड़ा जाता है. एक को सह-स्थानीयकृत लक्ष्यों में फ्लोरोफोर 540 और 570 के उपयोग से बचना चाहिए क्योंकि ये सबसे अधिक भेदभाव करते हैं और परिणाम को ख़राब कर सकते हैं। फ्लोरोफोर 620 बहुत उज्ज्वल हो जाता है और एंटीबॉडी है कि ऊतक में प्रचुर मात्रा में नहीं हैं के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। हाल ही में प्रत्येक फ्लोरोफोर के लिए एक संदर्भ के रूप में इस्तेमाल किया पुस्तकालय भी फ्लोरोफोर्स के वर्णक्रमीय ओवरलैप को कम करने में एड्स. एक खाली स्लाइड जो एंटीजन रिट्रीवल के सभी दौरों से गुजरती है, समग्र छवि से ऑटोफ्लोरेसेंस निष्कर्षण सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है। इस रिक्त स्लाइड में एक काम करने वाले प्राथमिक एंटीबॉडी और फ्लोरोफोर के स्थान पर मल्टीप्लेक्स स्लाइड के रूप में एक ही उपचार से गुजरना होगा, एंटीबॉडी डिलुएंट और फ्लोरोफोर डिमूएंट का उपयोग क्रमशः चित्र 4खकिया जाएगा।

यह सुनिश्चित करने के लिए मल्टीप्लेक्स डिजाइन ठीक से काम किया और समग्र छवि में देखा मार्करों विशिष्ट हैं, माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर है जो एक अशुद्ध IHC छवि है जो तो हो सकता है बनाता है का उपयोग कर "ब्राइटफील्ड" सेटिंग विकल्प के साथ संयोजन में "रोग विज्ञान छवि" का उपयोग करें अनुभाग 1 में चर्चा की पिछले IHC परख की तुलना में. दुर्भाग्य से, सुंदर समग्र छवियों जरूरी एक सटीक दाग को प्रतिबिंबित नहीं हो सकता है और इस प्रक्रिया को नियंत्रित करने और झूठी सकारात्मक परिणाम को रोकने के लिए गुणवत्ता के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है. चित्र 5A प्रारंभिक चिंता के बिना एक समग्र छवि को दर्शाता है. CD3 कल्पना की है और विशिष्ट धुंधला (हरा) से पता चलता है और चित्र 5Bमें विकृति ब्राइटफील्ड छवि द्वारा पुष्टि की है। CD163 (नारंगी) समग्र छवि में देखा जाता है (चित्र 5A); तथापि, CD163 (चित्र5C)के पैथोलॉजी ब्राइटफील्ड दृश्य के मूल्यांकन में एंटीबॉडी गैर-विशिष्ट है। विशिष्ट अभिरंजन के साथ इष्टतम बहुसंकेतित छवि का एक उदाहरण समग्र छवि में प्रदर्शित किया जाता है (चित्र 5D)। CD3 और CD163 विशिष्टता पैथोलॉजी ब्राइटफील्ड दृश्य का उपयोग कर की पुष्टि की है (चित्र 5E और चित्र 5F, क्रमशः) और इन एंटीबॉडी का उपयोग कर प्रदर्शन पिछले IHC assays के लिए अनुकूल तुलना (नहीं दिखाया).

Figure 1
चित्र 1: धुंधला कार्यप्रवाह आरेख.
कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: मोनोप्लेक्स विकास।
(क) स्थिति 1 पर FOXP3 के साथ बृहदान्त्र कैंसर स्लाइड. (बी) स्थिति 2 पर FOXP3 के साथ बृहदान्त्र कैंसर स्लाइड. (ग) स्थिति 3 पर FOXP3 के साथ बृहदान्त्र कैंसर स्लाइड. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: सफलता और मोनोप्लेक्स और मल्टीप्लेक्स के नुकसान.
(क) स्थिति 3 पर FOXP3 के साथ प्राथमिक बृहदान्त्र कैंसर के मोनोप्लेक्स परख, फ्लोरोसेंट तीव्रता लेबल दिखाया गया. (ख) स्थिति 3 पर FOXP3 और CD3 स्थिति 2 पर के साथ प्राथमिक बृहदान्त्र कैंसर के मल्टीप्लेक्स परख. (ग) स्थिति 1 पर FOXP3 के साथ प्राथमिक बृहदान्त्र कैंसर के मोनोप्लेक्स परख, फ्लोरोसेंट तीव्रता लेबल दिखाया गया. (घ) स्थिति 1 और सीडी 3 पर FOXP3 के साथ प्राथमिक बृहदान्त्र कैंसर की बहुसंकेत परख 2 स्थिति पर. (ई) एंटीबॉडी के क्रम के साथ प्राथमिक बृहदान्त्र कैंसर की बहुसंकेत परख इस प्रकार है: CD8 (पीला), CD3 (हरा), CD163 (नारंगी), pancytokeratin (सफेद), पीडी-L1 (मजेंटा), FOXP3 (लाल), काम DAPI (नीला). (च) एंटीबॉडी के क्रम के साथ प्राथमिक बृहदान्त्र कैंसर की बहुसंकेत परख इस प्रकार है: CD8 (पीला), CD3 (हरा), CD163 (नारंगी), pancytokeratin (सफेद), पीडी-L1 (मजेंटा), FOXP3 (लाल), गैर काम DAPI (नीला). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: बहुसंकेत विकास.
(क) 7-रंग मल्टीप्लेक्स में पेट के कैंसर की मल्टीप्लेक्स स्लाइड। (बी) पेट के कैंसर के ऊतकों का उपयोग कर एक 7 रंग मल्टीप्लेक्स में खाली स्लाइड. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: 7-रंग मल्टीप्लेक्स की विशिष्टता का विश्लेषण करना.
(ए) एंटीबॉडी के साथ मल्टीप्लेक्स समग्र छवि इस प्रकार है: CD8 (पीला), CD3 (हरा), CD163 (नारंगी), pancytokeratin (सफेद), Ki67 (लाल), DAPI (नीला). (बी) पैथोलॉजी ब्राइटफील्ड व्यू इन इमेज ऑफ़ पैनल ए ऑन सीडी3 ही व्यू. (ग) पैथोलॉजी ब्राइटफील्ड व्यू ऑफ इमेज ऑफ़ पैनल ए ऑन सीडी163 ही दृश्य. (डी) एंटीबॉडी के साथ मल्टीप्लेक्स समग्र छवि इस प्रकार है: CD8 (पीला), CD3 (हरा), CD163 (नारंगी), pancytokeratin (सफेद), पीडी-L1 (magenta), FOXP3 (लाल), DAPI (नीला). () पैथोलॉजी ब्राइटफील्ड व्यू ऑफ इमेज ऑफ़ पैनल डी ऑन सीडी3 ही व्यू. (च) पैथोलॉजी ब्राइटफील्ड व्यू ऑफ इमेज ऑफ़ पैनल डी ऑन सीडी163 ही दृश्य. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

ठोस ट्यूमर बायोप्सी और सर्जिकल लकीर से बरकरार ऊतक नमूनों रोग विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण नैदानिक और भविष्य कहनेवाला उपकरण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से रोगी रोग का निदान रहते हैं. मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (mfIHC) एक उपन्यास तकनीक है जो इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी), इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) और प्रवाह साइटोमेट्री के लाभों को जोड़ती है। पिछले तरीकों situ में कोशिकाओं की जांच करने के लिए एक ऊतक वातावरण में सेल से सेल व्यवस्था के मूल्यांकन के लिए अनुमति दी है8, हालांकि, epitopes की कम संख्या है कि सीमा जटिल विश्लेषण की जांच की जा सकती है. प्रवाह साइटोमेट्री, हालांकि एक नमूना में कई सेल प्रकार का विश्लेषण करने में उपयोगी है, एक एकल सेल निलंबन9,10के रूप में नमूने तैयार करने के आधार पर स्थानिक संदर्भ खो देता है। mfIHC इन तकनीकों को सेलुलर सूक्ष्म पर्यावरण के स्थानिक संदर्भ को बनाए रखने और epitopes है कि लेबल किया जा सकता है की संख्या में वृद्धि करके पुल, जबकि लेबल epitope11प्रति संकेत बढ़ाना . पिछले शोध में कैंसर और कैंसर के ऊतकों के नमूनोंमेंसेकोलर की घुसपैठ के लिए mfIHC का इस्तेमाल किया गया है 1 ,2,3,4,5,15. छवि-पश्चात विश्लेषण का उपयोग ऊतक सूक्ष्म पर्यावरण 1,2,4के भीतर कोशिकाओं और संरचनाओं के स्थानिक संबंधों का विश्लेषण करने के लिए भी किया गया है। विश्वसनीय विश्लेषण के लिए, एक विशिष्ट और सटीक छवि पहले का उत्पादन किया जाना चाहिए. मैनुअल धुंधला तकनीक, के रूप में एक स्वचालित धुंधला प्रणाली का विरोध किया, इस तकनीक के लिए छोटे और लागत के प्रति सजग प्रयोगशालाओं का उपयोग सक्षम बनाता है. अनुकूलन समय और धुंधला समय आगे स्थानिक विश्लेषण के लिए एक विश्वसनीय छवि को प्राप्त करने के लिए सबसे बड़ी बाधाओं के बीच हैं.

कई सामान्य नियम विश्वसनीय मिश्रित मल्टीप्लेक्स छवि के सफल उत्पादन की संभावना को बढ़ाते हैं और समय और संसाधनों की बचत करते हैं। मल्टीप्लेक्स में इस्तेमाल किए जाने वाले एंटीबॉडी को मैनुअल पारंपरिक आईएचसी के साथ सफलता के आधार पर चुना जाना चाहिए। पीएच 6 और पीएच 9 के साथ एंटीजन रिट्रीवल बफ़र्स का उपयोग आईएचसी के लिए किया जाना चाहिए ताकि मल्टीप्लेक्स में उपयोग के लिए उपयुक्त प्रतिजन पुनर्प्राप्ति की जांच की जा सके। मल्टीप्लेक्स विकास मल्टीप्लेक्सिंग प्रोटोकॉल के भीतर एंटीबॉडी की नियुक्ति की पहचान करने के लिए आवश्यक है। इस के लिए तर्क जटिल है और ऊतक नमूनों और epitopes के बीच बदलता है. कुछ उदाहरणों में, epitope कई microwaving कदम और मार्कर दृश्य के साथ नीचा कर सकते हैं खो दिया है, के रूप में अक्सर CD3 के साथ मामला है. FOXP3 , तथापि, अधिक microwaving कदम के साथ उज्जवल हो जाता है और मुश्किल से दिखाई देता है अगर मल्टीप्लेक्स13के पहले या दूसरे दौर में रखा,14.

दाग प्रक्रिया आरोप लगाया स्लाइड पर कटौती FFPE ऊतक के साथ शुरू होता है. पहली समस्या है कि सामना किया जा सकता है ऊतक microwaving के बाद स्लाइड से गिर रहा है. जब चार्ज स्लाइड का उपयोग नहीं कर रहे हैं, कांच की सतह के लिए ऊतक का पालन सीमित है और ऊतक या तो अत्यधिक तह होगा या पूरी तरह से बंद स्लाइड कर सकते हैं. आगे यह सुनिश्चित करने के लिए ऊतक धुंधला प्रक्रिया के दौरान स्लाइड का पालन करता है, कई तकनीकों का प्रदर्शन किया जाता है। सबसे पहले स्लाइड पर ब्लॉक काटने के दौरान, पानी का शुद्ध रूप सबसे अच्छा काम करता है। कुछ प्रयोगशालाओं के लिए, deionized पानी पर्याप्त हो सकता है लेकिन आसुत पानी सबसे अच्छा काम किया है. स्लाइड को रात में 37 डिग्री सेल्सियस पर काटने के तुरंत बाद फ्लैट सूखे जाने चाहिए। आगे पालन सुनिश्चित करने के लिए, स्लाइड तो एक संकरीकरण ओवन में रखा जाता है और सिर्फ उपयोग करने से पहले एक घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर फ्लैट झूठ बोल रही है। हालांकि औपचारिक निर्धारण पहले से ही प्रारंभिक ऊतक तैयारी की प्रक्रिया के दौरान हुई है, deparaffinization और rehydration प्रक्रिया के बाद 30 मिनट के लिए तटस्थ बफर formalin में स्लाइड रखने घुड़सवार की संरचनात्मक अखंडता को बढ़ाता है ऊतक1,13.

मैनुअल धुंधला प्रक्रिया इस्तेमाल एंटीबॉडी की संख्या के आधार पर तीन, 8 घंटे के दिनों तक ले जा सकते हैं। नुकसान से बचने के समय की बचत और अभिकर्मकों को कम करने में आवश्यक है. पहली आम गलती अक्सर अभिकर्मक तैयारी में होती है। पानी प्रयोगशालाओं के बीच अलग है और एक प्रयोगशाला से अगले करने के लिए परिणामों में एक एकल अंतर हो सकता है. सभी प्रतिक्रियाओं और अभिकर्मकों के लिए एक साफ पानी के स्रोत के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक ही प्रयोग एक सुसंगत परिणाम सुनिश्चित करता है. एंटीबॉडी, अवरुद्ध समाधान, और फ्लोरोफोर्स कमरे के तापमान पर सबसे अच्छा काम करते हैं। अभिकर्मक और कार्य समाधान तैयारी में नुकसान से बचने के लिए, सभी अभिकर्मकों के लिए एक ही पानी का उपयोग करें। इसके अलावा कमरे के तापमान पर काम कर रहे समाधान और अभिकर्मकों के सभी का उपयोग करें।

MFIHC का निवारण महत्वपूर्ण है और घटकों और/या ऑपरेटर त्रुटि के संदूषण को सीमित करने के लिए महत्वपूर्ण सख्त प्रयोगशाला दिशा निर्देशों का पालन। suboptimal छवियों का उत्पादन परिणाम तिरछा और झूठी सकारात्मक और नकारात्मक सेल आबादी जो नकारात्मक डेटा को प्रभावित कर सकते हैं करने के लिए नेतृत्व करेंगे. क्योंकि अंतिम विश्लेषण आम तौर पर मशीन सीखने के आधार पर कंप्यूटर जनित phenotypes भी शामिल है, धुंधला में छोटी त्रुटियों को बढ़ाया जा सकता है पूरे डेटा सेट को प्रभावित. उदाहरण के लिए, हालांकि सभी दाग पूरी तरह से काम कर सकते हैं, एक त्रुटि या DAPI की चूक भविष्य सेल विभाजन को रोकने और प्रयोग बेकार प्रतिपादन गिनती. विश्लेषण सॉफ्टवेयर न केवल कोशिकाओं की पहचान करने के लिए DAPI धुंधला का उपयोग करता है, लेकिन प्रत्येक सेल को x और y निर्देशांक असाइन करता है और यदि मल्टीप्लेक्स मंद, खराब खतना, या फैलाना DAPI धुंधला है, छवि आगे इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है और मल्टीप्लेक्स redone या प्रयास किया जाना चाहिए बचाव और DAPI के फिर से दाग. पैथोलॉजी और ब्राइटफील्ड विचारों जैसे सॉफ्टवेयर घटकों का उपयोग अनुकूलन प्रक्रिया में जल्दी संवेदनशीलता और विशिष्टता में विश्वास को बढ़ाएगा और मल्टीप्लेक्स प्रक्रिया में जल्दी गलतियों को रोक देगा।

इमेजिंग प्रक्रिया के संशोधित पहलुओं को भी छवि अनुकूलन में सहायता कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, ध्यान केंद्रित करने के लिए दृश्य सहायता के रूप में DAPI का उपयोग कर एक छवि लेने blurry छवियों से बचने में मदद करता है। सॉफ्टवेयर के लिए नव निर्मित फ्लोरोफोर पुस्तकालय जोड़ने के विश्लेषण चरण के दौरान प्रत्येक फ्लोरोफोर की एक स्वच्छ छवि और कम वर्णक्रमीय ओवरलैप सुनिश्चित करेगा और autofluorence निकालने के लिए खाली स्लाइड का उपयोग मार्करों तेज और छवि को बढ़ाता है गुणवत्ता.

ऊतक नमूनों का उपयोग किया है और रोग के pathophysiology की जांच में एक आवश्यक उपकरण के रूप में रहेगा. उभरते प्रौद्योगिकी सेल से सेल बातचीत की हमारी समझ में वृद्धि हुई है और mfIHC एक होनहार नए खिलाड़ी है. अनुकूलन और इस तकनीक में धुंधला प्रक्रिया के दौरान सटीकता उचित उपयोग और सेल से सेल बातचीत के आगे विश्लेषण के लिए सर्वोपरि है.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों एड स्टैक शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, पहले पर्किन Elmer से, सेटअप और मूल मल्टीप्लेक्स धुंधला के अनुकूलन के साथ उनकी सहायता के लिए. लेखकों को भी विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर सुझावों के लिए Akoya Biosciences से क्रिस्टन श्मिट शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. इस प्रकाशन में रिपोर्ट अनुसंधान पुरस्कार संख्या P30CA046592 के तहत स्वास्थ्य के राष्ट्रीय कैंसर संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया था, K08CA201581 (tlf), K08CA234222 (जेएस), R01CA15158807 (mpm), RSG1417301CSM (mpm), R01CA19807403 (mpm), U01CA22414501 (mpm, hc), CA170568 (एच.सी.) सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है. अतिरिक्त सहायता जेफरी ए कोल्बी बृहदान्त्र कैंसर और टॉम लियू मेमोरियल रिसर्च फंड द्वारा प्रदान की गई थी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100% ethanol Fisher HC8001GAL
70% ethanol Fisher HC10001GL
95% ethanol Fisher HC11001GL
Analysis software Akoya Biosciences CLS135783 inForm version 2.3.0
Antifade mountant ThermoFisher P36961 ProLong Diamond
Blocking solution Vector SP-6000 Bloxall
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Life Sciences A9647-100G
Cover Slips Fisher 12-548-5E
Delicate task wipe Kimberly-Clark 34120
Fluorescent diluent Akoya Biosciences ARD1A01EA Opal TSA diluent
Fluorophore 520 Akoya Biosciences FP1487001KT 1:100
Fluorophore 540 Akoya Biosciences FP1494001KT 1:100
Fluorophore 570 Akoya Biosciences FP1488001KT 1:100
Fluorophore 620 Akoya Biosciences FP1495001KT 1:100
Fluorophore 650 Akoya Biosciences FP1496001KT 1:100
Fluorophore 690 Akoya Biosciences FP1497001KT 1:100
Fluorophore DAPI Akoya Biosciences FP1490 3 drops in TBST or PBS
Heat resistant box Tissue-Tek 25608-904 Plastic slide box-green
Humidified Chamber Ibi Scientific AT-12
Hybridization oven FisherBiotech
Hydrophobic barrier pen Vector H-4000 ImmEdge
Microscope Perkin Elmer CLS140089 Mantra quantitative pathology workstation
Microwave Panasonic NN-A661S with inverter technology
Neutral buffered formalin Fisher Scientific SF100-4 10% neutral buffered formalin
pH 6 antigen retrieval buffer Akoya Biosciences AR600 AR6
pH 9 antigen retrieval buffer Akoya Biosciences AR900 AR9
Phosphate buffered saline Fisher BP3994 PBS
Plastic slide box Tissue-Tek 25608-906
Plastic wrap Fisher NC9070936
Polysorbate 20 Fisher BP337-800 Tween 20
Primary antibody CD163 Lecia NCL-LCD163 1:400
Primary antibody CD3 Dako A0452 1:400
Primary antibody CD8 Spring Bio M5390 1:400
Primary antibody FOXP3 Dako M3515 1:400
Primary antibody pancytokeratin Cell Signaling 12653 1:500
Primary antibody PD-L1 Cell Signaling 13684 1:200
Secondary antibody Akoya Biosciences ARH1001EA Opal polymer
Slide stain set Electron Microscopy Sciences 6254001
Tris buffered saline Corning 46-012-CM TBS
Vertical slide rack Electron Microscopy Sciences 50-294-72
Xylene Fisher X3P1GAL

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References

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