수동 멀티플렉스 형광 면역성 화학의 최적화, 설계 및 함정 방지

Cancer Research

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Summary

멀티플렉스 형광 면역 조직 화학은 그대로 포르말린 고정, 파라핀 임베디드 (FFPE) 조직 내에서 여러 세포 유형의 시각화를 가능하게하는 새로운 기술이다. 제시된 7색 멀티플렉스는 항체 및 시약을 최적화하고, 슬라이드를 준비하고, 일반적인 문제를 피하기 위한 설계 및 팁을 준비하기 위한 지침이 제시되어 있습니다.

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Lazarus, J., Akiska, Y., Perusina Lanfranca, M., Delrosario, L., Sun, L., Long, D., Shi, J., Crawford, H., Di Magliano, M. P., Zou, W., Frankel, T. Optimization, Design and Avoiding Pitfalls in Manual Multiplex Fluorescent Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (149), e59915, doi:10.3791/59915 (2019).

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Abstract

세포 침투 및 공간 조직의 분석을 위한 손상되지 않은 조직의 미세 환경 평가는 질병 과정의 복잡성을 이해하는 데 필수적입니다. 과거에 사용된 원리 기술은 1과 4 마커 사이를 사용하여 시간에 스냅샷으로 세포의 가시화를 가능하게 하는 면역성 결합 (IHC) 및 면역 형광 (IF)를 포함합니다. 두 기술 모두 불량 항원 표적 염색 어려움 및 종 간 반응성과 관련된 한계를 포함한 단점이 있습니다. IHC는 신뢰할 수 있고 재현 가능하지만 화학의 특성과 가시광선 스펙트럼에 대한 의존도는 소수의 마커만 사용할 수 있게 해주며 공동 현지화를 어렵게 만듭니다. IF의 사용은 잠재적인 마커를 넓히지 만 일반적으로 포르말린 고정 다음 광범위한 조직 자가 형광으로 인해 냉동 조직에 의존합니다. 유세포분석법은 여러 에피토프의 동시 라벨링을 가능하게 하는 기술로, IF와 IHC의 많은 결핍을 폐지하지만, 단일 세포 현탁액으로 세포를 검사할 필요성은 중요한 생물학적 제제를 버리는 세포의 공간적 맥락을 상실한다. 관계. 멀티플렉스 형광 면역조직화학(mfIHC)은 이러한 기술을 통해 전체적인 미세환경 구조및 공간적 구조를 보존하면서 포르말린 고정 파라핀 임베디드(FFPE) 조직에서 다중 에피토프 세포 자형질짝을 허용합니다. 그대로 중단되지 않은 조직 내의 세포의 관계. 조직 에피토프에 공유적으로 결합하는 높은 형광 강도 형광은 이차 항체에 의한 종 특정 교차 반응성에 대한 걱정없이 1 차 항체의 여러 응용 프로그램을 가능하게합니다. 이 기술은 질병 연구를 위해 신뢰할 수 있고 정확한 이미지를 생성하는 것으로 입증되었지만, 유용한 mfIHC 염색 전략을 만드는 과정은 광범위한 최적화 및 설계로 인해 시간과 정확할 수 있습니다. 현장에서 정확한 세포 상호 작용을 나타내는 견고한 이미지를 만들고 수동 분석을 위한 최적화 기간을 완화하기 위해 슬라이드 준비, 항체 최적화, 멀티플렉스 설계 및 오류를 위한 방법이 여기에 제시되어 있습니다. 염색 과정에서 일반적으로 발생합니다.

Introduction

손상되지 않은 종양 미세 환경 (TME)의 가시화는 고체 악성종양에서뿐만 아니라 세포 상호 작용에 세포 침투뿐만 아니라 세포 침투를 평가하는 데 필수적입니다. 멀티플렉스 형광 면역성화학(mfIHC)은 암 및 관련 질환의 연구에서 세포의 다항원 자형질에 효과적인 도구로부상하고 있다 1,2,3,4, 5,6,7. 이것은, 큰 데이터 세트를 분석하도록 설계된 새로운 소프트웨어 및 프로그램과 결합하여, 세포 사이의 복잡한 상호 작용의 관찰을 가능하게1,2,4. 데이터 수집의 속도 제한 요인은 종종 분석 전에 염색된 조직의 품질입니다.

TME에 있는 표현형 세포에 이용된 이전 기술은 면역성 결합 (IHC), 면역 형광 (IF) 및 유세포 세포 분석 이 모두 중요한 한계를 제시포함합니다. IHC는 포르말린 고정 파라핀 임베디드(FFPE) 조직 섹션을 사용하여 가장 자주 하나의 항체에 의해 염색되기 전에 분리되고 재수화됩니다. 고추냉이 과산화아제(HRP)의 사용은 이차 항체와 화학 반응을 결합하여 단일 항원 에피토프8의 가시화를 가능하게 한다. IHC는 신뢰할 수 있고 작동하기 쉬운 FFPE 조직에서 수행되지만, 가시광 스펙트럼에 대한 제한은 하나 또는 두 개의 마커만이신뢰할 수 있는 구별및 항원의 동국화가 매우 어렵다는 것을 의미한다. 단일 섹션에서 조사할 수 있는 사용 가능한 마커 및 따라서 항원을 확장하는 방법은 더 넓은 범위의 시각 스펙트럼을 사용할 수 있도록 형광으로 변경하는 것입니다. IF의 경우, 동결 또는 FFPE 조직은 다양한 형광체에 공액되는 슬라이드 및 항체로 옮겨질 수 있다. 이것은 조사될 수 있는 항원의 수를 증가하는 동안, 몇몇 중요한 한계가 있습니다. 첫째, 각 항체는 전형적으로 하나의 형광공만 부착되어 있기 때문에, 밝기는 종종 조직 자가형광을 극복할 만큼 충분히 강하지 않다. 이러한 이유로, 대부분의 IF는 저장 비용이 많이 들고 작업하기 어려운 냉동 조직에서 수행됩니다. 특히 비공액 항체가 사용될 때 스펙트럼 중복 및 교차 종 반응성으로 인해 제한된 수의 형광 태그를 사용할 수 있습니다. 단일 세포 현탁액으로 신선한 조직 처리및 형광 항체로 라벨링으로 구성된 유세포분석은 수십 년 동안 면역phenotaing을 위한 금 본위제9,10. 유세포 분석의 이점은 대부분의 것이 공액화되기 때문에 종 교차 반응성에 대한 우려없이 여러 항체에 라벨을 붙일 수 있다는 것입니다. 세포는 기계에 의해 "시각화"되고 인간의 눈이 아니기 때문에 훨씬 더 많은 형광단이 사용할 수 있지만 이것은 비용이 함께 제공됩니다. 보상은 거짓 긍정 및 부정적인 인구를 생성하는 결과를 크게 바꿀 수 있는 수동으로 수행해야 합니다. 유세포분석의 가장 중요한 한계는 조직 구조와 이후에 모든 공간 정보가 단일 세포 현탁액에 대한 필요성에 의해 손실된다는 것입니다.

새로운 소프트웨어와 결합된 자동 형광 현미경을 이용한 멀티플렉스 형광 면역조직화학(mfIHC)은 신호 증폭과 함께 다중 항원 조직 염색을 허용함으로써 IHC, IF 및 유세포분석의 이점을 결합하고 보상할 필요 없이 공간 관계를 유지합니다. FFPE 조직은 항원 검색 후 IHC와 유사한 HRP 화학 태그를 가진 이차 항체가 관심있는 표적 항원에게 1 차 항체 적용의 라운드를 거치는 충전 된 슬라이드에 배치됩니다. 이차 항체의 배치 후, HRP 특이적 반응은 관심있는 에피토프에 공유결합하여 형광공자(11)를 초래한다. 일단 조직이 표지되면, 슬라이드를 가열하는 또 다른 라운드는 조직 에피토프(11)에 결합된 형광 태그만을남기고 이전에 적용된 1차 및 2차 항체 복합체를 제거하는 것으로 완성된다. 이것은 교차 반응성11,12에대한 염려없이 임의의 종의 다중 항체가 재적용될 수 있게 한다. 다중 형광 염료의 수동 보상에 대한 필요성을 최소화하기 위해 핵 카운터 얼룩을 포함하여 스펙트럼이 거의 겹치는 형광단 컬렉션을 사용하여 mfIHC를 완료합니다. FFPE 조직과 마주치는 자가형광을 설명하기 위해 소프트웨어는 불소 후 항원 특이형광의 강도 때문에 가능한 빈 슬라이드에서 이미지를 사용하여 최종 이미지에서 자가형광을 뺍니다. 신호 증폭. 대용량 데이터 세트를 위해 설계된 새로운 프로그램을 사용하여 공간컨텍스트 1,2,4에대해 셀 위치를 식별하고 분석할 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 제한사항은 최적화 시간입니다. 실험 설계 및 염색 및 이미징 전략에 대한 지침이 포함된 자세한 방법론이 여기에서 확인할 수 있습니다. mfIHC는 현재 수동 기술을 사용하여 본래 FFPE 조직에서 세포 간 상호 작용의 공간 적 맥락을 더 잘 이해하고 자하는 최적화 된 자동 염색 시스템이없는 실험실에 유용 할 것입니다.

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Protocol

모든 작업은 미시간 대학의 내부 검토 위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 1 차 항체 및 슬라이드 준비 최적화

  1. 기존의 IHC를 사용하여 멀티플렉스용 항체의 이상적인 농도를 결정합니다.
    1. 기존의 면역화학(IHC) (IHC)13을수동하여 멀티플렉스에 대한 항체를 시험한다.
    2. CD3 항체 시험을 위해 편도선 조직을 사용하는 것과 같이 시험된 각 항체를 위한 풍부한 세포 모형이 있는 특정 조직을 사용하십시오.
    3. 회사에서 권장하는 IHC에 대한 기준 농도를 사용한 다음 권장 농도 와 권장 농도 이하의 농도에서 항체 농도로 IHC를 완료하십시오.
  2. 슬라이드에 포르말린 고정 파라핀 내장 조직을 준비합니다.
    1. 마이크로토메를 사용하여 FFPE 조직의 블록을 4~6 μm 두께로 자르고 충전된 슬라이드에 적용합니다.
      참고: 증류수를 사용하면 멀티플렉스 전체에 적절한 조직 장착 및 준수가 보장됩니다.
    2. 슬라이드를 평평하게, 티슈 쪽을 위로 올려 놓고, 밤새 37°C에서 건조시키십시오.
    3. 멀티플렉스를 완료할 준비가 될 때까지 슬라이드 상자에 극단적인 온도에서 멀리 보관하십시오.

2. 일반적인 염색 방법

  1. 세척 및 항원 회수 솔루션의 준비
    1. 9L의 탈이온수, 1L의 트리스 완충식염수(TBS) 및 10 mL의 폴리소르베이트 20을 혼합하여 0.1% TBST의 세척 용액을 준비한다.
    2. 항원 회수 액(pH 6 및 pH 9) 모두 준비; 재료표) 탈이온수로 1배로 희석하여
  2. 탈파화 및 수화
    1. 하이브리드화 오븐에서 1 시간 동안 60 °C에서 평평하게 누워있는슬라이드를 굽습니다. 오븐에서 슬라이드를 제거하고 적어도 5-10 분 동안 식힌 다음 수직 슬라이드 랙에 놓습니다.
    2. 다음 용액에서 슬라이드를 순차적으로 처리한다: 삼중항에 자일렌, 100% 에탄올, 95% 에탄올, 및 마지막으로 70% 에탄올을 슬라이드염색 세트를 사용하여 10분 동안 단일 처리한다.
    3. 30 분13에 대한 중립 버퍼 드 포르말린으로 채워진 플라스틱 슬라이드 상자에 침수에 의해 고정 다음 플라스틱 슬라이드 상자에 침수에 의해 탈이온 물로 2 분 동안 슬라이드의 랙을 씻어. 탈이온수에서 슬라이드를 2분 간 세척한 다음 항원 회수를 진행합니다.
  3. 항원 회수
    1. 슬라이드 랙을 pH 6 또는 pH 9 항원 회수 버퍼가 있는 내부 라인(약 300mL)에 채워진 내열 상자에 넣습니다.
      참고: 항원 회수 완충제는 pH 6 또는 pH 9일 수 있으며 이는 에피토프당 최적화되어야 할 수도 있다. 그러나, 핵 에피토프및 pH6에 결합하는 항체에 대해 다른 모든 항체에 대해 pH 9를 사용하여 시작한다.
    2. 비닐 랩으로 상자를 덮고 고무 밴드를 사용하여 고정하십시오. 상자를 회전 판 가장자리의 전자레인지에 넣습니다(전자레인지는 가열을 위해 인버터 기술을 갖추어야 합니다). 100 % 전력에서 45 s의 슬라이드를 가열한 다음 20 % 전력13에서15 분 동안 가열하십시오.
      참고: 전자레인지 처리는 사용되는 전자레인지에 따라 최적화가 필요할 수 있습니다.
    3. 슬라이드를 약 15-20분 동안 식힙니다.
  4. 차가운 슬라이드 동안 항체와 형광단의 작동 솔루션을 준비합니다.
    1. 0.5 g의 소 혈청 알부민 과립을 TBST의 50 mL로 용해시킴으로써 1차 항체 희석제를 준비한다. 또는, 과립을 용해시키기 위해 1x 인산완충식염수(PBS)의 50 mL를 사용한다.
    2. 각 1차 항체 작동 액을 제1절에서 결정된 최적화된 농도로, 1차 항체 희석제에서 만든다. 슬라이드당 약 200 μL을 예상합니다.
    3. 1:100의 농도로 불소 희석제내의 각 형광포를 희석시켜 형광공 작용액을 준비한다.
      참고: 이것은 항체에 따라서 낙관한되어야 할 수도 있습니다. 슬라이드당 약 100 μL을 예상합니다.
    4. 염색의 마지막 날에, 준비 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) TBST의 1 mL에 DAPI의 3 방울을 추가 하 여 작업 솔루션.
  5. 슬라이드 염색(세탁 및 차단)
    1. 냉각 후 전자 레인지에서 상자를 제거하고 플라스틱 랩을 벗고 2 분 동안 탈이온물로 슬라이드를 씻은 다음 TBST13을채워진 플라스틱 슬라이드 상자에 2 분 세척하십시오.
    2. 각 슬라이드를 섬세한 작업으로 티슈 주위로 건조한 후 조직이 마르지 않도록 조심스럽게 닦아 내고 소수성 장벽 펜을 사용하여 조직 외부를 추적합니다. 섬세한 작업 으로 티슈를 만지지 마십시오.
    3. 각 슬라이드를 가습 챔버에 넣고 차단 용액 (약 4 방울)을 조직에 추가하십시오. 실온(RT)에서 10분 동안 배양합니다.
  6. 슬라이드 염색 (1 차 항체 응용 프로그램)
    1. 각 슬라이드를 가지고 종이 타월 의 스택에 슬라이드의 측면을 누르고 조직 주위에서 과잉 차단 에이전트를 제거하기 위해 섬세한 작업 닦아하여 차단 솔루션을 제거합니다.
    2. 슬라이드를 다시 가습 챔버에 놓고 작동 1 차 항체의 약 200 μL을 추가합니다. RT에서 1 시간 동안 가습 챔버에서 배양하십시오.
    3. TBST로 2분간 3배에 잠기면13.
      참고: 각 세탁 단계 후에 TBST를 변경하면 더 깨끗한 이미지를 보장하는 데 도움이 됩니다.
  7. 슬라이드 염색(이차 항체 적용)
    1. 각 슬라이드로부터 나머지 TBST를 dab하고 약 3~4방울의 이차 항체(토끼 및 마우스 이차 HRP 공액 항체의 혼합물)를 적용한다. RT13에서가습 챔버에서 10 분 동안 배양하십시오.
      참고: 마우스 나 토끼 이외의 이차 항체를 필요로하는 1 차 항체를 사용하거나 대체 이차 항체를 사용하기로 결정한 경우, 슬라이드에 적절한 HRP 컨쥬게이션 보조를 적용하고 RT에서 45 분 동안 배양하십시오. 인큐베이션 시간은 대체 보조14에필요할 수 있습니다.
    2. 배양 후, TBST로 2 분 동안삼중 13로 씻어.
  8. 슬라이드 염색(형광포응용)
    1. 약 100 μL의 불소 작동 용액을 적용하고 10 분13동안 RT에서 가습 챔버에서 배양하십시오.
    2. TBST로 2 분 동안 삼중 13로 씻으하십시오.
  9. 항체의 제거
    1. 전자레인지 슬라이드(45초에서 100%, 20분에서 15분) 내열 상자 (단계 2.3.2 참조)에서 항체 의 제거13,14.
      참고 : 이것은 멀티 플렉스의 한 라운드를 완료합니다. 프로토콜을 일시 중지할 수 있는 유일한 지점입니다. 프로토콜을 일시 중지하려면, 슬라이드가 실온에서 밤새 항원 검색 버퍼에 잠긴 상태로 둡니다.
  10. 염색의 추가 라운드를 계속합니다. 나머지 항체 형광부 쌍에 대해 2.5.1-2.9.1 단계를 반복합니다. 모든 항체와 형광단이 사용되면 섹션 2.11로 진행하십시오.
  11. DAPI 애플리케이션 및 마운팅
    1. 멀티플렉스에서 마지막 염색 라운드 후, 항원 회수 용액 pH 613으로마지막 항체 적용을 제거한다. 탈이온수로 세척한 다음 TBST를2분당 13분씩 세척합니다.
    2. RT1에서10 분 동안 가습 챔버에서 슬라이드 및 배양에 작동하는 DAPI 용액의 약 150 μL을 적용하십시오.
    3. TBST로 약 30초 동안 세척하고 안티페이드 마운트로 커버슬립을 장착합니다. 커버슬립을 고정하기 위해 마운팅 매체가 건조되면 커버슬립의 네 모서리에 투명한 손톱 광택을 바치게 합니다(선택 사항).

3. 라이브러리, 모노플렉스 및 멀티플렉스에 대한 세부 정보

  1. 형광포어 라이브러리를 작성하기 위한 슬라이드를 선택합니다.
    1. 7색 멀티플렉스를 위해 라이브러리를 위한 7개의 면역 세포가 풍부한 조직 슬라이드(즉, 편도선, 비장 등)를 수집한다.
      참고: 멀티플렉스에서 사용될 각 고유형 플루오로폴을 나타내는 각 슬라이드가 있는 형광부 라이브러리에 사용할 컨트롤 슬라이드를 선택합니다. 대조군 슬라이드는 선택의 풍부한 에피토프를 가져야 하며 각 형광단에 대해 동일한 유형의 조직일 수 있다.
  2. 모노플렉스 및 멀티플렉스와 함께 사용할 수 있는 얼룩 및 이미지 라이브러리 슬라이드.
    1. 2.1-2.9.1 단계를 따라 제어 슬라이드를 사용하여 선택한 조직 슬라이드를 제어합니다. 각 슬라이드에 1:100의 농도로 다른 형광을 놓습니다. 하나의 슬라이드에는 DAPI만 포함되어야 합니다.
    2. DAPI 염색을 생략하는 것을 제외하고 섹션 2.11로 진행하고 대신 설명된 대로 TBST 및 마운트를 사용하십시오.
    3. 슬라이드를 하룻밤 건조시키는 후, 모든 채널DAPI, CY3, CY5, CY7, 텍사스 레드, 반도체 양자점 및 플루오레세인 이소티옥시아네이트(FITC)를 사용하여 이미지 포화보호 기능 1을 사용하여 250ms로 노출을 설정한다.
      참고 : 노출 시간은 50-250 ms13로설정할 수 있습니다.
    4. 라이브러리 이미지를 소프트웨어에 업로드하고 모노플렉스 및 멀티플렉스 분석에 사용합니다.
  3. 모노플렉스에 대한 슬라이드를 선택합니다.
    1. 최적화된 항체(섹션 1)를 기반으로 풍부한 에피토프를 가진 컨트롤 슬라이드를 선택합니다. 멀티플렉스에서 수행할 모든 얼룩의 경우 해당 컨트롤 슬라이드 수를 선택하여 모노플렉스를 만듭니다.
      참고: 모노플렉스의 목적은 멀티플렉스에서 사용되는 각 항체에 대해 최적의 위치(order)를 결정하는 것이다.
  4. 얼룩 모노 플렉스.
    1. 각 슬라이드에 대해 상이한 순서(위치)로 1차 항체를 사용하여 2.1-2.11 섹션을 따르십시오. 각 슬라이드는 다른 슬라이드와 다른 순서(위치)로 하나의 기본 항체만 적용되어야 합니다.
      참고: 라운드가 1차 항체 또는 불소가 없는 각 슬라이드에 대해, 대신 1차 항체 희석제 및 형광성 희석제를 사용한다13.
  5. 이미지 슬라이드 및 모노 플렉스를 분석합니다.
    1. 현미경을 사용하고 모든 채널에 대해 노출 시간을 250ms로 설정하여 DAPI를 활용하여 각 이미지를 캡처하여 초점을 맞춥니다.
      참고 : 노출 시간은 50-250 ms14로설정할 수 있습니다.
    2. 분석 소프트웨어를 사용하여 스테인드 마커의 형광 강도를 보고 각 단일플렉스 슬라이드를 평가한다.
    3. 이 강도를 배경과 비교합니다. 배경보다 5~10배 이상 높으면 해당 슬라이드의 위치는 최종 멀티플렉스에서 사용하기에 최적의 위치입니다.
  6. 멀티플렉스용 슬라이드를 선택합니다.
    1. 관심 있는 슬라이드를 선택하고 염색 및 이미징 후 자동 형광을 빼기 위한 빈 슬라이드로 사용할 추가 슬라이드를 추가합니다.
  7. 멀티플렉스에 얼룩을 지입니다.
    1. 모노플렉스 결과에 기초하여, 단계 3.5.3에 기초하여 각 항체에 대한 적절한 순서(위치)를 선택한다. 각 형광포를 항체에 할당합니다.
      참고: 최적화가 필요할 수 있습니다. 그러나, 덜 풍부한 마커 1에 대한밝은 항체를 사용하는 계획, 공동 국소화 항체는 서로 13에서멀리 스펙트럼에서 형광단과 일치해야하며, 스펙트럼 540 및 570을 가진 형광단은 공동 국소화되어서는 안됩니다. 에 스펙트럼 중복 문제1.
    2. 2.1-2.11 섹션을 진행하여 빈 슬라이드가 1차 항체, 형광포, 또는 DAPI를 수신하지 않도록 하고, 대신 항체 희석제, 형광환성 희석제 및 TBST를 그 자리에 각각 사용한다.
  8. 이미지 멀티플렉스 및 염색의 무결성 분석
    1. 현미경을 사용하여 모든 채널에 대해 노출 시간을 250ms로 설정하고 DAPI를 사용하여 각 이미지를 캡처하여 초점을 맞춥니다.
    2. 분석 소프트웨어(재료표)를사용하여 각 멀티플렉스를 형광 거짓 색상으로 평가합니다.
      참고: 선명한 이미지는 각 마커를 명확하게 보여줘야 합니다. 마커가 확산되고 거칠어보이거나 존재하지 않는 경우 마커가 작동하지 않아 다시 최적화해야 할 수 있습니다.
    3. 분석 소프트웨어를 사용하여 병리학 적 보기별로 각 멀티플렉스를 평가합니다. 병리학 보기는 각 마커의 특이성을 확인할 것이다. 이전에 최적화된 IHC와 비교합니다(섹션 1).

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Representative Results

7색 멀티플렉스 분석법획득의 전체적인 과정은 반복적인 패턴을 따른다. 그림 1은 다이어그램 형식으로 프로세스를 설명합니다. 일단 슬라이드가 절단되고 건조되거나 실험실에서 수신되고 60°C에서 혼성화 오븐에서 1시간 동안 구운 후, 탈파피화 및 재수화를 진행한 다음, 다시 포르말린에서 슬라이드를 고치고 항원 회수에 이어 다시 고쳐낸다. 다중화의 각 라운드는 항원 회수에서 시작하고 항체제거에서 끝납니다 (그림 1).

프로세스의 각 단계를 최적화하는 것은 명확하고 사용 가능한 이미지를 달성하는 데 가장 중요합니다. 항체는 특정 항체와 가장 잘 작동하는 항원 회수 완충액을 가시화하기 위하여 각 항체를 위한 pH 6 및 pH 9를 가진 항원 회수 완충장치를 사용하여 IHC에 의해 첫째로 시험되어야 합니다. 일반적으로 핵 표적은 완충제 pH 9로 항원 검색에 반응한다. 예를 들어, FOXP3는 pH 9의 항원 검색 버퍼가 pH 6의 항원 검색 버퍼와 가장 잘 작동하는 CD3와 반대로 사용될 때 가장 잘 작동합니다. IHC 공정에서 가져온 이미지는 멀티플렉스 분석의 특이성을 검증하는 데 사용되어야 합니다.

멀티플렉스에서 각 항체의 순서를 결정하기 위해서는 모노플렉스가 필요하다. 4-또는 7-컬러 키트를 사용하는 경우, 각 항체는 어레이에서 바람직한 순서를 가질 것이다. 사용될 항체의 수에 대해, 적절한 대조 슬라이드를 수집한다(즉, 한 가지 색상이 DAPI인 7색 멀티플렉스의 경우, 6개의 다른 형광단에 대한 6개의 조직 특이적 대표적인 대조군 슬라이드를 선택한다). 그림 2 A-C는 FFPE 결장암 조직을 가진 3개의 슬라이드를 사용하여 단색 분석의 개략적 표현이다. 각 슬라이드는 태그로서 플루오로포폴(570)을 사용하여 어레이에서 다른 위치에 FOXP3를 가한다. DAPI는 핵을 적절하게 시각화하기 위해 카운터 얼룩으로 사용됩니다. 그림3에서는 다양한 FOXP3 위치를 가진 모노플렉스 및 멀티플렉스의 대표적인 이미지가 표시됩니다. 그림3A, FOXP3가 세 번째 위치(그림 2C에표시된 순서에 해당)에 있는 B에서, FOXP3(빨간색)의 구체적이고 견고한 염색은 밝은 핵 염색 그림 3A 및 공동 지역화에 의해 입증된 것으로 보입니다. CD3 그림 3B와함께 . 불소 신호 강도는 조직 도 3A에서비특이적 염색 없이 FOXP3의 특이성을 확인한다. 그림 3C에서는FOXP3가 첫 번째 위치(그림 2A의순서에 해당)에 있는 경우 FOXP3의 비특이적 얼룩이 있습니다. 빨간색의 거친 확산 영역은 슬라이드의 대부분을 커버하고이 영역에서 형광 강도는 1 미만입니다. 먼저 모노플렉스를 완료하지 않고 멀티플렉스를 시도하여 염색 결과의 순서를 테스트하면 유사한 결과가 발생하며 시약을 낭비하게 된다. 멀티플렉스 프로세스에서 간과할 수 없는 또 다른 중요한 단계는 DAPI 염색입니다. 작동하는 DAPI 카운터스테인은 분석 소프트웨어를 사용하여 세포 식별 및 추가 공간 분석을 위한 기초입니다. 그림 3E에서 DAPI(파란색)가 작동하는 복합 이미지와 그림 3F의비작동 DAPI에서 중요한 대비를 볼 수 있습니다. 도 3F의 이미지는 분석 소프트웨어에서 셀을 식별하는 데 사용할 수 없었습니다. 멀티플렉스 및 조직 분석을 구출하려는 시도, 커버슬립은 TBST에서 슬라이드를 담그고 DAPI의 추가 적용을 통해 pH 6 항원 회수 완충제에 마이크로웨이브 단계를 거쳐 제거될 수 있다.

모노플렉스 분석이 완료되고 최적의 항체 주문이 확인되면, 멀티플렉스 전략을 구성할 수 있다 4. 모든 대상에 대해 다른 형광피를 선택해야합니다. 각 형광공과 관련된 숫자는 대략 유세포측정과 유사하게 여기 후에 방출되는 스펙트럼 형광 파장을 나타낸다. 제안된 항체와 형광단을 매칭하여 마커의 스펙트럼 중복 및 잠재적 출혈을 제한할 때 주의를 기울여야 합니다. 좋은 전략은 선명한 이미지와 보다 신뢰할 수 있는 자형질(13)을 제공하는 과잉 스펙트럼 중복을 줄이기 위해 항체를공동 국소화하기 위해 서로 멀리 떨어진 파장을 선택하는 것이다. 예를 들어, 멀티플렉스 전략표시(도 4)에서 CD8은 형광포백(570)과 페어링되고 CD3는 형광포어(520)와 페어링된다. 이들은 가장 차별없는 경향이 있고 결과를 손상시킬 수 있기 때문에 공동 지역화 된 표적에 불소 540 및 570의 사용을 피해야 합니다. 형광공 620은 매우 밝은 경향이 있으며 조직에 풍부하지 않은 항체에 사용되어야 합니다. 각 형광에 대한 참조로 사용되는 최근 라이브러리는 또한 형광단의 스펙트럼 중복을 줄이는 데 도움이됩니다. 복합 이미지에서 자동 형광 추출을 보장하기 위해 모든 항원 검색을 겪는 빈 슬라이드가 필요합니다. 이러한 블랭크 슬라이드는 작업하는 1차 항체 및 불소, 항체 희석제 및 불소 희석제를 제외하고 멀티플렉스 슬라이드와 동일한 처리를 거치게 될 것이다.

멀티플렉스 디자인이 제대로 작동하고 합성 이미지에서 볼 수있는 마커가 특정되도록하려면 현미경 소프트웨어를 사용하여 "brightfield"설정 옵션과 함께 "병리학 이미지"를 사용하여 가짜 IHC 이미지를 생성할 수 있습니다. 섹션 1에서 논의된 이전 IHC 어시어와 비교됩니다. 불행히도 아름다운 합성 이미지는 반드시 정확한 얼룩을 반영하지 않을 수 있으며 이는 공정을 관리하고 잘못된 긍정 결과를 방지하는 중요한 단계입니다. 그림 5A는 초기 문제 없이 합성 이미지를 보여 줍니다. CD3는 가시화되고 특정 염색(녹색)을 나타내고 도 5B에서병리학적인 밝은 필드 이미지에 의해 확인된다. CD163(주황색)은 합성 이미지에서 볼 수 있다(도5A); 그러나, CD163(도 5C)의 병리학적밝은 시야를 평가할 때, 항체는 비특이적이다. 특정 염색이 있는 최적의 멀티플렉스 이미지의 예는 합성이미지(그림 5D)에서 입증됩니다. CD3 및 CD163 특이성은 병리학적 브라이트필드 뷰(도5E도 5F,각각)를 사용하여 확인되고 이들 항체를 사용하여 수행된 이전 IHC 검문과 유리하게 비교한다(도시되지 않음).

Figure 1
그림 1: 염색 워크플로우 다이어그램.
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Figure 2
그림 2: 모노플렉스 개발.
(A) 위치 1에서 FOXP3를 가진 결장암 슬라이드. (B) 제 2 위치에서 FOXP3를 가진 결장암 슬라이드. (C) 위치 3에서 FOXP3를 가진 결장암 슬라이드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 모노플렉스와 멀티플렉스의 성공과 함정.
(a) FOXP3를 가진 1차 대장암의 모노플렉스 분석위치 3, 형광 강도 라벨을 나타내고 있다. (B) 위치 3및 CD3 위치에서 FOXP3를 가진 1 차적인 결장암의 다중 분석 제 2. (C) FOXP3를 가진 1차 대장암의 모노플렉스 분석결과, 1위, 형광 강도 라벨을 나타내고 있다. (D) 위치 2에서 위치 1 및 CD3에서 FOXP3를 가진 1 차적인 결장암의 멀티플렉스 분석. (E) 항체의 순서로 1차 대장암의 멀티플렉스 분석: CD8(노란색), CD3(녹색), CD163(주황색), 팬시토케라틴(흰색), PD-L1(마젠타), FOXP3(적색), 작동 DAPI(파란색) (F) 항체의 순서로 1차 대장암의 멀티플렉스 분석: CD8(노란색), CD3(녹색), CD163(주황색), 판시토케라틴(흰색), PD-L1(마젠타), FOXP3(적색), 비작동 DAPI(파란색). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 멀티플렉스 개발.
(A) 결장암의 멀티플렉스 슬라이드를 7색 멀티플렉스로 슬라이드합니다. (B) 결장암 조직을 이용하여 7색 멀티플렉스에 블랭크 슬라이드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 7색 멀티플렉스의 특이성 분석.
(A) 항체를 가진 멀티플렉스 합성 이미지는 다음과 같습니다: CD8(노란색), CD3(녹색), CD163(주황색), 팬시토케라틴(흰색), Ki67(적색), DAPI(파란색). (B) CD3에서만 볼 수 있는 패널 A에서 이미지의 병리학 밝은 시야. (C) CD163에서 만 보기 패널 A에서 이미지의 병리학 밝은 필드보기. (D) 항체를 가진 멀티플렉스 합성 이미지는 다음과 같습니다: CD8 (노란색), CD3 (녹색), CD163 (주황색), 팬시토케라틴 (흰색), PD-L1 (마젠타), FOXP3 (빨간색), DAPI (파란색). (E) CD3 보기에만 패널 D에서 이미지의 병리학 밝은 필드 보기. (F) CD163에서만 볼 수 있는 패널 D에서 이미지의 병리학 밝은 시야. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

고형 종양 생검 및 외과 절제술에서 온전한 조직 견본은 환자 예후 뿐만 아니라 질병 분석을 위한 중요한 진단 그리고 예측 공구 남아 있습니다. 멀티플렉스 형광 면역히스토화학(mfIHC)은 면역성화학(IHC), 면역형광(IF) 및 유세포분석의 이점을 결합한 새로운 기술이다. 이전에는 세포가 있는 장소에서 세포를 프로브하는 방법들은 조직 환경에서 세포 간배열의 평가를 허용하였다 8, 그러나, 조사될 수 있는 에피토프의 수가 적어 복잡한 분석이 제한된다. 유세포분석은 시편에서 많은 세포 유형을 분석하는데 유용하지만, 단일 세포 현탁액으로 샘플을준비하는 덕택에 공간적 맥락을 잃는다 9,10. mfIHC는 이러한 기술을 세포 미세 환경의 공간 적 맥락을 유지하고 표지된 에피토프(11)당 신호를 증폭시키면서라벨링할 수 있는 에피토프의 수를 증가시킴으로써 교량화한다. 이전 연구는 암 및 비암 조직 표본에서 세포 침투를 자형질화하기 위한 mfIHC를 사용하였으며 1, 2,3, 4,5,15. 사후 영상 분석은 또한 조직 미세 환경 내의 세포 및구조물의 공간 관계를 분석하기 위하여 이용되었습니다 1,2,4. 신뢰할 수 있는 분석을 위해서는 먼저 구체적이고 정확한 이미지를 생성해야 합니다. 자동 염색 시스템과 는 달리 수동 염색 기법은 이 기술에 대한 작고 비용 에 민감한 실험실 액세스를 가능하게 합니다. 최적화 시간과 염색 시간은 공간 분석을 위한 신뢰할 수 있는 이미지를 달성하는 데 가장 큰 장애물 중 하나입니다.

몇 가지 일반적인 규칙은 신뢰할 수 있는 복합 멀티플렉스 이미지를 성공적으로 생성할 가능성을 높이고 시간과 리소스를 절약합니다. 멀티플렉스에서 사용되는 항체는 수동 종래의 IHC와의 성공에 기초하여 선택되어야 한다. pH 6 및 pH 9를 이용한 항원 회수 완충제는 멀티플렉스에서 사용하기 에 적합한 항원 검색을 조사하기 위해 IHC에 사용되어야 한다. 모노플렉스 개발은 멀티플렉싱 프로토콜 내에서 항체의 배치를 규명하는 데 필요하다. 이것에 대한 근거는 복잡하고 조직 견본과 에피토프 사이에서 변화합니다. 경우에 따라, 에피토프는 CD3의 경우와 같이 여러 마이크로웨이브 단계와 마커 시각화가 손실되어 저하될 수 있습니다. 그러나 FOXP3는 더 많은 마이크로 웨이브 단계로 밝아지고 멀티 플렉스13,14의첫 번째 또는 두 번째 라운드에 배치하면 거의 보이지 않습니다.

염색 과정은 충전 된 슬라이드에 FFPE 조직 절단으로 시작합니다. 발생할 수있는 첫 번째 문제는 마이크로 웨이브 후 슬라이드에서 떨어지는 조직입니다. 충전 된 슬라이드를 사용하지 않을 때, 유리 표면에 조직의 준수가 제한되고 조직은 과도한 접이식을 하거나 완전히 미끄러 질 수 있습니다. 염색 과정에서 조직이 슬라이드에 부착되도록하기 위해 여러 가지 기술이 수행됩니다. 먼저 슬라이드에 블록을 절단하는 동안, 물의 가장 순수한 형태는 가장 잘 작동합니다. 일부 실험실의 경우 탈이온수가 충분할 수 있지만 증류수는 가장 잘 작동했습니다. 슬라이드는 밤새 37 °C에서 절단 한 후 즉시 평평하게 건조되어야한다. 순응도를 더욱 보장하기 위해 슬라이드를 혼성화 오븐에 넣고 사용하기 직전 1시간 동안 60°C에서 평평하게 구워넣습니다. 포르말린 고정은 초기 조직 준비 과정에서 이미 발생되었지만, 분리및 수화 과정 후 30분 동안 중성 완충 포르말린에 슬라이드를 두면 장착된 의 구조적 무결성이 향상됩니다. 조직1,13.

수동 염색 공정은 사용되는 항체의 수에 따라 최대 3, 8시간이 걸릴 수 있습니다. 시간을 절약하고 시약을 절약하는 데는 함정을 피하는 것이 필수적입니다. 첫 번째 일반적인 실수는 종종 시약 준비에서 발생합니다. 물은 실험실마다 다르며 한 실험실에서 다음 실험실로의 결과에 하나의 단일 차이점이 될 수 있습니다. 모든 반응 및 시약에 대해 깨끗한 수원을 동일하게 사용할 경우 일관된 결과를 보장합니다. 항체, 차단 용액 및 형광은 실온에서 가장 잘 작동합니다. 시약 및 작업 용액 준비의 함정을 피하려면 모든 시약에 동일한 물을 사용하십시오. 또한 실온에서 모든 작업 용액과 시약을 사용하십시오.

mfIHC의 문제 해결은 중요하며 구성 요소 및/또는 작업자 오류의 오염을 제한하는 데 중요한 엄격한 실험실 지침을 준수하는 것이 중요합니다. 최적이 아닌 이미지를 생성하면 결과가 왜곡되고 데이터에 부정적인 영향을 줄 수 있는 거짓 긍정 및 음수 세포 집단이 발생합니다. 궁극적인 분석에는 일반적으로 기계 학습을 기반으로 컴퓨터에서 생성된 표현형이 포함되어 있기 때문에 염색의 작은 오류를 확대하여 전체 데이터 집합에 영향을 줄 수 있습니다. 예를 들어, 모든 얼룩이 완벽하게 작동할 수 있지만 DAPI의 오류 나 누락은 향후 셀 세분화 및 계산을 방지하여 실험을 쓸모없게 만듭니다. 분석 소프트웨어는 DAPI 염색을 사용하여 셀을 식별할 뿐만 아니라 각 셀에 x 및 y 좌표를 할당하며 멀티플렉스가 어둡거나, 잘못 방사되거나, DAPI 염색이 확산되면 이미지를 더 이상 사용할 수 없으며 멀티플렉스를 다시 사용하거나 시도해야 합니다. 구조 및 DAPI의 재 염색. 병리학 및 밝은 시야와 같은 소프트웨어 구성 요소를 사용하면 최적화 프로세스 초기에 감도와 특이성에 대한 신뢰도가 향상되고 멀티플렉스 프로세스 초기에 실수를 방지할 수 있습니다.

이미징 프로세스의 수정 측면은 이미지 최적화에도 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어 DAPI를 사용하여 초점을 맞추는 데 도움이 되는 이미지를 촬영하면 흐릿한 이미지를 방지할 수 있습니다. 새로 만든 형광포 라이브러리를 소프트웨어에 추가하면 분석 단계에서 각 형광포의 깨끗한 이미지와 스펙트럼 중복이 적도록 보장하고 빈 슬라이드를 사용하여 자동 형광을 추출하면 마커가 강화되고 이미지가 향상됩니다. 품질.

조직 견본의 사용은 질병의 병리생리학을 조사하기에 있는 필수적인 공구로 남아 있을 것입니다. 신흥 기술은 세포 간 상호 작용에 대한 우리의 이해를 증가시켰으며 mfIHC는 유망한 새로운 플레이어입니다. 이 기술의 염색 공정 중 최적화 및 정확도는 세포 간 상호 작용의 적절한 활용 및 추가 분석을 위해 가장 중요합니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

저자는 원래 멀티 플렉스 얼룩의 설정 및 최적화에 대한 그의 도움, 퍼킨 엘머에서 이전에 에드 스택에 감사드립니다. 저자는 또한 분석 소프트웨어를 사용하여 팁 아코야 바이오 사이언스에서 크리스틴 슈미트에게 감사하고 싶습니다. 이 간행물에 보고된 연구는 수상 번호 P30CA046592의 밑에 건강의 국가 암 학회에 의해 지원되었습니다, K08CA201581 (tlf), K08CA234222 (js), R01CA1515807 (mpm), RSG1417301CSM (mpm), R01CA19807403 (mpm), U01CA22414501 (mpm, hc), CA170568 (hc). 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 추가 지원은 제프리 A. 콜비 결장암과 톰 리우 기념 연구 기금에 의해 제공되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100% ethanol Fisher HC8001GAL
70% ethanol Fisher HC10001GL
95% ethanol Fisher HC11001GL
Analysis software Akoya Biosciences CLS135783 inForm version 2.3.0
Antifade mountant ThermoFisher P36961 ProLong Diamond
Blocking solution Vector SP-6000 Bloxall
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Life Sciences A9647-100G
Cover Slips Fisher 12-548-5E
Delicate task wipe Kimberly-Clark 34120
Fluorescent diluent Akoya Biosciences ARD1A01EA Opal TSA diluent
Fluorophore 520 Akoya Biosciences FP1487001KT 1:100
Fluorophore 540 Akoya Biosciences FP1494001KT 1:100
Fluorophore 570 Akoya Biosciences FP1488001KT 1:100
Fluorophore 620 Akoya Biosciences FP1495001KT 1:100
Fluorophore 650 Akoya Biosciences FP1496001KT 1:100
Fluorophore 690 Akoya Biosciences FP1497001KT 1:100
Fluorophore DAPI Akoya Biosciences FP1490 3 drops in TBST or PBS
Heat resistant box Tissue-Tek 25608-904 Plastic slide box-green
Humidified Chamber Ibi Scientific AT-12
Hybridization oven FisherBiotech
Hydrophobic barrier pen Vector H-4000 ImmEdge
Microscope Perkin Elmer CLS140089 Mantra quantitative pathology workstation
Microwave Panasonic NN-A661S with inverter technology
Neutral buffered formalin Fisher Scientific SF100-4 10% neutral buffered formalin
pH 6 antigen retrieval buffer Akoya Biosciences AR600 AR6
pH 9 antigen retrieval buffer Akoya Biosciences AR900 AR9
Phosphate buffered saline Fisher BP3994 PBS
Plastic slide box Tissue-Tek 25608-906
Plastic wrap Fisher NC9070936
Polysorbate 20 Fisher BP337-800 Tween 20
Primary antibody CD163 Lecia NCL-LCD163 1:400
Primary antibody CD3 Dako A0452 1:400
Primary antibody CD8 Spring Bio M5390 1:400
Primary antibody FOXP3 Dako M3515 1:400
Primary antibody pancytokeratin Cell Signaling 12653 1:500
Primary antibody PD-L1 Cell Signaling 13684 1:200
Secondary antibody Akoya Biosciences ARH1001EA Opal polymer
Slide stain set Electron Microscopy Sciences 6254001
Tris buffered saline Corning 46-012-CM TBS
Vertical slide rack Electron Microscopy Sciences 50-294-72
Xylene Fisher X3P1GAL

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References

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