Ottimizzazione, progettazione ed evitare le falle nella immunostiera fluorescente manuale

Cancer Research

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Summary

L'immunohistochimica fluorescente multiplex è una tecnologia emergente che consente la visualizzazione di più tipi di cellule all'interno del tessuto incorporato in parina (FFPE) intatto. Le linee guida presentate sono linee guida per garantire un multiplex a 7 colori di successo con istruzioni per ottimizzare anticorpi e reagenti, preparare diapositive, progettare e suggerimenti per evitare problemi comuni.

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Lazarus, J., Akiska, Y., Perusina Lanfranca, M., Delrosario, L., Sun, L., Long, D., Shi, J., Crawford, H., Di Magliano, M. P., Zou, W., Frankel, T. Optimization, Design and Avoiding Pitfalls in Manual Multiplex Fluorescent Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (149), e59915, doi:10.3791/59915 (2019).

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Abstract

La valutazione microambiente del tessuto intatto per l'analisi dell'infiltrazione cellulare e dell'organizzazione spaziale è essenziale per comprendere la complessità dei processi della malattia. Le tecniche principali utilizzate in passato includono l'immunosintochimica (IHC) e l'immunofluorescenza (IF) che consentono la visualizzazione delle cellule come un'istantanea nel tempo utilizzando tra 1 e 4 marcatori. Entrambe le tecniche presentano carenze, tra cui difficoltà a macchiare obiettivi scarsamente antigenici e limitazioni legate alla reattività tra specie. IHC è affidabile e riproducibile, ma la natura della chimica e della dipendenza dallo spettro della luce visibile consente di utilizzare solo pochi marcatori e rende difficile la co-localizzazione. L'uso di IF amplia i potenziali marcatori, ma in genere si basa sul tessuto congelato a causa dell'estesa autofluorescenza dei tessuti dopo la fissazione della formalina. Citometria di flusso, una tecnica che consente l'etichettatura simultanea di più epitopi, abroga molte delle carenze di SE e IHC, tuttavia, la necessità di esaminare le cellule come una singola sospensione cellulare perde il contesto spaziale delle cellule che scartano importanti sostanze biologiche Relazioni. L'immunohistochimica fluorescente multiplex (mfIHC) collega queste tecnologie consentendo la fenotipizzazione cellulare multi-epitopo nel tessuto incorporato a paraffina fissa di formalina (FFPE), preservando l'architettura complessiva del microambiente e lo spazio relazione delle cellule all'interno di tessuto intatto senza interruzioni. L'alta intensità fluorescente fluorofori che si legano covalentmente all'epitopo tissutale consente l'applicazione multipla di anticorpi primari senza preoccuparsi della reattività incrociata specifica delle specie da parte di anticorpi secondari. Anche se questa tecnologia ha dimostrato di produrre immagini affidabili e accurate per lo studio della malattia, il processo di creazione di un'utile strategia di colorazione mfIHC può richiedere molto tempo e richiede molto tempo e richiede grazie a un'ampia ottimizzazione e progettazione. Al fine di creare immagini robuste che rappresentano interazioni cellulari accurate in loco e per mitigare il periodo di ottimizzazione per l'analisi manuale, presentate qui sono metodi per la preparazione delle diapositive, l'ottimizzazione degli anticorpi, la progettazione del multiplex e gli errori comunemente riscontrato durante il processo di colorazione.

Introduction

La visualizzazione di un microambiente tumorale intatto (TME) è essenziale nella valutazione non solo dell'infiltrazione cellulare nelle neoplasie solide, ma anche delle interazioni tra cellule e cellule. L'immunoistochimica fluorescente multiplex (mfIHC) è emersa come uno strumento efficace per la fenofitipo multi-antigene delle cellule nello studio del cancro e delle malattie associate1,2,3,4, 5,6,7. Questo, in combinazione con nuovi software e programmi progettati per analizzare grandi set di dati, consente l'osservazione di interazioni complesse tra le celle1,2,4. Il fattore di limitazione del tasso nell'acquisizione dei dati è spesso la qualità del tessuto macchiato prima dell'analisi.

Le tecniche precedenti utilizzate per le cellule fenotipiche nel TME includono l'immunosintochimica (IHC), l'immunofluorescenza (IF) e la citometria di flusso che presentano limitazioni significative. IHC utilizza le sezioni di tessuto di paraffina fissa (FFPE) formalina che vengono deparaffinate e reidratate prima di essere macchiate dal più delle volte un anticorpo. L'uso di un anticorpo secondario legato alla perossidasi di rafano (HRP) e una reazione chimica consente la visualizzazione di un singolo epitopo antigenico8. Mentre IHC è affidabile ed eseguito su tessuto FFPE che è facile da lavorare, limitazioni allo spettro di luce visibile significa che solo uno o due marcatori possono essere affidabili distinti e co-localizzazione di antigeni abbastanza difficile8. Un modo per espandere i marcatori disponibili e quindi gli antigeni che possono essere sondati su una singola sezione è quello di passare alla fluorescenza che consente l'uso di una gamma più ampia dello spettro visivo. Per IF, il tessuto congelato o FFPE viene trasferito su vetrini e anticorpi utilizzati che sono coniugati a vari fluorofori. Mentre questo aumenta il numero di antigeni che possono essere sondati, ci sono diverse limitazioni importanti. In primo luogo, poiché ogni anticorpo in genere ha solo un fluoroforo attaccato, la luminosità spesso non è abbastanza forte per superare l'autofluorescenza dei tessuti. È per questo motivo, la maggior parte IF viene eseguita su tessuto congelato che è costoso da memorizzare e difficile da lavorare. Un numero limitato di tag fluorescenti sono disponibili per l'uso a causa della sovrapposizione spettrale e della reattività delle specie incrociate, in particolare quando vengono utilizzati anticorpi non coniugati. La citometria di flusso, che consiste nell'elaborazione di tessuti freschi in una singola sospensione cellulare enell'etichettatura con anticorpi fluorescenti è stato il gold standard per l'immunofenofizzazione per decenni 9,10. Un vantaggio della citometria di flusso è la capacità di etichettare più anticorpi senza preoccuparsi della reattività incrociata delle specie, poiché la maggior parte è coniugata. Poiché le cellule sono "visualizzate" da una macchina e non da occhi umani, ci sono molti più fluorofori disponibili, ma questo ha un costo. La compensazione deve essere fatta manualmente che può alterare significativamente i risultati producendo popolazioni false positive e negative. La limitazione più significativa della citometria di flusso è che l'architettura dei tessuti e successivamente tutte le informazioni spaziali vengono perse dalla necessità di sospensione di singole cellule.

Multiplex fluorescente immunohistochimica (mfIHC) utilizzando un microscopio fluorescente automatizzato in combinazione con un nuovo software combina i benefici di IHC, SE e citometria di flusso, consentendo la colorazione dei tessuti multi-antigene con l'amplificazione del segnale e mantenimento delle relazioni spaziali senza la necessità di una compensazione. Il tessuto FFPE viene posto su vetrini carichi che, dopo il recupero dell'antigene, subiscono un ciclo di applicazione primaria dell'anticorpo all'antigene bersaglio di interesse seguito da un anticorpo secondario con un tag chimico HRP, simile all'IHC. Dopo il posizionamento dell'anticorpo secondario, una reazione specifica HRP si traduce in un fluoroforo che si lega covalentmente all'epipologo di interesse11. Una volta etichettato il tessuto, un altro ciclo di riscaldamento dei vetrini viene completato rimuovendo il complesso anticorpale primario e secondario precedentemente applicato lasciando solo il tag fluorescente legato all'epitopo del tessuto11. Ciò consente di riapplicare più anticorpi di qualsiasi specie senza preoccuparsi della reattività incrociata11,12. Per ridurre al minimo la necessità di una compensazione manuale di più coloranti fluorescenti, una raccolta di fluorofori con poca sovrapposizione spettrale, inclusa una macchia nucleare, viene utilizzata per completare il mfIHC. Per tenere conto dell'autofluorescenza incontrata con il tessuto FFPE, il software sottrae l'autofluorescenza dall'immagine finale utilizzando un'immagine da una diapositiva vuota che è possibile a causa della forza della fluorescenza specifica dell'antigene dopo fluoroforo l'amplificazione del segnale. Utilizzando nuovi programmi progettati per grandi set di dati, le posizioni delle celle possono essere identificate e analizzate per il contesto spaziale1,2,4. La limitazione più significativa di questa tecnica è il tempo di ottimizzazione. Una metodologia dettagliata con istruzioni per la progettazione sperimentale e la strategia di colorazione e imaging si trova qui. mfIHC sarà utile per i laboratori che attualmente non dispongono di un sistema di colorazione automatizzato ottimizzato che vorrebbe comprendere meglio il contesto spaziale delle interazioni cellula-cellula nel tessuto FFPE intatto utilizzando la tecnica manuale.

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Protocol

Tutto il lavoro è stato approvato dal comitato di revisione interna dell'Università del Michigan.

1. Ottimizzazione degli anticorpi primari e preparazione dello scivolo

  1. Determinare la concentrazione ideale di anticorpi per multiplex utilizzando IHC convenzionale.
    1. Testare gli anticorpi per il multiplex mediante immunoistochimica convenzionale manuale (IHC)13.
    2. Utilizzare tessuti specifici che hanno un tipo di cellula abbondante per ogni anticorpo testato come l'utilizzo di tessuto tonsille per il test anticorpale CD3.
    3. Utilizzare la concentrazione di riferimento per IHC raccomandata dall'azienda e quindi completare LHC con concentrazioni di anticorpi alle concentrazioni raccomandate, nonché le concentrazioni al di sopra e al di sotto della concentrazione raccomandata.
  2. Preparare formalina tessuto incorporato paraffina fissa sulle diapositive.
    1. Utilizzando un microtoma, tagliare blocchi di tessuto FFPE ad uno spessore compreso tra 4 e 6 m e si applicano ai vetrini caricati.
      NOTA: l'utilizzo di acqua distillata garantisce il corretto montaggio dei tessuti e l'aderenza in tutto il multiplex.
    2. Posizionare i vetrini piatti, il lato dei tessuti verso l'alto, e lasciare asciugare a 37 gradi durante la notte.
    3. Conservare le diapositive in una scatola di diapositive lontano dalla temperatura estrema fino a quando non è pronto per completare il multiplex.

2. Metodo di colorazione generale

  1. Preparazione di soluzioni di lavaggio e recupero dell'antigene
    1. Preparare la soluzione di lavaggio dello 0,1% TBST mescolando 9 L di acqua deionizzata, 1 L di tris tamponata salina (TBS) e 10 mL di polisoromatto 20.
    2. Preparare entrambe le soluzioni di recupero dell'antigene (pH 6 e pH 9; Tabella dei materiali) diluindo a 1x con acqua deionizzata.
  2. Deparaffinazione e reidratazione
    1. Cuocere i vetrini, sdraiati piatti, lato dei tessuti fino a 60 gradi centigradi per 1 h in un forno di ibridazione1. Togliere i vetrini dal forno e lasciare raffreddare per almeno 5-10 min, quindi mettere in un rack di scorrimento verticale.
    2. Trattare le diapositive nelle seguenti soluzioni in sequenza: xilene in triplice copia, seguito da un singolo trattamento di 100% etanolo, 95% etanolo e infine 70% etanolo per 10 min ciascuno utilizzando un set di colorazione slide1.
    3. Lavare il rack di vetrini per 2 min con acqua deionizzata per sommersione in una scatola di diapositive di plastica seguita da fissazione per immorbidimento in una scatola di diapositive di plastica piena di formalina tampone neutra per 30 min13. Lavare i vetrini in acqua deionizzata per 2 min quindi procedere al recupero dell'antigene.
  3. Recupero dell'antigene
    1. Collocare il rack di vetrini in una scatola resistente al calore riempita alla linea interna (circa 300 mL) con pH 6 o pH 9 antigene buffer.
      NOTA: il buffer di recupero dell'antigene può essere pH 6 o pH 9 che potrebbe essere necessario ottimizzare per ogni epitopo. Tuttavia, iniziare utilizzando il pH 9 per gli anticorpi che si legano agli epitopi nucleari e al pH 6 per tutti gli altri anticorpi.
    2. Coprire la scatola con pellicola trasparente e utilizzare un elastico per fissare. Posizionare la scatola nel forno a microonde sul bordo della piastra rotante (microonde deve essere dotato di tecnologia inverter per il riscaldamento uniforme). Riscaldare i vetrini per 45 s al 100% di potenza seguita da 15 min al 20% di potenza13.
      NOTA: il trattamento a microonde potrebbe richiedere l'ottimizzazione a seconda del forno a microonde utilizzato.
    3. Lasciare raffreddare gli scivoli per circa 15-20 min.
  4. Preparare soluzioni di lavoro di anticorpi e fluorofori mentre gli scivoli sono freschi.
    1. Preparare il diluente anticorpo primario sciogliendo 0,5 g di granuli di albumina del siero bovino in 50 mL di TBST. In alternativa, utilizzare 50 mL di 1x fosfato buffered salina (PBS) per sciogliere i granuli.
    2. Rendere ogni soluzione di lavoro anticorpo primario per la concentrazione ottimizzata determinata nella sezione 1, nel diluente anticorpo primario. Stimare circa 200 L per diapositiva.
    3. Preparare la soluzione di lavoro del fluoroforo diludo ogni fluoroforo nel diluente del fluoroforo ad una concentrazione di 1:100.
      NOTA: Potrebbe essere necessario ottimizzarlo a seconda dell'anticorpo. Stimare circa 100 l per diapositiva.
    4. L'ultimo giorno di colorazione, preparare la soluzione di lavoro DAPI (4,6-diamidino-2-fenylindole) aggiungendo 3 gocce di DAPI in 1 mL di TBST.
  5. Colorazione del vetrino (lavaggio e blocco)
    1. Togliere la scatola dal microonde dopo il raffreddamento e togliere l'involucro di plastica, lavare i vetrini con acqua deionizzata per 2 min seguita da un lavaggio di 2 min in una scatola di diapositive di plastica riempita TBST13.
    2. Dopo aver asciugato ogni vetrino intorno al tessuto con un compito delicato pulire attentamente a non lasciare asciugare il tessuto, traccia intorno all'esterno del tessuto utilizzando una penna barriera idrofobica. Non toccare il tessuto con la delicata pulizia o penna.
    3. Posizionare ogni vetrino nella camera umidificata e aggiungere la soluzione di blocco (circa 4 gocce) al tessuto. Incubare per 10 min a temperatura ambiente (RT).
  6. Colorazione diapositiva (applicazione anticorpale primaria)
    1. Prendere ogni diapositiva e rimuovere la soluzione di blocco toccando il lato della diapositiva su una pila di asciugamani di carta e utilizzando una delicata pulizia attività per rimuovere l'agente di blocco in eccesso da tutto il tessuto.
    2. Posare il vetrino nella camera umidificata e aggiungere circa 200 l dell'anticorpo primario funzionante. Incubare nella camera umidificata per 1 h a RT.
    3. Lavare con TBST per 2 min con un'immersione in triplice13.
      NOTA: dopo ogni passaggio di lavaggio, la modifica della TBST contribuirà a garantire un'immagine più pulita.
  7. Colorazione del vetrino (applicazione anticorpale secondaria)
    1. Dab fuori la TBST rimanente da ogni diapositiva e applicare circa 3 a 4 gocce di anticorpo secondario (miscela di coniglio e topo secondario HRP anticorpi coniugati). Incubare per 10 min nella camera umidificata a RT13.
      NOTA: Se si pianifica l'uso di un anticorpo primario che richiede un anticorpo secondario diverso da mouse o coniglio o scegliendo di utilizzare un anticorpo secondario alternativo, applicare l'HRP appropriato coniugato secondario ai vetrini e incubare a RT per 45 min. tempo di incubazione può essere necessario per il secondario alternativo14.
    2. Dopo l'incubazione, lavare con TBST per2 min in triplice 13 .
  8. Colorazione scorrevole (applicazione fluoroforo)
    1. Applicare circa 100 l della soluzione di lavoro del fluoroforo e incubare nella camera umidificata a RT per 10 min13.
    2. Lavare con TBST per 2 min in triplice13.
  9. Rimozione di anticorpi
    1. Scivoli a microonde (45 s al 100% poi 15 min al 20%) nella scatola resistente al calore (vedi punto 2.3.2) per la rimozione degli anticorpi13,14.
      NOTA: questo completa un round del multiplex. Questo è l'unico punto in cui il protocollo può essere messo in pausa. Per sospendere il protocollo, lasciare le diapositive immerse nel buffer di recupero dell'antigene durante la notte a temperatura ambiente.
  10. Continuare ulteriori giri di colorazione. Ripetete i passi da 2,5,1 a 2,9,1 per il resto delle coppie anticorpo-fluoroforo. Una volta utilizzati tutti gli anticorpi e i fluorofori, procedere alla sezione 2.11.
  11. Applicazione E montaggio DAPI
    1. Dopo l'ultimo giro di colorazione nel multiplex, rimuovere l'ultima applicazione anticorpale con soluzione di recupero antigene pH 613. Lavare con acqua deionizzata seguita da TBST per 2 min ogni13.
    2. Applicare circa 150 - L della soluzione DAPI di lavoro per scivoli e incubare nella camera umidificata per 10 min a RT1.
    3. Lavare con TBST per circa 30 s e montare i coperchi dei coperchi con un montante antisbidiscatore. Applicare lo smalto trasparente delle unghie ai quattro angoli del coperchio una volta che il supporto di montaggio si è asciugato per fissare il coperchio (opzionale).

3. Dettagli per libreria, monoplex e multiplex

  1. Scegliere diapositive per la creazione di una libreria di fluorofori.
    1. Per un multiplex a 7 colori raccogliere 7 diapositive di tessuto ricco di cellule immunitarie (ad esempio, tonsille, milza, ecc. ) per la biblioteca.
      NOTA: Scegliere le diapositive di controllo da utilizzare per una libreria di fluorofori con ogni diapositiva che rappresenta ogni fluoroforo univoco che verrà utilizzato nel multiplex. I vetrini di controllo devono avere un abbondante epitopo di scelta e possono essere lo stesso tipo di tessuto per ogni fluoroforo.
  2. Colorato e diapositive della libreria di immagini per l'uso con monoplex e multiplex.
    1. Seguite i passaggi 2.1-2.9.1 utilizzando le diapositive di controllo e i vetrini dei tessuti che hanno scelto. Mettere un fluoroforo diverso su ogni vetrino ad una concentrazione di 1:100; una diapositiva deve contenere solo DAPI.
    2. Procedere alla sezione 2.11 tranne omettere la colorazione DAPI e utilizzare invece TBST e montare come descritto.
    3. Dopo aver lasciato i vetrini asciugare durante la notte, immagine con tutti i canali DAPI, CY3, CY5, CY7, Texas Red, punti quantici semiconduttori, e fluorescein isothiocyanate (FITC) impostando l'esposizione a 250 ms con la funzione di protezione della saturazione1.
      NOTA: i tempi di esposizione possono essere impostati a 50-250 ms13.
    4. Caricare le immagini della libreria sul software e utilizzare nell'analisi dei monoplex e multiplex.
  3. Scegliere le diapositive per i monoplex.
    1. Scegliere diapositive di controllo che hanno un abbondante epitopo di scelta in base agli anticorpi ottimizzati (sezione 1). Per ogni giro di colorazione da eseguire nel multiplex, selezionare il numero di diapositive di controllo per creare monoplex.
      NOTA: Lo scopo del monoplex è quello di determinare la posizione migliore (ordine) per ogni anticorpo da utilizzare nel multiplex.
  4. Monoplex di macchia.
    1. Seguite le sezioni 2.1-2.11 usando l'anticorpo primario in un ordine diverso (posizione) per ciascuna delle diapositive. Ogni diapositiva deve avere un solo anticorpo primario applicato in un ordine (posizione) diverso rispetto alle altre diapositive.
      NOTA: Per ogni diapositiva in cui il round non richiede anticorpi primari o fluorofori, utilizzare invece il diluente anticorpo primario e il diluente del fluoroforo13.
  5. Immagini diapositive e analizzare il monoplex.
    1. Utilizzando il microscopio e impostando il tempo di esposizione a 250 ms per tutti i canali catturare ogni immagine utilizzando DAPI per mettere a fuoco.
      NOTA: i tempi di esposizione possono essere impostati a 50-250 ms14.
    2. Utilizzando il software di analisi valutare ogni diapositiva monoplex osservando l'intensità fluorescente del marcatore colorato.
    3. Confrontare questa intensità con lo sfondo. Se è almeno 5/10 volte superiore a quello dello sfondo, la posizione di quella diapositiva è una posizione ottimale da utilizzare nel multiplex finale.
  6. Scegliere le diapositive per il multiplex.
    1. Scegliere le diapositive di interesse e aggiungere una diapositiva supplementare da utilizzare come diapositiva vuota per la sottrazione dell'autofluorescenza dopo la colorazione e l'imaging.
  7. Macchia il multiplex.
    1. In base ai risultati monoplex, scegliere l'ordine appropriato (posizioni) per ogni anticorpo in base al passaggio 3.5.3. Assegnare ogni fluoroforo a un anticorpo.
      NOTA: potrebbe essere necessaria l'ottimizzazione; tuttavia, il piano di utilizzare anticorpi luminosi per marcatori meno abbondanti1, gli anticorpi co-localizzanti devono essere abbinati a fluorofori lontani l'uno dall'altro13, e i fluorofori con lo spettro 540 e 570 non devono essere co-localizzati a causa di alle emissioni spettrali di sovrapposizione1.
    2. Procedere con le sezioni 2.1-2.11 assicurandosi che la diapositiva vuota non riceva anticorpi primari, fluoroforo o DAPI, ma utilizzare invece anticorpi diluenti, diluenti del fluoroforo e TBST rispettivamente al suo posto.
  8. Immagine multiplex e analisi per l'integrità della colorazione
    1. Utilizzando il microscopio e impostando il tempo di esposizione a 250 ms per tutti i canali, acquisire ogni immagine utilizzando DAPI per mettere a fuoco.
    2. Utilizzando il software di analisi (Tabella dei materiali), valutare ogni multiplex per colore falso fluorescente.
      NOTA: un'immagine chiara dovrebbe dimostrare chiaramente ogni marcatore. Se un marcatore sembra diffuso e granuloso o è inesistente, è probabile che il marcatore non ha funzionato e deve essere ri-ottimizzato.
    3. Utilizzando il software di analisi, valutare ogni multiplex in base alla vista patologica. La vista patologica confermerà la specificità di ogni marcatore. Confrontare con IHC precedentemente ottimizzato (sezione 1).

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Representative Results

Il processo complessivo di ottenimento di un multiplex assay a 7 colori segue un modello ripetitivo. Figura 1 descrive il processo in una forma diagrammatica. Una volta che i vetrini vengono tagliati e asciugati o vengono ricevuti dal laboratorio e cotti in un forno di ibridazione a 60 gradi centigradi per 1 h, quindi procedere alla deparaffinazione e alla reidratazione, fissare nuovamente i vetrini in formalina seguiti dal recupero dell'antigene. Ogni round di multiplexing inizia al recupero dell'antigene e termina alla rimozione dell'anticorpo (Figura 1).

L'ottimizzazione di ogni fase del processo è fondamentale per ottenere un'immagine chiara e utilizzabile. Gli anticorpi devono essere testati da IHC utilizzando prima i buffer di recupero dell'antigene con pH 6 e pH 9 per ogni anticorpo per visualizzare quale buffer di recupero dell'antigene funziona meglio con quel particolare anticorpo. Generalmente, gli obiettivi nucleari rispondono al recupero dell'antigene con pH buffer 9. Ad esempio, FOXP3 funziona meglio quando viene utilizzato il buffer di recupero dell'antigene di pH 9 rispetto a CD3 che funziona meglio con il buffer di recupero dell'antigene di pH 6. Le immagini tratte dal processo IHC devono essere utilizzate per convalidare la specificità dell'analisi multiplex.

Un monoplex è necessario per determinare l'ordine di ogni anticorpo nel multiplex. Quando si utilizza un kit a 4 o 7 colori, ogni anticorpo avrà un ordine preferito nell'array. Per il numero di anticorpi che verranno utilizzati, raccogliere i vetrini di controllo appropriati (ad esempio, per un multiplex a 7 colori in cui un colore è DAPI, selezionare 6 diapositive di controllo rappresentative specifiche del tessuto per gli altri 6 fluorofori). Figura 2 A-C è una rappresentazione schematica di un test monoplex utilizzando 3 diapositive con tessuto tumorale FFPE. Ogni diapositiva ha FOXP3 in una posizione diversa nell'array utilizzando fluorophore 570 come tag. DAPI viene utilizzato come una contro macchia per visualizzare adeguatamente i nuclei. Nella Figura 3, vengono visualizzate immagini rappresentative di un monoplex e di un multiplex con una posizione FOXP3 variabile. Nella figura 3A,B, dove FOXP3 si trova alla terza posizione (corrispondente all'ordine illustrato nella figura 2C),la colorazione specifica e robusta di FOXP3 (rosso) è vista come dimostrato dalla colorazione nucleare brillante Figura 3A e co-localizzazione con CD3 Figura 3B. L'intensità del segnale fluoroforo conferma la specificità di FOXP3 senza colorazione non specifica altrove nel tessuto Figura 3A. Nella figura 3C, dove FOXP3 si trova nella prima posizione (corrispondente all'ordine nella figura 2A), è presente una colorazione non specifica di FOXP3. Le aree di colore sgranato di colore rosso coprono la maggior parte dello scivolo e l'intensità fluorescente in queste aree sono inferiori a 1. Tentativo di fare un multiplex senza completare prima un monoplex per testare l'ordine dei risultati di colorazione in un risultato simile e sprecherà reagenti. Un altro passaggio critico che non può essere trascurato nel processo multiplex è la colorazione DAPI. Una contromacchia DAPI funzionante è la base per l'identificazione delle cellule e un'ulteriore analisi spaziale utilizzando il software di analisi. Un importante contrasto può essere visto nell'immagine composita con DAPI funzionante (blu) nella figura 3E e nel DAPI non funzionante in Figura 3F. L'immagine nella figura 3F non è stata utilizzata per identificare le celle nel software di analisi. Un tentativo di salvare il multiplex e l'analisi dei tessuti, il coverslip forse rimosso immergendo il vetrino in TBST seguito da un passo microwaving nel buffer di recupero dell'antigene pH 6 con un'ulteriore applicazione di DAPI.

Una volta che il saggio monoplex è stato completato e l'ordine anticorpale ottimale confermato, una strategia multiplex può essere costruita Figura 4. Per ogni bersaglio deve essere scelto un fluoroforo diverso. Il numero associato a ciascun fluoroforo rappresenta approssimativamente la lunghezza d'onda fluorescente spettrale emessa dopo l'eccitazione, simile alla citometria del flusso. Occorre prestare attenzione quando si abbinano gli anticorpi proposti con fluorofori per limitare la sovrapposizione spettrale e il potenziale sanguinamento dei marcatori. Una buona strategia è quella di scegliere lunghezze d'onda lontane l'una dall'altra per co-localizzare gli anticorpi per ridurre la sovrapposizione spettrale in eccesso fornendo un'immagine nitida e fenotipizzazione più affidabile13. Ad esempio, nella strategia multiplex visualizzata (Figura 4), CD8 viene associato al fluoroforo 570 mentre CD3 è associato al fluoroforo 520. Si dovrebbe evitare l'uso di fluoroforo 540 e 570 in obiettivi co-localizzati in quanto questi tendono ad essere i più indiscriminanti e possono compromettere i risultati. Fluoroforo 620 tende ad essere molto luminoso e deve essere utilizzato per anticorpi che non sono abbondanti nel tessuto. Una libreria recente utilizzata come riferimento per ogni fluoroforo aiuta anche a ridurre la sovrapposizione spettrale dei fluorofori. Una diapositiva vuota che subisce tutti i cicli di recupero dell'antigene è necessaria per garantire l'estrazione dell'autofluorescenza dall'immagine composita. Questa diapositiva vuota subirà lo stesso trattamento dei vetrini multiplex tranne al posto di un anticorpo primario funzionante e fluoroforo, il diluente anticorpo e fluorophore diluente sarà utilizzato rispettivamente Figura 4B.

Per garantire che il disegno multix funzioni correttamente e che i marcatori visti nell'immagine composita siano specifici, utilizzare l'"immagine patologica" in combinazione con l'opzione di impostazione "brightfield" utilizzando un software al microscopio che crea un'immagine IHC finta che può quindi essere rispetto ai precedenti saggi IHC discussi nella sezione 1. Sfortunatamente, belle immagini composite potrebbero non riflettere necessariamente una macchia accurata e questo è un passo importante per controllare la qualità del processo e prevenire risultati falsi positivi. Figura 5A illustra un'immagine composita senza preoccupazioni iniziali. CD3 viene visualizzato e mostra una colorazione specifica (verde) ed è confermato dall'immagine del campo luminoso patologico nella Figura 5B. Cd163 (arancione) è visto nell'immagine composita (Figura 5A); tuttavia, nella valutazione della visione della patologia brightfield del CD163 (Figura 5C), l'anticorpo non è specifico. Un esempio di un'immagine multiplex ottimale con colorazione specifica è illustrato in un'immagine composita (Figura 5D). La specificità del CD3 e del CD163 viene confermata utilizzando la visualizzazione del campo luminoso della patologia (rispettivamenteFigura 5E e Figura 5F) e viene confrontata favorevolmente con i saggi IHC precedenti eseguiti utilizzando questi anticorpi (non mostrati).

Figure 1
Figura 1: Diagramma del flusso di lavoro di colorazione.
Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Sviluppo monoplex.
(A) Scivolo di cancro del colon con FOXP3 nella posizione 1. (B) Scivolo del cancro del colon con FOXP3 nella posizione 2. (C) Scivolo del cancro del colon con FOXP3 nella posizione 3. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Successi e insidie di monoplex e multiplex.
(A) Saggio monoplex del cancro primario del colon con FOXP3 nella posizione 3, mostrata l'etichetta di intensità fluorescente. (B) Ranini multiplex del cancro primario del colon con FOXP3 nella posizione 3 e CD3 nella posizione 2. (C) Test monoplex del cancro primario del colon con FOXP3 nella posizione 1, mostrata l'etichetta di intensità fluorescente. (D) Ranto multiplex del cancro primario del colon con FOXP3 nella posizione 1 e CD3 nella posizione 2. (E) Analisi multiplex del cancro primario del colon con ordine di anticorpi come segue: CD8 (giallo), CD3 (verde), CD163 (arancione), pancytokeratin (bianco), PD-L1 (magenta), FOXP3 (rosso), che lavora DAPI (blu). (F) Analisi multiplex del cancro primario del colon con ordine di anticorpi come segue: CD8 (giallo), CD3 (verde), CD163 (arancione), pancytokeratin (bianco), PD-L1 (magenta), FOXP3 (rosso), DAPI non funzionante (blu). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: sviluppo Multiplex.
(A) Scivolo multiplex di cancro del colon in un multiplex a 7 colori. (B) Diapositiva vuota in un multiplex a 7 colori con tessuto tumorale del colon. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Analisi della specificità di un multiplex a 7 colori.
(A) Immagine composita Multiplex con anticorpi come segue: CD8 (giallo), CD3 (verde), CD163 (arancione), pancytokeratin (bianco), Ki67 (rosso), DAPI (blu). (B) Patologia luminosa vista dell'immagine nel pannello A solo su CD3. (C) Patologia luminosa vista dell'immagine nel pannello A su CD163 solo vista. (D) Immagine composita Multiplex con anticorpi come segue: CD8 (giallo), CD3 (verde), CD163 (arancione), pancytokeratin (bianco), PD-L1 (magenta), FOXP3 (rosso), DAPI (blu). (E) Patologia luminosa vista dell'immagine nel pannello D solo sulla vista CD3. (F) Patologia luminosa vista dell'immagine nel pannello D solo sulla vista CD163. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

I campioni di tessuto intatti della biopsia tumorale solida e della resezione chirurgica rimangono importanti strumenti diagnostici e predittivi per l'analisi della malattia e la prognosi del paziente. L'immunohistochimica fluorescente multiplex (mfIHC) è una nuova tecnica che combina i benefici dell'immunostochimica (IHC), l'immunofluorescenza (IF) e la citometria di flusso. Precedenti metodi per sondare le cellule in situ hanno permesso la valutazione delle disposizioni da cellula a cellula in un ambiente tissutale8, tuttavia, il basso numero di epitopi che possono essere sondati limita l'analisi complessa. La citometria di flusso, sebbene utile nell'analisi di molti tipi di cellule in un campione, perde il contesto spaziale in virtù della preparazione di campioni come una singola sospensione cellulare9,10. mfIHC collega queste tecniche mantenendo il contesto spaziale del microambiente cellulare e aumentando il numero di epitopi che possono essere etichettati amplificando il segnale per epitopo etichettato11. Ricerche precedenti hanno utilizzato mfIHC per fenotipizzazione dell'infiltrato cellulare nel cancro e campioni di tessuto non-cancro1,2,3,4,5,15. L'analisi post-immagine è stata utilizzata anche per analizzare le relazioni spaziali di cellule e strutture all'interno del microambiente tissutale1,2,4. Per un'analisi affidabile, deve prima essere prodotta un'immagine specifica e accurata. La tecnica di colorazione manuale, a differenza di un sistema di colorazione automatizzato, consente ai laboratori più piccoli e attenti ai costi di accedere a questa tecnologia. I tempi di ottimizzazione e i tempi di colorazione sono tra le maggiori barriere al raggiungimento di un'immagine affidabile per un'ulteriore analisi spaziale.

Diverse regole generali aumentano la probabilità di una generazione di successo di un'immagine multiplex composita affidabile e consentono di risparmiare tempo e risorse. Gli anticorpi da utilizzare nel multiplex devono essere scelti in base al successo con l'IHC convenzionale manuale. I buffer di recupero dell'antigene con pH 6 e pH 9 devono essere utilizzati per IHC al fine di esaminare il recupero dell'antigene appropriato per l'uso nel multiplex. Lo sviluppo monoplex è necessario per identificare il posizionamento degli anticorpi all'interno del protocollo di multiplexing. La logica per questo è complicata e varia tra campioni di tessuto ed epitopi. In alcuni casi, l'epitopo può degradarsi con più passaggi di microwaving e la visualizzazione dei marcatori viene persa, come spesso accade con il CD3. FOXP3, tuttavia, diventa più luminoso con passi più microonde ed è appena visibile se posizionato al primo o al secondo round di multiplex13,14.

Il processo di colorazione inizia con il taglio del tessuto FFPE su vetrini caricati. Il primo problema che può essere incontrato è il tessuto che cade fuori dal vetrino dopo microwaving. Quando i vetrini caricati non vengono utilizzati, l'aderenza del tessuto alla superficie del vetro è limitata e il tessuto avrà un'eccessiva piegatura o potrebbe scivolare completamente. Per garantire ulteriormente che il tessuto aderisca ai vetrini durante il processo di colorazione, vengono eseguite diverse tecniche. In primo luogo durante il taglio dei blocchi sugli scivoli, la forma più pura di acqua funziona meglio. Per alcuni laboratori, l'acqua deionizzata può essere sufficiente, ma l'acqua distillata ha funzionato meglio. I vetrini devono essere essiccati piatti subito dopo il taglio a 37 gradi durante la notte. Per garantire ulteriormente l'aderenza, i vetrini vengono poi collocati in un forno di ibridazione e cotti a 60 gradi per un'ora appena prima dell'uso. Sebbene la fissazione della formalina sia già avvenuta durante il processo iniziale di preparazione dei tessuti, l'inserimento dei vetrini in formalina neutra tampografata per 30 min dopo il processo di deparaffinazione e reidratazione migliora l'integrità strutturale del tessuto1,13.

Il processo di colorazione manuale può richiedere fino a tre, 8 ore al giorno a seconda del numero di anticorpi utilizzati. Evitare le insidie è essenziale per risparmiare tempo e risparmiare reagenti. Il primo errore comune si verifica spesso nella preparazione del reagente. L'acqua differisce tra i laboratori e può essere l'unica differenza nei risultati da un laboratorio all'altro. L'utilizzo della stessa e di una fonte di acqua pulita per tutte le reazioni e i reagenti garantisce un risultato costante. Gli anticorpi, la soluzione di blocco e i fluorofori funzionano meglio a temperatura ambiente. Per evitare insidie nella preparazione del reagenti e della soluzione di lavoro, utilizzare la stessa acqua per tutti i reagenti. Utilizzare anche tutte le soluzioni di lavoro e reagenti a temperatura ambiente.

La risoluzione dei problemi di mfIHC è importante e l'adesione a rigide linee guida di laboratorio cruciali per limitare la contaminazione dei componenti e/o l'errore dell'operatore. La produzione di immagini non ottimali distorcerà i risultati e porterà a popolazioni di cellule false positive e negative che possono avere un impatto negativo sui dati. Poiché l'analisi finale include in genere fenotipi generati dal computer basati sull'apprendimento automatico, piccoli errori di colorazione possono essere ingranditi per influire sull'intero set di dati. Ad esempio, anche se tutte le macchie possono funzionare perfettamente, un errore o un'omissione di DAPI impedirà la segmentazione futura delle cellule e il conteggio rendendo l'esperimento inutile. Il software di analisi utilizza la colorazione DAPI non solo per identificare le celle, ma assegna le coordinate x e y a ogni cella e se il multiplex ha dim, scarsamente circoscritto, o diffusa colorazione DAPI, l'immagine non può essere ulteriormente utilizzata e il multiplex deve essere rifatto o tentato salvataggio e ri-colorazione di DAPI. L'uso di componenti software come la patologia e le viste luminose migliorerà la fiducia nella sensibilità e nella specificità nelle prime fasi del processo di ottimizzazione ed eviterà errori nelle prime fasi del processo multiplex.

Gli aspetti di modifica del processo di imaging possono anche aiutare nell'ottimizzazione delle immagini. Ad esempio, l'acquisizione di un'immagine tramite DAPI come aiuto visivo per la messa a fuoco consente di evitare immagini sfocate. L'aggiunta della libreria di fluorofori appena realizzata al software garantirà un'immagine pulita e una minore sovrapposizione spettrale di ogni fluoroforo durante la fase di analisi e l'utilizzo della diapositiva vuota per estrarre l'autofluorescenza intensifica i marcatori e migliora l'immagine qualità.

L'uso di campioni di tessuto ha e rimarrà uno strumento essenziale per studiare la fisiopatologia della malattia. La tecnologia emergente ha accresciuto la nostra comprensione delle interazioni tra cellule e mfIHC è un nuovo promettente giocatore. L'ottimizzazione e la precisione durante il processo di colorazione in questa tecnica è fondamentale per un corretto utilizzo e un'ulteriore analisi delle interazioni cellula-cellula.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori desiderano ringraziare Ed Stack, precedentemente di Perkin Elmer, per la sua assistenza con l'impostazione e l'ottimizzazione della colorazione multiplex originale. Gli autori desiderano anche ringraziare Kristen Schmidt di Akoya Biosciences per suggerimenti sull'utilizzo del software di analisi. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dal National Cancer Institutes of Health sotto il premio numero P30CA046592, K08CA201581(tlf), K08CA234222 (js), R01CA15158807 (mpm), RSG1417301CSM (mpm), R01CA19807403 (mpm), U01CA22414501 (mpm, hc), CA170568 (hc). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali dei National Institutes of Health. Un ulteriore sostegno è stato fornito da Jeffery A. Colby Colon Cancer e Tom Liu Memorial Research Funds.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100% ethanol Fisher HC8001GAL
70% ethanol Fisher HC10001GL
95% ethanol Fisher HC11001GL
Analysis software Akoya Biosciences CLS135783 inForm version 2.3.0
Antifade mountant ThermoFisher P36961 ProLong Diamond
Blocking solution Vector SP-6000 Bloxall
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Life Sciences A9647-100G
Cover Slips Fisher 12-548-5E
Delicate task wipe Kimberly-Clark 34120
Fluorescent diluent Akoya Biosciences ARD1A01EA Opal TSA diluent
Fluorophore 520 Akoya Biosciences FP1487001KT 1:100
Fluorophore 540 Akoya Biosciences FP1494001KT 1:100
Fluorophore 570 Akoya Biosciences FP1488001KT 1:100
Fluorophore 620 Akoya Biosciences FP1495001KT 1:100
Fluorophore 650 Akoya Biosciences FP1496001KT 1:100
Fluorophore 690 Akoya Biosciences FP1497001KT 1:100
Fluorophore DAPI Akoya Biosciences FP1490 3 drops in TBST or PBS
Heat resistant box Tissue-Tek 25608-904 Plastic slide box-green
Humidified Chamber Ibi Scientific AT-12
Hybridization oven FisherBiotech
Hydrophobic barrier pen Vector H-4000 ImmEdge
Microscope Perkin Elmer CLS140089 Mantra quantitative pathology workstation
Microwave Panasonic NN-A661S with inverter technology
Neutral buffered formalin Fisher Scientific SF100-4 10% neutral buffered formalin
pH 6 antigen retrieval buffer Akoya Biosciences AR600 AR6
pH 9 antigen retrieval buffer Akoya Biosciences AR900 AR9
Phosphate buffered saline Fisher BP3994 PBS
Plastic slide box Tissue-Tek 25608-906
Plastic wrap Fisher NC9070936
Polysorbate 20 Fisher BP337-800 Tween 20
Primary antibody CD163 Lecia NCL-LCD163 1:400
Primary antibody CD3 Dako A0452 1:400
Primary antibody CD8 Spring Bio M5390 1:400
Primary antibody FOXP3 Dako M3515 1:400
Primary antibody pancytokeratin Cell Signaling 12653 1:500
Primary antibody PD-L1 Cell Signaling 13684 1:200
Secondary antibody Akoya Biosciences ARH1001EA Opal polymer
Slide stain set Electron Microscopy Sciences 6254001
Tris buffered saline Corning 46-012-CM TBS
Vertical slide rack Electron Microscopy Sciences 50-294-72
Xylene Fisher X3P1GAL

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References

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