Author Produced

הערכה של נזק חמצוני בעכבר הראשי פני השטח העינית/תאים גזע בתגובה אולטרה סגול (UV-C) נזק

* These authors contributed equally
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

פרוטוקול זה מדגים את הזיהוי הסימולטני של מינים חמצן תגובתי (ROS), תאים חיים, ותאים מתים בתרבויות הראשיות חי מפני העכבר משטח העינית תאים. 2 ', 7 '-diלורופלוט אצטט, propidium יודיד, וכתמים הופסט משמשים כדי להעריך את רוס, תאים מתים, ותאים חיים, בהתאמה, ואחריו הדמיה וניתוח.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Bose, B., Kapoor, S., Sen, U., Nihad AS, M., Chaudhury, D., Shenoy P, S. Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage. J. Vis. Exp. (156), e59924, doi:10.3791/59924 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

משטח העינית נתון לבלאי רגיל ולקריעה בשל גורמים סביבתיים שונים. חשיפה לקרינת UV-C מהווה סיכון בריאותי תעסוקתי. כאן, אנו להדגים את החשיפה של תאי גזע ראשוני מן העכבר העינית משטח לקרינת UV-C. מינים חמצן תגובתי (ROS) היווצרות היא הבדיקה של היקף לחץ חמצוני/נזק. ב ניסיוני בקביעת חוץ גופית, זה חיוני גם כדי להעריך את אחוז התאים המתים שנוצרו עקב לחץ חמצוני. במאמר זה, אנו נדגים את 2 ', 7 '-Diלורוofluorescl (DCFDA) כתמים של UV-C חשוף העכבר הראשי משטח העינים הפנים בתאי גזע ואת הקוונפיקציה שלהם מבוסס על תמונות פלורסנט של DCFDA כתמים. DCFDA מכתים ישירות מתאים לדור ROS. אנו גם להדגים את הקוונפיקציה של תאים מתים וחיים על ידי מכתים בו זמנית עם propidium יודיד (PI) ו Hoechst 3332 בהתאמה ואת אחוז DCFDA (ROS חיוביים) ו PI חיובי תאים.

Introduction

המשטח העינית (OS) היא יחידה תפקודית המורכבת בעיקר של השכבה החיצונית epithelia של קרנית, בלוטת la, בלוטת מייבואן, לחמית, חלק משולי מכסה העין ו innervations שינוי אותות1. שכבת הקרנית בצורת הכיפה השקופה מתמקדת באור על הרשתית. זו רקמה נמק העצם מורכב מרכיבים סלולריים כגון תאים אפיתל, keratocytes, ותאי האנדותל ורכיבים acellular כגון קולגן ו גליקוזנוגליקנים2. האזור מנוקז על ידי דמעות כי גם לספק את רוב החומרים המזינים. המיקום האנטומי של מערכת ההפעלה מאלץ אותו להיות במגע ישיר עם הסביבה החיצונית, לעתים קרובות חושף אותו לרכיבים קשים שונים כגון אור בוהק, חיידקים, חלקיקי אבק וכימיקלים. גורם זה מקדם את מערכת ההפעלה לפציעות פיזיות והופך אותו לנוטה למחלות שונות.

מתח חמצוני נגרמת בשל הdisequilibrium בין הייצור של מינים חמצן תגובתי (ROS) ואת נוגדי חמצון מנגנוני ההגנה האנדודוגני3. ROS מסווגים מולקולות תגובתי ורדיקלים חופשיים, שניהם נגזרים מחמצן מולקולרי (O2) באמצעות זרחון חמצוני מיטוכונדרילציה4. הקבוצה הקודמת מורכבת ממינים לא רדיקלים כגון מי חמצן (H2o2), סינגתן חמצן (1o2) והשני כולל מינים כגון סופראוקסיד אניונים (O2-), ו רדיקלים הידרוקסיל (או), בין היתר. מולקולות אלה הן על ידי-מוצרים של תהליכים סלולריים נורמליים התפקידים שלהם היו מעורבים פונקציות פיזיולוגיות חשוב כגון התמרה אותות, ביטוי גנים, והגנה מארחים5. ייצור משופר של ROS ידוע להיווצר בתגובה לגורמים כגון הפלישה הפתוגן, xenobiotics, וחשיפה אולטרה סגול (UV) קרינה4. זה ייצור יתר של ROS תוצאות לחץ חמצוני שמוביל לנזק של מולקולות כגון חומצות גרעין, חלבונים, ושומנים6.

אור השמש הטבעי, המקור השולט ביותר של קרינת UV, מורכב UV-A (400 – 320 nm), UV-B (320 – 290 nm), ו-UV-C (290 – 200 ננומטר)7. דווח על קורלציה הפיכה בין אורך הגל לבין האנרגיות הספקטרליות. למרות קרינה UV-C טבעי נספג על ידי האטמוספירה, מקורות מלאכותיים כגון מנורות כספית ומכשירי ריתוך פולטים, ולכן, מהווים סיכון מקצועי. תסמינים של חשיפה לעיניים כוללים פוטוקרטיטיס ו פוטוקראטודלקת הלחמית8. הפקה של ROS הוא אחד המנגנונים העיקריים של גרימת נזק לתאי UV המושרה9. במחקר הנוכחי, אנו מדגימים את הזיהוי של ROS באמצעות 2 ', 7 '-Diכלור דיהידרוטסטוסטרון diאצטט (DCFDA) הצביעת שיטה העכבר הראשי משטח עינית העין/תאי גזע חשופים UV-C. הזריחה הירוקה נתפסה. בעזרת מיקרוסקופ פלורסנט תאים היו מוכתם נגד שני צבעים, Hoechst 33342 ו אדום propidium יודיד, כדי להכתים את התאים חי ומת, בהתאמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הניסוי בוצע על התאים העינית העיקרי/תאי גזע נגזר עין העכבר השוויצרי לבקן. השימוש בבעלי חיים למסיק העיניים לניסוי זה אושר על ידי הוועדה המוסדית של בעלי החיים המוסדיים, Yenepoya (הנחשבת לאוניברסיטה) (מספר אישור IEAC, 6a/19.10.2016).

1. ההכנות של ריאגנטים

הערה: הנגזרת של תאים ראשוניים/תאי גזע ממשטח העינית של העכבר הוא מעבר לטווח של פרוטוקול זה. מכאן, אנו מדגימים את מינונים החשיפה UV-C, הכנה מגיב להערכת ROS, תאים חיים ומתים הכמת שלהם. נא להפנות לטבלה 1 עבור הכרכים המתאימים של ריאגנטים (10% סרום בפרה העוברי, Dcfda, Hoechst ו propidium יודידה פתרונות מניות להתווסף להשגת פתרון הצביעת הסופי).

  1. להכין פתרון מניות של 10 מ"מ מילימטר DCFDA על ידי המסת 25 מ"ג של אבקת DCFDA ב 5.13 mL של DMSO. Aliquot 250 μL כל אחד בצבע ענבר 1.5 mL וחנות ב-20 ° c.
  2. הכנת פתרון מניות של 10 מ"ג/mL (16.23 mM פתרון) Hoechst 33342 על ידי המסת התוכן כולו של 25 מ"ג בקבוקון ב 2.5 mL של מים מוהים. להפוך ali, ts של 100 μL בצינורות מיקרוצנטריפוגה בצבע ענבר ולאחסן ב 2-6 ° צ' עבור עד 6 חודשים. לאחסון ארוך טווח, חנות ב-20 ° c.
  3. הכנת פתרון מניות של 1 מ"ג/mL propidium יודיד במים מיוהים, סדרת מחלקים 1 mL כל אחד בצבע ענבר 1.5 ml, ולאחסן ב 4 ° c.

2. ציפוי תאים וקרינת UV-C

  1. לפני ציפוי, לנתק את העכבר העיקרי העין תאים העין מבודדים במעבדה שלנו (תוצאות שלא פורסמו; תאים כאלה הם תערובת של אפיתל הקרנית, מסטרומה תאים ו keratocytes) באמצעות סוכן הדיסוציאציה של התא עדין (טבלת חומרים).
  2. צלחת 0.2 x 106 משטח העכבר הראשי העינית תאים ב 35 mm 0.2% מרתף קרום מטריצות מטריקס מצופה תאים מנות התרבות 2.5 mL של מדיה שלמה. המלון משלב בין לילה ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% ומחולל חממה.
    הערה: מדיה מלאה עבור תאים ראשוניים של culturing מפני השטח העינית של העכבר מורכב גלוקוז גבוה המכיל 20% FBS, 1% עט-דלקת, 1% גלוטמקס, 1% חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA), 1% נתרן פירובט, ו 0.1% β-mercaptoethanol.
  3. לפני חשיפת התאים למינונים שונים של UV-C, למחוק את הנפח המרבי של מדיה ולאפשר רק שכבה דקה של מדיה (~ 500 μL) כדי להישאר בקשר עם התאים, רק מספיק כדי לכסות אותם.
  4. קח את הכלים, אחד בכל פעם אל המקור/תא UV-C (החדר התחתון של תנור הכלאה/מקשר צלב UV; טבלה של חומרים). מניחים את הצלחת לתוך החדר ולהסיר את המכסה של המנה. מיקום המכסה הפתוח של המנה מבטיח כי התאים יקבלו את המינון UV-C המקסימלי במהלך החשיפה UV-C.
  5. לחשוף את התאים ציונים שונים/מינונים של UV-C: 1 J/m2, 100j/m2, 1,000 j/m2 ו 10,000 J/m2.
  6. לאחר החשיפה UV-C, להחליף את המכסה של כל אחד מהמנות מיד ולהסיר אותם מהתא מקור UV-C.
  7. הביאו את כל הכלים למכסה האוויר המבינארי ולמעלה כל אחת מהמנות עם 2 מ ל של מדיה טרייה מלאה.
  8. מודאת התאים במשך 3 שעות בחממה 37 ° c ושות2 . שלוש שעות של הדגירה לאחר החשיפה UV-C הוא אופטימלי להמחיש ולכמת את ההשפעות המוקדמות.

3. הכנת מדיה לצביעת תאים בשידור חי

  1. הכינו את מדיית הצביעת טרי במהלך 15 הדקות האחרונות של 3 שעות הדגירה של התא הפוסט UV-C חשיפה.
  2. טרום חם 10 מ ל של מדיה הצביעת המכיל 10% FBS-DMEM שיושלם עם 1% עט-דלקת עד 37 ° c.
  3. הוסף 5 μL של 10 מ"מ מילימטר DCFDA; 5 μL של 10 מ"ג/mL הפתרון וה200 μL של 1 מ"ג/mL propidium יודיד. ריכוזי הסופי של DCFDA, Hoechst ו-PI הם 5 μM, 5 μg/mL ו -20 μg/mL, בהתאמה, ב 10 מ ל של צביעת מדיה.

4. DCFDA כתמים של UV-C חשופים העכבר הראשי העינית

  1. לאחר 3 שעות של דגירה של UV-C חשופים העכבר הראשי בתאי העינית במינונים שונים, מרוב המדיה של 35 mm מנות.
  2. לחדש עם 2 מ ל של המוכן מחדש DCFDA לצביעת כל הכלים בעדינות מהצדדים.
  3. דגירה את התאים עם מדיה הצביעת עבור 15 דקות בחושך בתוך 37 מעלות צלזיוס ° c2 בחממה לצביעת תא חי.

5. צפייה של DCFDA (ROS), הופסט ו-PI תאים ויטראז '

  1. לאחר השלמת הדגירה, למחוק את המדיה הצביעת.
  2. הוסף מדיה מלאה טרי לתאים ולהתבונן התאים תחת מיקרוסקופ פלורסנט הפוכה/תא צמידה (טבלת חומרים). צלם את השדות הרצויים: שדה בהיר, זריחה כחולה, זריחה אדומה, זריחה ירוקה.
    הערה: התאים הכחולים ויטראז ' כחול הם גרעינים, הזריחה הירוקה היא עבור התאים מייצרים ROS ואת הזריחה אדום מציין את PI חיובי תאים מתים.

6. הכמת של תאים מוכתמים (הושע-כחול, PI-מת וירוק-רוס) באמצעות טכניקות דימות

  1. לייצא את התמונות שנתפסו תחת מיקרוסקופ פלורסנט הפוכה/תא צמידה כדי imagej עבור כימות.
  2. פתח כל אחד מהתמונות בכל פעם, באמצעות כל ערוץ (כלומר, כחול (גרעינים/הואכסט), ירוק (רוס), אדום (מת/PI חיובי)) ברצף, לספירה. התחל מהפקד שלא נחשף באופן רציף לעבור 1, 100, 1,000 ו 10,000 J/m-2.
  3. ספירת התאים באמצעות כלי ספירת התאים המסומנים כצלב בתפריט התוכנה עבור כל אחד מהשדות [כחול חיובי (hoechst חיובי; גרעינים), אדום חיובי (PI חיובי; תאים מתים); ירוק חיובי (רוס)] בכל אחת מהתמונות המתאימות לכל אחד מ טיפולים.
  4. ספירה על-ידי לחיצה על כל אחד מהאותות הספציפיים בכל אחד מהשדות. לדוגמה, לחיצה על הגרעינים הכחולים/Hoechst ויטראז ' תעניק את המספר הכולל של גרעינים בשדה נתון.
  5. לחשב את התוצאות כאחוז של מוות התאים על ידי נזק UV (מספר תאים חיוביים של PI x 100 מחולק על ידי מספר תאים חיוביים hoechst) ואת אחוז הייצור של רוס על ידי נזק UV (מספר של dcfda התאים החיוביים x 100 מחולק על ידי מספר תאים חיוביים הואכסט).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

DCFDA הוא צבע חסר צבע כי הוא צורה כימית מופחתת של fluorescein המשמש כאינדיקטור לגילוי ROS בתאים. צבע זה מקבל לכוד בתוך תאים והוא תחמוצת בקלות כדי פלורסנט diכלור דיהידרוטסטוסטרון (DCF), אשר פולט זריחה ירוקה. ניתן לזהות את הקרינה הפלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט. התאים יכולים להיות דמיינו ומתואם עם הצטברות ROS כדלקמן: (אני) לחיות תאים ללא רוס פולטים זריחה כחולה גבוהה; (ii) תאים חיים עם הצטברות של ROS פולטים זריחה כחולה גבוהה עם פלואורסצנטית ירוק נמוך; ו (iii) תאים מתים עם הצטברות של ROS פולטים זריחה כחולה נמוכה עם זריחה גבוהה אדום גבוה וירוק.

בקרת תאים ותאים חשופים 1 J/m2 של UV-C לא הוצג dcfda/ROS ו PI תאים חיוביים. ה-UV-C הבקרה חשוף הראה מכתים גרעיני רק כפי שצוין על ידי כתמים הופסט (איור 1). עם זאת, לא התאים החיוביים של PI או DCFDA נראו בתאי הבקרה הבלתי חשופים של UV-C (איור 1).

תאים חשופים 100 J/m2 של UV-C הציג נמוך ROS ו-PI תאים חיוביים. התאים הראשוניים מהמשטח של העכבר העינית בעת חשיפה UV-C במינון של 100 J/m2 הראה על 5% שיתוף כתמים של dcfda ו-PI, ובכך, המציין את היווצרות של רוס ומוות התא ב 5% התאים (איור 1).

תאים שנחשפו 1,000 J/m2 של UV-C הציגו 60% – 70% ROS ו-PI תאים חיוביים. התאים הראשוניים מהמשטח העינית של העכבר בעת חשיפה ל-UV-C במינון של 1,000 J/m2 הראו על 70% שיתוף כתמים של dcfda ו-PI, ובכך, המציין את היווצרות של רוס ומוות התא ב 70% של התאים (איור 1).

תאים חשופים 10,000 J/m2 של UV-C הציגו 100% ROS תאים חיוביים ~ 100% תא מוות. המינון הגבוה ביותר UV-C (10,000 J/m2) כאשר נחשף התאים הראשי העינית העכבר הביא 100% תא מוות (PI תאים חיוביים) ו-ROS היווצרות (dcfda כתמים), ובכך לציין את הרמה הגבוהה ביותר של מינון UV-C מסוים (איור 1).

תאים שטופלו עם 1 J/m2 של קרינת UV-C לא הראו כל הצטברות של ROS ואת אחוז התאים החיים במינון זה היה דומה לזה של תאי הבקרה. תאים הפגינו כמות משמעותית של מוות תאים ו-ROS הצטברות ב 100 J/m2. הכמות הגבוהה ביותר של הצטברות ROS ו מוות התאים נצפתה בתאים שטופלו עם 10,000 J/m2 של קרינת UV-C.

תוצאות הספרות (אחוז הדור של רוס ואחוז המוות של התאים לפי השניתנו לפי סעיף 6.3) הותוו בצורת גרף עמודות (איור 2). ציר ה-X מייצג את מנות UV-C בעוד שציר Y מייצג את אחוז התאים. הבר הירוק מייצג את אחוז ה-ROS, והסורגים האדומים מייצגים את מוות התאים במינונים שונים של קרינת UV-C (איור 2). אחוז ה-ROS והתאים המתים היו הסדר של 0%, 0%, 10%, 70% ו 100% ב-UV-C מינונים: שליטה בלתי נחשפת, 1 J/m2, 100 j/m2, 1,000 j/m2 ו-10,000 j/m2, בהתאמה (איור 2).

Figure 1
איור 1: תמונות מרוכבות לחיות בתאים של העכבר משטח העינית הראשי חשופים מינונים שונים של UV-C (בקרה לא חשוף, 1, 100, 1,000, 10,000 J/m2). תמונות אלה נלכדו תחת מסננים שונים: בהיר-שדה (עבור מורפולוגיה תא), כחול (כתם גרעיני הופסט), ירוק (הדור רוס) ו אדום (propidium יודיד תאים מתים מוכתם). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תרשימי בר המראים את תוצאות הקוונפיקציה שהתקבלו לאחר חישוב אחוז הדור של רוס ואחוז של תאים מתים על חשיפה של תאים ראשוניים של העכבר משטח העינית למינונים שונים של קרינת UV-C. ציר ה-X מייצג את מינון ה-UV-C, ואילו ציר Y מייצג את אחוז התאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

רכיב אמצעי אחסון
10% סרום של שור עוברי המכיל DMEM 9790 מיקרומטר
פתרון מניות DCFDA 5 מיקרומטר
הואכסט 33342 פתרון מניות 5 מיקרומטר
פתרון מלאי Propidium יודיד 200 מיקרומטר

שולחן 1: ריאגנטים נדרש להכנת פתרון הצביעת.

עיה סיבות סבירות פתרון בעיות ערות
לא או הקטן מאוד ROS או תאים חיוביים מוכתם כאשר התאים טופלו עם גבוה למינון UV הגבוהה ביותר i. שימוש בפתרון מכתים ישן. i. השתמש בפתרון כתמים טרי מוכן. i. מוקדם יותר הכין הפתרון מוביל לצביעת לא תקין של התאים.
ב. צלחת התרבות המוקונשוטפת הנובעת מחילוץ נזק של UVC על-ידי התאים. ii. לוחית בלבד 200,000 תאים בכל מאכל 35 mm לתרבות התא ולעולם לא לאפשר לתאים לגדול יותר 12 h לפני חשיפת אותם מינונים UVC. ii. תאים Overconfluent יכול להציל של נזק UVC, ולכן לא או ROS קטנים תאים חיוביים ו-PI יהיו דמיינו.

טבלה 2: פתרון בעיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

The DCFDA הצביעת השיטה המתוארת כאן מאפשר ויזואליזציה של ROS בתוך העכבר הראשי העינית לחיות תאים מטופלים עם קרינת UV-C. היתרון של שיטה זו מכתים הוא גם מאפשר לחוקרים ללמוד את ההשפעות המיידיות של UV-C (3 שעות לאחר חשיפה UVC) על התאים החיים ואת הספירה הסימולטני שלהם עבור אחוז של ROS חיובי, כמו גם, תאים מתים. יתר על כן, כמו שיטת הצביעת משמש על התאים החיים, התאים יכולים להיות מודבטים עוד באותו מדיה במשך זמן רב יותר (מספר ימים) למחקר של השפעות מושהית של קרינת UV-C. מכאן, זו שיטה מכתים מאפשר להמחיש את הדור רוס (ירוק) ובמקביל להבחין את החיים, האפוטוטיים ואוכלוסיות המתים תאים בחיים בתוך מיקרוסקופ הפוך פלואורסצנטית. עם זאת, בנסיבות מסוימות, למרות הציפייה להשיג את התאים החיוביים של רוס חיובי ו-PI, ההדמיה יכול להיכשל. עבור מקרים כאלה, פתרון בעיות מוצע (טבלה 2).

פרוטוקול זה חייב להתבצע באופן מדויק כדי להשיג תוצאות אופטימליות. תוצאות אופטימליות מצביעים על מתאם של אות פלורסנט ירוק נפלט/רוס שנוצר כבדיקה מדויקת של המינון הספציפי UV-C המושרה נזק DNA. במילים אחרות, עבור ביצוע שלב זה, את נפח התקשורת הנמצא במגע עם התאים במהלך החשיפה UV-C לא צריך להיות כל כך הרבה, כך מינון UV-C לא מצליח להפיק את הנזק הנדרש. מכאן, זה חיוני כדי לשמור על נפח מינימלי של מדיה, לומר 500 μL לכל 35 מ"מ מנה, רק מספיק כדי לכסות את התאים במהלך החשיפה UV-C בכל המינונים שצוינו. שנית, נפח המדיה לא צריך להיות כל כך קטן כי התאים להתייבש במהלך חשיפה UV-C. לבסוף, מיד לאחר החשיפה של התאים UV-C, התאים צריכים להיות מכוסה עם מדיה טרייה לכרך האופטימלי (לומר 2 מ ל), כדי למנוע עוד להימנע כל נזק ו-ROS דור.

מגבלה אחת של טכניקה זו היא סוג של ROS שנוצר. בחני נוספים אחרים יש לבצע כדי לזהות את הסוג הספציפי של ROS בתגובה לטווחים המינון UV-C. כגון מוסר כולל את ההערכה של רדיקלים תאיים הידרוקסיל (או), קיצוניים סופראוקסיד רדיקלים, מינים חנקן מגיב תאיים, רדיקלים הידרוקסיל מיטוכונדריאיל, מיטוכונדרילי על-תחמוצת מימן, מי חמצן בתאים חיים באמצעות ערכות זמינות מסחרית. הגבלה נוספת של טכניקה זו היא הפרשנות של הדור אחוז רוס במינונים מתחת 10 J/m2 ומעלה 10,000 J/m2. ככל הנראה, התאים החיוביים של ROS היו גלויים כאשר התאים העיקריים/תאי גזע מן העכבר משטח עינית נחשפו למינונים UV-C פחות מ 10 J/m2. להיפך, 100% ROS תאים חיוביים היו גלויים כאשר התאים נחשפו למינון UV-C מעל 10,000 J/m2. לפיכך, בחני אחרים (למשל, ניתוח אנזימים, מדידה של סמנים לחץ חמצוני כגון 8-hydroxydeoxyguanosine (8-ohdg) (סמן נזק dna), וניתוח כתמי המערבית של נזק לחלבונים dna במינונים שונים) עשוי להיות שימושי כדי להבין את המידה/סוג של נזקים סלולריים/מולקולריים ברמות שונות. הגבלה שלישית של טכניקה זו היא הקורלציה של מינונים UV-C ל-ROS שנוצר על פני סוגי תאים שונים. . צריך לוודא את זה

כיום, DCFDA ערכות זמינים מסחרית לאיתור ROS באמצעות מיקרוסקופ או זרימה cy,מנסה 10,11. עם זאת, ערכות כאלה יקרות ולא ניתן לקבל על ידי מעבדות מחקר במדינות מוגבלות משאבים. מכאן, פרוטוקול זה הוא מאוד שימושי עם יעילות הדומה לשיטות שנמכרו מסחרית. שנית, יש לנו שילב את הכתם תא מת propidium יודיד יחד עם הדור DCFDA/ROS. מכאן, ניטור התא לחיות של התאים החיוביים והמתים של ROS יכול להתבצע בו באמצעות שיטה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

מחברים קיבלו תמיכה מימון ביו-רד מעבדות הודו פרטית מוגבלת עבור המממן את המאמר.

Acknowledgments

המחברים מכירים בתמיכה ממרכז המחקר יאנפויה, יאנפוייה (באוניברסיטה) עבור מתקני התשתית הקונסטרוקטיבית.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2',7'-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA) Sigma D6883 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate is fluorogenic probe and is permeable to cells. It is used for quantification of reactive oxygen species.
Cell culture dish (35 mm) Eppendorf SA 003700112 Sterile dishes for culturing the cells.
DMEM High Glucose HiMedia AT007 Most widely used cell culture media, contains 4500 mg/L of glucose.
Fetal Bovine Serum, EU Origin HiMedia RM99955 One of the most important components of cell culture media. It provides growth factors, amino acids, proteins, fat-soluble vitamins such as A, D, E, and K, carbohydrates, lipids, hormones, minerals, and trace elements.
GlutMax Gibco, Thermo Fisher Scientific 35050061 Used as a supplement and an alternative to L-glutamine. It helps in improving cell viability and growth.
HL-2000 Hybrilinker UVP Hybridization oven/UV cross linker
Hoechst 33342 Sigma B2261 Hoechst stain is permeable to both live and dead cells. It binds to double starnded DNA irrespective of wether the cell is dead or alive.
Matrigel Corning Basement membrane matrix
MEM Non-Essential Amino Acids (100X) Gibco, Thermo Fisher Scientific 11140050 Used as a supplement to increase the cell growth and viability.
Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep) Gibco, Thermo Fisher Scientific 15140122 Penicillin and streptomycin is used to prevent the bacterial contamination in culture.
Propidium Iodide Sigma P4170 Fluorescent dye which is only permeable to dead cells. It binds with DNA and helps in distinguishing between live and dead cells.
TryplE Express Thermo Fisher Scientific Gentle cell dissociation agent
ZOE Fluorescent Cell Imager Bio-rad

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gipson, I. K. The ocular surface: the challenge to enable and protect vision: the Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48, (10), 4391-4398 (2007).
  2. Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmoogy. 66, (2), 190-194 (2018).
  3. Betteridge, D. J. What is oxidative stress. Metabolism. 49, (2), Suppl 1 3-8 (2000).
  4. Ray, P. D., Huang, B. W., Tsuji, Y. Reactive oxygen species (ROS) homeostasis and redox regulation in cellular signaling. Cell Signaling. 24, (5), 981-990 (2012).
  5. Nita, M., Grzybowski, A. The Role of the Reactive Oxygen Species and Oxidative Stress in the Pathomechanism of the Age-Related Ocular Diseases and Other Pathologies of the Anterior and Posterior Eye Segments in Adults. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3164734 (2016).
  6. Covarrubias, L., Hernandez-Garcia, D., Schnabel, D., Salas-Vidal, E., Castro-Obregon, S. Function of reactive oxygen species during animal development: passive or active. Developmental Biology. 320, (1), 1-11 (2008).
  7. Behar-Cohen, F., et al. Ultraviolet damage to the eye revisited: eye-sun protection factor (E-SPF(R)), a new ultraviolet protection label for eyewear. Clinical Ophthalmology. 8, 87-104 (2014).
  8. Izadi, M., Jonaidi-Jafari, N., Pourazizi, M., Alemzadeh-Ansari, M. H., Hoseinpourfard, M. J. Photokeratitis induced by ultraviolet radiation in travelers: A major health problem. Journal of Postgraduate Medicine. 64, (1), 40-46 (2018).
  9. de Jager, T. L., Cockrell, A. E., Du Plessis, S. S. Ultraviolet Light Induced Generation of Reactive Oxygen Species. Advances in Experimental Medicine and Biology. 996, 15-23 (2017).
  10. Degl'Innocenti, D., et al. Oxadiazon affects the expression and activity of aldehyde dehydrogenase and acylphosphatase in human striatal precursor cells: A possible role in neurotoxicity. Toxicology. 411, 110-121 (2019).
  11. Li, Z., et al. APC-Cdh1 Regulates Neuronal Apoptosis Through Modulating Glycolysis and Pentose-Phosphate Pathway After Oxygen-Glucose Deprivation and Reperfusion. Cellular and Molecular Neurobiology. 39, 123-135 (2019).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics