نموذج كالفاري لتكبير العظام في الأرنب لتقييم نمو العظام والأوعية الدموية الجديدة في مواد استبدال العظام

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

هنا نقدم بروتوكول جراحي في الأرانب بهدف تقييم مواد استبدال العظام من حيث قدرات تجديد العظام. باستخدام اسطوانات نظرة خاطفة ثابتة على جماجم الأرانب، والتوصيل العظمي، وosteoinduction، وتكوّن العظام والتكوين الأوعية الدموية الناجمة عن المواد يمكن تقييمها إما على الحيوانات الحية أو القتل الرحيم.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Marger, L., Barone, A., Martinelli-Kläy, C. P., Schaub, L., Strasding, M., Mekki, M., Sailer, I., Scherrer, S. S., Durual, S. Calvarial Model of Bone Augmentation in Rabbit for Assessment of Bone Growth and Neovascularization in Bone Substitution Materials. J. Vis. Exp. (150), e59976, doi:10.3791/59976 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

المبدأ الأساسي لنموذج كالفاريال الأرنب هو أن تنمو أنسجة العظام الجديدة عموديا على رأس الجزء القشري من الجمجمة. يسمح هذا النموذج بتقييم مواد استبدال العظام لتجديد العظام عن طريق الفم والوجه القحفي من حيث نمو العظام ودعم الأوعية الدموية الجديدة. مرة واحدة يتم التخدير الحيوانات والتهوية (التنبيب داخل الرغامى)، يتم مشدود أربع اسطوانات مصنوعة من كيتون الأثير متعدد الأثير (PEEK) على الجمجمة، على جانبي الغرز المتوسطة والإكليلية. يتم حفر خمسة ثقوب داخل النخاع داخل منطقة العظام المحددة من قبل كل اسطوانة، مما يسمح بتدفق خلايا نخاع العظام. يتم وضع عينات المواد في الاسطوانات التي يتم إغلاقها بعد ذلك. وأخيرا، يتم خياطة الموقع الجراحي، والحيوانات تستيقظ. يمكن تقييم نمو العظام على الحيوانات الحية باستخدام التصوير الميكروتومي. وبمجرد قتل الحيوانات، يمكن تقييم نمو العظام والأوعية الدموية الجديدة باستخدام التصوير المجهري، وعلم الأنسجة المناعية، والفلورة المناعية. وبما أن تقييم المادة يتطلب أقصى قدر من التوحيد القياسي والمعايرة، فإن النموذج الكالفاري يبدو مثالياً. والوصول سهل جدا، ويسهل المعايرة والتوحيد باستخدام اسطوانات محددة، ويمكن تقييم أربع عينات في وقت واحد. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام التصوير المقطعي الحي، وفي نهاية المطاف يمكن توقع حدوث انخفاض كبير في الحيوانات التي سيتم قتلها الرحيم.

Introduction

تم تطوير نموذج كالفاريل لتكبير العظام في التسعينات بهدف تحسين مفهوم تجديد العظام الموجه (GBR) في المجال الجراحي عن طريق الفم والوجه القحفي. المبدأ الأساسي لهذا النموذج هو زراعة أنسجة العظام الجديدة عموديا على رأس الجزء القشري من الجمجمة. وللقيام بذلك، يتم تثبيت مفاعل (مثل قبة التيتانيوم أو الاسطوانة أو القفص) على الجمجمة لحماية تجديد العظام الذي يتم بواسطة الكسب غير المشروع (على سبيل المثال، هيدروجيل، بديل العظام، وما إلى ذلك). مع المعونة من هذا النموذج،التيتانيوم أو أقفاص السيراميك 1،GBR الأغشية9 ،10، العوامل العظمية11،12،13،14،15،16،17، العظام الجديدة البدائل12و16و17و18و19و20و21و22و23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 أو تم تقييم آلية الأوعية الدموية الجديدة خلال عملية تجديد العظام30.

من وجهة نظر الترجمة، يمثل نموذج calvarial عيب جدار واحد التي يمكن مقارنتها بعيب الفئة الرابعة في الفك31. والهدف من ذلك هو زراعة عظام جديدة فوق منطقة القشرية، دون أي دعم جانبي من جدران العظام الذاتية. وبالتالي فإن النموذج صارم للغاية ويقيّم الإمكانات الحقيقية للموصل الرأسي للعظام فوق الجزء القشري من العظام. إذا كان النموذج الموضح هنا مخصص في المقام الأول لتقييم التوصيل العظمي في بدائل العظام، يمكن أيضا تقييم تكوين العظام و / أو الأوستيو، فضلا عن تكوين الأوعية الدموية1،2،3، 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ،14،15،16،17،18،19،20،21،22 ،23،24،25،26،27،28،29،30.

أساسا لأسباب أخلاقية وعملية واقتصادية، تم تطوير نموذج calvarial في الأرنب الذي التمثيل الغذائي للعظام والهيكل هي ذات الصلة تماما بالمقارنة مع الإنسان32. من بين 30 مرجعاالمذكورة أعلاه، 80٪تستخدم نموذج كالفاريال الأرنب 1،8 ,9,10,11,12,13,14,15,17,22, 23،26،27،28،29،30،33،مما يدل على أهمية هذا النموذج الحيواني. في 2008, [بوسّنلشنر] نقل المجموعة النموذج [كلفريل] إلى الخنزير, أن يسمح المقارنة من ثمانية عظمة بدائل في وقت واحد20 (يقارن إلى اثنان عظم ة بديلة مع الأرنبة). من ناحية أخرى، نقلت مجموعتنا نموذج الأرنب كالفاريال إلى الأغنام. وباختصار، تم وضع قباب التيتانيوم على جماجم الأغنام لتوصيف التوصيل العظمي لبديل عظام جديد مطبوع ثلاثي الأبعاد. هذه الدراسات سمحت لنا بتطوير وإتقان نموذج الكالفارية وتحليلها16،21.

وذكرت الدراسات الثلاث الأخيرة16،20،21، جنبا إلى جنب مع العديد من التحقيقات الأخرى12،17،18،19،22، 23،24،26،27،28،29،وأكد الإمكانات الكبيرة لنموذج كالفاريال كفحص وتوصيف نموذج. ومع ذلك، على الرغم من أن النتائج التي تم الحصول عليها كانت مرضية جدا، وأشاروا أيضا إلى بعض القيود: (1) استخدام قباب التيتانيوم، التي منعت انتشار الأشعة السينية وبالتالي العيش استخدام الأشعة المقطعية الدقيقة. لا يمكن إزالة هذه قبل المعالجة النسيجية، مما اضطر الباحثين إلى تضمين العينات في بولي (ميثيل ميثاكريلات) الراتنج (PMMA). ولذلك اقتصرت التحليلات الناتجة إلى حد كبير على الطوبوغرافيا. (2) ارتفاع التكاليف المالية خاصة بسبب تكلفة الحيوانات، والتكاليف المتعلقة باللوجستيات والصيانة والجراحة للالحيوانات. (3) صعوبات الحصول على الموافقات الأخلاقية للالحيوانات الكبيرة.

دراسة حديثة من قبل بولو، وآخرون26 تحسنت إلى حد كبير النموذج على الأرنب. تم استبدال القباب التيتانيوم باسطوانات closable التي يمكن ملؤها مع حجم ثابت من المواد. وقد وضعت أربع من هذه الاسطوانات على جماجم الأرانب. وعند الانتهاء، يمكن إزالة الاسطوانات بحيث تكون الخزعات خالية من المعادن، مما يوفر مرونة أكبر بكثير فيما يتعلق بمعالجة العينات. أصبح نموذج كالفاريال الأرنب جذابة للاختبار في وقت واحد مع انخفاض التكاليف، وسهولة التعامل مع الحيوانات وتسهيل معالجة العينات. وبالاستفادة من هذه التطورات الأخيرة، قمنا بزيادة تحسين النموذج عن طريق استبدال التيتانيوم بـ PEEK لإنتاج اسطوانات، مما يسمح بنشر الأشعة السينية واستخدام التصوير المقطعي المجهري على الحيوانات الحية.

في هذه المقالة، سوف نقوم بوصف عمليات التخدير والجراحة وعرض أمثلة على المخرجات التي يمكن الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول، أي علم الأنسجة (المناعية)، ودراسة الأنسجة، والتصوير المجهري الحي والجسم الحي من الخارج لتقييم آليات العظام تجديد وتحديد كمية تخليق العظام الجديدة التي تدعمها المواد البديلة للعظام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وتمشياً مع المتطلبات القانونية السويسرية، وافقت لجنة أكاديمية على البروتوكول وأشرفت عليه الوكالات البيطرية الكانتونية والاتحادية (الترخيصان رقم GE/165/16 وGE/100/18).

1- أجهزة وحيواناتهم محددة

  1. اسطوانات
    1. اسطوانات آلة مع علامات التبويب استقرار الجانبية من نظرة خاطفة أن يكون القطر الداخلي من5 ملم، القطر الخارجي من 8 ملم وارتفاع 5 ملم (الشكل 1).
    2. قبعات نظرة خاطفة آلة مع تصميم يسمح لكليب على وجه التحديد على الجزء العلوي من الاسطوانة (سمك 1 ملم).
    3. تعقيم اسطوانات نظرة خاطفة وقبعات عن طريق الأوتوكلاف قبل الجراحة.
  2. مسامير
    1. استخدام الذاتي الحفر مسامير صغيرة (مصنوعة من التيتانيوم النقي التجاري (الصف 5)) لإصلاح اسطوانات (1.2 ملم في القطر، 4 ملم في الطول). تعقيم عن طريق الأوتوكلاف قبل الجراحة.
  3. الحيوانات
    1. شراء الأرانب البيضاء النيوزيلندية البالغة من العمر ثلاثة أشهر (ذكر أو أنثى)، وزنها حوالي 2.5 كجم لكل منها.
      ملاحظة: حصلنا على الأرانب عن طريق تربية في جامعة جنيف.

2. الجراحة

  1. صينية جراحية
    1. الحفاظ على مشرط، مقص، اثنين ملقط، مصعد periosteal، المحاقن (1، 2، 5، 50 مل)، المحرك الجراحي، الجحور الجراحية المستديرة (قطر 0.8 ملم)، والإبر، المالحة المعقمة، وأربع اسطوانات، وثمانية مسامير، ومفك جاهزة.
  2. العلاج قبل السريرية
    1. تكييف الحيوانات قبل أسبوع واحد من الجراحة.
    2. توفير مضاد حيوي وقائي يوميًا (5-10 ملغم/كغم عن طريق الفم)) يبدأ 2 ساعة قبل الجراحة حتى 3 أيام بعد الجراحة.
  3. التخدير والتنبيب
    1. تُسْدِع الحيوانات عن طريق حقن الكيتامين العضلي (IM) (25 ملغم/كغم، 50 ملغم/مل، 0.5 مل/كغ) + إكسلازين (3 ملغم/كغم، 20 ملغم/مل، 0.15 مل/كغم). انتظر ~ 20 دقيقة للالحيوانات للنوم
      بعمق (كامل العضلات الحجرية).
      ملاحظة: سيسمح هذا الدواء المسبق بعملية تنبيب بسيطة وسريعة وغير مؤلمة. يتم حث التسكين العميق والتخدير كما هو موضح في الخطوة 2.3.8.
    2. ضع قنية عن طريق الوريد (IV) في الوريد الهامشي من الأذن وأبقيها مغلقة حتى يكتمل التنبيب.
      ملاحظة: هذا الخط الرابع سوف تعمل على perfuse الفنتانيل وبروبوفول للتسكين العميق والتخدير، على التوالي (انظر الخطوة 2.3.8).
    3. الحفاظ على التخدير عن طريق توفير 5٪ سيفوفلوران في الأكسجين النقي حتى يتم إجراء التنبيب.
      ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية فقط إذا كان الحيوان يظهر علامات الصحوة (حركات العين، وتقلصات العضلات).
    4. التخدير القصبة الهوائية محليا عن طريق رش 10٪ ليدوكائين. وضع الأرنب في موقف عرضة والحفاظ على رأسه في تمديد عمودي.
    5. حرك الأنبوب الرغامى الأول من قطر صغير (2.5 مم) في القصبة الهوائية للأرنب حتى يمكن سماع تدفق الهواء في الأنبوب. وهذا فتح الحنجرة وتسهيل إدخال الأنبوب النهائي.
    6. أدخل دليلًا (قسطرة التنبيب) في الأنبوب لإصلاح موضع الأنبوب في القصبة الهوائية. إزالة أنبوب قطرها الصغير وحرك أنبوب الرغامى النهائي (4.9 مم) على الدليل.
    7. إزالة الدليل وتضخيم البالون في نهاية الأنبوب داخل الرغامى لختم ومنع الجهاز في القصبة الهوائية. سيبقى الأنبوب في مكانه ولكن قد يتم تأمينه باستخدام الدانتيل المربوط حول الجبين.  تهوية على الفور (7 مل / كغ، تردد 40/min) الحيوان مع 3٪ سيفوفلوران في الأكسجين النقي.
    8. الفنتانيل المستمر (وريد الأذن) الفنتانيل (0.01 ملغم/مل، 2-4 مل/ساعة) للحث على التسكين، 2-4 ملغم/كغم من (2٪) بروبوفول (20 ملغ / مل، 4-8 مل / ساعة) للحث على التخدير، و 4 مل / كغ / ساعة من خلات رينجر للحفاظ على ظروف متساوي الحجم.
    9. وضع مسبار درجة حرارة المستقيم. أيضا رصد وظيفة القلب، ودرجة الحرارة وتشبع الأكسجين خلال العملية بأكملها.
    10. السيطرة على عمق التخدير عن طريق رصد التنفس الذاتي. إذا كان الحيوان يظهر علامات التنفس الذاتي، الاستغناء عن بولوس صغيرة من البروبوفول والفينتانيل.
  4. إعداد الموقع
    1. ضع الأرنب على وسادة ساخنة (39 درجة مئوية) مغطاة بوسادة فراش (لتجنب الحروق) على طاولة الجراحة. اذيك فروة الرأس
    2. تطبيق هلام التشحيم على العينين لتجنب تهيج وجفاف. تطهير الموقع عن طريق تنقية الجلد مع اليود البوفيدون (10٪). ثم تغطية الأرنب مع الستائر الجراحية المعقمة وقطع منطقة الوصول للجمجمة.
    3. تطهير الموقع الجراحي باليود البوفيدون (10٪) للمرة الثانية. تطبيق هلام التشحيم على العينين لتجنب تهيج وجفاف.
    4. إعداد طاولة رايات (الستائر المعقمة) التي لوضع علبة جراحية كاملة.
  5. افتتاح موقع العمليات الجراحية
    1. التخدير محليا مع حقن تحت الجلد (SC) من ليدوكائين 2٪ (1 مل) على الجمجمة.
    2. يُقطع عن طريق الجلد (مع مشرط) على طول خط الكالفاري المترهل، من المدارات إلى البذير الخارجية (حوالي 4 سم في الطول). تأكد من أن periosteum هو قاطعة.
    3. رفع بلطف periosteum (مع مصعد periosteal) على كلا الجانبين من الشق. شطف الموقع مع المالحة معقمة.
  6. وضع اسطوانة
    1. تحديد موقع الغرز المتوسطة والإكليلية على الجمجمة (الشكل2A،B). لاحظ أن هذه الخطوط التشريحية تشكل صليباً. سيتم وضع الاسطوانات في كل من الأرباع التي يحددها الصليب، وضمان أن حافة الاسطوانة ليست على خياطة (الشكل2C).
    2. ضع الاسطوانة الأولى على الربع العلوي الأيسر (العظام الأمامية اليسرى)، وحاول وضع الجهاز مسطحًا. إصلاح في الموقف مع ضغط اليد قوية والمسمار المسمار الصغير، حتى يشعر المقاومة. تأكد من أن رأس المسمار هو دافق مع سطح علامة التبويب اسطوانة.
    3. كرر نفس الإجراء في علامة التبويب الأخرى لإصلاح الاسطوانة بإحكام على الجمجمة. تأكد من أن الاسطوانة ثابتة بإحكام إلى العظام.
    4. كرر الإجراء في الربع العلوي الأيمن (العظام الأمامية اليمنى)، الربع السفلي الأيسر (العظام الجدارية اليسرى اليسرى) والربع السفلي الأيمن (العظام الجدارية اليمنى).
  7. حفر العظام من 5 ثقوب داخل النخاع داخل المنطقة المحاطة بالاسطوانات (الشكل 1)
    1. حفر حفرة داخل النخاع تحت الري المالحة (0.8 ملم في القطر، ~ 1 ملم في العمق) مع جحر جولة على العظام، في وسط المنطقة التي تحصرها الاسطوانة. تأكد من أن النزيف يظهر.
    2. حفر اثنين من الثقوب داخل أكثر على طول المحور يمر من خلال مسامير علامة التبويب اثنين، في الحواف الداخلية للاسطوانة. على طول الفأس عمودي، حفر اثنين من الثقوب داخل النخاع أكثر في الحواف الداخلية للاسطوانة. تأكد من أن النزيف يظهر.
    3. كرر العملية داخل الاسطوانات الثلاث الأخرى.
  8. اسطوانات تعبئة مع عينات المواد والسد (الشكل 3)
    1. إعداد المواد البديلة العظام المطلوب وفقا لتعليمات الشركة المصنعة أو مواصفات المواد.
    2. ملء الاسطوانة الأولى إلى حافة مع عينة المواد وإغلاق الاسطوانة عن طريق تركيب الغطاء. كرر العملية في 3 اسطوانات أخرى.
  9. إغلاق المواقع الجراحية
    1. أغلق الجلد فوق الأسطوانات بخياطة متقطعة غير قابلة للإعادة.
    2. تطبيق خلع الملابس القابلة للرش على الجرح.

3. العلاج بعد الجراحة

  1. وقف التسكين والتخدير (بروبوفول والفينتانيل التسريب اعتقال) العرض والتحقق من انتعاش التنفس الذاتي.
  2. إيقاف التهوية بمجرد أن يتعافى الحيوان من التنفس المستقل. الحفاظ على الحيوان تحت الأكسجين النقي قبل الصحوة الكاملة.
  3. حقن البوبرينورفين هيدروكلوريد SC (0.02 ملغ / كغ، 0.03 ملغ / مل، 0.67 مل / كغ) وتكرار الحقن كل 6 ساعة لمدة 3 أيام كما التسكين بعد الجراحة.
  4. نقل الحيوان إلى مسكنه المعتاد مع الماء والتغذية الكاملة.
  5. إزالة الغرز بعد حوالي 10 أيام من التئام الجروح.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

النموذج الموضح هنا مخصص لتقييم التوصيل العظمي في بدائل العظام. ويمكن أيضا تقييم تكوين العظام وأو العظام من بدائل العظام إما (قبل) الخلوية أو محملة الجزيئات النشطة بيولوجيا، فضلا عن تكوين الأوعية الدموية1،2،3،4، 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 سنوات , 11 , 12 , 13 , 14 سنة , 15 , 16 سنة , 17 سنة , 18 سنة , 19 سنة , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30.ويمكن استخدام دراسة حركية، من 3 أيام إلى 3 أشهر بعد الجراحة اعتمادا على الآليات والمخرجات التي سيتم تحليلها. الجدول الزمني الكلاسيكي الذي يسمح بالأوصاف في وقت مبكر ومنتصف الوقت هو: 2 و 4 و 6 و 8 و 12 أسابيع. لاحظ أن ما لا يقل عن 6 عينات لكل نقطة زمنية إلزامية للحصول على نتائج هامة. كل عينة ليتم اختبارها يحتاج إلى وضع مرة واحدة على الأقل في كل موقف على الجمجمة لكل نقطة زمنية (تخصيص عشوائي). وأخيراً، يجب إدراج عينات صورية (مثل الاسطوانات المملوءة بالدم المتخثر) في البروتوكول34.

بمجرد الانتهاء من الجراحة، يمكن رصد نمو العظام في نقاط زمنية مختلفة باستخدام التصوير المقطعي للعظام على الحيوانات الحية. ويرد مثال في الشكل 4A،B. ويتطلب التحليل الإضافي التضحية بالحيوانات (الحقن الوريدي المميت بـ 150 ملغم/كغم من البنتوباربيتال (100 ملغم/مل). بعد القتل الرحيم، يتم تقسيم العينات وإزالةالاسطوانات بعناية (الشكل 5). يتم إصلاح الخزعات مع حل من المالحة الفوسفات المخزنة و 4٪ الفورمالديهايد. ويمكن بعد ذلك تقييم نمو العظام باستخدام التصوير الميكروتومي (الشكل4 C,D). ويمكن أيضا معالجة العينات لتلطيخ النسيج (المناعية). ثم يمكن تحليل الهيسوفمورمتر وتلطيخ محددة لاستكمال التحليل بشكل أكثر تحديدا (الشكل 6).

Figure 1
الشكل 1: مواصفات اسطوانات نظرة خاطفة. تم حفر ثقبين (0.8 مم في القطر) على علامات التبويب استقرار الجانبية لالشد. يتم وضع علامة على مواقع الثقوب الداخلية الخمسة (قطرها 0.8 مم) التي سيتم حفرها على الجمجمة داخل المنطقة المحددة بالاسطوانة باستخدام دوائر حمراء. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: صورة تمثيلية لجمجمة الأرنب ووضع الأسطوانات. صور تظهر الغرز المتوسطة والإكليلية على جمجمة الأرنب التي تحدد العظام الجدارية اليسرى والأمامية (A،B). وضع الاسطوانات على جانبي الغرز (C). قضبان مقياس = 5 ملم.

Figure 3
الشكل 3: صورة تمثيلية للاسطوانات الثابتة والمملوءة والمثبتة. صورة تظهر أربع اسطوانات ثابتة على جمجمة أرنب مع مسامير التيتانيوم. داخل المنطقة المحددة من قبل كل اسطوانة، تم حفر 5 ثقوب داخل النخاع (0.8 ملم في القطر، ~ 1 ملم في العمق) تحت الري مع جحر جولة للسماح هجرة خلايا العظام. تمتلئ الاسطوانات بعينات مختلفة من بدائل العظام (وحدات تخزين معايرة) قبل أن يتم وضع حد أقصى (تظهر اسطوانة واحدة مغلقة فقط). شريط مقياس = 5 ملم.

Figure 4
الشكل 4: الصور التمثيلية المستمدة من التحليل المجهري (التصوير المقطعي المجهري). مع الهدف النهائي لتقييم نمو العظام التي أجرتها بدائل العظام، تم تثبيت 4 اسطوانات على جمجمة أرنب مع مسامير التيتانيوم ومليئة بالمواد البديلة للعظام. (أ) التصوير الحي: المسح العرضي ثنائي الأبعاد (14 دقيقة، 99 كيلوفولت/88 ميكروفولت/ أ، مع دقة 20 ميكرومتر) من الاسطوانة في 12 أسبوعاً. (B) إعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد (3D) من تحليل التصوير المقطعي المجهري الحي في 4 أسابيع (الدوائر الحمراء: بدائل العظام في اسطوانات؛ السهم الأحمر: التحكم الذي تمتلئ الاسطوانة مع الدم المتخثر). (C,D) بعد القتل الرحيم (12 أسبوعا)، تمت إزالة الاسطوانات قبل التثبيت وتحليل التصوير المقطعي الدقيق. (C) 2D المسح العرضي (57 دقيقة، 99 كيلوفولت/ 88 درجة مئوية مع قرار 10 ميكرومتر) من اسطوانة و3D-إعادة بناء العظام الجديدة الإجمالية في الاسطوانة(D). وتظهر جزيئات استبدال العظام (الأحمر) والعظام الجديدة (الخضراء) وسرير العظام (الأصفر). قضبان مقياس = 2 مم الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: صور تمثيلية لخزعة في 4 أسابيع. بعد القتل الرحيم (4 أسابيع)، تم تقسيم العينات وإزالة الاسطوانات قبل التثبيت في 4٪ فورمالين، وتحليل التصوير المقطعي الدقيق ومعالجة النسيج. شريط مقياس = 5mm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: الصور التمثيلية للأقسام النسيجية (المناعية). مع الهدف النهائي لتقييم نمو العظام والأوعية الدموية الجديدة التي أجرتها بدائل العظام، تم تثبيت 4 اسطوانات على جمجمة أرنب مع مسامير التيتانيوم ومليئة ببدائل العظام. بعد القتل الرحيم (12 أسبوعا)، تمت إزالة الاسطوانات قبل التثبيت ومعالجة النسيج. (أ) تلطيخ ماسون-غولدنر (50x): يظهر بديل العظام كجسيمات مافي محاطة بعظام جديدة باللون الأخضر. (ب) تم مسح الشرائح ومعالجتها للاستخراج الرقمي للمواد البديلة للعظام بحيث يمكن قياس العظام الجديدة (الحمراء) بسهولة. (C) تلطيخ المناعة من CD31 (الأسهم)، علامة نموذجية من الخلايا البطانية وعملية الأوعية الدموية الجديدة. (D) تلطيخ الفلورسنت المناعي (الأخضر) من منطقة الأوعية الدموية الجديدة للغاية التي بعض الشعيرات الدموية الجديدة تعبر للغاية CD31 (السهم). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

النموذج الموضح هنا بسيط وينبغي تطويره بسهولة تامة طالما يتم اتباع جميع الخطوات والمعدات المناسبة. كما وصف البروتوكول هو طريقة جراحية، جميع الخطوات تبدو حاسمة ويجب اتباعها بشكل صحيح. من المهم أن يتم تدريبنا على التجارب الحيوانية، وخاصة في التعامل مع الأرانب والتخدير. لا تتردد في طلب التخدير المهنية والمساعدة البيطرية. من المهم الإصرار على المراقبة البصرية اليومية للالحيوانات قبل وبعد إزالة الخياطة. حتى لو كان الجلد من الجمجمة سميكة ووفيرة وفضفاضة، وتثبيت الاسطوانات يسبب توترات كبيرة. إذا تمت إزالة الغرز في وقت مبكر جدا، قد إعادة فتح الجرح وسوف تتطلب أسبوعا آخر من خياطة وعلاج مضاد حيوي جديد. في حالة الإنحطاب من خط الجرح ، سيتعين على الجراح أن ينظر فيما إذا كان الخياطة ممكنًا أم لا. وإذا لم يكن الأمر كذلك، سيتعين النظر في رفض العينة.

بالإضافة إلى الخطوات الهامة الموضحة في قسم البروتوكول، قد تكون التفاصيل أدناه مفيدة في التنفيذ السليم لهذا البروتوكول. من وجهة نظر تقنية، كما الأرانب المستخدمة هي صغيرة وصغيرة، من المهم استخدام تنبيب خطوتين، كما هو موضح في البروتوكول. الأنبوب الثاني (والأخير) كبير جداً بحيث لا يمكن استخدامه في التنبيب الأول، وهناك خطر حقيقي من "الطريقة الخاطئة" التي قد تكون ضارة أو حتى قاتلة.
اعتمادا على المواد التي تم اختبارها، قد يكون من المثير للاهتمام أن تأخذ بعض عينة الدم الطازجة من خط الأذن الرابع الذي تم وضعه بالفعل. وهذا يمكن أن يوفر طريقة جيدة لضخ المواد البديلة العظام مسبقا مع الخلايا الطبيعية وعوامل النمو. قد يوفر الدم المتخثر حديثًا أيضًا عينة زائفة مثالية.

الطريقة التي يتم حفر الثقوب داخل النخاع يجب أن تكون مفيدة جدا للمعالجة النسيجية في المستقبل والتحليل الهيتوميفولومتري. في الواقع، طالما أن الثقوب هي '1' في نفس الموقع، '2' الخزعات موجهة بالمثل و '3' عملية القطع موحدة (أي نفس السمك، نفس مستوى القطع)، والحقول التي يتم تقييمها هي متساوية والمقارنة بينها هي إلى حد كبير ذات الصله. وكمسألة توحيد، قد يكون من الأهمية الحقيقية معايرة كمية كمية المواد لملء الاسطوانة، وإعدادها مسبقا، بطريقة معقمة.

من وجهة نظر علمية، اعتمادا على المنتجات أو فرضية اختبارها، قد يكون من المهم تجنب وضع الاسطوانات على غرز العظام. بعض الخلايا الجذعية المحددة موجودة في هذه الهياكل35، مختلفة عن الخلايا الجذعية العظام mesenchymal التي تشارك في آليات التحجر داخل التحجر داخل، أي عملية تجديد العظام التي تواجهها في منطقة الأورومية الوجه. ولذلك، قد يحدث تحيز حقيقي في حالة سوء التنسيب.

واحدة من المزايا الرئيسية لنموذج calvarial هو استخدام التصوير الميكروتومي الحي الذي يمكن أن يتبع نمو العظام على الحيوان واحد كدراسة طولية. هذه الاستراتيجية قد تقلل إلى حد كبير من عدد الحيوانات القتل الرحيم، وبالتالي احترام "قاعدة 3R"36. اعتمادا على جهاز التصوير المجهري المستخدمة (القرار، والفضاء المتاح للحيواني)، وسوف تحدث الاختلافات من حيث استراتيجية التخدير (الرابع، والغاز، وما إلى ذلك)، وكذلك في دقة الصورة وأهمية التحليل الناتج.
نحن نستخدم بشكل روتيني التصوير المجهري المخصص للتجارب الحيوانية (على سبيل المثال، Quantum GX) للفحوصات الروتينية. تبدأ التجربة النموذجية بالتخدير، كما هو موضح في الخطوة 2.3.1. ثم يتم الحفاظ على التخدير مع 2٪ isoflurane في الأكسجين النقي. وهذا يسمح للحيواني بالتنفس بهدوء خلال وقت المسح الضوئي من حوالي 14 دقيقة (99 كيلوفولت/88 درجة مئوية مع قرار 20 درجة مئوية)؛ وهذا يكفي للتحقق من المعلمات الأساسية (الطعوم، تثبيت اسطوانة، تحليل شبه كمي لنمو العظام، الخ). عند البحث عن تحليل نوعي وكمي دقيق، ستكون هناك حاجة إلى ضبط دقيق جدا من وقت المسح الضوئي، والقرار، والتخدير وتحديد المواقع الحيوانية.

النماذج القائمة التي وضعت لتقييم التوصيل العظمي، وتكوّن العظام، وتحريض العظام، فضلا عن تكوين الأوعية الدموية، عديدة، وخاصة في مجال الأوروفيوالوجه. بسبب الاعتبارات الأخلاقية والاقتصادية، سوف يقتصر هدفنا على الأرانب أو الحيوانات الصغيرة. وبصرف النظر عن الجمجمة، والمواقع التي يمكن اختبار المواد هي mandibulla37،38،39،40،41،42،43، 44،45،46،47،دياستيما48 أو مآخذ قاطعة (بعد استخراج الأسنان)49،50،51. ويمكن استخدام الفئران والفئران والخنازير الغينية والأرانب لكل نموذج من النماذج الموصوفة أدناه. باختصار، يتم حفر عيب حرج (أو يتم إنشاء مقبس عن طريق استخراج قاطعة)، مليئة عينة المواد ومن ثم تغطيتها غشاء. وبصرف النظر عن حقيقة واضحة أن اثنين فقط من العينات يمكن اختبارها في كل من هذه المواقع (عينة واحدة لكل جانب الفك السفلي أو لكل مقبس قاطع)، والإجراءات الجراحية هي أيضا إلى حد كبير أكثر صعوبة والغازية. الوصول إلى الموقع محدود، وإذا كان أحد يستخدم الفئران أو الفئران، وزيادة صعوبة أكبر من حجم الحيوانات. وأخيراً، فإن الحجم الحرج للعيوب (أي الأبعاد التي لا تسمح بتجدد العظام تلقائياً) غير محدد بشكل جيد ويختلف من حيواني إلى آخر.
وإلى جانب هذه العموميات، قد تنشأ قيود محددة تبعاً للموقع التشريحي الذي يتعرض للعيب وللتحليل اللاحق. على سبيل المثال، في نموذج الفك السفلي، جذور الأسنان موجودة داخل العيب. وهذا قد تتداخل مع المواد وتعديل عملية تجديد العظام. يمكن وضع العيب أكثر من غير رسمي على راموس، ولكن في هذه الحالة، فإن العظام تكون رقيقة جدا (اثنين من القشرية المثبتة مع مساحة النخاع رقيقة للغاية) وحجم عيب الناتجة قد تكون صغيرة جدا45،46، 47- وبالنظر إلى هذه الأمثلة على القيود وتبعا للنموذج، يمكن توقع حدوث انحرافات كبيرة من حيث حجم المواد التي يتعين اختبارها، ونوعية وكمية البيانات المجمعة.

وبما أن تقييم المادة يتطلب الحد الأقصى من التوحيد القياسي والمعايرة، فإن النموذج الكالفاري يبدو مثالياً. والوصول سهل جداً، ويسهل المعايرة والتوحيد باستخدام اسطوانات محددة، ويمكن تقييم 4 عينات في وقت واحد. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام التصوير المقطعي الحي، وأخيرا يمكن توقع انخفاض كبير في الحيوانات التي سيتم قتلها الرحيم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

والمؤلفون مدينون لشركة Geistlich AG (Wolhusen, CH) ومؤسسة علم العظام (لوسيرن, CH) (منحة رقم 18-049) لدعمهم, فضلا عن D العالمية (Brignais, FR) لتوفير مسامير. شكر خاص للدكتور ب. شايفر من جيستليش. كما أننا ممتنون لإليان دوبوا وكلير هيرمان على معالجتهما النسيجية الممتازة ونصائحهما الثمينة. وأخيراً، نعترف بحرارة بكزافييه بيلين، سيلفي روليه وفريق كامل من بير وليد حبري، "الجراحة التجريبية Dpt"، لمساعدتهم التقنية الرائعة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drugs
Enrofloxacine Baytril 10% Bayer Antibiotic
Fentanyl Bischel For analgesia
Ketalar 50mg/ml Pfizer Ketamine for anesthesia
Lidohex Bichsel Lubricating gel for the eyes
Opsite Smith and Nephew 66004978 Sprayable dressing
Povidone iodine 10%, Betadine Mundipharma anti-infective agent
Propofol 2% Braun 3538710 For anesthesia
Rapidocain 2% sintetica Local anesthesia
Ringer-acetate Fresenius Kabi Volume compensation
Rompun 2% Bayer Xylazin for anesthesia
Sevoflurane 5% Abbvie For anesthesia
Sterile saline Sintetica
Temgesic Reckitt Benckiser Buprenorphine hydrochloride, analgesia
Thiopental Inresa Ospediala For anesthesia
Xylocaine 10% spray Astra Zeneca For intubation
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Fresenius Vial pilot C Imexmed Infusion pump
Heated pad Harvard Apparatus
Suction dominant 50 Medela
Suction tubing Optimus Promedical 80342.2
Surgical motor Schick dental Qube Drilling of intramedullary holes
Ventilation Maquet Servo1
Name Company Catalog Number Comments
Material
Cylinders and caps Boutyplast Customized composition: PEEK (poly ether ether ketone)
Manual self-retaining shaft GlobalD ACT1K
Mobile handle for self-retaining shaft GlobalD MTM
Self- drilling screws GlobalD VA1.2KL4 cross-drive screws composed by Titanium grade5, ISO 5832-3
Name Company Catalog Number Comments
Surgical tray
Endotracheal tube Shiley diameter 2,5mm Covidien 86233 For intubation
Endotracheal tube Shiley diameter 4,9mm Covidien 107-35G For intubation
Ethicon prolene 4-0 Ehticon 8581H Non-resorbable suture
Forceps Marcel Blanc BD027R 145 mm
Intubation catheter Cook medical Guide for intubation
Needlle holder Marcel Blanc BM008R
Needles BD Microlance3 Becton Dickinson 300300/304622 26G; 18G
Periosteal HU-Friedy P9X
Round surgical burs Patterson 78000 0.8 mm in diameter, Drilling of intramedullary holes
Scalpel Swann-Morton n°10 and n°15
Scissors Marcel Blanc 00657 180 mm
Syringes Omnifix Braun 4616057V 5ml, 10ml and 50ml
Venflon G22 Braun 42690985-01 Vasofix safety for the ear iv line

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anderud, J., et al. Guided bone augmentation using a ceramic space-maintaining device. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology and Oral Radiology. 118, (5), 532-538 (2014).
  2. Lundgren, A. K., Lundgren, D., Hammerle, C. H., Nyman, S., Sennerby, L. Influence of decortication of the donor bone on guided bone augmentation. An experimental study in the rabbit skull bone. Clinical Oral Implants Research. 11, (2), 99-106 (2000).
  3. Lundgren, D., Lundgren, A. K., Sennerby, L., Nyman, S. Augmentation of intramembraneous bone beyond the skeletal envelope using an occlusive titanium barrier. An experimental study in the rabbit. Clinical Oral Implants Research. 6, (2), 67-72 (1995).
  4. Slotte, C., Lundgren, D. Impact of cortical perforations of contiguous donor bone in a guided bone augmentation procedure: an experimental study in the rabbit skull. Clinical Implant Dentistry and Relat Research. 4, (1), 1-10 (2002).
  5. Tamura, T., et al. Three-dimensional evaluation for augmented bone using guided bone regeneration. Journal of Periodontal Research. 40, (3), 269-276 (2005).
  6. Yamada, Y., et al. Correlation in the densities of augmented and existing bone in guided bone augmentation. Clinical Oral Implants Research. 23, (7), 837-845 (2012).
  7. Chierico, A., et al. Electrically charged GTAM membranes stimulate osteogenesis in rabbit calvarial defects. Clinical Oral Implants Research. 10, (5), 415-424 (1999).
  8. Ikeno, M., Hibi, H., Kinoshita, K., Hattori, H., Ueda, M. Effects of the permeability of shields with autologous bone grafts on bone augmentation. International Journal of Oral and Maxillofacial Implants. 28, (6), e386-e392 (2013).
  9. Ito, K., Nanba, K., Murai, S. Effects of bioabsorbable and non-resorbable barrier membranes on bone augmentation in rabbit calvaria. Journal of Periodontology. 69, (11), 1229-1237 (1998).
  10. Lee, Y. M., et al. Enhanced bone augmentation by controlled release of recombinant human bone morphogenetic protein-2 from bioabsorbable membranes. Journal of Periodontology. 74, (6), 865-872 (2003).
  11. Fugl, A., et al. S-nitroso albumin enhances bone formation in a rabbit calvaria model. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 43, (3), 381-386 (2014).
  12. Ikeno, M., Hibi, H., Kinoshita, K., Hattori, H., Ueda, M. Effects of self-assembling peptide hydrogel scaffold on bone regeneration with recombinant human bone morphogenetic protein-2. International Journal of Oral and Maxillofacial Implants. 28, (5), e283-e289 (2013).
  13. Ito, K., et al. Effects of ipriflavone on augmented bone using a guided bone regeneration procedure. Clinical Oral Implants Research. 18, (1), 60-68 (2007).
  14. Jung, R. E., Hammerle, C. H., Kokovic, V., Weber, F. E. Bone regeneration using a synthetic matrix containing a parathyroid hormone peptide combined with a grafting material. International Journal of Oral and Maxillofacial Implants. 22, (2), 258-266 (2007).
  15. Minegishi, T., et al. Effects of ipriflavone on bone augmentation within a titanium cap in rabbit calvaria. Journal of Oral Science. 44, (1), 7-11 (2002).
  16. Moussa, M., et al. Medium-Term Function of a 3D Printed TCP/HA Structure as a New Osteoconductive Scaffold for Vertical Bone Augmentation: A Simulation by BMP-2 Activation. Materials. 8, (5), 2174-2190 (2015).
  17. Thoma, D. S., Kruse, A., Ghayor, C., Jung, R. E., Weber, F. E. Bone augmentation using a synthetic hydroxyapatite/silica oxide-based and a xenogenic hydroxyapatite-based bone substitute materials with and without recombinant human bone morphogenetic protein-2. Clinical Oral Implants Research. 26, (5), 592-598 (2014).
  18. Busenlechner, D., et al. Resorption of deproteinized bovine bone mineral in a porcine calvaria augmentation model. Clinical Oral Implants Research. 23, (1), 95-99 (2012).
  19. Busenlechner, D., et al. Paste-like inorganic bone matrix: preclinical testing of a prototype preparation in the porcine calvaria. Clinical Oral Implants Research. 20, (10), 1099-1104 (2009).
  20. Busenlechner, D., et al. Simultaneous in vivo comparison of bone substitutes in a guided bone regeneration model. Biomaterials. 29, (22), 3195-3200 (2008).
  21. Carrel, J. P., et al. A 3D printed TCP/HA structure as a new osteoconductive scaffold for vertical bone augmentation. Clinical Oral Implants Research. 27, (1), 55-62 (2016).
  22. Murai, M., et al. Effects of different sizes of beta-tricalcium phosphate particles on bone augmentation within a titanium cap in rabbit calvarium. Dental Materials Journal. 25, (1), 87-96 (2006).
  23. Nishida, T., et al. Effects of bioactive glass on bone augmentation within a titanium cap in rabbit parietal bone. Journal of Periodontology. 77, (6), 983-989 (2006).
  24. Nyan, M., et al. Feasibility of alpha tricalcium phosphate for vertical bone augmentation. Journal of Investigating and Clinical Dentistry. 5, (2), 109-116 (2012).
  25. Polimeni, G., et al. Histopathological observations of a polylactic acid-based device intended for guided bone/tissue regeneration. Clinical Implant Dentistry and Related Research. 10, (2), 99-105 (2008).
  26. Polo, C. I., et al. Effect of recombinant human bone morphogenetic protein 2 associated with a variety of bone substitutes on vertical guided bone regeneration in rabbit calvarium. Journal of Periodontology. 84, (3), 360-370 (2013).
  27. Slotte, C., Lundgren, D., Burgos, P. M. Placement of autogeneic bone chips or bovine bone mineral in guided bone augmentation: a rabbit skull study. International Journal of Oral and Maxillofacial Implants. 18, (6), 795-806 (2003).
  28. Tamimi, F. M., et al. Bone augmentation in rabbit calvariae: comparative study between Bio-Oss and a novel beta-TCP/DCPD granulate. Journal of Clinical Periodontology. 33, (12), 922-928 (2006).
  29. Torres, J., et al. Effect of solely applied platelet-rich plasma on osseous regeneration compared to Bio-Oss: a morphometric and densitometric study on rabbit calvaria. Clinical Implant Dentistry and Related Research. 10, (2), 106-112 (2008).
  30. Yamada, Y., et al. Angiogenesis in newly augmented bone observed in rabbit calvarium using a titanium cap. Clinical Oral Implants Research. 19, (10), 1003-1009 (2008).
  31. Cordaro, L., Terheyden, H. ITI Treatment Guide. Wismeijer, D., Chen, S., Buser, D. 7, Quintessence. (2014).
  32. Pearce, A. I., Richards, R. G., Milz, S., Schneider, E., Pearce, S. G. Animal models for implant biomaterial research in bone: A review. European Cells & Materials. 13, 1-10 (2007).
  33. Min, S., et al. Effects of marrow penetration on bone augmentation within a titanium cap in rabbit calvarium. Journal of Periodontology. 78, (10), 1978-1984 (2007).
  34. Braun, T. M. Ch. 4. Osteology guidelines for oral and maxillofacial regeneration Preclinical models for translational research. Giannobile, W. V., Nevins, M. Quintessence publishing. 31-43 (2011).
  35. Doro, D. H., Grigoriadis, A. E., Liu, K. J. Calvarial Suture-Derived Stem Cells and Their Contribution to Cranial Bone Repair. Frontiers in Physiology. 8, 956 (2017).
  36. Russel, W., Burch, R. The principles of humane experimental technique. Universities Federation for Animal Welfare. (1959).
  37. Asvanund, P., Chunhabundit, P. Alveolar bone regeneration by implantation of nacre and B-tricalcium phosphate in guinea pig. Implant Dentistry. 21, (3), 248-253 (2012).
  38. Gielkens, P. F., et al. Gore-Tex as barrier membranes in rat mandibular defects: an evaluation by microradiography and micro-CT. Clinical Oral Implants Research. 19, (5), 516-521 (2008).
  39. Lioubavina, N., Kostopoulos, L., Wenzel, A., Karring, T. Long-term stability of jaw bone tuberosities formed by "guided tissue regeneration". Clinical Oral Implants Research. 10, (6), 477-486 (1999).
  40. Mardas, N., Kostopoulos, L., Stavropoulos, A., Karring, T. Osteogenesis by guided tissue regeneration and demineralized bone matrix. Journal of Clinical Periodontology. 30, (3), 176-183 (2003).
  41. Stavropoulos, A., Kostopoulos, L., Mardas, N., Nyengaard, J. R., Karring, T. Deproteinized bovine bone used as an adjunct to guided bone augmentation: an experimental study in the rat. Clinical Implant Dentistry and Related Research. 3, (3), 156-165 (2001).
  42. Stavropoulos, A., Kostopoulos, L., Nyengaard, J. R., Karring, T. Deproteinized bovine bone (Bio-Oss) and bioactive glass (Biogran) arrest bone formation when used as an adjunct to guided tissue regeneration (GTR): an experimental study in the rat. Journal of Clinical Periodontology. 30, (7), 636-643 (2003).
  43. Stavropoulos, A., Kostopoulos, L., Nyengaard, J. R., Karring, T. Fate of bone formed by guided tissue regeneration with or without grafting of Bio-Oss or Biogran. An experimental study in the rat. Journal of Clinical Periodontology. 31, (1), 30-39 (2004).
  44. Stavropoulos, A., Nyengaard, J. R., Kostopoulos, L., Karring, T. Implant placement in bone formed beyond the skeletal envelope by means of guided tissue regeneration: an experimental study in the rat. Journal of Clinical Periodontology. 32, (10), 1108-1115 (2005).
  45. Thomaidis, V., et al. Comparative study of 5 different membranes for guided bone regeneration of rabbit mandibular defects beyond critical size. Medical Science Monitor. 14, (4), (2008).
  46. Zhang, J. C., et al. The repair of critical-size defects with porous hydroxyapatite/polyamide nanocomposite: an experimental study in rabbit mandibles. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 39, (5), 469-477 (2010).
  47. Zhang, X., et al. Osteoconductive effectiveness of bone graft derived from antler cancellous bone: an experimental study in the rabbit mandible defect model. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 41, (11), 1330-1337 (2012).
  48. Bronoosh, P., et al. Effects of low-intensity pulsed ultrasound on healing of mandibular bone defects: an experimental study in rabbits. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 44, (2), 277-284 (2015).
  49. Gomes, F. V., et al. Low-level laser therapy improves peri-implant bone formation: resonance frequency, electron microscopy, and stereology findings in a rabbit model. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 44, (2), 245-251 (2014).
  50. Lalani, Z., et al. Spatial and temporal localization of secretory IgA in healing tooth extraction sockets in a rabbit model. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 62, (4), 466-472 (2004).
  51. Osorio, L. B., et al. Post-extraction evaluation of sockets with one plate loss--a microtomographic and histological study. Clinical Oral Implants Research. 27, (1), 31-38 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics