兔子骨增增的千叶模型,用于骨代材料骨生长和新血管化的评估

Bioengineering

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Summary

在这里,我们提出了一个手术方案在兔子,目的是评估骨替代材料的骨再生能力。通过使用固定在兔子头骨上的PEEK圆柱体,可以对活体动物或安乐死动物进行骨传导、骨诱导、成骨和血管生成。

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Marger, L., Barone, A., Martinelli-Kläy, C. P., Schaub, L., Strasding, M., Mekki, M., Sailer, I., Scherrer, S. S., Durual, S. Calvarial Model of Bone Augmentation in Rabbit for Assessment of Bone Growth and Neovascularization in Bone Substitution Materials. J. Vis. Exp. (150), e59976, doi:10.3791/59976 (2019).

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Abstract

兔钙质模型的基本原理是在颅骨皮质部分垂直生长新的骨组织。该模型允许评估骨替代材料的口腔和颅骨再生在骨生长和新血管化支持方面。一旦动物被麻醉和通风(内切管插管),四个圆柱体由圆柱体醚酮(PEEK)拧到头骨上,在中位和日冕缝合线两侧。在由每个圆柱体划定的骨骼区域内钻出五个髓洞,允许骨髓细胞的流入。材料样品被放入气缸中,然后关闭。最后,手术部位被缝合,动物被唤醒。骨骼生长可以通过微断层扫描在活体动物身上评估。一旦动物被安乐死,骨骼生长和新血管化可以通过微断层扫描、免疫组织学和免疫荧光进行评估。由于材料评估需要最大的标准化和校准,因此千数模型显得非常理想。检修非常简单,使用定义的气缸可促进校准和标准化,并可同时评估四个样品。此外,可以使用活断层扫描,最终有望大量减少要安乐死的动物。

Introduction

骨增增的千数模型是在90年代发展起来的,目的是优化口腔和颅面外科领域的引导性骨再生(GBR)概念。该模型的基本原理是在颅骨皮质部分垂直生长新的骨组织。为此,将反应器(如钛圆顶、圆柱或-笼)固定在头骨上,以保护移植物(如水凝胶、骨代用品等)进行的骨再生。在这个模型的帮助下,钛或陶瓷保持架1,2,3,4,5,6,GBR膜7,8,9 ,10, 骨原因子11,12,13,14,15,16,17,新骨替补12,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29或骨再生过程中新血管化机理30被评估。

从平移的角度来看,千数模型表示一个单壁缺陷,可以与钳口31中的IV类缺陷进行比较。目标是在皮质区域上方生长新骨骼,无需内源性骨壁的任何横向支撑。因此,该模型非常严格,并评估了垂直骨传导在骨皮部分的实际潜力。如果本文描述的模型主要用于评估骨代用品中的骨传导,则还可以评估成骨和/或骨诱导,以及血管生成1、2、3 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30 。

基本上出于伦理、实际和经济原因,在兔子中发展了钙化模型,其中骨代谢和结构与人类32相比相当相关。在上述30个参考文献中,80%使用兔钙模式1,2,3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13,14,15,17,22, 23,26,27,28,29,30,33,从而证明了这种动物模型的相关性。2008年,Busenlechner小组将骨质模型转移到了猪,允许同时比较8种骨代用品20个(与兔子的两个骨代用品相比)。另一方面,我们小组将兔肉模型转移到绵羊身上。简而言之,钛圆顶被放置在羊头骨上,以描述一种新的3D打印骨替代品的骨传导。这些研究使我们能够开发和掌握千数模型及其分析16,21。

最后三项研究引用了16、20、21,以及其他几项调查12、17、18、19、22 23,24,26,27,28,29,证实了千花模型的巨大潜力作为筛选和表征模型。然而,尽管获得的结果相当令人满意,他们也指出了一些局限性:(1)使用钛圆顶,防止了X射线扩散,反过来又活微CT使用。在组织学处理之前,这些样品无法去除,迫使研究人员将样品嵌入聚(甲基丙烯酸酯)树脂(PMMA)中。因此,由此产生的分析主要限于地形。(2) 高昂的财务费用,特别是因为动物的费用,以及与动物的后勤、维护和手术有关的费用。(3) 难以获得大型动物的道德批准。

Polo等人最近进行的一项研究在很大程度上改进了兔子的模型。钛圆顶被可堵塞的圆柱体所取代,这些圆筒可以填充恒定的材料量。其中四个圆柱体被放置在兔子头骨上。完成后,可以去除钢瓶,使活检无金属,在样品处理方面引入更大的灵活性。兔钙模型在成本更低、动物处理方便、样品处理方便的同时,对同时测试极具吸引力。利用这些最近的发展,我们进一步改善了模型,用PEEK取代钛来生产圆柱体,从而允许X射线扩散和在活体动物身上使用微断层扫描。

在本文中,我们将描述麻醉和手术过程,并展示使用该协议可以获得的输出示例,即(免疫-)组织学、组织学、活体和外体微断层扫描,以评估骨骼机制再生和量化由骨替代材料支持的新骨合成。

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Protocol

根据瑞士的法律要求,该协议由一个学术委员会批准,并由州和联邦兽医机构监督(批准程序为 GE/165/16 和 GE/100/18)。

1. 特定设备和动物

    1. PEEK 外侧稳定卡舌的机器油缸内径为 5 mm,外径为 8 mm,高度为 5 mm(图 1)。
    2. 机器 PEEK 盖的设计允许精确地夹在气缸顶部(厚度为 1 mm)。
    3. 手术前通过高压灭菌对PEEK气缸和瓶盖进行消毒。
  1. 螺丝
    1. 使用自钻微型螺钉(由商用纯钛制成(5 级))固定气缸(直径 1.2 毫米,长度为 4 mm)。手术前通过高压灭菌进行灭菌。
  2. 动物
    1. 购买三个月大的新西兰白兔(雄性或雌性),每只重2.5公斤。
      注:我们在日内瓦大学通过繁殖获得了兔子。

2. 外科

  1. 手术托盘
    1. 保持手术刀,剪刀,两个钳子,窥探电梯,注射器(1,2,5,50 mL),手术马达,圆形手术毛刺(直径0.8毫米),针头,无菌盐水,四个钢瓶,8个螺丝和螺丝刀准备。
  2. 临床前治疗
    1. 在手术前一周使动物适应。
    2. 每天提供预防性抗生素(5~10毫克/千克口(PO))从手术前2小时开始,手术后3天。
  3. 麻醉和插管
    1. 通过肌肉内注射氯胺酮(25毫克/千克,50毫克/千米/千克,0.5毫克/千克)+木拉津(3毫克/千克,20毫克/升/千米,0.15毫克/千克)来使动物受毒。等待约20分钟让动物入睡
      深(完全肌肉的石头)。
      注:此预授将允许简单、快速和无痛的插管过程。深麻醉和麻醉诱导步骤2.3.8所述。
    2. 将静脉(IV)管插入耳朵的边际静脉,并保持关闭,直到插管完成。
      注:此 IV 线将分别用于分别用于深麻醉和麻醉的芬太尼和异丙酚(参见步骤 2.3.8)。
    3. 通过在纯氧中供应5%的分氟,直到进行插管,保持麻醉。
      注:只有当动物有觉醒迹象(眼睛运动、肌肉收缩)时,此步骤才是必要的。
    4. 通过喷洒10%利多卡因局部麻醉气管。将兔子置于易发位置,并保持其头部垂直延伸。
    5. 将第一根直径小(2.5毫米)的内切管滑入兔气管,直到管中能听到气流。这将打开喉部,并方便插入最终管。
    6. 在管中插入导管(插管导管),将管的位置固定到气管中。拆下小直径管,将最终的内切管(4.9 mm)滑向导轨上。
    7. 拆下导管,在内切管末端充气气球,以密封并将设备密封并阻塞到气管中。管子将保持原位,但可以通过用绑在额头上的花边固定。 立即对动物进行呼吸(7 mL/kg,频率为40/分钟),在纯氧中使用3%的分氟。
    8. 连续渗透(耳静脉)芬太尼(0.01毫克/升,2⁄4 mL/h),诱导麻醉,2⁄4毫克/千克(2%)异丙酚(20毫克/升,4~8 mL/h)诱导麻醉,4 mL/kg/h的林格醋酸盐维持异体积条件。
    9. 放置直肠温度探头。同时在整个过程中监测心脏功能、温度和氧饱和度。
    10. 通过监测自主呼吸控制麻醉深度;如果动物有自主呼吸的迹象,则配发一小波列酚和芬太尼。
  4. 现场准备
    1. 将兔子放在手术台上的加热垫(39°C)上,垫子覆盖(避免烧伤)。刮头皮。
    2. 在眼睛上涂上凝胶,避免刺激和干燥。用波维多酮碘(10%)擦洗皮肤,对部位进行消毒。然后用无菌手术窗帘给兔子披上窗帘,并切出头骨的通道区域。
    3. 用波维多酮碘消毒手术部位 (10%)第二次。在眼睛上涂上凝胶,避免刺激和干燥。
    4. 准备一个覆盖的桌子(无菌窗帘),放在上面放置完整的手术托盘。
  5. 手术部位开放
    1. 用皮下 (SC) 注射利多卡因 2% (1 mL) 在头骨上局部麻醉。
    2. 沿着钙质下垂线穿过皮肤(用手术刀),从轨道到外部腹腔突起(长度约4厘米)。确保渗透物被切开。
    3. 轻轻提升切口两侧的穿孔(带窥动电梯)。用无菌盐水冲洗现场。
  6. 气缸放置
    1. 找到颅骨上的中位和日冕缝合线(图2A,B)。请注意,这些解剖线形成十字形。气缸将放置在由十字定义的每个面限中,确保气缸边缘不超过缝合线(图 2C)。
    2. 将第一个圆柱体放在左上象限(左前骨)上,并尝试将设备平放。用强手压固定在位置,拧下微型螺钉,直到感觉到阻力。确保螺钉头与气缸卡舌的表面齐平。
    3. 在另一个标签上重复相同的步骤,将圆柱体紧紧地固定在头骨上。确保圆柱体密封固定在骨骼上。
    4. 在右上部(右前骨)、左下部(左前骨)和右下部(右前骨)上重复该过程。
  7. 在圆柱体所限定区域内的5个膜内孔的骨钻孔(图1)
    1. 在盐水灌溉(直径0.8毫米,深度±1毫米)下,在圆柱体的中心,在骨骼上钻一个膜内孔。确保出现出血。
    2. 沿着轴钻两个穿过两个卡舌螺钉的轴线,在气缸的内边缘再钻两个内部孔。沿着垂直的斧头,在圆柱体的内边缘再钻两个内孔。确保出现出血。
    3. 在另外三个气缸内重复此操作。
  8. 用材料样品和封盖填充油缸(图3)
    1. 根据制造商说明或材料规格准备所需的骨替换材料。
    2. 用材料样品将第一个气缸填充到边缘,并通过安装盖来关闭气缸。在另外 3 个气缸中重复此过程。
  9. 手术部位关闭
    1. 用间歇性不可吸收缝合关闭气缸上方的皮肤。
    2. 在伤口上涂抹可喷敷料。

3. 手术后治疗

  1. 停止麻醉和麻醉(异丙酚和芬太尼灌注停止)供应,并检查自主呼吸的恢复。
  2. 动物恢复自主呼吸后停止通风。在完全觉醒之前,在纯氧下保持动物。
  3. 注射盐酸氯丁二醇SC(0.02毫克/千克,0.03毫克/升,0.67 mL/kg),每6小时重复一次注射3天,作为手术后的麻醉。
  4. 将动物转移到其通常的居所与水和完整的喂养。
  5. 伤口愈合约10天后,取出缝合线。

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Representative Results

本文描述的模型专门用于骨代用品中骨传导的评估。骨代生和骨代用品的骨质诱导(预)细胞或加载生物活性分子也可以评估,以及血管发生1,2,3,45,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30.根据要分析的机制和输出,在手术后3天至3个月内,可以使用动力学研究。允许在早期和中期描述的经典时间线是:2、4、6、8 和 12 周。请注意,每个时间点必须至少 6 个样本才能获得显著结果。每个要测试的样本需要在每个时间点上在每个位置放置至少一次(随机分配)。最后,假样品(例如,充满凝固血的钢瓶)必须包含在协议34中。

手术后,通过在活体动物身上使用骨断层扫描,可以在不同时间点监测骨骼生长。图4A,B显示了一个示例。额外的分析要求牺牲动物(致命静脉注射150毫克/千克五巴比妥(100毫克/mL)。安乐死后,对样品进行分割,并小心地取出油缸(图5)。活检用磷酸盐缓冲盐和4%甲醛溶液固定。然后,可以使用微断层扫描(图4 C,D)评估骨骼生长。样品也可以处理(免疫-)组织染色。然后,组织学分析和特定的染色可以更具体地完成分析(图6)。

Figure 1
图1:PEEK气缸的规格。在侧稳定片上钻了两个孔(直径 0.8 mm),用于拧紧。在圆柱体划定的区域内,要在头骨上钻孔的 5 个内孔(直径 0.8 mm)的位置用红色圆圈标记。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:兔子头骨的代表性图像和圆柱体的位置。图片显示兔子头骨上的中位和冠状缝合线,描绘了左右骨骼和前骨(A,B)。将气缸放置在缝合线(C) 的两侧。比例尺 = 5 mm。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3:固定、填充和盖的圆柱体代表图像。图为用钛螺丝固定在兔子头骨上的四个圆筒。在由每个圆柱体划定的区域内,在灌溉下用圆孔钻出5个内孔(直径0.8毫米,深±1毫米),以允许骨细胞迁移。在封盖之前,气缸填充了不同的骨替换样品(校准体积)(仅显示一个闭合的气缸)。比例尺 = 5 毫米。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图4:微断层(微CT)分析的代表性图像。以骨代用品评估骨骼生长为最终目标,用钛螺钉固定在兔子头骨上,并填充骨代材料。(A) 实时成像:在 12 周内对气缸进行二维横向扫描(14 分钟,99 kV/88 μA,分辨率为 20 μm)。(B) 在 4 周内从活微CT分析(红色圆圈:圆柱体中的骨代用品;红色箭头:圆柱体充满凝固血液的控制控制)进行三维 (3D) 重建。(C,D)安乐死(12周)后,在固定和微CT分析之前去除气缸。(C) 2D 横向扫描 (57 分钟, 99 kV/88 μA, 分辨率为 10 μm) 的圆柱体和气缸(D) 中新骨骼的 3D 重建。显示骨骼替代粒子(红色)、新骨骼(绿色)和骨床(黄色)。比例尺 = 2 mm请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图5:4周活检的代表性图像。安乐死(4周后),样品被块分割,在4%正式化、微CT分析和组织学处理中固定之前,将油缸取出。比例尺 = 5 毫米。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 6
图6:(免疫-)组织学部分的代表性图片。以评估骨骼生长和新血管化为最终目标,用钛螺钉和骨代用品固定在兔子头骨上,将4个圆柱体固定在兔子头骨上。安乐死(12周)后,在固定和组织学处理之前,将钢瓶取出。(A) 马森-戈尔德纳染色 (50x): 骨代用品显示为绿色新骨包围的淡紫色颗粒。(B) 扫描和处理切片,以便对骨替代材料进行数字提取,以便轻松量化新骨(红色)。(C) CD31(箭头)的免疫染色,是内皮细胞和新血管化过程的典型标记。(D) 高度新血管化区域的免疫荧光染色(绿色),其中一些新毛细血管高度表达CD31(箭头)。请点击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

本文描述的模型很简单,只要遵循所有步骤,设备合适,就很容易开发。由于所述方案是一种手术方法,所有步骤都显得至关重要,必须正确遵循。对动物实验进行训练至关重要,特别是在兔子处理和麻醉方面。不要犹豫,要求专业的麻醉和兽医帮助。坚持在缝合切除前后对动物进行日常视觉监测至关重要。即使头骨的皮肤厚、丰、松,气瓶的固定也会引起较大的张力。如果缝合线过早切除,伤口可能会重新开放,还需要一周的缝合和新的抗生素治疗。如果伤口线外出现脱体,外科医生必须考虑是否可能进行缝合。如果没有,必须考虑样品拒绝。

除了协议部分中描述的关键步骤外,以下详细信息可能有助于正确实现此协议。从技术角度来看,由于使用的兔子是幼小的,因此使用两步插管非常重要,如协议中所述。第二个(和最终)管太大,不能用于第一次插管,并且有"错误的方式",可能是有害甚至致命的真正风险。
根据测试的材料,从已经放置的耳IV线采集一些新鲜血液样本可能很有趣。这提供了一个很好的方法,预先注入骨替代材料与天然细胞和生长因子。新鲜凝固的血液也可能提供理想的假样。

钻取地内孔的方式,对于未来的组织学处理和组织学分析应大有裨益。实际上,只要孔在同一位置 (i),(ii) 活检的方向相似,(iii) 切割过程标准化(即相同厚度,相同的切割水平),评估的字段是等效的,并且其比较高度相关。作为标准化问题,校准材料的体积和数量以填充气缸,并预先以无菌方式准备,可能确实具有实际意义。

从科学的角度来看,根据测试的产品或假设,避免将圆柱体放在骨缝合线上可能很重要。这些结构中存在一些特定的干细胞35,不同于参与膜内造血机制的间质骨干细胞,即在骨面区域遇到的骨再生过程。因此,在放置不当的情况下,可能会出现真正的偏差。

千数模型的主要优点之一是使用活的微断层扫描法,通过这种微断层扫描,骨骼生长可以跟随单个动物作为纵向研究。这种策略可能大大减少安乐死动物的数量,因此尊重"3R规则"36。根据所使用的显微图仪(分辨率、可供动物使用的空间),麻醉策略(IV、气体等)以及图像分辨率和结果分析的相关性将发生变化。
我们经常使用专用于动物实验的显像仪(例如,量子GX)进行常规检查。典型的实验从镇颤开始,如步骤 2.3.1 中所述。麻醉然后维持与2%的异常在纯氧。这使得动物在大约14分钟的扫描时间(99 kV/88 μA,分辨率为20μm)期间能够平静地呼吸;这足以检查基本参数(移植、圆柱固定、骨骼生长的半定量分析等)。在寻找精确的定性和定量分析时,需要对扫描时间、分辨率、麻醉和动物定位进行非常微调。

为评估成骨传导、成骨、成骨诱导以及血管生成而开发的现有模型很多,特别是在面部。出于伦理和经济方面的考虑,我们的目的将仅限于兔子或较小的动物。除头骨外,可以测试材料的地点是Mandibulla 37、38、39、40、41、42、43 44,45,46,47,糖尿病48或切口插座 (拔牙后)49,50, 51。大鼠、老鼠、豚鼠和兔子可用于下面描述的每种模型。简单地说,一个关键缺陷被钻孔(或插座通过精吸产生),填充材料样品,然后覆盖膜。除了显而易见的事实,只有两个样品可以测试在每个位置(一个样品每个下颌侧或每个切口插座),外科手术也在很大程度上更加困难和侵入性。进入现场的机会是有限的,如果一个人使用老鼠或老鼠,困难会因动物的大小而进一步增加。最后,缺陷的关键大小(即不允许自发骨骼再生的尺寸)没有很好地定义,并且因动物而异。
除了这些一般性之外,还可能产生具体的约束,这取决于受缺陷影响的解剖位置和随后的分析。例如,在颌面模型中,牙齿根存在于缺陷中。这可能会干扰材料并修改骨骼再生过程。缺陷可以放在拉面上更不端,但在这种情况下,骨头会非常薄(两个皮质贴有一个极薄的髓体空间),由此产生的缺陷体积可能太小45,46,47.鉴于这些局限性的例子,并视模型而定,在要测试的材料数量、收集的数据的质量和数量方面,可能会出现较大的偏差。

由于材料评估需要最大的标准化和校准,因此千数模型显得非常理想。检修非常简单,使用定义的气缸可促进校准和标准化,并可同时评估 4 个样品。此外,可以使用活断层扫描,最后可以预期要安乐死的动物会大大减少。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

作者感谢Geistlich AG(沃尔胡森,CH)和骨病学基金会(卢塞恩,CH)(授予n_18-049)的支持,以及全球D(布里格奈斯,FR)提供螺丝。特别感谢盖斯特利希的B.舍费尔博士。我们也感谢埃利亚内·杜布瓦和克莱尔·赫尔曼的出色组织学处理和他们的宝贵建议。最后,我们热烈感谢哈维尔·贝林、西尔维·轮盘和Pr Walid Habre的整个团队,"实验性手术Dpt",感谢他们出色的技术援助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drugs
Enrofloxacine Baytril 10% Bayer Antibiotic
Fentanyl Bischel For analgesia
Ketalar 50mg/ml Pfizer Ketamine for anesthesia
Lidohex Bichsel Lubricating gel for the eyes
Opsite Smith and Nephew 66004978 Sprayable dressing
Povidone iodine 10%, Betadine Mundipharma anti-infective agent
Propofol 2% Braun 3538710 For anesthesia
Rapidocain 2% sintetica Local anesthesia
Ringer-acetate Fresenius Kabi Volume compensation
Rompun 2% Bayer Xylazin for anesthesia
Sevoflurane 5% Abbvie For anesthesia
Sterile saline Sintetica
Temgesic Reckitt Benckiser Buprenorphine hydrochloride, analgesia
Thiopental Inresa Ospediala For anesthesia
Xylocaine 10% spray Astra Zeneca For intubation
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Fresenius Vial pilot C Imexmed Infusion pump
Heated pad Harvard Apparatus
Suction dominant 50 Medela
Suction tubing Optimus Promedical 80342.2
Surgical motor Schick dental Qube Drilling of intramedullary holes
Ventilation Maquet Servo1
Name Company Catalog Number Comments
Material
Cylinders and caps Boutyplast Customized composition: PEEK (poly ether ether ketone)
Manual self-retaining shaft GlobalD ACT1K
Mobile handle for self-retaining shaft GlobalD MTM
Self- drilling screws GlobalD VA1.2KL4 cross-drive screws composed by Titanium grade5, ISO 5832-3
Name Company Catalog Number Comments
Surgical tray
Endotracheal tube Shiley diameter 2,5mm Covidien 86233 For intubation
Endotracheal tube Shiley diameter 4,9mm Covidien 107-35G For intubation
Ethicon prolene 4-0 Ehticon 8581H Non-resorbable suture
Forceps Marcel Blanc BD027R 145 mm
Intubation catheter Cook medical Guide for intubation
Needlle holder Marcel Blanc BM008R
Needles BD Microlance3 Becton Dickinson 300300/304622 26G; 18G
Periosteal HU-Friedy P9X
Round surgical burs Patterson 78000 0.8 mm in diameter, Drilling of intramedullary holes
Scalpel Swann-Morton n°10 and n°15
Scissors Marcel Blanc 00657 180 mm
Syringes Omnifix Braun 4616057V 5ml, 10ml and 50ml
Venflon G22 Braun 42690985-01 Vasofix safety for the ear iv line

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References

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