Isolamento rapido dei macrofagi di Ganglion dorsale

Neuroscience

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Summary

Qui presentiamo un protocollo di dissociazione meccanica per isolare rapidamente i macrofagi dal ganglio della radice dorsale per la fenotipizzazione e l'analisi funzionale.

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Yu, X., Leff, J., Guan, Z. Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages. J. Vis. Exp. (151), e60023, doi:10.3791/60023 (2019).

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Abstract

Ci sono crescenti interessi per studiare le interazioni molecolari e cellulari tra le cellule immunitarie e neuroni sensoriali nei gangli della radice dorsale dopo la lesione del nervo periferico. Le cellule monocitiche periferiche, compresi i macrofagi, sono note per rispondere a una lesione tissutale attraverso la fagocitosi, la presentazione dell'antigene e il rilascio di citochine. Prove emergenti hanno implicato il contributo dei macrofagi dei gangli della radice dorsale allo sviluppo del dolore neuropatico e alla riparazione assonale nel contesto di lesioni nervose. Si desidera che la fenotipizzazione rapida (o "isolamento rapido") la risposta dei macrofagi dei gangli della radice dorsale nel contesto della lesione nervosa sia desiderata per identificare i fattori neuroimmuni sconosciuti. Qui dimostriamo come il nostro laboratorio isola rapidamente ed efficacemente i macrofagi dai gangli della radice dorsale utilizzando un protocollo di dissociazione meccanica privo di enzimi. I campioni sono conservati sul ghiaccio per tutto il massimo per limitare lo stress cellulare. Questo protocollo richiede molto meno tempo rispetto al protocollo enzimatico standard ed è stato regolarmente utilizzato per la nostra analisi di ordinamento cellulare attivata dalla fluorescenza.

Introduction

Ora ci sono notevoli prove che le cellule immunitarie contribuiscono al dolore neuropatico a seguito di lesioni nervose periferiche1,2. Le cellule monocitiche periferiche, compresi i macrofagi maturi, sono note per rispondere alle lesioni ai tessuti e all'infezione sistemica attraverso la fagocitosi, la presentazione dell'antigene e il rilascio di citochine. Parallelamente all'attivazione di microglia indotta da lesioni nervose nel corno spinale, i macrofagi nei gangli della radice dorsale (DRG) si espandono in modo significativo dopo la lesione nervosa3,4. In particolare, ci sono crescenti interessi per determinare se i macrofagi contribuiscono allo sviluppo del dolore neuropatico dopo la lesione del nervo periferico interagendo con i neuroni sensoriali nel DRG5,6,7 8 (IN vio , 9 (in vie , 10 del sistema , 11.Inoltre, studi recenti implicano anche il contributo dei macrofagi DRG nella riparazione assonale dopo lesioni nervose12,13. Un altro studio suggerisce inoltre che le sottopopolazioni di macrofagi (ad es. CD11b-Ly6Chi e CD11b-Ly6Clow/- cells) possono svolgere un ruolo diverso nell'ipersensibilità meccanica14. Pertanto, la rapida fenotipizzazione della risposta dei macrofagi DRG nel contesto di lesioni nervose può aiutarci a identificare i fattori neuroimmuni che contribuiscono al dolore neuropatico.

Convenzionalmente, il protocollo per isolare i macrofagi nel DRG prevede più passaggi tra cui la digestione ezimatica15,16. La tecnica richiede spesso molto tempo e può essere costosa per gli esperimenti su larga scala. Anche se la digestione lieve con collagenase di tipo II (4 mg/mL) e dispase tipo II (4,7 mg/mL) per 20 min è stato raccomandato in precedenza15, è possibile che le cellule dopo l'esposizione a questo enzima siano soggette a danni alle cellule o morte cellulare, che possono portare a fruttare. Inoltre, la differenza nella qualità degli enzimi da lotto a lotto può influire ulteriormente sull'efficienza di questo processo. Ancora più importante, i macrofagi esposti alla digestione enzimatica potrebbero essere stimolati indesiderabilmente e quindi possono essere molto diversi dallo stato in vivo. I cambiamenti possono complicare potenzialmente l'esito dello studio funzionale.

Qui descriviamo un protocollo privo di enzimi per isolare rapidamente i macrofagi DRG a 4 gradi centigradi usando la dissociazione meccanica. I campioni sono tenuti sul ghiaccio per limitare lo stress cellulare. Di conseguenza, il nostro approccio offre un vantaggio per mantenere la coerenza dell'isolamento, e le cellule isolate sono presumibilmente più sane e meno stimolate. Presentiamo inoltre le prove per convalidare la qualità delle cellule isolate con l'analisi FACS (Fluorescence-activated Cell Sorting).

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Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università della California di San Francisco e sono stati condotti in conformità con la Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.

1. Raccogliere lombare DRG da topi sperimentali

  1. Prima di iniziare l'esperimento, preparare la soluzione di lavoro del mezzo di pendenza di densità (ad esempio,Percoll) mescolando 9 volumi del mezzo con 1 volume di C./Mg- 10x HBSS. Tienilo sul ghiaccio.
  2. Anestesizzare il topo con 2,5% Avertin. Verificare che l'animale sia completamente anetizzato dalla mancanza di risposta al pizzico della zampa posteriore.
    NOTA: Sono stati utilizzati sia topi maschi che femmine di età compresa tra 6 e 8 settimane.
  3. Perfecone il mouse transcardialmente con 10 mL di PBS pre-raffreddato 1x.
    1. Posizionare il mouse in posizione supina con quattro zampe fissate con il nastro all'interno di un cappuccio di fumi chimici. Sollevare la pelle sotto la gabbia toracica dalle pinze e fare una piccola incisione con forbici chirurgiche per esporre il fegato e il diaframma.
    2. Continuare a usare le forbici per tagliare il diaframma e la gabbia toracica, aprire la cavità plemeale per esporre il cuore che batte.
    3. Tagliare rapidamente l'appendice atriale destra con le forbici dell'iride. Una volta che l'emorragia è nota, inserire un ago 30 G nell'estremità posteriore del ventricolo sinistro e iniettare lentamente 10 mL di PBS pre-raffreddato per perfondere l'animale.
  4. Eseguire la laminectomia dorsale15 sul mouse posizionato nella posizione prona.
    NOTA: Se è prevista la coltura cellulare, spruzzare il mouse con il 70% di etanolo prima dell'incisione e utilizzare strumenti chirurgici pre-sterilizzati per la dissezione.
    1. Utilizzare un bisturi taglia 11 per fare un longitudinale incisioni profonde laterali a partire dalla regione toracica fino alla regione sacrale. Rimuovere la pelle dalle forbici per esporre lo strato muscolare dorsale.
    2. Utilizzare Friedman-Pearson Rongeur per staccare i tessuti e i muscoli connettivi fino a quando non vengono esposti i processi della colonna vertebrale lumbosacrale e i processi trasversali bilaterali.
    3. Utilizzare una forbice noyes Spring per aprire con attenzione la colonna vertebrale dorsale, quindi passare a un Friedman-Pearson Rongeur per rimuovere le ossa vertebrali per esporre il midollo spinale con nervi spinali intatti attaccati.
  5. Sezionati attentamente lo zombi e il contralaterale lumbar DRG (L4/L5 DRG nel nostro studio) e posizionalo in 1 mL di Ca freddo al ghiaccio -/Mg-libero 1x HBSS in un omogeneizzatore di tessuto Dounce. Ora i tessuti sono pronti per il passaggio 2.
    NOTA: Tagliare il nervo spinale attaccato al DRG, se possibile.

2. Isolare singole cellule dal DRG lombare del mouse

  1. Omogeneizzare il tessuto DRG con un pestello sciolto nell'omogenizer Dounce 20-25 volte.
  2. Mettere un colino sterile a celle di nylon da 70 m in un tubo conico sterile da 50 ml. Sbondare il colino cellulare con 800 l di ghiaccio freddo 1x HBSS, e il flusso-attraverso viene raccolto nel tubo conico.
  3. Raccogliere la sospensione del tessuto omogeneizzato dall'omogeneizzatore utilizzando una pipetta e passare attraverso il colino bagnato di 70 m di nylon nel tubo conico da 50 mL.
  4. Sciacquare l'omogenizzatore due volte con 800 luna di ghiaccio-freddo 1x HBSS e poi decant nello stesso tubo conico 50 mL con colino cellulare per aumentare la resa.
  5. Aggiungere 1,5 mL di mezzo di pendenza isotonica a freddo equilibrato (preparato al punto 1.1) in uno sterile tubo di polistirolo FACS da 5 mL.
  6. Trasferire l'omogenea cellulare dal tubo conico da 50 mL (nel passaggio 2.4) nel tubo FACS, mescolare bene con il mezzo di gradiente di densità con tubazioni su e giù. Aggiungete altri 500 l1 l di 1x HBSS per sigillare la parte superiore.
  7. Pellet le cellule per centrifugazione a 800 x g per 20 min a 4 gradi centigradi.
  8. Aspirare con attenzione il supernatante contenente la mielina nel mezzo senza disturbare il pellet cellulare nella parte inferiore del tubo FACS.
  9. Risospendere le cellule nel buffer PBS o FACS contenente il 5% di siero bovino fetale (FBS) per l'analisi FACS.
    NOTA: sono previste almeno 50.000 celle a 100.000 celle da L4 /L5 DRG di un mouse.
    1. Risospendere le cellule DRG isolate meccanicamente (L4/L5) in 100 gradi l di PBS contenenti il 5% di siero bovino fetale per 1 h.
    2. Lavare le celle con 5 mL di PBS una volta; centrifugare le cellule 360 x g per 8 min a 4 gradi centigradi.
    3. Aspirare il supernatante, quindi risospendere il pellet cellulare in 300 - L di PBS per l'analisi FCAS. Se è pianificato l'ordinamento delle celle, sospendere le celle nel buffer FACS.

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Representative Results

Per convalidare le cellule isolate, abbiamo prima scelto i topi transgenici17(Macrophage Fas-Indotta) apoptosis . Questa linea esprime un gene di fusione suicida FK506 (FKBP)-Fas e proteina fluorescente verde (eGFP) sotto il controllo del promotore del recettore CSF1 (CSF1R), che è specificamente espresso sia nei macrofagi che nei microgli. L'iniezione sistemica di dimerizer proteico legante FK, AP20187 (AP), induce l'apoptosi delle cellule che esprimono il transgene. L'espressione di EGFP ci permette anche di monitorare i macrofagi nel DRG. Per esaurire i macrofagi nei topi MAFIA, abbiamo iniziato i nostri studi con 3 iniezioni intraperitoneali giornaliere di AP (1 mg/kg). Dopo l'ultima iniezione, DRG sono stati sezionati per l'immunostaining per GFP. Abbiamo registrato una perdita significativa di GFP- cellule nel DRG dei topi trattati con AP rispetto ai topi trattati con VEH (Figura 1A-B). In un esperimento separato, abbiamo usato questo protocollo per dissociare meccanicamente i macrofagi DRG dopo il trattamento. Successive analisi FACS hanno rivelato un esaurimento riuscito della popolazionedi GFP nei topi trattati con AP(Figura 1C-D) e hanno dimostrato l'alta qualità delle cellule isolate.

Abbiamo anche caratterizzato le cellule DRG isolate dai topi selvatici. Le cellule DRG isolate meccanicamente (L4/L5) sono state macchiate con anticorpo CX3CR1-APC a z-topi. Abbiamo scoperto che il 6% delle cellule DRG erano CX3CR1- macrofagi (Figura 2A-B). La fattibilità cellulare è stata valutata anche con Propidium Iodide (concentrazione finale di 2,5 g/ml) che si lega al DNA intracellulare delle cellule non vitali, rivelando che più dell'80% delle cellule DRG appena isolate erano vitali (Figura 2C-D).

Figure 1
Figura 1: Analisi FACS dei macrofagi nella DRG dei topi MAFIA dopo il trattamento AP.
I topi MAFIA hanno ricevuto un'iniezione intraperitale giornaliera di 1 mg/kg di AP20187 (AP) o veicolo (VEH) per 3 giorni prima dell'analisi. (A, B) Rappresentativo delle immagini immunostaining che mostrano l'esaurimento indotto da AP dei macrofagiGFP (verde) nel DRG L4/L5 dopo il trattamento 3rd AP. NF200 (blu) è stato utilizzato per etichettare i neuroni mielinati. Barra della scala: 50 m. (C, D) La percentuale di csF1R-GFPhi cells dopo la dissociazione meccanica del DRG L4/5 è stata determinata dall'analisi FACS, e un set di dati rappresentativo da tre esperimenti indipendenti è mostrato con la percentuale della popolazione di cellule gated indicata. Il risultato mostra che il 4% delle cellule isolate totali del DRG di animali trattati con VEH erano macrofagihipages GFP. Al contrario, solo lo 0,4% delle cellule DRG totali eranomacrofagi GFP in topi trattati con AP. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: caratterizzazione FACS dei macrofagi nella DRG dei topi selvatici.
(A, B) Ipsilateral l4 e L5 DRG di ingenuo topo wild-type sono stati raggruppati per la dissociazione meccanica. La percentuale di CX3CR1- macrofagi sono stati misurati dall'analisi FACS (A). L'gating per lecellule CX3CR1 si basava sulla fluorescenza di fondo nelle cellule incubate con anticorpi di controllo isotipiari coniugati APC (B). (C, D) La vitalità cellulare delle cellule DRG appena isolate è stata valutata con la colorazione DiRio Iodide (PI). Le cellule PIe le cellule (C) sono state recintate in base alla fluorescenza di fondo nelle cellule incontaminate (D). Viene mostrato un set di dati rappresentativo da tre esperimenti indipendenti con la percentuale della popolazione di cellule recintate indicata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Qui introduciamo un nuovo metodo per arricchire efficacemente i macrofagi isolati dal mouse DRG. L'approccio convenzionale per isolare le cellule immunitarie DRG richiede la digestione ezimatica15,18, che è ora sostituita con l'omogeneizzazione meccanica nel nostro protocollo per limitare i danni alle cellule indesiderate e aumentare la resa. Pertanto, il nuovo protocollo richiede molto meno tempo. Ancora più importante, la digestione enzimatica potrebbe stimolare i macrofagi e cambiare la firma molecolare. Al contrario, il nostro approccio meccanico limita notevolmente lo stress cellulare.

Utilizzando l'analisi FACS, abbiamo ulteriormente caratterizzato i macrofagi nelle cellule DRG isolate e dimostrato un grande recupero cellulare. Più dell'80% delle cellule DRG isolate nell'ambito di questo protocollo sono risultate vitali (Figura 2D). Sono previste da Almeno 50.000-100.000 celle da L4 /L5 DRG di un mouse. Pertanto, possiamo concludere con fiducia che le cellule DRG possono essere ulteriormente suddivise in sottopopolazioni di macrofagi14 per la coltura o l'isolamento dell'RNA. Tuttavia, ci sono alcuni passaggi critici che possono influenzare il rendimento. Se si nota la resa cellulare insoddisfacente, si sospetta l'omogeneizzazione insufficiente o eccessiva nel passaggio 2.1. L'entità della morte cellulare valutata con PI (Figura 2) o colorazione 7-AAD può essere utilizzata per ottimizzare il protocollo. Inoltre, la dissezione DRG nel passaggio 1.4 può richiedere pratica ripetuta per i principianti.

Attualmente, il nostro laboratorio utilizza principalmente questo protocollo per studiare i macrofagi DRG. Probabilmente, l'applicazione di questo protocollo può essere ampliata per studiare altre cellule non neuronali nel DRG, come le cellule satellitari19e le cellule T20. Sono necessari ulteriori studi per confermare l'efficacia dell'isolamento cellulare. Sfortunatamente, il nostro attuale metodo di dissociazione meccanica non è ideale per l'isolamento dei neuroni sensoriali DRG, e la digestione enzimatica rimane il metodo più efficace per l'isolamento sensoriale deineuroni 15.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti relativi a questo manoscritto.

Acknowledgments

Lo studio è stato sostenuto da: Fondazione per l'anestesia Istruzione e ricerca (XY); il Dipartimento di Anestesia e Cura Perioperatoria dell'UCSF (XY); e 1R01NS100801-01(G). Questo studio è stato sostenuto in parte da HDFCCC Laboratory for Cell Analysis Shared Resources Facility attraverso una sovvenzione del NIH (P30CA082103).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AP20187 Clontech 635058
α-mouse CX3CR1-APC antibody Biolegend 149007
Avertin Sigma T48402
Cell strainer (70 mm nylon) Falcon 352350
Centrifuge Eppendorf 5810R
Dounce tissue homogenizer Wheaton 357538 (1ml)
FACS tubes (5ml) Falcon 352052
Friedman-Pearson Rongeur FST 16121-14
HBSS (10x, Ca++/Mg++-free) Gibco 14185-052
Noyes Spring Scissor FST 15012-12
Percoll Sigma P4937-500ml
Propidium iodide Sigma P4864-10ml

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References

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