מערכת Microdrive היברידית עם בדיקה ההשבה Opto-סיליקון ו Tetrode עבור הקלטה כפול בצפיפות גבוהה בחופשיות העברת עכברים

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הבנייה של מערך microdrive היברידית המאפשר השרשה של תשעה באופן עצמאי tetrodes מתכווננת ובדיקה אחת opto-סיליקון מתכווננת בשני אזורי המוח בעכברים נעים בחופשיות. כמו כן הפגינו היא שיטה לשחזור בבטחה ושימוש חוזר במחקר opto-סיליקון למטרות מרובות.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Osanai, H., Kitamura, T., Yamamoto, J. Hybrid Microdrive System with Recoverable Opto-Silicon Probe and Tetrode for Dual-Site High Density Recording in Freely Moving Mice. J. Vis. Exp. (150), e60028, doi:10.3791/60028 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

הקלטות עצביות מרובות-אזוריות יכולות לספק מידע חיוני להבנת אינטראקציות בציר הזמן העדין בין אזורי מוח מרובים. עם זאת, עיצובים מיקרו-כונן קונבנציונלי לעתים קרובות רק לאפשר שימוש בסוג אחד של אלקטרודה להקליט מאזורים בודדים או מרובים, הגבלת התשואה של יחידה אחת או פרופיל עומק הקלטות. זה גם לעתים קרובות מגביל את היכולת לשלב הקלטות אלקטרודה עם כלים אלקטרואופטיקה למטרה מסלול ו/או תא סוג פעילות מסוימת. מוצג כאן הוא מערך מיקרו-כונן היברידית עבור עכברים נע בחופשיות כדי למטב את התשואה ותיאור של הייצור שלה ושימוש חוזר של מערך microdrive. העיצוב הנוכחי מעסיקה תשעה tetrodes ובדיקה אחת opto-סיליקון מושתל בשני אזורי מוח שונים במקביל עכברים נע בחופשיות. The tetrodes ו opto-סיליקון בדיקה מתכווננת באופן עצמאי לאורך הציר הגזובנמי במוח כדי למקסם את התשואה של היחידה ופעילויות מנופדות. מערך זה של המיקרו-כונן משלב גם הגדרת מניפולציה של אור, מניפולציות אלקטרואופטיקה מדיה כדי לחקור את סוג האזור המקומי או התאים הספציפיים הפונקציות של מעגלים עצביים ארוכת טווח. בנוסף, בדיקה opto-סיליקון ניתן לשחזר בבטחה ושימוש חוזר לאחר כל ניסוי. מכיוון שמערך המיקרו-כונן מורכב מחלקים מודפסים תלת-ממדיים, ניתן לשנות בקלות את העיצוב של המיקרו-כוננים כדי להתאים להגדרות שונות. תיאר לראשונה הוא העיצוב של מערך microdrive וכיצד לחבר את הסיבים האופטיים כדי בדיקה סיליקון עבור ניסויים אלקטרואופטיקה, ואחריו הייצור של הצרור tetrode והשרשה של המערך לתוך מוח העכבר. ההקלטה של פוטנציאל השדה המקומי ויחידה העולה בשילוב עם גירוי אלקטרואופטיקה גם להפגין היתכנות של מערכת מערך microdrive בעכברים נעים בחופשיות.

Introduction

חשוב להבין כיצד הפעילות העצבית תומכת בתהליך קוגניטיבי, כגון למידה וזיכרון, על-ידי חקירת מאזורי מוח שונים הפועלים באופן דינאמי זה עם זה. כדי להבהיר דינמיקה של הפעילות העצבית הבסיסית משימות קוגניטיביות, בקנה מידה גדול אלקטרופיזיולוגיה לחילוץ כבר נערך באופן חופשי בעלי חיים בעזרת מערכים microdrive1,2,3, ד. בשני העשורים האחרונים, מספר סוגים של מערך microdrive פותחו כדי השתל אלקטרודות לאזורים המוח מרובים עבור חולדות5,6,7,8 ועכברים9, מיכל עשור , מיכל בן 11 , 12. עם זאת, עיצובים מיקרו כונן הנוכחי בדרך כלל לא מאפשרים שימוש בסוגי בדיקה מרובים, לאלץ חוקרים לבחור סוג אלקטרודה אחת עם הטבות ומגבלות ספציפיות. לדוגמה, מערכי tetrode פועלים היטב עבור אזורי מוח מאוכלסים בצפיפות כגון ההיפוקמפוס הCA11,13, בעוד שבדיקות סיליקון נותנות פרופיל גיאומטרי טוב יותר ללמידה של חיבורים אנטומיים14 , . חמש עשרה

Tetrodes ובדיקה סיליקון משמשים לעתים קרובות בהקלטה vivo כרונית, ולכל אחד יש יתרונות וחסרונות משלו. Tetrodes הוכחו יש יתרונות משמעותיים בבידוד יחידה אחת טובה יותר מאשר אלקטרודות יחיד16,17, בנוסף האפקטיביות עלות קשיחות מכנית. הם גם מספקים תשואות גבוהות יותר של פעילות יחידה בודדת בשילוב עם microdrives8,18,19,20. חיוני להגדיל את מספר הנוירונים הנרשמים בו זמנית להבנת התפקוד של מעגלים עצביים21. לדוגמה, מספר גדול של תאים נחוצים כדי לחקור אוכלוסיות קטנות של סוגי תאים הטרוגנית פונקציונלית כגון זמן הקשור22 או תגמול קידוד23 תאים. מספרי תאים גבוהים הרבה יותר נדרשים כדי לשפר את איכות פענוח רצפי ספייק13,24,25.

Tetrodes, עם זאת, יש חיסרון בהקלטת תאים מבוזרים מרחב, כמו בקליפת המוח או תלמוס. בניגוד tetrodes, סיליקון בבדיקות יכול לספק הפצה מרחבית ואינטראקציה של פוטנציאל השדה המקומי (lfps) ופעילויות העולה בתוך מבנה מקומי14,26. Multi-shank בבדיקות סיליקון להגדיל עוד יותר את מספר אתרי ההקלטה ולאפשר הקלטה על פני מבנים יחיד או שכנים27. עם זאת, מערכים כאלה הם גמישים פחות במיקום של אתרי האלקטרודה לעומת tetrodes. בנוסף, אלגוריתמים מורכבים של מיון דקר נדרשים בבדיקות בצפיפות גבוהה כדי לחלץ מידע על הפוטנציאל הפעולה של ערוצים שכנים כדי לשקף את הנתונים שנרכשו על ידי tetrodes28,29,30. מכאן, התשואה הכוללת של יחידות יחיד היא לעתים קרובות פחות מאשר tetrodes. יתר על כן, בדיקה סיליקון הם חוסר יתרון בשל בסדר שלהם ועלות גבוהה. כך, הבחירה של tetrodes vs. סיליקון בדיקה תלוי במטרה של ההקלטה, שהיא שאלה אם קבלת תשואה גבוהה של יחידות יחיד או פרופיל מרחבי באתרי ההקלטה הוא העדיפות.

בנוסף הקלטת פעילות עצבית, מניפולציה אלקטרואופטיקה הפך לאחד כלים חזקים יותר במדעי המוח כדי לבחון כיצד סוגי תאים ספציפיים ו/או מסלולים תורמים פונקציות המעגל העצבי13,31, 32,33. עם זאת, ניסויים אלקטרואופטיקה דורשים שיקול נוסף בעיצוב מערך microdrive כדי לחבר את מחבר סיבים גירוי מקורות אור34,35,36. לעתים קרובות, חיבור סיבים אופטיים דורש כוח גדול יחסית, אשר עשוי להוביל לשינוי מכני של הגשוש במוח. לכן, זו אינה משימה טריוויאלית לשלב סיבים אופטיים מוהשתלות למערכים מיקרו-כוננים קונבנציונליים.

מהסיבות הנ ל, החוקרים נדרשים כדי למטב את הבחירה של סוג של האלקטרודה או להשתיל סיבים אופטיים בהתאם למטרה של ההקלטה. לדוגמה tetrodes משמשים כדי להשיג תשואה יחידה גבוהה יותר ההיפוקמפוס1,13, בעוד הסיליקון בדיקה משמשים כדי לחקור את פרופיל עומק למינארי של אזורים קליפת המוח, כגון קליפת entorhinal המדיאלי (MEC)37. כיום, מיקרו כוננים עבור השרשה בו של tetrodes ובבדיקות סיליקון דווחו עבור חולדות5,11. עם זאת, זה מאוד מאתגר להשתיל tetrodes מרובים ובדיקות סיליקון בעכברים בגלל המשקל של מיקרו-כוננים, שטח מוגבל על ראש העכבר, ודרישות מרחבית לעיצוב microdrives להעסיק בדיקות שונות. למרות שניתן להשתיל בדיקה סיליקון ללא microdrive, הליך זה אינו מאפשר התאמה של החללית ומפחית את שיעור ההצלחה של סיליקון-בדיקה התאוששות12,38. יתר על כן, ניסויים אלקטרואופטיקה דורשים שיקולים נוספים בעיצוב מערך microdrive. פרוטוקול זה מדגים כיצד לבנות ולשתול מערך microdrive עבור הקלטה כרונית בעכברים נעים בחופשיות, אשר מאפשר השרשה של תשעה באופן עצמאי tetrodes מתכוונן אחד opto-סיליקון לבדוק. מערך זה מיקרודרייב מקלה גם על ניסויים אלקטרואופטיקה והתאוששות של לווין הסיליקון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של המרכז הרפואי הדרום-מערבי של אוניברסיטת טקסס.

1. ההכנות של חלקי מערך מיקרו-כוננים

  1. הדפס את החלקים של מערך המיקרו-כונן במדפסת תלת-ממדית באמצעות שרף מודל דנטלי (איור 1A, B). ודא כי העובי של שכבות מודפסות בודדות תלת-ממד קטן מ-50 יקרומטר כדי לשמור על החורים הקטנים על החלקים המודפסים ברורים ומעשי.
    הערה: מערך המיקרו-כונן מורכב מחמישה חלקים (איור 1C): (1) הגוף העיקרי של מערך microdrive, הכולל תשעה מיקרודרייב-ברגים עבור tetrodes ובורג אחד עבור הסיליקון-לווין (איור 1c-d). התיאום של צרור החבילה והחור של המקדח opto-סיליקון בתחתית תלוי בקואורדינטות של אזור המוח היעד (איור 1Cd); (2) מעבורת לצרף סיליקון-בדיקה או optrode (איור 1Ce); (3) המכשיר החשמלי בחללית הר להחזיק את החיבור בדיקה סיליקון (איור 1Cf); (4) מחזיק סיבים בכלל כי התפסים לחלק המרכזי של הגוף כדי למנוע תנועות בלתי רצויות של בדיקה opto מושתל-סיליקון בעת חיבור/ניתוק מחבר סיבים אופטיים (איור 1Cg); (5) קונוס מגן המספק מיגון פיסי וחשמלי למערך המיקרו-כונן להקלטה יציבה (איור 1Ch). המשקל הכולל של מערך המיקרו-כונן הוא 5.9 g, כולל חרוט המגן (שולחן 1). אם החורים סתומים בחלקים המודפסים, לקדוח את החורים באמצעות חתיכות מקדחה: #76 עבור החורים הפנימיים ו#68 עבור החורים החיצוניים עבור ברגים tetrode-microdrive, #71 עבור מיקרודרייב מיקרו-כונן-בורג תומך החור, ו #77 עבור חורים עבור המדריך-הודעות בחלק התחתון של את הגופה
  2. החדרת הודעות מדריך לגוף מערך המיקרו-כונן.
    1. גזור 2 16 מילימטר אורך של כבל נירוסטה 26-Ga. לחדד בעדינות את הטיפים בחוט באמצעות מטחנת רוטרי.
    2. הכניסו את החוטים לחורים התחתונים של הגוף (איור 2 א). החל כמות קטנה של דבק ציאנואקרילי בתחתית הגוף כדי לאבטח את הודעות המדריך.

2. הכנה לבדיקה באמצעות סיליקון

  1. הכן את בורג המיקרו-כונן. לבדיקה של סיליקון
    הערה: בורג microdrive עבור בדיקה סיליקון מורכב בורג מותאם אישית (300 יקרומטר גובה), תמיכה צינור תמיכה, ו צינור L-צורה (איור 2b).
    1. הכן את העובש לראש המיקרו-כונן (איור 2C). כדי לבנות את העובש, הכינו את תבנית הפלסטיק המודפסת בתלת-ממד של המיקרו-כונן (איור 2Ca). ואז, יוצקים ג'ל סיליקון נוזלי לאחר יצירת קיר זמני על ידי הצבת קלטות סביב התבנית. להסיר בועות אוויר על ידי טלטול בעדינות, לחכות עד שהוא נרפא, ולאחר מכן להסיר את העובש ג'ל סיליקון מהתבנית (איור 2Cb).
    2. גזור 18 מ"מ ו 9.5 מילימטר לאורך של 23 גרם נירוסטה באמצעות מטחנת רוטרי. קשוחים העליון 2 – 3 מ"מ של החוטים עם מטחנת רוטרי כדי לשפר את הדבקה של אקריליק שיניים.
    3. קח בורג מותאם אישית אחד להחיל כמות קטנה של שמן סיליקון כדי להפחית את החיכוך עם אקריליק שיניים. הגדר את החוטים ובורג מותאם אישית לתבנית.
    4. יוצקים אקריליק שיניים לתוך העובש באמצעות מזרק לחסל בועות אוויר סביב החוטים ואת הברגים. זיהום בועות האוויר יגרום. למיקרו-כונן להיות שברירי המתן עד אקריליק שיניים הוא נרפא לחלוטין, ואז להוריד את הברגים microdrive מן העובש. לכופף 6 מ"מ של קצה חוט ארוך יותר זווית 60 מעלות באמצעות צבת.
    5. בדוק את האיכות של בורגי המיקרו-כונן (לדוגמה, סדקים, בועות אוויר וחיכוך) כדי לסובב את הבורג. אם יש חיכוך גבוה, לסובב את הבורג עד שהם הופכים להחליק באמצעות מנהל התקן בורג חשמלי עם קצה הנהג מותאם אישית, אשר זוגות עם בורג המיקרו-כונן.
    6. התקן את בורג המיקרו-כונן לתוך גוף המערך של המיקרו-כונן כדי לבדוק אם הוא נע בצורה חלקה למעלה ולמטה על-ידי הפיכת הבורג. האשכולות עבור הבורג נוצרים באופן אוטומטי בעת הכנסת הבורג לתוך חור הגוף.
  2. הכן את המעבורת (איור 3Aa).
    1. גזור שני אורכים 5 מ"מ של polyetheretherketone (להציץ) אבובים באמצעות מספריים חדים. ליישר את הצינורות בשני צידי המעבורת. הדבק את הצינורות והמעבורת באמצעות אפוקסי.
    2. החלת כמות קטנה של שמן סיליקון בהצבות המדריך. בדוק את האיכות של המעבורת על ידי הוספת על הודעות מדריך של גוף מערך microdrive. ודא שהמעבורת זזה בצורה חלקה ללא חיכוך מוגזם.
  3. הכן optorode (איור 3Ab). ניתן לדלג על שלב זה אם ניסוי אלקטרואופטיקה אינו נדרש.
    1. קליב סיבים אופטיים עד 21 מ"מ באורך באמצעות חותך אודם. לטחון את העצה סיבים כדי להפוך את הקצה שטוח ומבריק.
    2. בעדינות למקם את הסיבים האופטיים בצד הקדמי של לווין הסיליקון. טיפ סיבים ממוקם 200 – 300 יקרומטר מעל החלק העליון של אתרי האלקטרודה. החזק את הסיבים באופן זמני באמצעות סרט שקוף.
    3. הדבק את סיבים אופטיים לבסיס של סיליקון-בדיקה באמצעות כמות קטנה של אפוקסי. המתן לפחות 5 שעות עד שהאפוקסי נרפא לחלוטין.
      הערה: מומלץ לחבר את הסיבים האופטיים באותו צד כמו אתרי האלקטרודה. חיבור הסיבים בישבן עלול למנוע מהאור להאיר כראוי את אתרי ההקלטה.
  4. לצרף את המעבורת לבדוק את הסיליקון (איור 3Ac): להחיל כמות קטנה של אפוקסי בחלק האחורי של הבסיס של הסיליקון-לווין. הצמד את החלק התחתון של המעבורת אל הבסיס של הסיליקון-בדיקה, ולהחזיק בעדינות במיקום עבור 2 – 3 דקות כדי למנוע היווצרות פער בין המעבורת סיליקון-בסיס בדיקה במהלך התרופה הראשונית של אפוקסי. המתן לפחות 5 שעות עד שהאפוקסי נרפא לחלוטין.
  5. הכנס בזהירות את שפופרות ההסעות אל הודעות המדריך של הגוף העיקרי תחת המיקרוסקופ (איור 3B). במהלך הליך זה, להחזיק את החריץ של המעבורת עם פינצטה בסדר.
  6. הכנס את בורג המיקרו-כונן לתוך חור הברגים על-ידי הפיכת הבורג. לעסוק בדיקה סיליקון ו microdrive-בורג על ידי הוספת קצה חוט L-צורה לתוך החריץ של ראש המעבורת (איור 3C).
  7. חבר את מחזיק החיבור החשמלי המכשיר לגוף מערך microdrive (איור 3D).
    1. גזור שני ברגים #0 לאורך חוט 3.5 מ"מ. לטחון את הטיפים כדי להסיר burrs.
    2. הצב את מחזיק החיבור של המכשיר על הגוף. הניחו את המחבר החשמלי במכשיר הסיליקון למחזיק.
    3. אבטח את מחבר בדיקה סיליקון במחזיק באמצעות אפוקסי, והקפד לא להדביק אותו לגוף מערך microdrive כדי לאפשר את תהליך ההחלמה של הבדיקה סיליקון. הכנס את הברגים כדי להחזיק את מחזיק החיבור של המכשיר.
  8. לצרף את מחזיק ferrule הבדיקה opto-סיליקון הגוף מערך microdrive (איור 3D).
    1. גזור שני ברגים #0 לאורך חוט 6 מ"מ. לטחון את הטיפים כדי להסיר burrs.
    2. לטחון את החלק החיצוני של שני #0 מכונת בורג אגוזים לעשות אגוזים hex קטן עם 2.5 – 3.0 מילימטר בקוטר החיצוני כדי להפחית את משקל וחלל.
    3. הכנס את הברגים לרכיב A של המחזיק. הדבק את ראשי הברגים באמצעות אפוקסי.
    4. החלת כמות קטנה של משחה סיליקון לרכיב A ו-B כדי להפחית את החיכוך עם הגוף. הוסף רכיב A לתוך הגוף ולאחר מכן החזק באופן זמני את השימוש בפינצטה הפיכה.
    5. הצב את הרכיב B אל רכיב ברגים. הפתיל אגוזים המותאם אישית לתוך הברגים. להשתמש צבת כדי להדק את האגוזים כדי לאבטח את מחזיק חזיות על הגוף.
    6. הכנס את כלל הסיבים לתוך החריץ של בעל כללי הסיבים (רכיב B). ודא כי הסיבים בכלל נדבקת 4 – 5 מ"מ מבעל.
    7. החלת כמות קטנה של אפוקסי בין הסרגל לבין חריץ המחזיק. המתן עד שאפוקסי נרפא לחלוטין ובדוק כי הכלל אינו זז. בדוק את המעבורת ואת מחזיק חזיות עבור תנועה חלקה על ידי התרופפות אגוזים לפני הפיכת microdrive-בורג.
    8. בדוק את מרחק העבודה של הגשוש. ודא כי הטיפ בדיקה לחלוטין מופרע הזה בו לתוך הגוף כאשר מחזיק ferrule הוא בעמדה העליונה בעוד הצינורות המעבורת עדיין משויך המדריך-פוסטים. מרחק העבודה המקסימלי נקבע לפי אורך בדיקת הסיליקון ואזור המוח היעד.
    9. אם המיקרו-כונן-בורג רופף, להחיל כמות קטנה של אקריליק שיניים סביב הבורג כדי להוסיף יותר הליכי תמיכה. כאשר הוא נרפא, לסובב את הבורג כדי לבדוק את האטימות והיציבות.

3. הכנה לטטרגדה

הערה: הליך זה דומה למאמרים שפורסמו קודם לכן8,19,20,39.

  1. הכן את בורגי המיקרו-כונן עבור הטטרוידה. המיקרו-כונן עבור tetrode מורכב בורג המכונה מנהג 23 G (איור 2B). הליך זה דומה לסעיף 2.1.
  2. הפוך צרור של 30 צינור פלדה אל חלד כי יש 5.5 מיליון תיל בתוך. במקרה זה, סך של 9 30 G אבובים (שמונה tetrodes הקלטה אחד התייחסות אלקטרודה) שימשו.
  3. הפתיל צרור של 30 גרם מהחלק התחתון של הגוף הכונן, ולאבטח אותם עם 20 G-החומה דק צינורות לגוף הראשי. חתוך את החלק התחתון של צרור עם מטחנת רוטרי כדי להפוך את הקצה אפילו וסומק. לקצץ בחלק העליון של 30 צינורות G עם מטחנת סיבוביים כך 30 G צינור מקלות החוצה על 0.5 מ"מ מהגוף הראשי.
  4. טען 5.5 מיל פוליאימיד בידוד צינורות לתוך הצינורות 30 G. להכין חוטים tetrode ולטעון אותם לתוך לוח 32 ערוץ חשמלי ממשק (EIB). בדוק את החיבור החשמלי עם הבוחן עכבה לפני חיתוך דיוק סופי.
  5. התנגדות התחתון עצה העכבה ל 250 – 350 kΩ עם פתרון ציפוי זהב. . תתקן את כל הטטרודס עם דבק-על
  6. מילוי פער מוגזם בין צינור פוליאימיד לבין tetrode עם שמן מינרלי לאיטום ושימון. הובל את התיל הקרקעי אל EIB.
    הערה: במקרה הצורך, ניתן לשלב את הסיבים האופטיים לאורך חוטי הטיק12.

4. חיבור חרוט המגן

  1. צבע מגינים מוליכי כסף על החלק הפנימי של החרוט המודפס. הצב את מערך המיקרו-כונן בתוך החרוט (איור 3E).
  2. גזור שני ברגים #0 לאורך חוט 3.5 מ"מ. הדק את הברגים מחוץ לחרוט כדי להחזיק את מערך המיקרו-כונן במקומו.
  3. החלת צבע כסף סביב ראש הבורג כדי לחבר את קונוס המגן עם הקרקע החשמלית. תבדקו את הקישוריות החשמלית. בין חוט הקרקע לקונוס החל כמות קטנה של אפוקסי בין גוף מערך המיקרו-כונן לבין חרוט המגן כדי לחבר את הגוף בצורה מאובטחת.
    הערה: דרך נוספת להכין את קונוס המגן היא להשתמש בסרט אלומיניום40 (איור 3f). ראשית, הכן את נייר הדפוס לקונוס המגן לאחר שנדבק ברדיד אלומיניום לנייר (איור 3Fa). ואז, לגלגל את הנייר ולצרף אותו לגוף microdrive באמצעות כמות קטנה של דבק ציאנואקרילי (איור 3Fb). המשקל של חרוט זה הוא 0.72 g והמשקל הכולל של מערך microdrive מופחת ל 4.7 g (שולחן 1).

5. ניתוח שתל

הערה: הליך זה משתנה ממאמרים שפורסמו קודם לכן18,39,41 עבור השרשה באתר כפול. ודא כי המשקל של בעל החיים הוא מעל 25 g עבור השתל microdrive להתאוששות מהירה יותר לאחר הניתוח.

  1. כנה
    1. כדי להכין בורג הקרקע, לצרף את חוט הכסף לבורג הגולגולת להחיל צבע כסף. ואז, לצרף סיכת זהב לצד השני של החוט באמצעות צבע כסף.
    2. הכן את מתאם החזקת הכונן כך שיחזיק את מערך המיקרו-כונן להתקן סטריאוטקטיקה. חברו חיבור גברי לידית אל חלד באמצעות אפוקסי. ודא כי יישור של החיבור והידית אל חלד הוא ישר.
    3. במקרה כי האימות היסטולוגית נדרש לאחר ההקלטה, להחיל Di-I כדי tetrodes או הישבן של הסיליקון-בדיקה38.
    4. הנמך את הסיליקון-בדיקה למטה כדי להיות בעומק הרצוי. לשחרר את האגוזים של מחזיק חזיות באמצעות צבת, להוריד את הסיליקון-בדיקה (opto-סיליקון בדיקה) על ידי הפעלת המיקרו-בורג סיליקון של בדיקה, לאחר מכן להדק את האגוזים כדי לאבטח את המחזיק חזיות. כאשר השתילה tetrodes באזור CA1 היפוקמאל ו סיליקון-בדיקה ב-MEC, המרחק בין הצינורית tetrodes ו סיליקון-בדיקה של הטיפ הוא 3 – 4 מ"מ.
  2. הגדר את העכבר הורדם (0.8% – 1.5% isofלוריאן) במכשיר סטריאוטקאית. מצב ההרדמה של העכבר הוא אישר על ידי העדר רפלקס צביטה הבוהן. החלת משחה ברורה על העיניים כדי למנוע ייבוש. לכסות את העיניים עם פיסת נייר כסף כדי להגן מפני חשיפה חזקה באור כירורגי.
  3. חטא את הקרקפת של העכבר עם יוד ו איזופנול לאחר גילוח הפרווה. הפוך את החתך 1.5 – 2.0 ס מ על הקרקפת באמצעות מספריים כירורגי רגיל, ולהסיר את הרקמה מעל הגולגולת באמצעות מטליות כותנה לאחר תת-עורי החלת לידוקאין.
  4. יישר את ראש העכבר עם הכלי הסטריאוטקאית. ודא שהפרש הגובה בין ברסגמה לבין למדא קטן מ-100 μm. לקבוע את המיקום בפתיחת הגולגולת באמצעות אטלס ולסמן מיקומים אלה עם עיפרון מעוקר.
  5. עגן את בורגי הגולגולת (0.8 מ"מ בקוטר, 0.200 מ"מ הפתיל המגרש) על ידי סיבוב אותם 1.5 פונה (0.3 מ"מ) על הגולגולת, באמצעות מלקחיים כירורגי מברג לאחר קידוח 8 – 11 חורים בגולגולת באמצעות מקדחה בגודל של 0.5 mm.
    הערה: 2 – 4 חורים בגולגולת הקדמית, 2 – 3 חורים בכל צד של הגולגולת הקודקודית, ו 1 – 2 חורים בגולגולת הבין-קודקודית מוצעים.
  6. הצמד את בורג הקרקע אל החור על ידי סיבוב אחד להפוך (0.2 מ"מ) לאחר קידוח חור בעצם הדופן הפנימי. ודא כי החור הזה לא חודר דרך העצם לתוך המוח מקרה; אחרת, אותות המוח יזהם את ההקלטה. בדוק כי העכבה היא פחות מ 20 kΩ ב 1 kHz בין בורג הקרקע ברגים הגולגולת באמצעות מד עכבה.
    הערה: עכבה גדולה יותר תגרום למבוא של חפצי תנועה במהלך ההקלטה.
  7. בצעו את פתיחת הגולגולת. במקומות המסומנים ניתן להשאיר את הדורא ללא פגע בעכברים.
  8. חברו את הסיכה הגברית של בורג הקרקע ואת מחבר הקרקע של מערך המיקרו-כונן. בדוק את הקישוריות באמצעות מד העכבה על ידי מדידת בין בורג הקרקע לבין הגנה.
  9. הגדר את מערך המיקרו-כונן למתאם, הגדר אותו למכשיר הסטריאוטקאלי, והנמך באיטיות את לווין הסיליקון עד לעומק הרצוי. ודא כי צרורות tetrode ממוקמים מעל פני השטח המוח אבל עדיין בתוך מערך microdrive כאשר בדיקה סיליקון מוכנס למוח (איור 4A).
  10. בזהירות להחיל את משחה סיליקון כדי לאטום את האזור של לווין הסיליקון ואת הצרור tetrode (איור 4B). לשים כמות קטנה של משחה סיליקון בקצה המחט 20 G ולהחיל את גריז סביב הגששים באמצעות המחט. חזור עד שגריז סיליקון מכסה לחלוטין את האזור סביב החללית כך אקריליק שיניים אינו זורם אל או מתחת אלקטרודות/בדיקה. להיזהר לא לתת את הגריז לגעת באתרי האלקטרודה, אחרת זה יהיה באופן דרמטי להגדיל את העכבה של אתרי ההקלטה.
  11. החלת אקריליק שיניים כדי לתקן את מערך microdrive כדי ברגים עיגון בגולגולת.
    הערה: מומלץ להחיל אקריליק שיניים בשלוש שכבות כדי למנוע את החום מוגזמת המיוצר במהלך הריפוי של אקריליק.
  12. הסר את המתאם ממערך המיקרו-כונן בזהירות. הכנס 1 mL של PBS תת-עורי כדי למנוע התייבשות. הכנס 5 מ"ג/ק"ג מלוקסיאם תת-עורי כטיפול כאבים.
  13. לכסות את המחבר סיליקון-בדיקה על ידי פיסת קלטת כדי למנוע כל לכלוך להיכנס פנימה של חיבורי חשמל. כסו את מערך המיקרו-כונן באמצעות סרט פרפין פלסטי והדבק אותו במקומו.
  14. ניהול טיפול כאבים המתאים 3 ימים (למשל, זריקות תת עורית של 2 מ"ג/ק"ג מלוקסיאם פעם ביום). אפשר 3 – 5 ימים להתאוששות לפני תחילת התאמת tetrode. העכבר מושתל לאחר תקופת ההחלמה מוצג באיור 4C.

6. שחזור סיליקון-בדיקה (איור 4D)

  1. הכנס קטמין (75 מ"ג/ק"ג) ו דקדמדטומדין (1 מ"ג/ק"ג) הרדמה intraperitoneally והעדר אישור של רפלקס הבוהן. לתקן את העכבר מורדם על ידי מימוש ישיר 4% פאראמפורמלדהיד דרך הלב באמצעות ברדס. שיטות כירורגיות למכרסמים מתוארות בעבר42.
  2. שחרר את האגוזים של בעל חזיות באמצעות plier. אז, בזהירות להעביר אותו לחלק העליון של הגוף על ידי הפיכת בורג הכוונון כדי למשוך באופן מלא את הסיליקון-בדיקה לכיוון בתוך הגוף מערך microdrive. להדק את האגוזים להחזיק את הגשוש בעמדה העליונה.
  3. להוציא את המוח העכבר מלמטה על ידי פיצוח הגולגולת מהצד. מערך המיקרו-כונן מופרד כעת מהחיה.
  4. להסיר לחלוטין את בצורת המיקרו-כונן-בורג המניע את בדיקת סיליקון. לשחרר ולהוציא את האגוזים של המחזיק חזיות באמצעות צבת. תוציא את הרכיב. ממחזיק הפרשול
  5. להתיר את המחבר מחבר הגשוש וניתוק מגוף הכונן. בדוק כי מחבר הגשוש יכול לרדת מגוף מערך המיקרו-כונן.
  6. החזיקו את החלק העליון של המעבורת עם מספריים, ולאחר מכן החלק בזהירות את ההרכבה הסיליקון-בדיקה מתוך מערך microdrive.
  7. נקה את העצה בדיקה עם מנקה עדשות מגע (הראשון עם אנזים, ואז 3% חמצן מימן) עבור יום אחד לפחות. נגב בזהירות את העצה האלקטרודה באמצעות רפידות איזופנול מתחת למיקרוסקופ. שמור את הגשוש בתיבת אחסון ללא סטטי.
    הערה: המעבורת ואת הרכב בדיקה המחבר להישאר מחובר הבדיקה סיליקון ניתן להשתמש חוזר בהשתלה הבאה.
    הערה: חלק מבדיקות הסיליקון לא נסבלים עם מי חמצן מימן. במקרה זה, להשתמש בפתרון עדשות מגע המכיל אנזים פרוטנוגד חרדה בלבד.
  8. כדי לעשות שימוש חוזר בגוף מערך microdrive עבור הניתוח הבא, להסיר אקריליק שיניים באמצעות שילוב של מקדחים טיפים עדינים מצבתים. לאחר מכן, לשחזר את בורגי הגולגולת על ידי הסרת אקריליק שיניים הוסרו לאצטון. שימו לב כי אצטון ימוסס חלקי פלסטיק של מערך microdrive.
  9. הסירו את האפוקסי בין גוף המיקרו-כונן לבין חרוט המגן בעזרת אזמל.
    הערה: אין צורך להדפיס חלקים נוספים לניתוח הבא אם המיקרו-כונן אינו מקולקל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מערך המיקרו-כונן נבנה בתוך 5 ימים. ציר הזמן של הכנת המיקרו-כונן מתואר בטבלה 2. באמצעות מיקרו-כונן זה, תשעה tetrodes ואחד בדיקה סיליקון היו מושתלים לתוך היפוקמאל CA1 ו-MEC של העכבר [21 שבוע/29 משקל גוף האדם pOxr1-המין הגברי (C57BL/6 רקע)], בהתאמה. זה עכבר הטרנסגניים מבטא את היצור ב-MEC שכבה III הנוירונים באמצע. העכבר הוזרק עם 200 nL של AAV5-DIO-ChR2-YFP (titer: 7.7 x 1012 Gc/mL) לתוך MEC 10 שבועות לפני השתל אלקטרודה. LFPs נרשמו באמצעות מסנן עם מעבר נמוך (1-500 Hz), ויחידות העולה זוהו באמצעות מסנן בעל מעבר גבוה (0.8-5 kHz). גירוי קל (λ = 450 nm) בוצע באמצעות רוחב הפולס 1 ms בעוצמה 10.6 mW הנמדד בסוף מחבר סיבים. האלקטרודות התייחסות עבור ההקלטה tetrode הוצב בחומר הלבן באמצעות חוט מוקדש tetrode. ההפניה עבור הקלטת בדיקה סיליקון הוגדרה כערוץ העליון של הגשוש.

לאחר התאמת הטטרודה, נבדק ביצועים התנהגותיים במסלול ליניארי (איור 5A) ובשדה פתוח (איור 5a). בשני הניסויים, העכבר לחקור בחופשיות ~ 30 דקות (איור 5Aa, b, c; איור 5Ba, b, ג. האותות האלקטרופיסיולוגיים נרשמו בהצלחה בלי רעש חמור הקשור לתנועה במהלך ההקלטה (איור 5לספירה, e; איור 5 Bd, e). לאחר מכן, גירוי קל בוצע ב-MEC כדי לעורר את הנוירונים השלישי שכבת שכבה הפרויקט CA143 (איור 6a). פעילות העולה ספונטנית (איור 6B, C) ו lfps (איור 6b) נרשמו מן tetrodes ו הסיליקון בדיקה כאשר העכבר היה ישן. LFPs שהוקלט ב-tetrodes הראה פעילויות אדווה גדולות, והציע כי כל הטטדות היו ממוקמים בקרבת שכבת התא CA1 מידתית. לאור המושרה פעילויות תגובה נצפו לראשונה ב MEC, ואחריו ב CA1 עם השהיה 13-18 ms (איור 6E).

Figure 1
איור 1: מבט כולל על מערך Microdrive. (א) מראה שלד של מערך המיקרו-כונן, מהצד הטטרודי (a) והסיליקון-בדיקה (ב). (ב) דימוי אמיתי של מערך המיקרו-כונן שנטען, הנצפה מהצד הטטרודי (A) ומצד הסיליקון-בדיקה (ב). מערך המיקרו-כונן ממוקם על במת הג בלוח (b). (ג) חלקים של מערך מיקרו-כונן מודפס תלת-ממדי. (a-d) גוף מערך המיקרו-כונן, מוצג מארבע זוויות שונות (a: tetrode השקפה צדדית; ב: הסיליקון-לבדוק צד לבדוק; c: התצוגה העליונה; d: התצוגה התחתונה). תצוגה מוגדלת של הקו המקווקו בלוח (c) מוצגת באיור 2A. (ה) המעבורת, אשר מחזיקה ומאפשר התאמה של הסיליקון-לווין. בדיקת סיליקון מחוברת בקו המקווקו בלוח (e). (ו) מחזיק מחובר המכשיר, אשר מחזיק התחברות בדיקה סיליקון 32-channel. (ז) מחזיק סיבים, אשר מחזיק בכלל סיבים אופטיים כדי למנוע מהתנועה של הגשוש בעת חיבור/ניתוק מחבר סיבים עם מקור האור. חלק זה מורכב משני רכיבים: [פאנל (גר') ורכיבים A ו-B]. (ח) חרוט המגן המודפס, המספק מיגון פיסי וחשמלי כאשר הוא נצבע בחומר מוליך. חלון חרוט מאפשר את היכולת לראות בתוך המבנה במהלך הכנת מערך microdrive, אשר מכוסה בסופו של דבר על ידי פיסת קלטת או 3D-מודפס חומר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הכנת מדריך הודעות ובורגי microdrive על הגוף הראשי. (א) מדריך אחרי ההכנה. (א) תצוגה מוגדלת של גוף המערך המיקרו-כונן המוצג באיור 1Cc. (ב) מדריך לאחר הכניסה לתוך חורי הגוף. (ב) עיצוב מיקרודרייב-בורג. (א) המיקרו-כונן-בורג של סיליקון-בדיקה, אשר מורכב 300 יקרומטר המגרש בורג מותאם אישית, תמיכה שפופרת, וצינור L-צורה. (ב) מיקרודרייב-בורג עבור tetrode, אשר מורכב 160 יקרומטר המגרש בורג מותאם אישית 30 G מדריך נירוסטה. (ג) ייצור של החלק העליון של המיקרודרייב-ברגים: (א) הכנת דפוסים תלת-ממדיים של האנטי-עובש עבור המיקרו-כונן-בורג. התמונה מראה תבנית עבור בורג המיקרו-בדיקה של הסיליקון. (ב) העובש עשה שימוש בתבנית האנטי-עובש (a) ובחומר הסיליקון-גומי. ברגים מורכבים מיקרודרייב מיוצרים על-ידי הוספת ברגים וחוטים/שפופרת מותאמים אישית, ושפיכת אקריליק שיניים בכל באר. שיבוץ: מבט מוגדל של הבארות של העובש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הרכבת מערך Microdrive. (A) הכנת בדיקה opto-סיליקון. (א) חיבור שני צינורות מדריך פלסטיק למעבורת. (ב) הדבקת הסיב האופטי למכשיר הסיליקון. (ג) חיבור המעבורת למחקר opto-סיליקון. בתמונה זו, החלק התחתון של המעבורת (קו מקווקו) מוצמד לבסיס של הסיליקון-לווין [הישבן של (ב)]. המעבורת והסכין הסיליקון. צריכים להיות במקביל (ב) טעינת מכלול המעבורת opto-סיליקון לתוך מדריך ההודעות של הגוף מערך microdrive. (ג) מיקום יחסי של הסיליקון-בדיקת microdrive כאשר החללית הוא הוכנס לחלוטין לתוך הגוף (א) וכאשר ממוקם בנמוך ביותר בגוף הכונן (ב). התיל הצורת L מוכנס לחריץ שעל המעבורת. (ד) תצוגה מופרדת של בעל סיבים ומחזיק מחבר הגשוש. (E) חרוט המגן מוצמד. החומר המוליך נצבע בתוך החרוט. (F) מיגון אלטרנטיבי חרוט בנייר ובסרט אלומיניום. (א) נייר דפוס. (ב) חרוט מיגון חלופי מוצמד, המפחית 1.1 גרם משקל בהשוואה לגרסה המודפסת בתלת-ממד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: איטום הגששים במהלך הניתוח וההתאוששות של לווין הסיליקון. (א) מערך המיקרו-כונן וגולגולת העכבר לאחר פתיחת הגולגולת, לפני החלת שומן סיליקון. בדיקת הסיליקון הוכנסה למוח. ב -2 מ"מ בשלב זה (ב) החלת סיליקון-שומן סביב הסיליקון-בדיקה וחבילות tetrode כדי להגן על הגששים של אקריליק שיניים. (ג) העכבר מושתל באופן כרוני לאחר תקופת ההחלמה, כאשר העכבר הוא הולך (א), לטפח (ב), וכאשר מחובר כבל ההקלטה עם מערכת מאזנת הנגדית (C). (ד) לווין הסיליקון המשוחזר, לפני (א) ואחרי (ב) טבילה לתוך פתרון הניקוי. הרקמות הביולוגי ב (א) יוסרו לאחר תהליך הניקוי (b). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: דוגמאות של tetrode/סיליקון בו-הקלטה בדיקה ב היפוקמאל CA1 וקליפת entorhinal המדיאלי (MEC) מן העכבר מתנהג. (א) הקלטה על המסלול הליניארי. (א) המסלול הליניארי המשמש להמרה. (ב) מסלולים של חקר העכבר עבור ~ 30 דקות על המסלול. (ג) ביצוע התנהגותי על המסלול הליניארי. (ד-ה) הקלטות LFP מייצגים מתוך tetrode (ד) ו הסיליקון-בדיקה (e). (ב) הקלטה בשדה הפתוח. (א) תא השדה הפתוח המשמש להמרה. (ב) מסלולים של חקר העכבר עבור ~ 30 דקות בחדר. (ג) ביצוע התנהגותי בשדה הפתוח. (ד, ה) הקלטות LFP מייצגים מתוך tetrode (ד) ו הסיליקון-בדיקה (e). נורית LED מצורפת למגבר הראשי כדי להקליט את מיקומי העכבר. המסלול הליניארי וחדר השדה הפתוח מחוברים לקרקע החשמלית כדי להפחית רעש אלקטרוסטטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: התוצאות הייצוגיות של הקלטות סימולטני בCA1 ו-MEC ו-אלקטרואופטיקה. (A) ביטוי של AAV5-DIO-CHR2-yfp לאחר 4 שבועות של הזרקה. MEC שכבה III הנוירונים באמצע שלהם הפרויקט האקטונים שלהם מ-MEC לCA1. קווים מקווקווים: אוריי, שכבה אורידים; לחטט, שכבה באמצע; ראד, שכבה רדיואטום; מול, שכבה לקטנוסום מאנקולאז. (ב) נציג הקלטת ספייק מאחד הטטרודס. (א) התחזיות האשכול של קוצים שנרשמו מ-tetrode. (ב) דוגמאות לצורת הדקר הממוצעת של שלושה אשכולות, המצוינים באמצעות קווים מקווקווים ב-(א). (ג) נציג הקלטת ספייק מאחד מאתרי האלקטרודה בדיקה סיליקון. (א) התחזית אשכול דו מימדית של רכיבים עיקריים של ספייק. (ב) דוגמאות ליתד הממוצעת בצורת גל של שלושה אשכולות. אשכולות ספייק (ורוד וירוק) מופרדים מאשכולות רעש (כחול). האשכולות ב (B, C) מחושבים באמצעות תוכנת KlustaKwik. (ד) עקבות של lfps ספונטנית הקליט בו זמנית מתוך tetrodes ב CA1 (a) ובדיקה סיליקון ב MEC (ב). חיצים שחורים לציין את tetrode המוצגת (ב) ו סיליקון-בדיקה באתר אלקטרודה המוצגת (ג). (ה) lfp התגובות גירוי אופטי פעמו (10.6 mW, 1 ms; ראש חץ מלא אדום) מ tetrodes ב CA1 (a) ו סיליקון בדיקה ב MEC (ב). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

גרם/אחד ספר סכום [גרם]
הגוף הראשי 1.25 1 1.25
הסעות 0.04 1 0.04
הר התחברות בדיקה 0.19 1 0.19
מחזיק סיבי שלטון 0.1 1 0.1
המגן חרוט 1.82 1 1.82 (0.72) *
הדבקה מוליך 0.2 1 0.2
מכונת בורג (#00, 2 מ ל), להחזיק EIB 0.05 2 0.1
בורג מכונות (#0-80, 3.5 ממ) 0.06 4 0.24
בורג מכונות (#0-80, 6mm) 0.09 2 0.18
אגוז 0.03 2 0.06
מיקרודרייב (tetrode) 0.05 9 0.45
microdrive (הסיליקון בדיקה) 0.29 1 0.29
הסיליקון בדיקה 0.28 1 0.28
לוח ממשק חשמלי 0.6 1 0.6
כולל 5.8 (4.7) *

טבלה 1: משקל בודד של כל חלק מערך מיקרו-כונן. המשקל הכולל של מערך microdrive היה 5.9 g לאחר תיקון חרוט המגן עם אפוקסי (* במקרה של שימוש בקונוס מיגון חלופי באמצעות נייר וסרט אלומיניום).

נהלים זמן
הכנה למיקרו-כונן
הדפסה של חלקים תלת-ממדיים יום אחד
הכנה לאופטיקה
הכן את העובש לראש המיקרו-כונן יום אחד *
הכנת ראש מיקרודרייב שלוש שעות
חיבור סיב אופטי שלוש שעות
חיבור מעבורת שלוש שעות
הכנה להכנה
הכן את העובש לראש המיקרו-כונן יום אחד *
הכנה לראשי מיקרודרייב שלוש שעות
העמסת חוטי הטטרויד יום אחד
חיבור חרוט המגן
ציור מיגון לילה
חיבור לגוף המיקרו-כונן שלוש שעות
* ניתן לנהל הליך זה במקביל

טבלה 2: ציר הזמן של הכנת המיקרו-כונן. הדפסת 3D-parts, מחכה לריפוי גומי סיליקון/שיניים אקריליק/אפוקסי, וטעינת חוטי tetrode לקחת את רוב הזמן של הכנת מערך microdrive, בסך הכל 4-5 ימים.

קבצים משלימים: הקבצים המשלימים כוללים נתוני דגם תלת-ממד של חמישה חלקים של מיקרו-כוננים בתבנית. sldprt ו-stl. הקבצים המקוריים של דגם תלת-ממד נוצרו באמצעות התוכנה Solidworks2003. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול מדגים כיצד לבנות ולשתול מערך microdrive היברידית המאפשר הקלטה של פעילויות עצביות משני אזורים המוח באמצעות tetrodes עצמאית מתכווננת ו סיליקון-בדיקה בעכברים מתנהגים בחופשיות. זה גם מדגים הניסויים אלקטרואופטיקה והתאוששות של בדיקה סיליקון לאחר ניסויים. בעוד בדיקה סיליקון מתכווננת33 או opto-סיליקון בדיקה36 השרשה מומחש בעבר עכברים, פרוטוקול זה יש יתרונות ברורים מערך tetrode סימולטני ו opto-סיליקון השתלת בדיקה כדי לספק גמיש בחירה של סוגי בדיקה מושתלים. סוג של החללית מושתל ניתן להחליף בהתאם למטרה של הניסוי, כגון בדיקה multi-shank27,44 או בצפיפות במיוחד נוירופיקסלים21,45. תיאום וזווית של השרשה7 ניתן לשנות בקלות בשלב עיצוב האובייקט 3d לפי הצורך. לדוגמה, אתר כפול או אפילו הקלטה משולשת האתר אפשרי במהלך משימות למידה באמצעות זיכרון מבנים הקשורים למוח, כגון ההיפוקמפוס46, הקליפה entorhinal47, הקליפה הקדמית48, האמיגדלה49, וcingulate קליפה50.

קיימים מספר הליכים קריטיים להשתלה והקלטה מוצלחים. בשל שבריאת של הבדיקות מבוססות סיליקון, כל תנודות מכני או השפעות על מערך microdrive צריך להיות ממוזער במהלך ההרכבה. לדוגמה, פתיחת החורים הסתומים באמצעות תרגיל צריך להסתיים לפני טעינת בדיקת הסיליקון לתוך מערך המיקרו-כונן. כמו כן, יש להדגיש כדי לבדוק בזהירות את הקשר הקרקע בכל שלב במהלך בניית מערך microdrive וניתוח שתל כדי להבטיח את היציבות של הנתונים המוקלטת. התקשרויות לא יציבות או התנגדות גבוהה אל הקרקע לגרום לרעשים כבדים וממצאים הקשורים בתנועה במהלך ההקלטה. עבור הקלטות יציבות, מומלץ לחכות 1-2 שבועות לאחר הניתוח כדי למנוע להיסחף אלקטרודה כי רקמת המוח מושפע לרעה על ידי ניתוח השתל. עם זאת, איכות האות על החללית סיליקון מתאושש לאחר 1-2 שבועות מן הטראומה כירורגית מבוסס על הניסיון הקודם. מומלץ להשתמש בדיור יחיד כדי למנוע נזק למערך המיקרו-כונן מושתל על ידי עכברים אחרים. עבור הניסוי אלקטרואופטיקה, חשוב לציין כי רוב סיליקון-רגשים לגרום צילום-חפצים בתגובה לגירוי באור51, בעוד אחרים נועדו למזער צילום-ממצאים52 (יש צילום-חפץ מופחת הסיליקון הזמין מסחרית).

המשקל של מערך המיקרו-כונן (5.9 g) כבד יותר מאשר מיקרוכוננים טיפוסיים המתוארים בסעיפים קודמים12,53, בעיקר בשל גוף מערך microdrive (~ 21% מהמשקל הכולל), מיגון חרוט (~ 31%), וחלקי מתכת (ברגים ואגוזים: ~ 22%). מומלץ להשתמש בעכברים עם משקולות של מעל 25 גרם (~ 2-3 חודשים בן עבור C57BL/6 עכברים54,55) לניתוח שתל, כי עכברים עם משקולות גוף נאותה נוטים להתאושש מוקדם יותר. מסיבה זו, מערך מיקרו-כונן זה עשוי להיות הפתרון הטוב ביותר עבור עכברים קטינים. בעוד התקנים כי הם 5%-10% ממשקל הגוף של העכבר מונחים לעתים קרובות להיות נסבל עבור שתלים12,56 (למרות שאין נתונים מפורסמים שפורסמו עבור זה57), מערך מיקרו-כונן זה שוקל ~ 24% של משקל הגוף של 25 גר' עכברים (~ 19% כאשר משתמשים בקונוס החלופי המתואר להלן).

עם זאת, העכברים למבוגרים מושתל הצליחו בחופשיות לנוע ולקפוץ סביב בכלובים בבית. עכברים מושתל עם משקל דומה מערך microdrive (~ 4.5 g) בעבר הוכחו לבצע את המשימה התנהגותית (משימה מבוך ליניארי) אפילו תחת הגבלת מזון13,17. החיסרון של משקל הוא לא בעיה במהלך ההקלטה, כמערכת איזון משקל נגד18,34,58 או headpost מערכת59 יתמוך מערך microdrive. בנוסף, את המשקל הכולל של מערך microdrive ניתן לצמצם על ידי הפחתת גובה או להקטין את עובי החרוט המגן ושינוי העיצוב כדי לנצל ברגים קטנים.

באמצעות חומר הדפסה 3D הנוכחי, את עובי חרוט המגן ניתן לצמצם עד ~ 0.3 מ"מ (מן העובי הנוכחי של ~ 0.6 מ"מ). גובה חרוט יכול להיות מופחת ~ 5 מ"מ כל עוד החוטים tetrode יכול עדיין להיות מכוסה. חשיפת חוטי הטטרוידה תגרום לשבר החוטים והכשל בהקלטה ארוכת הטווח. לחילופין, הכנת חרוט המגן באמצעות נייר סרט אלומיניום יכול להפחית את משקל חרוט כדי ~ 0.7 g (~ 15% של משקל כולל; מופחת 20% מהמשקל הכולל של מערך microdrive המקורי); למרות שאלה הם מעשה מסחרי עם הכוח הפיזי. בנוסף, גודל המיקרו-כונן (חרוט המגן הנוכחי: 4.2 x 4.0 x 2.6 ס"מ = ציר ראשי x ציר מינורי x גובה) יכול להיות מכשול למזון ולגישה למים אם הם מסופקים מראש כלוב החי. כל עוד הן מסופקות על רצפת הכלוב או מהקיר הצדדי, המיקרו-כונן אינו מפריע להתנהגויות טבעיות של עכברים, כגון אכילה, שתייה, טיפוח, גידול או קינון60.

לסיכום, פרוטוקול מיקרודרייב זה מספק לחוקרים בחירות גמישות להקלטה מאזורי מוח מרובים בעכברים הנעים בחופשיות להבנת הדינמיקה והפונקציות של מעגלים עצביים ארוכי טווח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת בחלקו על ידי האגודה היפנית לקידום המדע מלגות מחקר בחו ל (HO), תוכנית מלומד הוענק (TK), תוכנית מדעי הגבול האנושית (tk), הקרן לחקר המוח (TK), מדעי הפקולטה ורכישת טכנולוגיה תוכנית שמירה (TK), המוח & התנהגות מחקר הקרן (TK), ועל ידי מענק המחקר של קרן של Sumitomo (JY), NARSAD מחקר צעיר במחקר מענק (JY). אנו מודים ל-W. מארקס על הערות יקרות ערך והצעות במהלך הכנת כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#00-90 screw J.I. Morris #00-90-1/8 EIB screws
#0-80 nut Small Parts B00DGB7CT2 brass nut for holding fiber ferrule holder
#0-80 screw Small Parts B000FMZ57G brass machine screw for probe connector mount, fiber ferrule holder, and shielding cone
22 Ga polyetheretherketone tubes Small Parts SLPT-22-24 for attaching to the shuttle, 0.025 inches inner diameter
23 Ga stainless tubing Small Parts HTX-23R for tetrode
23 Ga stainless wire Small Parts HTX-23R-24-10 for L-shape/support wire
26 Ga stainless wire Small Parts GWX-0200 for guide-posts
30 Ga stainless wire Small Parts HTX-30R for tetrode
3-D CAD software package Dassault Systèmes SolidWorks 2003
3D printer FormLab Form2
5.5mil polyimide insulating tubes HPC Medical 72113900001-012
aluminum foil tape Tyco Tyco Adhesives 617022 Aluminum Foil Tape for the alternative shielding cone
conductive paste YSHIELD HSF54 for shielding cone
customized screws for silicon-probe microdrive AMT UNM1.25-HalfMoon half-moon stainless screw, 1.5 mm diameter, 300 µm thread pitch
customized screws for tetrode microdrive AMT Yamamoto_0000-160_9mm slotted stainless screw, 0.5 mm diameter, 160 µm thread pitch, custom-made to order for our design
dental acrylic Stoelting 51459
dental model resin FormLab RS-F2-DMBE-02
Dremel rotary tool Dremel model 800 a grinder
drill bit Fine Science Tool 19007-05
electric interface board Neuralynx EIB-36-Narrow
epoxy Devcon GLU-735.90 5 minutes epoxy
eye ointment Dechra Puralube Ophthalmic Ointment to prevent mice eyes from drying during surgery
fiber polishing sheet Thorlabs LFG5P for polishing the optical fiber
fine tweezers Protech International 15-368 for loading/recovering the silicon probe
gold pins Neuralynx EIB Pins Small
ground wire A-M Systems 781500 0.010 inch bare silver wire
headstage preamp Neuralynx HS-36
impedance meter BAK electronics Model IMP-2 1 kHz testing frequency
mineral oil ZONA 36-105 for lubricating screws and wires
optical fiber Doric MFC_200/260-0.22_50mm_ZF1.25(G)_FLT
Recording system Neuralynx Digital Lynx 4SX
ruby fiber scribe Thorlabs S90R for cleaving the optical fiber
silicon grease Fine Science Tool 29051-45
silicon probe Neuronexus A1x32-Edge-5mm-20-177 Fig. 3, 4A, 4B, 5
silicon probe Neuronexus A1x32-6mm-50-177 Fig. 4C
silicon probe washing solution Alcon AL10078844 contact lens cleaner
silicone lubber Smooth-On Dragon Skin 10 FAST for preparation of microdrive mold
silver paint GC electronic 22-023 silver print II coating, used for ground wires
skull screw Otto Frei 2647-10AC 0.8 mm diameter, 0.200 mm thread pitch
standard surgical scissors ROBOZ RS-5880
stereotaxic apparatus Kopf Model 942
super glue Loctite LOC230992 for applying to guide-posts
surgical tweezers ROBOZ RS-5135
Tetrode Twister Jun Yamamoto TT-01
tetrode wires Sandvik PX000004

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wilson, M. A., McNaughton, B. L. Dynamics of the hippocampal ensemble code for space. Science. 261, (5124), 1055-1058 (1993).
  2. Gothard, K. M., Skaggs, W. E., Moore, K. M., McNaughton, B. L. Binding of hippocampal CA1 neural activity to multiple reference frames in a landmark-based navigation task. The Journal of Neuroscience. 16, (2), 823-835 (1996).
  3. Keating, J. G., Gerstein, G. L. A chronic multi-electrode microdrive for small animals. Journal of Neuroscience Methods. 117, (2), 201-206 (2002).
  4. Winson, J. A compact micro-electrode assembly for recording from the freely moving rat. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 35, (2), 215-217 (1973).
  5. Michon, F., et al. Integration of silicon-based neural probes and micro-drive arrays for chronic recording of large populations of neurons in behaving animals. Journal of Neural Engineering. 13, (4), 046018 (2016).
  6. Lansink, C. S., et al. A split microdrive for simultaneous multi-electrode recordings from two brain areas in awake small animals. Journal of Neuroscience Methods. 162, (1-2), 129-138 (2007).
  7. Billard, M. W., Bahari, F., Kimbugwe, J., Alloway, K. D., Gluckman, B. J. The systemDrive: a Multisite, Multiregion Microdrive with Independent Drive Axis Angling for Chronic Multimodal Systems Neuroscience Recordings in Freely Behaving Animals. eNeuro. 5, (6), (2018).
  8. Kloosterman, F., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: drive fabrication. Journal of Visualized Experiments. (26), (2009).
  9. Lu, P. L., et al. Microdrive with Two Independent Moveable Sets for Wide-Ranging, Multi-Site, Multi-Channel Brain Recordings. Journal of Medical and Biological Engineering. 34, (4), 341-346 (2014).
  10. Haiss, F., Butovas, S. A miniaturized chronic microelectrode drive for awake behaving head restrained mice and rats. Journal of Neuroscience Methods. 187, (1), 67-72 (2010).
  11. Headley, D. B., DeLucca, M. V., Haufler, D., Pare, D. Incorporating 3D-printing technology in the design of head-caps and electrode drives for recording neurons in multiple brain regions. Journal of Neurophysiology. 113, (7), 2721-2732 (2015).
  12. Voigts, J., Siegle, J. H., Pritchett, D. L., Moore, C. I. The flexDrive: an ultra-light implant for optical control and highly parallel chronic recording of neuronal ensembles in freely moving mice. Frontiers in Systems Neuroscience. 7, 8 (2013).
  13. Yamamoto, J., Tonegawa, S. Direct Medial Entorhinal Cortex Input to Hippocampal CA1 Is Crucial for Extended Quiet Awake Replay. Neuron. 96, (1), 217-227 (2017).
  14. Schomburg, E. W., et al. Theta phase segregation of input-specific gamma patterns in entorhinal-hippocampal networks. Neuron. 84, (2), 470-485 (2014).
  15. Fernandez-Ruiz, A., et al. Entorhinal-CA3 Dual-Input Control of Spike Timing in the Hippocampus by Theta-Gamma Coupling. Neuron. 93, (5), 1213-1226 (2017).
  16. Rey, H. G., Pedreira, C., Quian Quiroga, R. Past, present and future of spike sorting techniques. Brain Research Bulletin. 119, (Pt B), 106-117 (2015).
  17. Gray, C. M., Maldonado, P. E., Wilson, M., McNaughton, B. Tetrodes markedly improve the reliability and yield of multiple single-unit isolation from multi-unit recordings in cat striate cortex. Journal of Neuroscience Methods. 63, (1-2), 43-54 (1995).
  18. Yamamoto, J., Wilson, M. A. Large-scale chronically implantable precision motorized microdrive array for freely behaving animals. Journal of Neurophysiology. 100, (4), 2430-2440 (2008).
  19. Nguyen, D. P., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly. Journal of Visualized Experiments. (26), (2009).
  20. Lu, L., Popeney, B., Dickman, J. D., Angelaki, D. E. Construction of an Improved Multi-Tetrode Hyperdrive for Large-Scale Neural Recording in Behaving Rats. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
  21. Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551, (7679), 232-236 (2017).
  22. Pastalkova, E., Itskov, V., Amarasingham, A., Buzsaki, G. Internally generated cell assembly sequences in the rat hippocampus. Science. 321, (5894), 1322-1327 (2008).
  23. Gauthier, J. L., Tank, D. W. A Dedicated Population for Reward Coding in the Hippocampus. Neuron. 99, (1), 179-193 (2018).
  24. Davidson, T. J., Kloosterman, F., Wilson, M. A. Hippocampal replay of extended experience. Neuron. 63, (4), 497-507 (2009).
  25. Gerwinn, S., Macke, J., Bethge, M. Bayesian population decoding of spiking neurons. Frontiers in Computational Neuroscience. 3, 21 (2009).
  26. Sakata, S., Harris, K. D. Laminar structure of spontaneous and sensory-evoked population activity in auditory cortex. Neuron. 64, (3), 404-418 (2009).
  27. Csicsvari, J., et al. Massively parallel recording of unit and local field potentials with silicon-based electrodes. Journal of Neurophysiology. 90, (2), 1314-1323 (2003).
  28. Harris, K. D., Quiroga, R. Q., Freeman, J., Smith, S. L. Improving data quality in neuronal population recordings. Nature Neuroscience. 19, (9), 1165-1174 (2016).
  29. Hilgen, G., et al. Unsupervised Spike Sorting for Large-Scale, High-Density Multielectrode Arrays. Cell Reports. 18, (10), 2521-2532 (2017).
  30. Rossant, C., et al. Spike sorting for large, dense electrode arrays. Nature neuroscience. 19, (4), 634-641 (2016).
  31. Iseri, E., Kuzum, D. Implantable optoelectronic probes for in vivo optogenetics. Journal of Neural Engineering. 14, (3), 031001 (2017).
  32. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11, (3), 338-346 (2014).
  33. Yamamoto, J., Suh, J., Takeuchi, D., Tonegawa, S. Successful execution of working memory linked to synchronized high-frequency gamma oscillations. Cell. 157, (4), 845-857 (2014).
  34. Rangel Guerrero, D. K., Donnett, J. G., Csicsvari, J., Kovacs, K. A. Tetrode Recording from the Hippocampus of Behaving Mice Coupled with Four-Point-Irradiation Closed-Loop Optogenetics: A Technique to Study the Contribution of Hippocampal SWR Events to Learning. eNeuro. 5, (4), (2018).
  35. Liang, L., et al. Integrated and Quick-to-Assemble (SLIQ) Hyperdrives for Functional Circuit Dissection. Frontiers in Neural Circuits. 11, 8 (2017).
  36. Chung, J., Sharif, F., Jung, D., Kim, S., Royer, S. Micro-drive and headgear for chronic implant and recovery of optoelectronic probes. Scientific Reports. 7, (1), 2773 (2017).
  37. Quilichini, P., Sirota, A., Buzsaki, G. Intrinsic circuit organization and theta-gamma oscillation dynamics in the entorhinal cortex of the rat. The Journal of Neuroscience. 30, (33), 11128-11142 (2010).
  38. Sauer, J. F., Struber, M., Bartos, M. Recording Spatially Restricted Oscillations in the Hippocampus of Behaving Mice. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
  39. Shikano, Y., Sasaki, T., Ikegaya, Y. Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials, Electrocardiogram, Electromyogram, and Breathing Rhythm from a Freely Moving Rat. Journal of Visualized Experiments. (134), (2018).
  40. Brunetti, P. M., et al. Design and fabrication of ultralight weight, adjustable multi-electrode probes for electrophysiological recordings in mice. Journal of Visualized Experiments. 91, (91), e51675 (2014).
  41. Battaglia, F. P., et al. The Lantern: an ultra-light micro-drive for multi-tetrode recordings in mice and other small animals. Journal of Neuroscience Methods. 178, (2), 291-300 (2009).
  42. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  43. Suh, J., Rivest, A. J., Nakashiba, T., Tominaga, T., Tonegawa, S. Entorhinal cortex layer III input to the hippocampus is crucial for temporal association memory. Science. 334, (6061), 1415-1420 (2011).
  44. Royer, S., et al. Multi-array silicon probes with integrated optical fibers: light-assisted perturbation and recording of local neural circuits in the behaving animal. The European Journal of Neuroscience. 31, (12), 2279-2291 (2010).
  45. Steinmetz, N. A., Koch, C., Harris, K. D., Carandini, M. Challenges and opportunities for large-scale electrophysiology with Neuropixels probes. Current Opinion in Neurobiology. 50, 92-100 (2018).
  46. Jones, M. W., Wilson, M. A. Theta rhythms coordinate hippocampal-prefrontal interactions in a spatial memory task. PLoS Biology. 3, (12), e402 (2005).
  47. Frank, L. M., Brown, E. N., Wilson, M. A. A comparison of the firing properties of putative excitatory and inhibitory neurons from CA1 and the entorhinal cortex. Journal of Neurophysiology. 86, (4), 2029-2040 (2001).
  48. Kitamura, T., et al. Eng and circuits crucial for systems consolidation of a memory. Science. 356, (6333), 73-78 (2017).
  49. McGaugh, J. L., Cahill, L., Roozendaal, B. Involvement of the amygdala in memory storage: interaction with other brain systems. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, (24), 13508-13514 (1996).
  50. Frankland, P. W., Bontempi, B., Talton, L. E., Kaczmarek, L., Silva, A. J. The involvement of the anterior cingulate cortex in remote contextual fear memory. Science. 304, (5672), 881-883 (2004).
  51. Mikulovic, S., et al. On the photovoltaic effect in local field potential recordings. Neurophotonics. 3, (1), 015002 (2016).
  52. Kuleshova, E. P. Optogenetics – New Potentials for Electrophysiology. Neuroscience and Behavioral Physiology. 49, (2), 169-177 (2019).
  53. Meng, E., Hoang, T. MEMS-enabled implantable drug infusion pumps for laboratory animal research, preclinical, and clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 64, (14), 1628-1638 (2012).
  54. Hu, S., et al. Dietary Fat, but Not Protein or Carbohydrate, Regulates Energy Intake and Causes Adiposity in Mice. Cell Metabolism. 28, (3), 415-431 (2018).
  55. Yang, Y., Smith, D. L. Jr, Keating, K. D., Allison, D. B., Nagy, T. R. Variations in body weight, food intake and body composition after long-term high-fat diet feeding in C57BL/6J mice. Obesity. 22, (10), 2147-2155 (2014).
  56. Morton, D. B., et al. Refinements in telemetry procedures. Seventh report of the BVAAWF/FRAME/RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement, Part A. Laboratory Animals. 37, (4), 261-299 (2003).
  57. Lidster, K., et al. Opportunities for improving animal welfare in rodent models of epilepsy and seizures. Journal of Neuroscience Methods. 260, 2-25 (2016).
  58. Lin, L., et al. Large-scale neural ensemble recording in the brains of freely behaving mice. Journal of Neuroscience Methods. 155, (1), 28-38 (2006).
  59. Kislin, M., et al. Flat-floored air-lifted platform: a new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents. Journal of Visualized Experiments. (88), e51869 (2014).
  60. Gaskill, B. N., Karas, A. Z., Garner, J. P., Pritchett-Corning, K. R. Nest building as an indicator of health and welfare in laboratory mice. Journal of Visualized Experiments. (82), 51012 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics