Isolatie van leukocyten van menselijke moedermelk voor gebruik in een antilichaam-afhankelijke cellulaire fagocytose test van HIV-doelwitten

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Moedermelk zendt humaan immunodeficiëntie virus (HIV), hoewel slechts ~ 15% van zuigelingen die borstvoeding krijgen door HIV-geïnfecteerde moeders geïnfecteerd raken. Borstvoeding zuigelingen nemen ~ 105− 108 maternale leukocyten dagelijks, hoewel deze cellen zijn onderonderzocht. Hier beschrijven we de isolatie van moedermelk leukocyten en een analyse van hun fagocytische capaciteit.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Powell, R. L., Fox, A. Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets. J. Vis. Exp. (151), e60149, doi:10.3791/60149 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Zelfs bij afwezigheid van antiretrovirale geneesmiddelen, wordt slechts ~ 15% van de zuigelingen die borstvoeding krijgen door HIV-geïnfecteerde moeders geïnfecteerd, wat duidt op een sterk beschermend effect van moedermelk (BM). Tenzij de toegang tot schoon water en de juiste zuigelingenvoeding betrouwbaar is, raadt de WHO het staken van de borstvoeding voor HIV-geïnfecteerde moeders niet aan. Talrijke factoren waarschijnlijk werken in tandem om BM transmissie te verminderen. Borstvoeding zuigelingen nemen ~ 105− 108 maternale leukocyten dagelijks, hoewel wat grotendeels onduidelijk blijft is de bijdrage van deze cellen aan de ANTIVIRALE kwaliteiten van BM. op dit moment waren we gericht op het isoleren van cellen van menselijke BM om te meten antilichaam-afhankelijke cellulaire fagocytose (ADCP), een van de meest essentiële en pervasieve aangeboren immuunresponsen, door BM fagocyten tegen HIV-doelwitten. Cellen werden geïsoleerd uit 5 menselijke BM monsters verkregen in verschillende stadia van de lactatie. Isolatie werd uitgevoerd via zachte centrifugeren gevolgd door zorgvuldige verwijdering van melkvet en herhaald wassen van de celpellet. Fluorescerende parels bedekt met HIV-envelop (env) epitoop werden gebruikt als doelstellingen voor analyse van ADCP. Cellen werden bevlekt met de CD45 oppervlakte marker om leukocyten te identificeren. Er werd vastgesteld dat ADCP-activiteit significant was boven controle-experimenten en reproduceerbare meetbaar met behulp van een HIV-specifiek antilichaam 830A.

Introduction

Menselijke moedermelk (BM) bestaat uit moeder cellen die > 90% levensvatbaar1. Cel samenstelling wordt sterk beïnvloed door het stadium van de lactatie, gezondheidstoestand van moeder en zuigeling, en individuele variatie, die blijft slecht begrepen1,2,3,4. Gezien het feit dat BM ~ 103− 105 leukocyten/ml bevat, kan worden geschat dat zuigelingen met borstvoeding ongeveer 105− 108 moeder leukocyten per dag innemen5. Verschillende in vivo studies hebben aangetoond dat maternale leukocyten kritische immuniteit bieden aan de zuigeling en functioneel ver buiten deze sites van initiële inname5,6,7,8 ,9,10,11. Alle maternally-afgeleide cellen ingenomen door de zuigeling hebben het potentieel om immune functies uit te voeren naast of te compenseren voor de zuigeling eigen leukocyten12.

De overdracht van moeder naar kind (MTCT) van het humaan immunodeficiëntie virus (HIV) blijft een crisis in landen met beperkte middelen. Aangezien diarree en luchtwegaandoeningen verantwoordelijk zijn voor een aanzienlijk sterftecijfer bij zuigelingen in hulpbronnen beperkte landen, en deze ziekten aanzienlijk worden verminderd door exclusieve borstvoeding, zijn de voordelen voor HIV-geïnfecteerde moeders van borstvoeding veel zwaarder dan de Risico's13,14,15. Tenzij de toegang tot schoon water en de juiste zuigelingenvoeding betrouwbaar is, raadt de WHO het staken van de borstvoeding voor HIV-geïnfecteerde moeders16niet aan. Ongeveer 100.000 MTCTs via BM komen jaarlijks voor; Toch wordt slechts ~ 15% van de zuigelingen die borstvoeding krijgen door hun HIV-geïnfecteerde moeders geïnfecteerd, wat een sterk beschermend effect van BM17,18,19,20,21suggereert. Talrijke factoren werken waarschijnlijk in tandem om transmissie te voorkomen. Belangrijk is dat HIV-specifieke antilichamen (ABS) in BM zijn gecorreleerd met verminderde MTCT en/of een verminderde baby sterfte van HIV-infectie22,23. Wat grotendeels onduidelijk blijft, is de bijdrage van de cellulaire fractie van BM aan zijn antivirale kwaliteiten.

Veel ABS vergemakkelijkt een verscheidenheid aan antivirale activiteiten die worden gemedieerd door de ' constante ' regio van het immunoglobuline molecuul, het kristalverbare fragment (FC), via interactie met FC receptoren (FcRs) gevonden op vrijwel alle aangeboren immuuncellen, vrijwel allemaal zijn te vinden in Human BM24. Antilichaam-afhankelijke cellulaire fagocytose (ADCP) is aangetoond indien nodig voor de klaring van virale infecties en is onderonderzocht in het geval van preventie van MTCT van HIV25,26,27, 28 , 29. gezien de schaarste van kennis over de potentiële bijdrage van de ADCP-activiteit door BM fagocyten aan de preventie van MTCT van HIV, hebben we ons gericht op het ontwikkelen van een rigoureuze methode om cellen te isoleren van menselijke BM om een studie te verrichten van ADCP gemedieerd door cellen uit BM verkregen in verschillende stadia van de lactatie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Elke deelnemer aan deze studie werd gerekruteerd en geïnterviewd in overeenstemming met de goedkeuring van de ethische en institutionele Review Board (IRB) met de begeleiding en toestemming van het Mount Sinai-programma voor de bescherming van menselijke proefpersonen (PPH'S) met behulp van een IRB-goedgekeurde protocol voor het verkrijgen van borst melkmonsters.

1. doel microsphere voorbereiding

  1. Selecteer een relevant doel antigen.
    Opmerking: in dit voorbeeld werd het recombinant eiwit V1V2-2F5K gebruikt, dat ontworpen was om de trimere Apex van inheemse HIV-envelop30na te bootsen.
  2. Voer biotinylatie uit met behulp van een commerciële Kit (tabel met materialen) volgens het Protocol van de fabrikant.
    1. Bereken mmol van het biotinereagens om toe te voegen aan de reactie voor een 5-voudige molaire overmaat met behulp van de formule: mmol Biotine = ml proteïne x (mg eiwit/ml eiwit) x (mmol Biotine/mg proteïne) x (5 mmol Biotine/mmol proteïne)30,31. Bereken vervolgens μL van het biotinereagens om toe te voegen met behulp van de formule: μL Biotine = mmol Biotine x (1.000.000 μL/L) x (L/10 mmol).
    2. Equilibrumbiotine op kamertemperatuur voor het openen. Los eiwitten op in 0,5 − 2,0 mL fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) volgens de bovenstaande berekening.
    3. Bereid een 10 mM-oplossing van biotinereagens in dimethylsulfoxide (DMSO) en voeg het juiste volume van 10 mM Biotine reagens toe aan de eiwit oplossing en inbroed de reactie op ijs gedurende 2 uur of bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
  3. Verwijder overtollig Biotine met proteïne concentrators (polyethersulfone [PES] membranen, 3 kDa molecuulgewicht cut-off [MWCO], 0,5 mL; Tabel met materialen) volgens de instructies van de fabrikant.
    1. Steek het monster in de bovenste kamer van de spin kolom en voeg PBS toe tot 400 μL. dop en steek deze monsterkamer in een verzamelbuis. Centrifugeer op 12.000 x g bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
    2. Gooi de doorstroming weg en voeg PBS toe aan 400 μL. herhaald centrifugeren. Gooi de doorstroming weg en voeg PBS toe aan 100 μL. meet de eiwitconcentratie door een spectrofotometer.
      Opmerking: eiwitten kunnen worden alicgeciteerd en bevroren bij-80 °C totdat ze worden gebruikt.

2. antilichaam-afhankelijke cellulaire fagocytose (ADCP) test plaat preparaat

  1. Geconjugeerde biotinyleerd proteïne tot 1 μm microsferen (' kralen '; Tabel met materialen) volgens de instructies van de fabrikant.
    1. Per plaat van geconjugeerde kralen, inbroed 6 μg eiwit met 12 μl voorraad kralen in 200 μl 0,1% boviene serumalbumine (BSA)-PBS bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, grondig zachtjes elke 20 min.
    2. Centrifugeer bij 13.000 x g gedurende 5 min. Gooi supernatant weg, Vortex zachtjes en respendeert in 1200 μL van 0,1% BSA-PBS. Herhaal de spin en spoel stap 2x. Respenderen in 1200 μL van 0,1% BSA-PBS.
  2. Aliquot 10 μL kraal oplossing per put in een ronde bodem 96-well plate. Bereid verdunningen van antilichamen of immuunsera die van belang zijn in 12 μL van 2% HBSS, meestal beginnend met 50 μg/mL antilichaam of een 1/100 serumverdunning.
    Opmerking: in de voorbeeldgegevens werd monoklonaal antilichaam (mAb) 830A gebruikt.
  3. Voeg 10 μL getitreerd antilichaam/sera toe aan de kraal plaat en incuberen gedurende 2 uur bij 37 °C. Voeg 200 μL van 2% HSA HBSS toe aan elke put en centrifuge plaat bij 2.000 x g gedurende 10 min.
  4. Verwijder voorzichtig supernatant door een snelle ommekeer en decanteren van vloeistof van de plaat putten in een gootsteen om te voorkomen dat de onzichtbare kraal pellet wordt verstoord.

3. borst melk celisolatie

  1. Verkrijgen van menselijke moedermelk van gezonde zogende vrouwen, uitgedrukt met behulp van dubbele elektronische of handmatige pompen. Isoleercellen binnen ~ 4 h van expressie, melk bij kamertemperatuur houden.
  2. Gebruik 50 mL tubes, centrifuge 50 mL melk bij 800 x g gedurende 15 min. Giet de magere melk en het vet voorzichtig af terwijl u de celpellet ongestoord verlaat. Veeg de binnenkant van de buis af met een pluisvrij doekje om alle vetten uit de buiswand te verwijderen.
  3. Voeg 10 ml 2% humane serumalbumine toe in de gebalanceerde zoutoplossing van Hank (2% HSA HBSS [zonder ca.2 + of mg+]). Rebreng de pellet door voorzichtig pipetteren om celactivatie en apoptosis te voorkomen. Breng aan op een buis van 15 mL en centrifugeer bij 450 x g gedurende 10 minuten.
  4. Giet de supernatant af en herhaal stap 1,3. Vervolgens, voorzichtig respenderen cellen in 1 − 2 mL van 2% HSA HBSS afhankelijk van verwachte celnummer, en cellen tellen door een hemocytometer of een geautomatiseerde cel teller, opmerkend ook de levensvatbaarheid van de cel.

4. ADCP-bepaling

Opmerking: hier beschreven methoden zijn aangepast van Ackerman et al.32.

  1. Voeg 50.000 vers geïsoleerde BM-cellen toe aan elke ADCP-test plaat goed in 200 μL van 2% HSA-HBSS. Inincuberen voor 2 uur bij 37 °C.
    1. Voor controle-experimenten, pre-Incubate cellen bij 37 ° c met 10 μg/mL actine remmer (cytochalasin-D), 50 μg/mL FcR-blokkerende agent (FcBlock), of een combinatie van beide vóór hun toevoeging aan de platen.
  2. Centrifuge plaat bij 930 x g gedurende 10 min. Voeg 200 μL van 2% HSA HBSS toe en herhaal centrifugeren. Verwijder voorzichtig supernatant zoals in stap 2,7 en herhaal wassen.
  3. Verwijder zorgvuldig supernatant-en vlek cellen voor levensvatbaarheid met 0,5 μg/ml (eindconcentratie) corrigeerbare levensvatbaarheid vlek 450 per put in 50 μL van 2% HSA HBSS. Inincuberen 20 min bij kamertemperatuur in het donker. Centrifuge plaat bij 930 x g gedurende 10 min en verwijder supernatant zoals in stap 2,7. Voeg 200 μL van 2% HSA HBSS en centrifuge plaat opnieuw toe, gevolgd door verwijdering van supernatant zoals in stap 2,7.
  4. Na levensvatbaarheid kleuring, vlek cellen voor leukocyten markers van belang, minimaal met een CD45-specifieke vlek zoals PE-muis anti-menselijke CD45 (kloon HI30) in een geoptimaliseerde concentratie (1 μg/μL in 50 μL van 1% BSA HBSS in de voorbeeldgegevens).
    Opmerking: eventuele Lineage-specifieke markeringen van belang kunnen worden opgenomen.
  5. Inincuberen 20 min bij kamertemperatuur in het donker. Centrifuge plaat bij 930 x g gedurende 10 min en verwijder supernatant zoals in stap 2,7. Voeg 200 μL van 1% BSA HBSS toe en herhaal centrifugeren. Verwijder supernatant. Repareer cellen in 200 μL van 0,5% formaldehyde in het donker bij kamertemperatuur gedurende 30 min of 's nachts bij 4 °C. Koel in het donker tot de analyse.

5. analyse doorstroming cytometrie

  1. Voer initiële gating uit om dubbeltjes op een forward Scatter (FSC) vs. Side Scatter (SSC) plot en puin (materiaal kleiner dan FSC = 5000) te elimineren (Zie Figuur 1). Gebruik een SSC vs. levensvatbaarheid vlek (V450 in dit geval) plot om dode cellen te elimineren (die positief zijn voor de levensvatbaarheid vlek).
  2. Gebruik een SSC vs. CD45 plot om de belangrijkste leukocyten klassen (Granulocyten, monocyten, lymfocyten) te differentiëren zoals uitvoerig beschreven33,34.
    Opmerking: deze classificatie is alleen suggestieve en Lineage-specifieke markeringen nodig zijn om te bevestigen celtype.
  3. Meet voor alle CD45 + cellen, of voor elke interesse groep van leukocyten, ADCP-activiteit door te gaten met een marker op de parel-positieve cellen in een histogram van het fluoresceïne isothiocyanaat (FITC)-kanaal, waar de fluorescerende kralen worden gedetecteerd.
    Opmerking: de negatieve controle putten waarin kralen niet zijn toegevoegd, geven aan waar de parel-positieve cellen zichtbaar zijn in het histogram en dus waar de gating marker moet worden geplaatst.
  4. Bereken ADCP scores als (mediane fluorescentie intensiteit [MFI] van parel-positieve cellen) x (% van de totale CD45 + cellen in de positieve populatie). Gebruik grafische software om scores te tekenen bij elke AB/serumconcentratie en om een Area-under-the-Curve (AUC)-analyse uit te voeren.
    Opmerking: ADCP wordt als positief beschouwd als de AUC groter is dan 3x standaarddeviatie van de ADCP Score AUC van een niet-specifieke negatieve controle mAb (in dit geval 3865).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Melk kan op kamertemperatuur of koeler worden gehouden (hoewel niet bevroren); echter, gezien het feit dat we verminderde levensvatbaarheid hebben waargenomen wanneer melk erg koud is gehouden (gegevens niet weergegeven), en dat het eenvoudiger is om te verzamelen, kort op te slaan en te vervoeren bij omgevingstemperaturen, wordt aanbevolen dat de monsters niet gekoeld worden om de variabiliteit in monster-to-sample. In melk verkregen 7 − 183 dagen post-partum, celconcentratie bepaald door geautomatiseerde celteller varieerden van 16083 − 222857 cellen/mL. Figuur 1 illustreert de gating-strategie die dubbeltjes, puin en dode cellen elimineert. De levensvatbaarheid was ~ 90 − 99%. Ongeveer 1,6 − 12,3% van de totale levende cellen waren CD45+ leukocyten (tabel 1). De meeste vermeende monocyten leek te zijn precursoren/onvolgroeide cellen zoals eerder beschreven, op basis van de suggestieve SSC vs. CD45 gating34. De vermeende monocyten werden gedefinieerd als SSClage-Intermediate/cd45laag, hoewel weinigen tentoongesteld de hogere CD45 kleuring niveaus onderscheiden van de vermeende LYMFOCYTEN populatie (SSClaag/cd45laag) meer typisch geassocieerd met bloed monocyten (Figuur 1), vergelijkbaar met eerdere studies33,34. De vermeende granulocyten werden gedefinieerd als SSCHigh/cd45Intermediate33,34 (tabel 1). Houd er rekening mee dat deze classificatie alleen suggestief is en dat Lineage-specifieke markeringen nodig zijn om het celtype te bevestigen.

De ADCP-activiteit van de vers geïsoleerde BM-cellen werd gemeten met behulp van de HIV-specifieke humane mAb 830A, die specifiek is voor de v2-regio van de HIV-envelop en zich bindt aan het V1V2-2F5K-antigeen dat hier wordt getest. ADCP-activiteit werd gemeten voor het voorbeeld hier met melk verkregen na 1 maand post-partum (Figuur 2A). Voorbeeldgegevens toont de verwachte FITC (Bead +) histogrammen gezien bij het gating op CD45+ cellen (gegevens gegenereerd met 1 μg/ml MAB wordt weergegeven). De zwarte markeringen geven de populaties aan die worden gebruikt om ADCP-scores te berekenen. In het voorbeeld van 830A gegevens (eerste paneel van Figuur 2A), percentage van CD45+ cellen en gemiddelde fluorescentie van die populatie worden getoond, die werden gebruikt om de ADCP score te berekenen met behulp van de vergelijking in stap 3,4. Cellen die vooraf zijn geïnincubeerd met actine remmer cytochalasin-D (cytoD) en/of FcR-blokkerende ABS (FcBlock) voorafgaand aan hun incubatie met de AB-gebonden/antigeen-gekoppelde kralen vertoonden ADCP-activiteit op het niveau van de controle mAb 3865 of lager, wat aangeeft dat ADCP FcR en actin-afhankelijk (Figuur 2). De ADCP-Score die voor de totale CD45+ -cellen werd bepaald was ~ 25 − 35-voudig boven de achtergrondniveaus gedefinieerd met behulp van de negatieve controle anti-Anthrax MAB 3865. Elke belangrijke subset werd ook afzonderlijk geanalyseerd. De vermeende granulocyten tentoongesteld ADCP activiteit ~ 12 − 29-fold hoger dan achtergrond. De vermeende monocyt ADCP was ~ 2 − 3-voudige boven achtergrond (Figuur 2). De vermeende lymfocyten zoals verwacht vertonen geen meetbare ADCP-activiteit (minder dan 3x standaarddeviatie van de ADCP-Score AUC van de niet-specifieke negatieve controle mAb 3865; gegevens niet weergegeven).

Figure 1
Figuur 1: monsterstroom cytometrie gegevens van cellen geïsoleerd uit moedermelk. Cellen werden verwerkt en gekleurd zoals beschreven in het protocol. (A) er werden enkele cellen afgesloten om de dubbeltjes in een FSC-H vs. FSC-a-plot te elimineren, zoals afgebeeld, waarbij ook het kleine puin < 5000 in FSC-a wordt uitgegopt. B) deze populatie werd gebruikt voor de poort op levende cellen (die niet met de levensvatbaarheid van de kleurstof vlekken) in een SSC vs. V450 (levensvatbaarheid vlek) plot. (C) deze levende cellen werden gebruikt in een FSC vs. SSC plot. De verwachte positie van niet-leukocyten, waarschijnlijk overwegend borstvlies cellen, wordt gemarkeerd ("E"). (D) hetzelfde FSC versus SSC-plot wordt alleen met CD45+ -cellen weergegeven. De belangrijkste deelverzamelingen van leukocyten die zijn genoteerd, zijn alleen vermeende identiteiten op basis van goed vastgelegde en verwachte SSC-parameters (G = granulocyten; M = monocyten; L = lymfocyten). (E) levensvatbare cellen werden gebruikt voor een SSC vs. CD45 perceel met de belangrijkste deelverzamelingen van leukocyten genoteerd. Back-gating van dit plot leverde de in panel D getoonde gegevens op. Merk op dat deze classificatie alleen suggestief is en dat Lineage-specifieke markeringen nodig zijn om het celtype te bevestigen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: voorbeeld van ADCP-gegevens met behulp van cellen geïsoleerd uit moedermelk. De uitgevoerde ADCP-test is gebaseerd op de assay die is aangepast van Ackerman et al.30. De test werd uitgevoerd zoals beschreven in het bovenstaande protocol. A) monster FITC histogrammen op 1 μg/ml MAB, met markers die de Bead/FITC + populaties aangeven die worden gebruikt om de ADCP-score te bepalen. Scores werden berekend als (MFI van parel-positieve cellen) x (% van de totale CD45+ cellen in de Bead/FITC + positieve populatie). Het eerste paneel dat mAb 830A alleen gebruikt, geeft ook het percentage van de totale CD45+ cellen aan en de gemiddelde fluorescentie intensiteitswaarde die wordt gebruikt om de ADCP-Score in dat voorbeeld te berekenen. (B) ADCP-scores bij elke met MAB verdunnen verdunde oplossing werden gebruikt om oppervlakte-onder-de-curve (AUC) waarden in grafische software te berekenen. Voor controle-experimenten, actine remmer cytochalasin-D (cytoD), FcR blokkerende agent (FcBlock), of een combinatie van beide werden vooraf geïnincubeerd met cellen voorafgaand aan hun toevoeging aan de immuuncomplexen (Zie legendes). Houd er rekening mee dat deze celclassificatie alleen suggestief is en dat Lineage-specifieke markeringen nodig zijn om het celtype te bevestigen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Monster Cellen/mL % CD45+ Granulocyten  Monocyten
1 222.857 12,3 ± 1,9 13,6 ± 3,8 65,9 ± 5,6
2 27.361 1,6 ± 0,01 25,2 ± 4,0 9,1 ± 5,6
3 161.486 3,6 ± 1,1 47,8 ± 6,8 24,3 ± 4,3
4 16.083 2,7 ± 0,1 17,9 ± 3,5 34,4 ± 1,0
5 25.155 4,0 ± 0,7 29,7 ± 2,6 20,5 ± 1,4
* van CD45+ cellen

Tabel 1: voorbeelden van typische cellen van de moedermelk cel en kenmerken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De flow cytometrie-gebaseerde techniek voor het meten van de ADCP-activiteit beschreven in dit document werd voor het eerst beschreven in 201130 en is sindsdien robuust en aangehaald in meer dan 80 studies. Het hier beschreven protocol past deze techniek voor de eerste keer aan voor gebruik met primaire BM-cellen. Eerdere studies met FC-gemedieerde functionaliteit van BM Cells zijn grotendeels beperkt tot het meten van oxidatieve uitbarstingen of op histologie gebaseerde fagocytose assays met cellen die geïsoleerd zijn van colostrum (0 − 4 dagen na de geboorte). Vrijwel geen onderzoeken hebben cellen onderzocht in humaan BM voorbij de colostrum fase. Studies waarbij colostrale-cellen werden gebruikt, hebben over het algemeen geconcludeerd dat de granulocyten in colostrum minder actief zijn dan die van bloed, die zich gedragen als een ' exudaat-cel ' die is verplaatst naar de extravasculaire ruimte35, hoewel tegenstrijdige studies gerapporteerde vergelijkbare fagocytische en bactericide capaciteiten36.

Al decennia lang werd traditionele microscopie gebruikt om BM leukocyten te identificeren, en dit type visuele identificatie kan hebben geleid tot celmisidentificatie1. Weinig studies hebben de samenstelling van BM leukocyten na de eerste maand van de lactatie vergeleken en de meesten hebben zich geconcentreerd op colostrum. Het gebruik van Flowcytometrie om cellen te identificeren is waarschijnlijk om cellen nauwkeurig te identificeren, hoewel slechts een klein aantal BM-studies zijn gedaan met behulp van deze methode, vaak met een zeer klein sample nummer. De huidige studies hebben aangegeven dat het leukocyten gehalte van BM in alle stadia van de lactatie sterk varieert, variërend van ~ 104− 7 x 105 leukocyten/ml in vroeg colostrum, tot 103− 5 x 104 leukocyten/ml in rijpe melk, Hoewel alle studies bevestigen dat de celconcentratie en de samenstelling sterk wordt beïnvloed door het stadium van de lactatie1,2,3,4,5. Als melk overgangen naar de volwassen samenstelling, neutrofiele concentratie lijkt te stijgen, hoewel dergelijke studies hebben meestal niet verlengd na de eerste maand postpartum34.

Het protocol dat hierin wordt beschreven gebruikt fluorescerende kralen als het phagocytische doelwit, hoewel het waarschijnlijk kan worden toegepast om BM ADCP te bestuderen van een verscheidenheid aan meer biologisch relevante doelen zoals immuuncomplexen en geïnfecteerde cellen, veroorzaakt door verschillende AB-isotypes en Subklassen. Een groter celkleurings paneel kan worden gebruikt om de leukocyten verder te differentiëren. Grote studies zullen essentieel zijn om een uitgebreid begrip van ADCP te ontwikkelen door deze relevante primaire cellen. Dit protocol maakt het mogelijk om ADCP door BM leukocyten op te zetten als een potentieel mechanisme voor reductie van MTCT van HIV en andere pathogenen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

We danken Dr. Susan Zolla-Pazner in het departement geneeskunde en departement microbiologie aan de Icahn school of Medicine op de berg Sinai voor manuscript Review. Het NIH/NICHD verstrekte financiering voor dit project onder grantnummer R21 HD095772-01A1. Daarnaast werd R. Powell gesteund door fondsen van de afdeling geneeskunde, afdeling besmettelijke ziekten, Icahn school of Medicine op de berg Sinaï.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 µm FluoSpheres NeutrAvidin-Labeled Microspheres  Thermo Fisher F8776
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 BD 560975
Bovine serum Albumin MP Biomedicals 8810025
Corning V-bottom polystyrene 96-well plate  Corning  3894
Cytochalasin D Sigma 22144-77-0
EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin kit  Thermo Fisher 21338
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Corning  352196
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Corning  352070
Fixable Viability Stain 450  BD 562247
Formaldehyde solution Sigma 252549 
HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red Life Technologies 14175-095
Human BD Fc Block BD 564219
Human Serum Albumin MP Biomedicals 2191349
Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers Kimberly-Clark Professional  34120
PBS 1x pH 7.4 Thermo Fisher 10010023
Polystyrene 10 mL Serological Pipettes  Corning  4488
Protein Concentrators PES, 3K MWCO, 0.5 mL Pierce 88512

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hassiotou, F., Geddes, D. T., Hartmann, P. E. Cells in human milk: state of the science. Journal of Human Lactation. 29, (2), 171-182 (2013).
  2. Lonnerdal, B. Nutritional and physiologic significance of human milk proteins. The American Journal of Clinical Nutrition. 77, (6), 1537S-1543S (2003).
  3. Butte, N. F., Garza, C., Stuff, J. E., Smith, E. O., Nichols, B. L. Effect of maternal diet and body composition on lactational performance. The American Journal of Clinical Nutrition. 39, (2), 296-306 (1984).
  4. Dewey, K. G., Finley, D. A., Lonnerdal, B. Breast milk volume and composition during late lactation (7-20 months). Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 3, (5), 713-720 (1984).
  5. Hassiotou, F., Geddes, D. T. Immune cell-mediated protection of the mammary gland and the infant during breastfeeding. Advances in Nutrition. 6, (3), 267-275 (2015).
  6. Hanson, L. A. The mother-offspring dyad and the immune system. Acta Paediatrica. 89, (3), 252-258 (2000).
  7. Wirt, D. P., Adkins, L. T., Palkowetz, K. H., Schmalstieg, F. C., Goldman, A. S. Activated and memory T lymphocytes in human milk. Cytometry. 13, (3), 282-290 (1992).
  8. Jain, L., et al. In vivo distribution of human milk leucocytes after ingestion by newborn baboons. Archives of Disease in Childhood. 64, (7 Spec No), 930-933 (1989).
  9. Zhou, L., et al. Two independent pathways of maternal cell transmission to offspring: through placenta during pregnancy and by breast-feeding after birth. Immunology. 101, (4), 570-580 (2000).
  10. Tuboly, S., Bernath, S. Intestinal absorption of colostral lymphoid cells in newborn animals. Advances in Experimental Medicine and Biology. 503, 107-114 (2002).
  11. Cabinian, A., et al. Transfer of Maternal Immune Cells by Breastfeeding: Maternal Cytotoxic T Lymphocytes Present in Breast Milk Localize in the Peyer's Patches of the Nursed Infant. PLoS ONE. 11, (6), e0156762 (2016).
  12. Filias, A., et al. Phagocytic ability of neutrophils and monocytes in neonates. BMC Pediatrics. 11, 29 (2011).
  13. Natchu, U. C., et al. Exclusive breastfeeding reduces risk of mortality in infants up to 6 mo of age born to HIV-positive Tanzanian women. The American Journal of Clinical Nutrition. 96, (5), 1071-1078 (2012).
  14. Dewey, K. G., Heinig, M. J., Nommsen-Rivers, L. A. Differences in morbidity between breast-fed and formula-fed infants. The Journal of Pediatrics. 126, (5 Pt 1), 696-702 (1995).
  15. WHO. Collaborative Study Team on the Role of Breastfeeding on the Prevention of Infant Mortality. Effect of breastfeeding on infant and child mortality due to infectious diseases in less developed countries: a pooled analysis. Lancet. 355, (9202), 451-455 (2000).
  16. World Health Organization. Updates on HIV and Infant Feeding: The Duration of Breastfeeding, and Support from Health Services to Improve Feeding Practices Among Mothers Living with HIVWHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee. World Health Organization. World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2016).
  17. Nelson, C. S., et al. Combined HIV-1 Envelope Systemic and Mucosal Immunization of Lactating Rhesus Monkeys Induces a Robust Immunoglobulin A Isotype B Cell Response in Breast Milk. Journal of Virology. 90, (10), 4951-4965 (2016).
  18. Fowler, M. G., Lampe, M. A., Jamieson, D. J., Kourtis, A. P., Rogers, M. F. Reducing the risk of mother-to-child human immunodeficiency virus transmission: past successes, current progress and challenges, and future directions. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 197, (3 Suppl), S3-S9 (2007).
  19. Shen, R., et al. Mother-to-Child HIV-1 Transmission Events Are Differentially Impacted by Breast Milk and Its Components from HIV-1-Infected Women. PLoS ONE. 10, (12), e0145150 (2015).
  20. Fouda, G. G., et al. HIV-specific functional antibody responses in breast milk mirror those in plasma and are primarily mediated by IgG antibodies. Journal of Virology. 85, (18), 9555-9567 (2011).
  21. Van de Perre, P., et al. HIV-1 reservoirs in breast milk and challenges to elimination of breast-feeding transmission of HIV-1. Science Translational Medicine. 4, (143), 143sr143 (2012).
  22. Milligan, C., Richardson, B. A., John-Stewart, G., Nduati, R., Overbaugh, J. Passively acquired antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity in HIV-infected infants is associated with reduced mortality. Cell Host & Microbe. 17, (4), 500-506 (2015).
  23. Pollara, J., et al. Association of HIV-1 Envelope-Specific Breast Milk IgA Responses with Reduced Risk of Postnatal Mother-to-Child Transmission of HIV-1. Journal of Virology. 89, (19), 9952-9961 (2015).
  24. Ackerman, M., Nimmerjahn, F. Antibody Fc. Academic Press. Cambridge, MA. (2014).
  25. Huber, V. C., Lynch, J. M., Bucher, D. J., Le, J., Metzger, D. W. Fc receptor-mediated phagocytosis makes a significant contribution to clearance of influenza virus infections. Journal of Immunology. 166, (12), 7381-7388 (2001).
  26. Fujisawa, H. Neutrophils play an essential role in cooperation with antibody in both protection against and recovery from pulmonary infection with influenza virus in mice. Journal of Virology. 82, (6), 2772-2783 (2008).
  27. Chung, K. M., Thompson, B. S., Fremont, D. H., Diamond, M. S. Antibody recognition of cell surface-associated NS1 triggers Fc-gamma receptor-mediated phagocytosis and clearance of West Nile Virus-infected cells. Journal of Virology. 81, (17), 9551-9555 (2007).
  28. Yasui, F., et al. Phagocytic cells contribute to the antibody-mediated elimination of pulmonary-infected SARS coronavirus. Virology. 454-455, 157-168 (2014).
  29. Quattrocchi, V., et al. Role of macrophages in early protective immune responses induced by two vaccines against foot and mouth disease. Antiviral Research. 92, (2), 262-270 (2011).
  30. Ackerman, M. E., et al. A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples. Journal of Immunological Methods. 366, (1-2), 8-19 (2011).
  31. Jiang, X., et al. Rationally Designed Immunogens Targeting HIV-1 gp120 V1V2 Induce Distinct Conformation-Specific Antibody Responses in Rabbits. Journal of Virology. 90, (24), 11007-11019 (2016).
  32. Sanders, R. W., et al. A next-generation cleaved, soluble HIV-1 Env trimer, BG505 SOSIP.664 gp140, expresses multiple epitopes for broadly neutralizing but not non-neutralizing antibodies. PLoS Pathogens. 9, (9), e1003618 (2013).
  33. Im, M., et al. Comparative quantitative analysis of cluster of differentiation 45 antigen expression on lymphocyte subsets. The Korean Journal of Laboratory Medicine. 31, (3), 148-153 (2011).
  34. Trend, S., et al. Leukocyte Populations in Human Preterm and Term Breast Milk Identified by Multicolour Flow Cytometry. PLoS ONE. 10, (8), e0135580 (2015).
  35. Buescher, E. S., McIlheran, S. M. Polymorphonuclear leukocytes and human colostrum: effects of in vivo and in vitro exposure. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 17, (4), 424-433 (1993).
  36. Franca, E. L., et al. Human colostral phagocytes eliminate enterotoxigenic Escherichia coli opsonized by colostrum supernatant. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 44, (1), 1-7 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics