Overvågning af ekstracellulære pH-pc'er i Biofilm på tværs af kongeriget ved hjælp af konfokalmikroskopi

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Protokollen beskriver dyrkning af biofilm på tværs af kongeriget bestående af Candida albicans og Streptococcus mutans og præsenterer en konfokalmikroskopibaseret metode til overvågning af ekstracellulær pH inde i disse biofilm.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Schlafer, S., Frost Kristensen, M. Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (155), e60270, doi:10.3791/60270 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Biofilm på tværs af kongeriget, der består af både svampe- og bakterieceller, er involveret i en række orale sygdomme, såsom endodontiske infektioner, parodontitis, slimhindeinfektioner og især tidlige barndomscaries. Under alle disse betingelser påvirker pH i biofilmmatrixen mikrober-vært interaktioner og dermed sygdomsprogression. Denne protokol beskriver en konfokal mikroskopibaseret metode til overvågning af pH-dynamikken i biofilm på tværs af kongeriget, der omfatter Candida albicans og Streptococcus mutans. Den pH-afhængige dual-emission spektrum og farvning egenskaber ratiometric sonde C-SNARF-4 udnyttes til at bestemme dråber i pH i ekstracellulære områder af biofilm. Brug af pH-ratiometri med sonden kræver et omhyggeligt udvalg af billeddannelsesparametre, en grundig kalibrering af farvestoffet og omhyggelig, tærskelbaseret efterbehandling af billeddataene. Når teknikken anvendes korrekt, giver den mulighed for hurtig vurdering af ekstracellulær pH i forskellige områder af en biofilm og dermed overvågning af både vandrette og lodrette pH-gradienter over tid. Mens brugen af konfokalmikroskopi begrænser Z-profilering til tynde biofilm på 75 μm eller derunder, er brugen af pH-ratiometri ideel til noninvasive undersøgelse af en vigtig virulensfaktor i biofilm på tværs af kongeriget.

Introduction

Biofilm på tværs af kongeriget, der omfatter både svampe- og bakteriearter, er involveret i flere patologiske tilstande i mundhulen. Candida spp. er ofte blevet isoleret fra endodontiske infektioner1 og fra parodontale læsioner2,3. I slimhindeinfektioner, streptokok arter fra mitis gruppen har vist sig at øge svampebiofilm dannelse, væv invasion, og formidling i både in vitro og murine modeller4,5,6,7. Mest interessant, oral transport af Candida spp. har vist sig at være forbundet med forekomsten af caries hos børn8. Som vist i gnaver modeller, en symbiotisk forhold mellem Streptococcus mutans og Candidas albicans øger produktionen af ekstracellulære polysaccharider og fører til dannelsen af tykkere og mere kariogene biofilm9,10.

I alle ovennævnte betingelser, især førskolekarier, er biofilmpH af betydning for sygdomsprogression, og biofilmmatrixens fremtrædende rolle for udviklingen af acidogene mikromiljøer11 kræver metoder, der gør det muligt at studere pH-ændringer i biofilm på tværs af kongeriget. Enkle og præcise konfokale mikroskopibaserede tilgange til at overvåge pH inde i bakterie12 og svampe13 biofilm er blevet udviklet. Med ratiometrisk farvestof C-SNARF-4 og tærskel-baseret billede efterbehandling, ekstracellulære pH kan bestemmes i realtid i alle tre dimensioner af en biofilm14. Sammenlignet med andre offentliggjorte teknikker til mikroskopibaseret pH-monitorering i biofilm er pH-ratiometri med C-SNARF-4 enkel og billig, fordi det ikke kræver syntese af partikler eller forbindelser, der omfatter et referencefarvestof15 eller brug af to-foton excitation16. Brugen af blot ét farvestof forhindrer problemer med sondeopdeling, fluorescerende udblødning og selektiv blegning16,17,18, mens der stadig er mulighed for en pålidelig differentiering mellem intra- og ekstracellulær pH. Endelig, inkubation med farvestoffet udføres efter biofilm vækst, som gør det muligt at studere både laboratorium og in situ-dyrkede biofilm.

Formålet med dette arbejde er at udvide anvendelsen af pH-ratiometri og tilvejebringe en metode til undersøgelse af pH-ændringer i biofilm på tværs af kongeriget. Som proof of concept anvendes metoden til at overvåge pH i bifilm af to arter bestående af S. mutans og C. albicaner, der udsættes for glukose.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokollen for spytindsamling blev gennemgået og godkendt af Aarhus Amts Etiske Komité (M-20100032).

1. Dyrkning af biofilm på tværs af kongeriget

  1. Grow S. mutans DSM 20523 og C. albicans NCPF 3179 på blod agar plader ved 37 °C under aerobe forhold.
  2. Overfør enkelte kolonier af hver organisme til reagensglas fyldt med 5 ml hjernehjerteinfusion (BHI). Vokse i 18 timer under aerobe forhold ved 37 °C.
  3. Centrifugerne stiler nattens kulturer ved 1.200 x g i 5 min. Kassér supernatanten, ophæng cellerne i fysiologisk saltvand igen, og OD550 nm justeres til 0,5 for C. albicans (~107 celler/ml) og S. mutans (~108 celler/ml). Fortynd S. mutans suspension 1:10 med sterile fysiologiske saltvand (~ 107 celler / ml).
  4. Pipette 50 μL steril spytopløsning, fremstillet efter metoden de Jong et al.19, i brøndene på en optisk bund 96-brøndplade til mikroskopi. Inkuber i 30 min ved 37 °C. Vask brøndene 3x med 100 μL steril fysiologisk saltvand. Tøm brøndene.
  5. Tilsæt 100 μL C. albicans suspension til hver brønd. Inkuber ved 37 °C i 90 min. Vask 3x med steril fysiologisk saltvand.
    BEMÆRK: Du må ikke tømme brøndene helt under vask. Efterlad et reservoir på 20 μL for at undgå for store forskydningskræfter.
  6. Der tilsættes 100 μL varmeinaktiveret føtal krease (inaktiveret ved 56 °C i 30 min. ) til hver brønd. Inkuber ved 37 °C i 2 timer. Vask 3x med steril fysiologisk saltvand. Tøm brøndene, så et reservoir på 20 μL.
  7. Tilsæt 100 μL S. mutans suspension (forberedt i trin 1.3) til hver brønd. Der tilsættes 150 μL BHI indeholdende 5% saccharose. Inkuber ved 37 °C i 24 timer eller længere. Når man dyrker ældre biofilm, skal mediet dagligt ændres til frisk BHI. I slutningen af cross-kingdom biofilm vækstfase, vaskes 5x med sterilfysiologisk saltvand.

2. Ratiometric pH Imaging

BEMÆRK: Ratiometric pH-billeddannelse skal udføres umiddelbart efter biofilmvæksten er fuldført.

  1. Ved ratiometric pH-billeddannelse skal du bruge et omvendt konfokallaserscanningsmikroskop med et 63x olie- eller vandnedsænkningsobjektiv, en 543 nm laserlinje og et spektralbilledsystem (dvs. META-detektor) for at muliggøre billeddannelse af overlappende fluorescerende signaler. Brug en kuvøse til at opvarme mikroskopscenen til 35 °C.
  2. Indstil detektoren for at sikre påvisning af grøn fluorescens fra 576−608 nm og samtidig påvisning af rød fluorescens fra 629−661 nm. Vælg en passende lasereffekt og forstærkning for at undgå over- og undereksponering.
    BEMÆRK: Eksponering af billederne ses bedst i paletbilleder med falsk farve.
  3. Indstil pinhole-størrelsen til 1 luftenhed eller en optisk skive på ~0,8 μm. Indstil billedstørrelsen til 512 x 512 pixel og scanningshastigheden til 2. Vælg et linjegennemsnit på 2 ved hjælp af middelindstillingen.
    BEMÆRK: I begyndelsen af en række eksperimenter skal du kontrollere, at de valgte mikroskopindstillinger giver en klar kontrast mellem bakterieceller, svampecellevægge, biofilmmatrix og svampecytoplasma.
  4. Der fremstilles 100 μL steril fysiologisk saltvand indeholdende 0,4 % (w/v) glukose, der er titreret til pH 7. Der fremstilles en lageropløsning af C-SNARF-4 (1 mM i dimethylsulfoxid). Farvestoffet tilsættes en endelig koncentration på 30 μM.
    FORSIGTIG: Bær nitrilhandsker ved håndtering af ratiometrisk farvestof.
  5. Tøm en af brøndene med en biofilm på tværs af kongeriget, hvilket efterlader et reservoir på 20 μL. Tilsæt den sterile saltvand, der indeholder glukose, og det ratiometriske farvestof. Placer 96-brøndspladen på mikroskopscenen, og begynd at billeddanne biofilmen.
  6. Anskaf enkelte billeder eller Z-stakke forskellige steder i biofilmen. Marker X-Y-positionen i mikroskopsoftwaren for at følge pH-ændringer i bestemte synsområder over tid. Med jævne mellemrum skal du tage billeder med laseren slukket for at korrigere for detektorforskydning.
  7. Gentag trin 2.4-2.6 til analyse af hver biofilm dyrket i en anden brønd.

3. Kalibrering af ratiometrisk farvestof

BEMÆRK: Kalibrering af farvestoffet og montering af en kalibreringskurve kan udføres på en anden dag end ratiometric pH-billeddannelse.

  1. Der fremstilles en serie med 50 mM 2-morfoethanesulfonsyre (MES) med til pH 4.0−7.8 i trin på 0,2 pH-enheder ved 35 °C. Pipette 150 μL af hver bufferopløsning i brøndene på en 96-brønds plade med optisk bund til mikroskopi.
  2. Farvestoffet til de bufferfyldte brønde på 96-brøndpladen til en endelig koncentration på 30 μM. Lad ligevægtik i 5 min.
  3. Varm mikroskopets trin op til 35 °C. Vælg de samme mikroskopindstillinger som for ratiometric pH-billeddannelse. Placer 96-brøndspladen på mikroskopscenen. Fokuser på bunden af brøndene. Anskaf to billeder (grøn og rød kanal) til alle bufferløsninger, 5 μm over bunden af brønden. Med jævne mellemrum skal du tage billeder med laseren slukket for at korrigere for detektorforskydning.
  4. Kalibreringseksperimentet udføres i treeksemplarer.
  5. Eksporter alle billeder som TIF-filer. Importere dem til dedikeret billedanalyse software (dvs. ImageJ20). Træk billederne med laseren fra derespektive billeder af bufferløsningerne ved at klikke på Proces | Billedberegner | Træk ).
    BEMÆRK: Beskære billederne, hvis det er nødvendigt, for at fjerne artefakter ved billedkanterne ved at udføre rektangulær markering ved hjælp af Billede | Beskær.
  6. Opdel billederne med den grønne kanal via billederne på den røde kanal, og beregn de gennemsnitlige fluorescensintensiteter i de resulterende billeder ved at klikke på Analysér | Histogram.
  7. Fra triplicate eksperimenter, plot den gennemsnitlige grøn / rød nøgletal mod pH. Brug dedikeret software til at passe en funktion til kalibreringsdataene (dvs. MyCurveFit).

4. Digital billedanalyse

BEMÆRK: Digital billedanalyse kan udføres når som helst efter kalibrering af farvestoffet og ratiometric pH-billeddannelse.

  1. Gem biofilmbillederne med den grønne og røde kanal i separate mapper, og omdøb begge serier af filer med sekventielle numre (f.eks. GREEN_0001). Importere billederne til dedikeret billedanalyse software (dvs. ImageJ). Klik på Analysér | Histogrammet til bestemmelse af den gennemsnitlige fluorescensintensitet i de billeder, der er taget med laseren, og trække værdien fra biofilmbillederne ved at klikke på Proces | Matematik | Træk fra.
  2. Importer 2 billedserien til dedikeret billedanalysesoftware (dvs. daime21). Udfør en tærskelbaseret segmentering af billederne på den røde kanal (Segment | Automatisk segmentering | Brugerdefineret tærskel). Indstil den "lave" tærskel over fluorescensintensiteten af svampecytoplasmaet og den "høje" tærskel under intensiteten af svampecellevæggene og bakterierne.
    BEMÆRK: Når der er valgt passende tærskler, genkendes kun ekstracelleområder som objekter.
  3. Overfør objektlaget i den segmenterede billedserie til billedserien med grøn kanal. Det kan du gøre ved at klikke på Målgruppe | Overfør objektlag.
    BEMÆRK: Hvis kontrasten mellem ekstracellulære områder og svampecytoplasma er for svag i de enkelte farvekanaler, skal du føje billedserien til den røde kanal til den røde kanalserie før segmentering ved at klikke på Rediger | Billedberegner | Addition. Udfør segmenteringen som beskrevet under 4.2, og overfør objektlaget i den segmenterede billedserie til både den grønne og den røde kanals billedserie.
  4. Anvend objekteditoren til at slette pixel, der ikke er objekter, i billedserien for den røde og grønne kanal (Visualizer | Objekteditor | I alle billeder | Slet pixel, der ikke er objektpixels). Nu er biofilm billeder er ryddet fra både bakterielle og svampeceller. Eksporter den behandlede billedserie som TIF-filer.
  5. Importer begge billedserier til ImageJ. ImageJ tildeler en intensitet på 0 til alle pixel, der ikke er objektpixels. Fjern disse pixel ved at dividere den røde billedserie (R1) af sig selv (Proces | Billedberegner | Billede 1: R1; Operation: Del; Billede 2: R1) og multiplicering af den resulterende billedserie (R2) med den oprindelige røde billedserie (Proces | Billedberegner | Billede 1: R1; Operation: Multiplicer; Billede 2: R2). Der oprettes en tredje billedserie (R3), der er identisk med R1, bortset fra det faktum, at NaN tildeles alle pixel med en intensitet på 0 i R1. Fortsæt på samme måde med den grønne billedserie.
  6. Brug filteret 'Mean' (Proces | Filtre | Gennemsnit | Radius | 1 pixel) på den røde og grønne kanalbilledserie for at kompensere for detektorstøj. Opdel billedserien for den grønne kanal efter billedserien for den røde kanal (Proces | Billedberegner | Billede 1: G3; Operation: Del; Billede 2: R3). Den resulterende billedserie (G3/R3) viser det grønne/røde forhold for alle objektpixel.
  7. Beregn det gennemsnitlige forhold for hvert billede (Analysér | Histogram). Anvend falsk farve for bedre visuel repræsentation af forholdet i billederne (Billede | Opslagstabeller). Omregne de grønne/røde forhold til pH-værdier, der anvender den funktion, der er monteret under 3,6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter 24 timer og 48 h, robuste cross-kingdom biofilm udviklet i brønden plader. C. albicans viste varierende grader af filamentous vækst, og S. mutans dannede tætte klynger på op til 35 μm i højden. Enkelte celler og kæder af S. mutans grupperet omkring svampe hyphae, og store intercellulære rum angivet tilstedeværelsen af en voluminøs matrix (Figur S1).

Kalibrering af det ratiometriske farvestof giver en asymmetrisk sigmoidalkurve13,14. Den ekstracellulære pH i biofilm faldt hurtigt i de første 5 min efter eksponering for glukose på forskellige satser i forskellige mikroskopiske synsvinkler. Derefter faldt forsuringen og nåede typisk værdier på 5,5-5,8 efter 15 min (figur 1). Replikere biofilm viste en lignende adfærd, med kun små variationer i gennemsnitlig pH(Figur S2).

Nøjagtigheden af pH-beregningerne afhænger i høj grad af et omhyggeligt valg af billedindstillinger under anskaffelse. For de pågældende biofilm viste en optisk skive på 0,8 μm sig at være ideel til at opnå den bedst mulige kontrast mellem ekstracellulære områder og svampecytoplasma (figur S3). Desuden gav en pixelstørrelse på 0,28 μm (figur S4), en pixel-dvæletid på 102,4 μs (figur S5), og et linjegennemsnit på 2 (figur S6) en god kontrast sammen med en acceptabel billedopskaffelsestid på ~1 min. Under billedefterbehandling blev alle bakterie- og svampeceller fjernet fra billederne, mens de fleste af de omkringliggende ekstracellulære områder blev inkluderet i den efterfølgende pH-analyse. Afhængigt af billedernes lysstyrke måtte der vælges forskellige øvre og nedre tærskler (figur 2).

De pH-data, der er vist i figur 1 og figur S2, blev registreret 5 μm fra grænsefladen mellem biofilmog substrat. Med stigende afstand fra substratet, og afhængigt af celletætheden i biofilm, falder fluorescensintensiteten, hvilket resulterer i en lavere kontrast mellem celler og matrix. I de tynde biofilm (~35 μm), der blev dyrket i denne undersøgelse, tillod kontrasten øverst i biofilmen imidlertid pålidelig billedanalyse (Figur S7A).

Figure 1
Figur 1: Anvendelse af pH-ratiometri i biofilm på tværs af kongeriget, der er eksponeret for glukose. (A) Et synsfelt i en plettet biofilm blev afbildet med konfokalmikroskopi, og det område, der er omfattet af bakterie- og svampeceller, blev fjernet før ratiometric-analysen. (B) PH i det ekstracellulære rum blev beregnet og visualiseret ved hjælp af en opslagstabel (16 farver). Skalastænger = 20 μm. (C) PH i de 24 h cross-kingdom biofilm faldt hurtigt ved eksponering for glukose med lidt forskellige satser i forskellige synsområder. Fejllinjer = standardafvigelse (SD). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Tærskelbaseret billedsegmentering af farvede biofilm. På grund af de lokale pH-ændringer ændres fluorescensintensiteten i biofilmene over tid. A) ogb) udviser samme mikroskopiske synsfelt efter henholdsvis 1 min og 15 min eksponering for glukose. Under billedsegmentering skal høje og lave tærskler vælges tilstrækkeligt for at eliminere alle områder, der er omfattet af bakterie- og svampeceller. C) Blå arealer blev fjernet ved den lave tærskel (40), røde områder med den høje tærskel (115). (D) Kun ekstracellulære områder blev anerkendt som objekter (omgivet af orange linjer). E) Efter eliminering af det område, der er omfattet af mikrobielle celler, kunne pH-beregningen udføres i biofilmmatrixen. Skalastænger = 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplemental Figure 1
Figur S1: Typisk 24 h cross-kingdom biofilm farves med ratiometric farvestof. Mange C. albicans celler viste filamentous vækst, mens S. mutans (gule) celler dannede tætte klynger eller lokaliseret omkring svampehyphae som enkelte celler eller kæder. Store intercellulære rum indikerede tilstedeværelsen af en voluminøs biofilmmatrix. Skalastænger = 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplemental Figure 2
Figur S2: PH-udviklingen i 24 h cross-kingdom biofilm udsat for glukose. (A),(B), ogC) PH blev bestemt ratiometi i tre replikat biofilm i 15 min efter eksponering for glukose. Efter et hurtigt pH-fald i de første 5 min faldt forsuringen, og niveauet på 5,5−5,8 blev nået efter 15 min. Der blev observeret lidt forskellige hastigheder i forskellige mikroskopiske synsfelter (hver repræsenteret ved en linje). Kalibrering af ratiometrisk sonden blev kun udført én gang. Fejllinjer = SD. Klik her for at få vist en større version af denne figur.

Supplemental Figure 3
Figur S3: Virkningen af optisk udsnitstykkelse på billedkontrasten. Billeder af farvede biofilm blev erhvervet med (A) en pinhole størrelse på 2 luftige enheder og en optisk skivetykkelse på 1,6 μm, ogb) 1 Airy Unit og en optisk skive på 0,8 μm. På 1 Airy Unit, en højere laser magt / gevinst var nødvendig for billederhvervelse, men kontrasten mellem svampecytoplasma og ekstracellulære områder forbedret. Skalastænger = 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplemental Figure 4
Figur S4: Opløsningens indvirkning på billedkontrasten. Billeder af farvede biofilm blev erhvervet med pixelstørrelser på (A) 1,12 μm ,(B) 0,56 μm,C) 0,28 μm ,(D) 0,14 μm, og (E) 0,11 μm. Reduktion af pixelstørrelsen under 0,28 μm forbedrede ikke kontrasten mellem ekstracellulære områder og svampecytoplasma. Skalastænger = 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplemental Figure 5
Figur S5: Scanningshastighedens indvirkning på billedkontrasten. Billeder af farvede biofilm blev erhvervet med pixelsvulmede tider på (A) 12,8 μs,B) 25,6 μs,C) 51,2 μs,D) 102 μs, og (E) 164 μs. Forøgelse af pixel-dwell-tiden ud over 102 μs forbedrede ikke kontrasten mellem ekstracellulære og intracellulære områder. Skalastænger = 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplemental Figure 6
Figur S6: Virkningen af gennemsnit på billedkontrast. Billeder af farvede biofilm blev erhvervet med linjegennemsnit (gennemsnit) på (A) 1, (B) 2 og (C) 4. Et linjegennemsnit på 2 gav det bedste kompromis mellem kontrast og overtagelsestid. Skalastænger = 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplemental Figure 7
Figur S7: Billedkontrast i rent svampebiofilm og biofilm på tværs af kongeriget. (A) Toppen af en plettet cross-kingdom biofilm blev afbildet 30 μm fra grænsefladen. Kontrasten mellem ekstracellulære og intracellulære områder var lavere end ved biofilmbasen, men stadig tilstrækkelig til ratiometric pH-analyse. (B) A C. albicans monospecies biofilm blev afbildet for pH ratiometri. Laser magt / gevinst kunne øges for at optimere kontrasten mellem svampecellevægge og cytoplasma. (C)I biofilm på tværs af kongeriget udelukkede de stærkt fluorescerende bakterier yderligere forøgelse af laserkraft/forstærkning. Derfor er kontrasten mellem svampecellevægge og cytoplasma mindre udtalt end i rent svampebiofilm. Skalastænger = 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Der ertidligerebeskrevet forskellige protokoller for dyrkning af biofilm på tværs af kongeriget C. albicans og Streptococcus spp. Men den nuværende opsætning fokuserer på enkle vækstbetingelser, en tidsplan forenelig med regelmæssige arbejdsdage, en afbalanceret artssammensætning og udviklingen af en voluminøs biofilmmatrix. Desuden blev 96-brøndsplader belagt med spytopløsning til at efterligne mundtlige betingelser for vedhæfte til en vis grad.

Anvendelsen af pH-ratiometri med C-SNARF-4 er en billig metode til hurtige målinger af biofilmpH, hvis fordele og ulemper er blevet drøftet i detaljer andetsteds12,26. Kort sagt giver teknikken mulighed for vurdering af pH forskellige steder inde i biofilm og dermed overvågning af horisontale pH-gradienter og pH-udvikling over tid27. Lodrette pH-profiler kan registreres, også, men penetration dybde er begrænset af brugen af konfokale mikroskopi. Derfor pH ratiometri repræsenterer en hurtigere, mere alsidig, og mindre invasive alternativ til pH mikroelektroder, som i øjeblikket er den foretrukne metode til Z-profilering af tykke biofilm28. Sammenlignet med andre mikrokopibaserede metoder til pH-optagelser i biofilm har pH-ratiometri med C-SNARF-4 den fordel, at den kun anvender én plet. Derfor omgås flere problemer, der kan opstå som følge af den differentierede fluorescerende adfærd og samspillet mellem forskelligefarvestoffer, 26.

I biofilm på tværs af kongeriget giver tærskelbaseret differentiering mellem mikrobiel biomasse og ekstracellulære områder nogle problemer sammenlignet med biofilm, der kun omfatter bakterie- eller svampeceller. Bakterieceller internalisere ratiometric farvestof og vise en lysstofrør signal i forhold til biofilm matrix, men også i forhold til svampecellevægge. Svampecellevægge synes noget lysere end biofilmmatrixen, som igen viser højere fluorescens end svampecytoplasmaet. I biofilm, der kun består af svampeceller, kan billeder erhverves med en høj lasereffekt/forstærkning, hvilket resulterer i tilstrækkelig kontrast mellem biofilmmatrixen og svampecytoplasmaet (Figur S7B). Når bakterier er til stede, laser magt / gevinst skal reduceres for at undgå overeksponering af bakterieceller(Figur S7C). Kontrasten mellem svampecytoplasma og ekstracellulære områder er derfor ikke så udtalt, og billedindstillinger som pinhole størrelse, pixelstørrelse og pixel-dvæle tid skal vælges med stor omhu for ratiometric analyse.

Som for alle mikroskopi-baserede teknikker, billedkvalitet og erhvervelse tid er omvendt korreleret. I den nuværende cross-kingdom biofilm, en billeddannelse tid på ~ 30 s, ideelt set 1 min, var nødvendig for at opnå en passende kvalitet til efterfølgende pH-analyse. Til sammenligning kan biofilm, der kun havnebakterier afbildes med tilstrækkelig kvalitet i 10 s eller mindre29. For mikroskopi analyser af biofilm vækst, struktur eller sammensætning, erhvervelse gange på 1 min ikke udgør et problem, og i mange tilfælde, dette kan også gælde for pH-optagelser. Ekstreme pH-ændringer, såsom hurtig forsuring, der observeres umiddelbart efter eksponering for glukose (ΔpH > 1 enhed/min), er imidlertid vanskelige at overvåge i biofilm på tværs af kongeriget.

Det nuværende arbejde viser, at ratiometric pH-optagelser med C-SNARF-4 er mulige i cross-kingdom biofilm bestående af S. mutans og C. albicans. Fremtidige undersøgelser kan anvende metoden til at analysere pH-ændringer i cross-kingdom biofilm med større arts mangfoldighed, især i biofilm dyrket in situ (dvs. hos børn med tidlig barndom caries)30. I denne undersøgelse blev pH i biofilmene overvåget under statiske forhold og i en begrænset observationstid på 15 min, lige efter en glukosepuls. Yderligere fremskridt kan omfatte anvendelse af en væskestrøm til at efterligne in situ betingelser tættere14,31,32. Desuden kan pH-ratiometri anvendes til at undersøge virkningen af forskellige ernæringsmæssige forhold på langsigtede pH-ændringer i biofilm på tværs af kongeriget og bidrage til at belyse biofilmpH's indvirkning på det underliggende værtsvæv. Igen, demineralisering af dental emalje i den tidlige barndom caries kan tjene som et fremtrædende eksempel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Anette Aakjær Thomsen og Javier E. Garcia er anerkendt for fremragende teknisk support. Forfatterne takker Rubens Spin-Neto for frugtbare diskussioner om billedanalyse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blood agar plates Statens Serum Institut 677
Brain heart infusion Oxoid CM1135
Brain heart infusion + 5 % sucrose BDH laboratory supplies 10274
Candida albicans National Collection of Pathogenic Fungi NCPF 3179
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270
daime: digital image analysis in microbial ecology Universität Wien N/A Freeware; V2.1; https://dome.csb.univie.ac.at/daime
Dimethyl sulfoxide Life Technologies D12345
Fetal bovine serum Gibco Life technologies 10270
GS-6R refrigerated centrifuge Beckman N/A
ImageJ National Institutes of Health N/A Freeware; V1.46r; https://imagej.nih.gov/ij
Java Oracle N/A Freeware necessary to run ImageJ; V8.0; https://java.com/en/download
µ-Plate 96 Well Black Ibidi 89626
MyCurveFit MyAssays Ltd. N/A
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer Bioworld 700728
PHM210 pH-meter Radiometer Analytical
Plan-Apochromat 63x oil immersion objective Zeiss N/A NA=1.4
SNARF®-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid Life Technologies S23920
Sterile physiological saline VWR 6404
Streptococcus mutans Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen DSM 20523
Vis-spectrophotometer V-3000PC VWR N/A
XL Incubator PeCON N/A
Zeiss LSM 510 META Zeiss N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siqueira, J. F., Sen, B. H. Fungi in endodontic infections. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontics. 97, (5), 632-641 (2004).
  2. Matic Petrovic, S., et al. Subgingival areas as potential reservoirs of different Candida spp in type 2 diabetes patients and healthy subjects. PloS One. 14, (1), 0210527 (2019).
  3. De-La-Torre, J., et al. Oral Candida colonization in patients with chronic periodontitis. Is there any relationship. Revista Iberoamericana De Micologia. 35, (3), 134-139 (2018).
  4. Xu, H., et al. Streptococcal co-infection augments Candida pathogenicity by amplifying the mucosal inflammatory response. Cellular Microbiology. 16, (2), 214-231 (2014).
  5. Xu, H., Sobue, T., Bertolini, M., Thompson, A., Dongari-Bagtzoglou, A. Streptococcus oralis and Candida albicans Synergistically Activate μ-Calpain to Degrade E-cadherin From Oral Epithelial Junctions. The Journal of Infectious Diseases. 214, (6), 925-934 (2016).
  6. Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. Characterization of mucosal Candida albicans biofilms. PloS One. 4, (11), 7967 (2009).
  7. Diaz, P. I., et al. Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model. Infection and Immunity. 80, (2), 620-632 (2012).
  8. Xiao, J., et al. Candida albicans and Early Childhood Caries: A Systematic Review and Meta-Analysis. Caries Research. 52, (1-2), 102-112 (2018).
  9. Falsetta, M. L., et al. Symbiotic relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans synergizes virulence of plaque biofilms in vivo. Infection and Immunity. 82, (5), 1968-1981 (2014).
  10. Hwang, G., et al. Candida albicans mannans mediate Streptococcus mutans exoenzyme GtfB binding to modulate cross-kingdom biofilm development in vivo. PLoS Pathogens. 13, (6), 1006407 (2017).
  11. Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm. Journal of Dental Research. 92, (12), 1065-1073 (2013).
  12. Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms. Journal of Visualized Experiments. (109), 53622 (2016).
  13. Schlafer, S., Kamp, A., Garcia, J. E. A confocal microscopy-based method to monitor extracellular pH in fungal biofilms. FEMS Yeast Research. 18, (5), (2018).
  14. Schlafer, S., Bælum, V., Dige, I. Improved pH-ratiometry for the three-dimensional mapping of pH microenvironments in biofilms under flow conditions. Journal of Microbiological Methods. 152, 194-200 (2018).
  15. Hidalgo, G., et al. Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors. Applied and Environmental Microbiology. 75, (23), 7426-7435 (2009).
  16. Vroom, J. M., et al. Depth Penetration and Detection of pH Gradients in Biofilms by Two-Photon Excitation Microscopy. Applied and Environmental Microbiology. 65, 3502-3511 (1999).
  17. Lawrence, J. R., Swerhone, G. D. W., Kuhlicke, U., Neu, T. R. In situ evidence for metabolic and chemical microdomains in the structured polymer matrix of bacterial microcolonies. FEMS Microbiology Ecology. 92, (11), (2016).
  18. Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy Environmental Science. 2, (1), 113-119 (2009).
  19. de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva. Applied and Environmental Microbiology. 47, (5), 901-904 (1984).
  20. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, (7), 671-675 (2012).
  21. Daims, H., Lücker, S., Wagner, M. Daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research. Environmental Microbiology. 8, (2), 200-213 (2006).
  22. Barbosa, J. O., et al. Streptococcus mutans Can Modulate Biofilm Formation and Attenuate the Virulence of Candida albicans. PloS One. 11, (3), 0150457 (2016).
  23. Thein, Z. M., Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. Effect of oral bacteria on growth and survival of Candida albicans biofilms. Archives of Oral Biology. 51, (8), 672-680 (2006).
  24. Krzyściak, W., et al. Effect of a Lactobacillus Salivarius Probiotic on a Double-Species Streptococcus Mutans and Candida Albicans Caries Biofilm. Nutrients. 9, (11), 1242 (2017).
  25. Liu, S., et al. Nicotine Enhances Interspecies Relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans. BioMed Research International. 2017, 7953920 (2017).
  26. Schlafer, S., Meyer, R. L. Confocal microscopy imaging of the biofilm matrix. Journal of Microbiological Methods. 138, 50-59 (2017).
  27. Schlafer, S., et al. Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4. Applied and Environmental Microbiology. 81, (4), 1267-1273 (2015).
  28. Ohle, C., et al. Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine. Applied and Environmental Microbiology. 76, (7), 2326-2334 (2010).
  29. Schlafer, S., et al. pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm. PloS One. 6, (9), 25299 (2011).
  30. Divaris, K., et al. The Supragingival Biofilm in Early Childhood Caries: Clinical and Laboratory Protocols and Bioinformatics Pipelines Supporting Metagenomics, Metatranscriptomics, and Metabolomics Studies of the Oral Microbiome. Methods in Molecular Biology. 1922, Clifton, N.J. 525-548 (2019).
  31. Stewart, P. S. Mini review: convection around biofilms. Biofouling. 28, (2), 187-198 (2012).
  32. Stoodley, P. Biofilms: Flow disrupts communication. Nature Microbiology. 1, 15012 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics