Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Identifikation af neutrofile ekstracellulære fælder i paraffin-embedded feline arteriel trombose ved hjælp af Immunofluorescence Mikroskopi
Chapters
Summary March 29th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi beskriver en metode til at identificere neutrofile ekstracellulære fælder (NETs) i formaldehyd-faste og paraffin-indlejret feline kardiogene trombi ved hjælp af varme-induceret antigen hentning og en dobbelt immunmærkning protokol.
Transcript
Denne protokol af parafinisering efterfulgt af antigen hentning af paraffin-indlejret aorta sektioner kan være et nyttigt redskab til at studere den rolle, neutrofile trekantede fælder i feline trombose. Påvisning af neutrofile trekantede fælder ved immunfluorescens i fast og paraffin-indlejret væv, er overlegen i forhold til konventionelle histologiske stenter som HNE, da det giver mulighed for samtidig påvisning af sikrere DNA og ekstracellulære proteiner. Denne protokol kan anvendes i andre typer af trombi og i andre veterinære arter.
Identifikation af neutrofil ekstracellulære fælder i kattearterietrombi tyder på, at de kan spille en rolle i trombose hos katte. Protokoller, der præsenteres her, er retningslinjer. Vi opfordrer på det kraftigste efterforskerne til at justere varigheden og betingelserne for antigenhentningsprocessen for at give et tilfredsstillende signal.
Hvis du vil bruge et automatiseret system til at udføre deparaffinisering og hydrering af sektionerne på glasdias, skal du placere glasdiasene i stativer. Nedsænk helt i 100 procent saltvand i tre minutter. Gentag dette trin to gange.
Skyl ikke mellem trinene. Nedsænk helt i faldende koncentrationer af ethanol ved stuetemperatur tre gange i tre minutter hver. Nedsænk helt i deioniseret vand i to minutter og gentag en gang til.
Efter behandling med TBST fyldes reservoiret med deioniseret vand opvarmet til 100 grader Celsius. Damperkammeret bringes i ligevægt i 20 minutter. På en varmeplade opvarmes den kommercielt tilgængelige antigenudtagningsopløsning, der indeholder Tris og EDTA ved pH 9,0 til 95 til 97 grader Celsius.
Sørg for, at den ikke koger. Understænning af objektglassene helt i den opvarmede antigenhentningsopløsning, og fortsæt anvendelsen af ekstern opvarmning via damperen i 20 minutter. Vask derefter rutsjebanerne tre gange med TBST i fem minutter.
Placer nu sektionerne i blokeringsbuffer 1. Inkuber i to timer ved stuetemperatur under blid rokkende mellem 30 og 50 omdr./min. Uden vask, straks anvende 100 mikroliter af fortyndet kanin polyklonale anti-human citrullinated histone H3 antistof direkte på diaset.
Placer en dæksel på hver sektion for at tillade en jævn fordeling af antistofblandingen. Inkubere i 12 til 16 timer ved fire grader Celsius med blid rokkende. Derefter vaskes diasene tre gange med TBST i fem minutter hver gang.
At anvende antistof, bruge en pipet og jævnt distribuere 100 mikroliter af ged anti-kanin antistof konjugeret til Alexa Fluor 488. Dæk objektglassene med sølvpapir og inkuber objektglassene i en time ved stuetemperatur under blid rokkende. Efter vask med TBST i henhold til manuskriptet, inkubere sektionerne i blokering buffer 2 natten over ved fire grader celsius under blid rokkende.
Beskyt mod lyset. Vask med TBST tre gange i fem minutter hver gang. Bloker sektionerne i blokerende buffer 3 som gjort tidligere ved stuetemperatur i to timer under blid rokkende.
Inkuber sektionerne med biotin laded ployklonal kanin anti-human neutrofil elastase antistof ved fire grader Celsius i 12 til 16 timer som beskrevet tidligere. Efter vask med TBST inkubere dias med Alexa Fluor 594 Streptavidin Konjugat i en time ved stuetemperatur. Derefter vaskes med TBST én gang i fem minutter.
Påfør 100 mikroliter autofluorescense quenching opløsning blanding direkte på sektionerne i et minut som anvist af producenten. Vask straks objektglassene med TBST seks gange i 10 minutter hver gang. Dæk hvert dias med 100 mikroliter på 300 nanomolar DAPI i fem minutter i mørke.
Derefter vaskes med TBST fem gange i tre minutter hver gang. Påfør en dråbe antifademonteringsmedium direkte på glasrutsjebanen omkring sektionen. Placer et dæksel forsigtigt på sektionen uden at skabe bobler.
Lad prøverne helbrede natten over i mørket ved fire grader Celsius. For at finde thrombi, scan kranielt til caudally langs længden af aorta, aorta bifurcation og hver femeral arterie ved hjælp af fase kontrast mikroskopi med en 10x mål. Først undersøge sektioner for celle-fri DNA ved hjælp af DAPI kanal med excitation på 357 og 44 nanometer.
Identificer ekstracellulære neutrofil elastase og citrullinated histone H3 på Texas røde og grønne fluorescerende protein kanaler hhv. Bevar ensartet eksponeringstid og gevinster for hver kanal i hele erhvervelsen af billeder for at undgå mætning i pixelintensitet. Neutrofil ekstracellulære fælder identificeres baseret co-lokalisering af neutrofil elastase, citrullinated histone H3 og cellefri DNA.
Ved hjælp af hæmatoxylin og eosin pletten, og brightfield mikroskopi, felin arteriel trombi består af røde blodlegemer, leukocytter, fibrin og blodplader. NETs optrådte som netværk af dybe lilla tråde af forskellige længder omkring nærliggende erythrocytter og leukocytter. Ved hjælp af denne protokol, immunofluorescens mikroskopi afslørede store aggregater af NETs består af celle-fri DNA, ekstracellulære citrullinated histone H3 og neutrofil elastase.
Under fase kontrast i immunmikroskopi, en trombe var karakteriseret som en velafgrænset struktur inden for det vaskulære rum. Der blev dog ikke påvist trombi i nogen af kontrolprøverne. Dette tal viser dyb autofluorest af blodprop elementer som erythrocytter når afbildet på 488 nanometer bølgelængde.
Kort autofluoresens dæmpning efter immunterapi betydeligt øget følsomheden af protein co-lokalisering og NET detektion selv i områder med en overflod af erythrocytter. Varigheden af fikseringen påvirker immunoraktiviteten af visse antigener. Vi anbefaler fiksering i højst 24 timer par dehydrering og paraffin indlejring.
Alternativt kan methanolfri paraformaldehyd bruges til at begrænse artefakt ved myresyre og ketoner fra oxidation af formaldehyd. For at forhindre interferens ved brug af primære antistoffer fra samme art inkluderede vi yderligere blokerende trin for at mætte eventuelle resterende bindingssteder på de sekundære antistoffer. Investigatorerne skal omfatte negativ kontrol bestående af isotypeantistoffer, udelukkelse af enten primære antistoffer og immunmærkningstrin og biologisk kontrol fra katte uden trombose.
Autofluoresens af væv grænser trombi kan hamre den mikroskopiske identifikation af neutrofil ekstracellulære fælder. Investigator kan minimere fluorescens ved hjælp af langt røde fluorophores. Denne teknik kan være et værdifuldt redskab til undersøgelse af neutrofil ekstracellulære fælder i andre veterinære arter.
Dette kan give en bedre forståelse af patofysiologi af trombose.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
