5つの脊椎動物群にわたる中枢神経系微小血管の信頼性の高い絶縁

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Summary

このプロトコルの目的は、リッセンセファリックおよびギレンセファリック脊椎動物の中枢神経系の複数の領域から微小血管を分離することです。

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Yuan, Y., Dayton, J. R., Freese, M. L., Dorflinger, B. G., Cruz-Orengo, L. Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups. J. Vis. Exp. (155), e60291, doi:10.3791/60291 (2020).

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Abstract

中枢神経系(CNS)からの微小血管の単離は、一般的に、複数の動物、最も頻繁にげっ歯類からの皮質組織を組み合わせることによって行われる。このアプローチは、血液脳関門(BBB)特性の尋問を皮質に制限し、個々の比較を可能にしません。このプロジェクトは、皮質、小脳、視床下部、下垂体、脳幹、脊髄など、複数のCNS領域からの神経血管ユニット(NVU)の比較を可能にする単離方法の開発に焦点を当てています。さらに、もともとマウスサンプル用に開発されたこのプロトコルは、脳半球白物から微小血管を分離することができる小さな大きな脊椎動物種のCNS組織での使用に適応することに成功しました。この方法は、免疫標識と組み合わせると、タンパク質発現の定量と個体、組織型、または治療間の統計的比較を可能にする。神経炎症性疾患、多発性硬化症のマウスモデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)におけるタンパク質発現の変化を評価することで、この応用性を証明した。さらに、この方法で隔離されたマイクロ容器は、qPCR、RNA-seq、ウェスタンブロットなどの下流アプリケーションに使用できます。これは、超遠心分離または酵素解離を使用せずにCNSマイクロ容器を分離する最初の試みではありませんが、単一の個人と複数のCNS領域の比較に対するその熟達性においてユニークです。したがって、CNS部分(皮質、小脳、視葉、脳幹、視床下部、下垂体、脊髄)、CNS組織型(灰色または白色物質)、個体、実験的治療群、および種。

Introduction

私たちの脳は、私たちの体の中で最も重要な器官です。このため、正常からの逸脱を引き起こす可能性のある外的要因にもかかわらず、脳恒常性を維持することが優先事項である。一部の学者によると、約4億〜5億年前の1、脊椎動物は、私たちが今血液脳関門(BBB)2、3として知っているものを開発しました。この保護「フェンス」は、血液とCNSパレンチマ間のイオン、分子、細胞の輸送を厳密に調節することにより、中枢神経系(CNS)恒常性および機能に最も大きな影響を及ぼします。BBBが破壊されると、脳は毒性暴露、感染、炎症を受けやすくなります。したがって、BBB機能障害は、すべてではないにしても、神経学的および神経発達障害4、5、6に関連している。

BBBの高度な機能は、神経血管ユニット(NVU)2、3によって適合されたユニークなCNS微小血管系に起因する。高度に専門化された内皮細胞、ペリサイト、および星値状端足は、NVU2、3の細胞成分である。これらの細胞によって生成される細胞外マトリックスは、NVUおよびBBB生理学2、3にも不可欠である。NVUの必須細胞成分および分子成分は脊椎動物の間で保存されるが、異質性は、秩序および種7、8の間で報告される。しかし、技術的な制限は、神経生物学、生物医学、または翻訳研究におけるこれらの違いを十分に考慮する能力を妨げる。

このため、CNS領域特異的なマイクロ血管分離法を拡充し、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類の5つの脊椎動物群から多数の種に適用できるようにしました。このプロトコルは、小リッセンセファリックおよび大ギレンセファリック脊椎動物に使用するために記載されており、翻訳関連性9を有する種を含む。さらに、我々は、この文脈内で以前に調査されていないCNSの他の領域が含まれていますが、神経生理学に関連し、驚異的な臨床的意味を持つ:視床下部、下垂体、および白色物質。最後に、NVUおよび/またはBBB9、10、11に沿ったタンパク質発現の変化を同定するための信頼できるツールとしてこの単離方法容量を試験した。概念実証として、EAE中のVCAM-1およびJAM-B発現の変化を、免疫蛍光に続いて単離法を用いて決定する方法を示した。

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Protocol

本研究のすべての手順は、カリフォルニア大学(UC)、デイビス制度動物ケア・使用委員会(IACUC)が定めたガイドラインに従っています。UCデイビスの動物ケアは、いくつかの独立したリソースによって規制されており、1966年以来、ラボアニマルケアインターナショナル(AAALAC)の評価と認定のための協会によって完全に認定されています。豚CNS組織は、食肉科学研究所動物科学UCD学科から得られました。レセウス・マカクのCNS組織は、カリフォルニア国立霊長類研究センター病理部(NIH P51OD011107)から得られた。麻酔、安楽死、または壊死は、豚やマカクの実験室スタッフによって行われませんでした。したがって、これらの問題に関する特定の推奨事項はありません。

注:この方法は、複数の種のために検証されましたが、提供されたプロトコルは、マウスとブタの組織により直接的に対応しています。哺乳動物標本を使用する場合、光学ローブに関する詳細は適用されません。すべてのバイオ危険物は、適切なバイオセーフティレベル(BSL)施設で取り扱う必要があります。すべての急性毒性材料は、ヒュームフードの下で処理する必要があります。すべての生体有害な医療廃棄物および急性毒性廃棄物は、適切に処分されなければならない。

1. 準備

  1. 少なくとも1日前に解決策(表1)を準備します。
    注:70 kDa分子量(MW)デキストランを溶解することは非常に困難です。パラフィンフィルムまたは箔のいずれかで覆われた溶液を一晩攪拌させる方が効率的です。プロトコルは、調査中の標本に応じて2つの異なるMV-2ソリューションを使用する必要があります。18%デキストランは、小さなリッセンセファリック標本に対してプロトコルを実行する際に、ミエリンをマイクロ容器ペレットから効率的に分離します。しかし、それは大きなギレンセファリック標本からのCNS組織の界面内でミエリンのスミアを開発するだけでなく、小さな標本から視床下部と下垂体。このスミアは20%デキストランを使用して防止されます。
  2. ポリD-リジンのウェルあたり50°Lをロードして十分なスライドを準備し、室温(RT)で2時間乾燥させ、好ましくは生物学的安全キャビネットクラス2(BSC-2)で乾燥させます。過乾燥しないでください。リン酸緩衝生理食塩分(PBS)で2回すすいで、使用できるまで冷蔵庫に保管してください。

2. 小さなリッセンセファリック脊椎動物標本からのCNS組織解剖

注:この記事では、C57BL6/J、10週齢、〜25g、オスマウスにプロトコルを適用する方法を示します。

  1. 15 mL円錐形チューブ2本と1.7mLマイクロ遠心管をそれぞれ5mLと1mLで調製し、検体1個あたりMV-1溶液を用意します。チューブは氷の上に置いておきなさい。
  2. 麻酔
    1. ケタミン、キシラジン、アセプロマジン麻酔カクテルを体重1kg当たり100/10/3mgで腹腔内注射し、70%エタノールでスプレーすることにより、マウスを麻酔する。眼に触れ、足をつまむことで、手のひらとペダル反射の欠如を評価して麻酔を確認する。
    2. 誘導麻酔ボックスを用いて5%のイソフルランを吸入してハトを麻酔する。
    3. 魚を保持する水タンクまたは両生類リンガーの溶液(材料の表)のいずれかで1%トリカインで魚やカエルを麻酔します。
    4. 安楽死前に4°Cで冷却することにより、トカゲを麻酔する。
  3. 外科的はさみで動物を切断し、頭蓋骨を露出させるために鉗子で皮膚を剥がし、ラグランジュは、マグナムを通してラグランジュハサミでカットする(図1A)。
  4. ヘラで脳を解剖し、MV-1溶液で15 mL円錐管に移す。チューブは氷の上に置いておきなさい。
  5. 鉗子で頭蓋骨のセラ・トゥルシカから下垂体を取り出し、MV-1溶液で1.7 mLマイクロ遠心管に移す。チューブは氷の上に置いておきなさい。
  6. 皮膚と筋肉を取り除き、椎骨柱を露出させます。手足、肋骨ケージ、内臓を切り取ります(図1B)。
  7. 後述する2つの方法のうちの1つによって脊髄を解剖する。次いで、MV-1溶液で5mL円錐管に移す。チューブは氷の上に置いておきなさい。
    1. 腰部コードに達するまで、頸椎の脊椎動物を通して始まるラグランジュはさみで、ラルストラルを切ってコード方向に切断してラミネクトーミーを行う。
    2. 18 G針と10 mLシリンジをMV-1溶液でロードした腰椎椎骨のフォルメン全体のロストラル方向にラウダルでフラッシュを行います(図1C,D)。
      注:この方法は、非常に小さな標本、主にげっ歯類(<100 g)でのみ動作します。
  8. 解剖スコープを使用して、脊髄から硬膜嚢をスプリングハサミで切り取り、残りの髄膜を二重ピックで取り除きます(図2)。
  9. 脳をペトリ皿に移し、解剖スコープを使用して、二重ピックで髄を取り除きます(図2A-C)。
  10. 嗅球と視床を鉗子、虹彩はさみ、春はさみで切除します。二重のピックを使用して、すべての脳心室からコロイド神経叢を取り除く。すべてのコロイド神経叢を取り除くようにしてください。
    注:コロイド神経叢と嗅球は、汚染の大規模な源です。BBBとは対照的に、これらの毛細血管は非常にフェネストレートされ、その後の実験の結果は除去されないと損なわれます。
  11. 鉗子を使用して、明確なCNS領域を分離する:皮質、小脳、脳幹、視葉(哺乳類標本ではない)、および視床下部。

3. 大きなギレンセファリック脊椎動物標本からのCNS組織解剖

注:このプロトコルは、アバトワールから得られた豚CNS組織を使用しています。したがって、麻酔、安楽死、または壊死は、ここで説明または示されていません。

  1. 氷の箱/バケツの中にMV-1溶液を積んだ0.946 L(32オンス)組織学の容器の輸送ブタCNS組織。
  2. 解剖スコープを使用して、各CNS組織から二重ピック、鉗子、虹彩はさみ、およびスプリングハサミで髄を取り除きます。脳心室からコロイド神経叢を取り除くようにしてください。

4. CNS組織均質化

注:2人の研究者が均質化プロセスに従事する場合、1つはステレオスコープの下で髄質を解剖し、もう1つはミンチ組織を均質化する場合に効率的です。このようにして、組織はすぐに氷のバケツに戻され、冷たく保たれます。

  1. 各CNS領域をMV-1溶液の約1mLのペトリ皿に置きます。シングルエッジブレードを使用して、組織をミンチして1~2mmの部分を得ます。
    1. 小さな脊椎動物の標本の場合は、100 mm x 20 mmのペトリ皿を使用します。
    2. 大きな脊椎動物の標本の場合は、150 mm x 15 mmのペトリ皿を使用してください。
  2. 小さい脊椎動物標本の均質化 (表2および表3)
    1. コルテックス、小脳、脳幹、視ローブ、脊髄を、転写ピペットを用いてPTFE害虫を用いて個々の10 mLポッター・エルベヘムガラス組織グラインダーでMV-1溶液の〜1 mLに移す。5 mL の MV-1 溶液を追加し、各組織を均質化します (約 10 ストローク).。個々の15 mL円錐管に移す。チューブは氷の上に置いておきなさい。
      注:小さな脊椎動物の場合、5または4、光学ローブの有無にかかわらず、それぞれ10 mLポッター-エルベヘムグラインダーと15 mL円錐チューブが必要です。
    2. 鉗子を含む視床下部と下垂体を個々の1.7 mLチューブで約100μLのMV-1溶液に移し、ガラスミクロペストルで慎重に均質化します。MV-1溶液の〜1 mLで各ミクロペスをすすいでください。チューブは氷の上に置いておきなさい。
      メモ:小さな脊椎動物の場合、ガラスミクロペス2個と1.7mLチューブが必要です。
  3. 大きな脊椎動物標本の均質化 (表4及び表5)
    1. 転写ピペットを使用して、55 mLポッター-エルベヘムガラス組織グラインダーにPTFE害虫でミンチ組織を移し、頭上の攪拌機に取り付けます。MV-1溶液の推奨体積の半分を、均質化される特定のCNS部分に従って加える(表5)。
    2. オーバーヘッドスターラーを非常に低速(約150rpm)でオンにし、ガラス管を約30s上下に慎重に動かします。
    3. オーバーヘッドスターラーをオフにし、さらにMV-1溶液を追加し、均質なスラリーが得られるまでステップ4.3.2を繰り返します。
    4. 50 mL円錐形チューブに移します。チューブは氷の上に置いておきなさい。
    5. 各CNS組織均質化の間に脱イオン水で粉砕機を洗浄します。
      注:大きな脊椎動物5または4の場合、それぞれ白物の有無にかかわらず、50 mLの円錐管が必要です。同様に、視床下部および下垂体には2本の(2)15mL円錐管が必要である。

5. マイクロ容器の精製

  1. ステップ4.2.1、4.2.2、または4.3.4で2,000 x gで得られた遠心分離組織ホモジを4°Cで10分間行う。ミエリンの大きな白い界面は、赤みを帯びたマイクロ容器のペレットの上に形成されます。上清を捨てる。
    1. 小脊椎動物標本(表2及び表3)
      1. 皮質、小脳、脳幹、視ローブ、脊髄ペレットを5mLの血清学的ピペット(〜10フラッシュ)で氷冷MV-2溶液の5mLで再中断する。各サスペンションに5mLの氷冷MV-2溶液を加え、チューブをひっくり返して慎重に混ぜます。
      2. 視床下部と下垂体ペレットを1mLのMV-2溶液で再中断します。
    2. 大脊椎動物標本(表4及び表5)
      1. 皮質、小脳、脳幹、脊髄マイクロ血管ペレットに20mLの氷冷MV-2溶液を加えます。チューブリボルバーシェーカーに混合してペレットを再懸濁し、40rpmで〜5分間攪拌します。
      2. 視床下部および下垂体マイクロ容器ペレットを5mLの血清学的ピペット(〜10フラッシュ)でMV-2溶液の5 mLで再中断する。懸濁液に5mLの氷冷MV-2溶液を加え、チューブをひっくり返して慎重に混ぜます。
  2. 遠心分離機は4,400 x gで4°Cで15分間。
  3. 慎重にチューブを回転させ、上清が壁に沿って通過できるようにすることで、各チューブの壁から液体界面の厚くて密なミエリン層を慎重に取り外します。
  4. ミエリンと液体の界面を捨て、低リント紙の拭き取りで包まれたスパチュラで各チューブの内壁をブロットします。小さな脊椎動物の標本の場合は、移圧ピペットで慎重に吸引することにより、各視床下部および下垂体チューブからミエリン層を除去します。
  5. ねじれた低リント紙の拭き取りで余分な液体を拭き取ります。低結合チップを使用して、MV-3溶液の1 mLで各ペレットを再サスペンドします。チューブは氷の上に置いておきなさい。

6. マイクロ容器の溶出とろ過

  1. CNS地域ごとに個々のビーカーに氷冷MV-3溶液を注ぎます。4°Cに保管してください。
    1. 小さな脊椎動物の標本の場合は、50 mL ビーカーあたり 10 mL の MV-3 溶液を使用します。光学ローブが含まれているかどうかに応じて、合計6~7ビーカーが必要です。
    2. 大きな脊椎動物の標本の場合は、100 mL ビーカーあたり 30 mL の MV-3 溶液を使用します。白質が含まれているかどうかに応じて、合計6~7ビーカーが必要です。
  2. 50 mL円錐管の上にセルストレーナーを置きます。CNS リージョンごとに 1 つを使用します。皮質、脳幹、視葉、脊髄、下垂体には100μmのストレーナーを使用します。小脳および視床下部には70μmの細胞ストレーナーを使用してください。
  3. 各ストレーナーを1mLの氷冷MV-3溶液で濡らします。
  4. 凝集を避けるために混合しながら、血清学的ピペットでステップ5.5で調製した懸濁液にさらにMV-3溶液を追加します。慎重にストレーナーの上にマイクロ容器をロードします。氷冷MV-3溶液ですすす。
    1. 小さな脊椎動物の標本(表2および表3)の場合は、血清学的ピペットで10~15mLのMV-3溶液を加え、5mLのMV-3溶液でリンスします。
    2. 大きな脊椎動物の標本の場合は、血清学的ピペットで20 mLのMV-3溶液を加え、10mLのMV-3溶液でリンスします。
  5. 20 μmのナイロンネットフィルターを変更されたフィルターホルダー(図2D)に置いて、CNS領域ごとに1つずつ、ろ過ユニットを組み立てます。
    1. 小さな脊椎動物の標本(表2および表3)の場合は、皮質、小脳、脳幹、視葉、脊髄用の25mm改質フィルターホルダーを使用します。視床下部と下垂体には13mmの修正フィルターホルダーを使用してください。
    2. 大きな脊椎動物の標本(表4および表5)の場合は、皮質、小脳、脳幹、脊髄用の47mm修飾フィルターホルダーを使用します。視床下部と下垂体には 25 mm を使用します。
  6. 50 mL円錐形チューブの上にフィルターを置き、5 mL の氷冷 MV-3 溶液を使用してフィルターを配置し、バッファーがフィルターホルダーを円錐管に流し込むことを確認します。
  7. 溶出したマイクロ容器(ステップ6.4から)を20μmナイロンネットフィルターの上に移し、5~10mLの氷冷MV-3溶液でマイクロ容器をすすいでください。
  8. クリーン鉗子を使用してフィルターを回収し、ステップ6.1で調製した氷冷MV-3溶液を含むビーカーに浸す。
  9. マイクロ容器を約30sゆっくりと振ってフィルターから取り外します。小さな脊椎動物の標本の場合は、ビーカーの含有量を15 mL円錐チューブに注ぎます。大きな脊椎動物の標本の場合は、ビーカーの含有量を50mL円錐チューブに注ぎます。
  10. 2,000 x gで4°Cで5分間遠心分離し、低結合ピペットチップを使用して1mLの氷冷MV-3溶液でペレットを再サスペンドします。
    1. 小さな脊椎動物の標本の場合は、懸濁液(ステップ6.10から)を1.7 mLマイクロ遠心管に移し、遠心分離機を20,000 x gで4°Cで5分間移します。
      注:このスピンは、堅牢な歩留まりを確保するために、最高速度(約20,000 x g)のベンチトップ遠心分離機で実行されます。
    2. 大きな脊椎動物の標本の場合は、ステップ6.10から5.0 mLマイクロ遠心管に懸濁液を移し、4mLのMV-3溶液を4mL加え、2,000 x gで遠心分離機を4°Cで5分間加えます。

7. 免疫染色

注:ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色は、爬虫類、両生類、魚類標本に対して、プロトコル実現可能性の概念実証として行った。したがって、これらの検体に対する免疫標識に対する推奨はない。

  1. マイクロ遠心管から上清を取り除く。
  2. 低結合ピペットチップ(材料表)を使用して、ペレットを1x滅菌PBSで再サスペンドします。マイクロ容器を複数回ピペット加工して凝集体を形成しないようにします。小さな脊椎動物の標本(表3)の場合は、ペレットサイズに応じて~100μL~2,000°Lを使用してください。大きな脊椎動物の標本(表5)の場合は、ペレットサイズに応じて~1,000μL~4,000°Lを使用してください。
  3. 低結合ピペットチップを使用して、マイクロ容器をよくスライドに移し、サイドウォールを避けて各井戸の中央に追加するように注意してください。
  4. BSC-2の内側に、覆われた井戸のスライドを設定し、RTで20〜30分間乾燥させます。
    注:凝集体形成を避けるために、1x PBSの比較的大きなボリュームが使用されます。このため、マイクロ容器がポリD-リジンコーティングによって保持されていることを確認するために、固定前にスライドを乾燥させる必要があります。
  5. 転写ピペットでピペットをピペットで取り出して残留1x PBSを取り出し、4%パラホルムアルデヒド(PFA)の200μLを加え、RTで30分間インキュベートします。
  6. 固定液をピペットアウトし、RTで5分間1x PBSの200 μLで3xを洗浄します。
    注:この時点で魚類、両生類、爬虫類CNS微小容器にH&E染色を行いました。
  7. 200°Lのブロッキングバッファをウェルスライドに追加し、37°Cで60分間インキュベートします。
  8. 転写ピペットでブロッキングバッファーを取り出し、抗体希釈剤に一次抗体カクテルの200μLを加えます(材料表)。4°Cで一晩インキュベートする。
  9. ピペットは、一次抗体カクテルをピペットアウトし、RTで5分間1x PBSの200 μLで3xを洗浄します。
  10. 1x PBSで希釈した二次抗体カクテル(材料表)をロードし、光から保護されたRTで2時間インキュベートします。
  11. 二次抗体カクテルをピペットアウトし、光から保護されたRTで1x PBSの200 μLで3xを洗浄します。最後の洗浄後、よくスライドのフレームを取り外し、低リント紙ワイプで余分な1x PBSをブロットドライします。
  12. 核染色用のカバースリップ、液体アンチフェードマウント剤、4',6-ジアミディノ-2-フェニリンドール(DAPI)を追加します。光から保護されたRTで一晩乾燥させてください。
  13. 乾燥したら、共焦点顕微鏡検査とデータ取得の準備ができるまで、スライドボックスの光から保護してください。

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Representative Results

マウスCNSから単離された微小血管は、神経血管ユニット2、3のすべての固有の細胞成分示した。血小板内皮細胞接着分子-1(PECAM、CD31とも呼ばれる)またはアイソレクチンIB4(内皮細胞グリコカリックスと結合する糖タンパク質)のいずれかを内皮細胞に使用し、 血小板由来増殖因子β(PDGFRβ)またはニューロングリア抗原2(NG2)は、天体細胞のペリサイトおよびアクアポリン-4(AQP4)に対して、これらの固有成分が単離された微小血管に存在することを示す。表示されるCNS領域には、皮質微小血管(図3B)、小脳(図3C)、下垂体(3D)、視床下部(3E)、脳幹(図3F)、脊髄(3G)が含まれる。全てこれらの正規マーカーの発現を示した。

同様に、マイクロ容器は、付着接合タンパク質VE-カドヘリン(4A,C)、クローディン-5およびソヌラオククルデンス-1(CLDN5およびZO-1) の接着性接合タンパク質の発現を示した。図4A,D)、三細胞接合タンパク質アングリン-1(4A,E)およびアピコバサルマーカーC-X-Cモチーフケモカインリガンド12およびγ-グルタミルトランスフェラーゼ1(CXCL12およびGGT1、4A,F)を表す。これらのタンパク質は、BBB特異的特性9、12、13、14の重要な特性の指標であるためこれらの知見は関連している。グリア線維性酸性タンパク質を発現するアストロサイト、オリゴデンドロサイト、およびニューロンの限られた存在(GFAP、図4B、C、G)、オリゴデンドロサイト特異的タンパク質(OSP、4B、G)、および神経フィラメント培地(NFM、4B,H)は、それぞれ、単離された微小血管が非神経血管の無視できる微量を有していたことを示す。また、マイクロ容器の大部分はα平滑筋アクチンの発現を欠いていた(αSMA、5B,C)。αSMAは動脈および静脈に関連する平滑筋細胞のマーカーである(5A)が、この単離プロトコルが小口径微小血管15を選択的に標的とすることを示すので、これは関連する。

他の小さなリッセンセファリック脊椎動物から得られた微小血管は、魚(カエルやトカゲは示していない)や鳥類の微小血管に見られるように、いくつかの形態学的特徴を共有する。これは、この方法が種間のNVUの違いのさらなる特性評価に有用であることを示唆している(図6)。さらに、鳥類CNSマイクロ容器(6H-N)は、ヒトおよびマウス用に開発された多くの抗体と交差反応性を示した。これは生物学的および生物医学的BBB研究のための鳥類標本のさらなる調査を奨励する。豚とマカクから微小血管を単離した場合も同様の結果を観察した(図7)。ブタマイクロ容器内のNVU正規マーカーのみが表示されます。前述のCNS領域に加えて、骨室白色物質からマイクロ容器を分離することができました(図7B)。これは、白色物質が神経炎症状態に関与しているために関連する(例えば、多発性硬化症16、17、18)。

この方法がタンパク質発現の変化を判断する信頼できるツールとして使用できるかどうかを調けたいと考えました。VCAM-1およびJAM-BがEAE中の脊髄の神経炎症過程に関与していることを知って、我々はEAEおよびシャムコントロールマウス(10週齢C57BL/6Jマウス)9、10、11のピークおよび慢性段階でこれらのタンパク質の発現を定量することにした。これを行うために、マイクロ容器の直径に沿って任意の強度単位(AUI)を測定しました。次に、DAPI に ≤20 AUI のしきい値を使用して、CNS 領域あたり 50 マイクロ船の VE カドヘリン、VCAM-1、および JAM-B の曲線 (AUC) の下の面積を計算しました (図 8A,B)。最後に、双方向ANOVAを行い、続いてシダックのポストホック試験を行い、タンパク質発現の変化の統計的有意性を決定しました。

予想どおり、EAEのピーク時に脊髄微小血管に沿ったVCAM-1およびJAM-Bの増加を観察しました(図8D,E)。しかし、EAEについて以前に報告されていない他のCNS地域の変化を観察した。VCAM-1は下垂体微小血管で有意に増加し、視床下部および脳幹微小血管で減少した。すべてのCNS組織において慢性EAE中に変化があった(図8D)。JAM-Bは、慢性EAE中の視床下部および下垂体微小血管において有意に増加した(図8E)。興味深いことに、EAEのピーク時に視床下部および脳幹から分離された微小血管に沿ったVE-カドヘリンの変化、慢性EAE時の小脳(8C)、ピーク時および慢性EAE時の下垂体微小血管幅の低下を観察した。全体として、このデータは、このマイクロ容器分離の方法が、健康および疾患中の局所タンパク質発現パターンの変化を特徴付ける有用なツールであることを示唆している。

Figure 1
図1:ラミネクトーシス切除なしの効率的な脊髄解剖。小さな脊椎動物標本からの脊髄の解剖(最大100g)は、脊椎動物全体のロストラル方向にコードをカウダルで洗い流すことによって、より速く、より効率的に行われる。解剖はさみを使用して、頭部はアトラス関節によって取り除かれ、背骨は股関節(A)によって切り取られます。残りの臓器はすべて取り除かれ、脊椎(B)だけが残ります。腰椎骨孔内の脊髄は、頸部コードの幅(B、黄色の矢印)と比較して非常に小さな白い円(<1 mmの直径)として現れます。腰椎骨前骨で狭い開口部を保つことは、18G針と10ccシリンジを1x PBS(CおよびD)でロードした場合に、腰部から頸椎までの圧力勾配を促進する。一度フラッシュされると、脊髄(D、黄色の矢印)は、ほとんど完全に硬膜嚢を欠き、解剖スコープの下でピアのみを除去する必要があります。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:二重ピック解剖ツールと修正フィルタホルダーこの11cmの長さの解剖ツール(A)は、2つの非常に鋭く、ほぼ水平に対向したポイント、2ミリメートルの先端から先端(B)を持っています。穏やかな下向きの圧力を適用し、時計回りにわずかにねじれることによって、ポイントは、彼らが上に持ち上げることができるように髄管に水平に自分自身を埋め込みます。これは、小脳の深さへのアクセスを可能にするので、小脳から髄度を除去する場合に特に便利です。また、皮質組織、特にギレンセファリックから髄膜を除去する場合にも非常に有用である。この場合、piaは、マイクロセ容器の単離の純度を損なう高口径血管系で高く埋め込まれています。同様に、それは汚染の最も可能性の高い源であるコロイド神経叢の除去を容易にする。47mm、25mm、直径13mmのフィルターホルダーをレーザーカットして上部コンパートメント(E)から入口コネクタ(D)を取り除いたが、ふるい成分(G)を保った。この変更により、20μmナイロンフィルターネットをふるいと底部(G、H)の上に置くことでフィルタユニット(I、J)組み立てが可能となり、上部部(E)をねじ込む際にネットを固定する。25mmフィルターホルダーのみが表示されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:複数のCNS領域から単離された微小血管は、正規神経血管ユニットマーカーを発現した。(A)免疫標識および共焦点顕微鏡を用いて、NVUの固有細胞成分を使用して成人(8~14週齢C57BL/6J)マウスCNSマイクロ血管を同定する。皮質微小血管(B)の融合画像に見られるように、内皮細胞マーカーCD31(白色)、ペリサイトマーカーPDGFRβ(赤)、および天体末端フィートマーカーAQP4(緑色)に対する個々の共焦点画像の上方に、これらの細胞成分はすべて保持される。内皮細胞とペリサイトの間の親密な関係は、それらをマージされた画像上でマゼンタのように見せ、天体の端足はそれらを囲むハローを持っているように見えることに注意してください(B)。小脳(C)、下垂体(D)、視床下部(E)、脳幹(F)、脊髄(G、DAPI、核染色=青、スケールバー=10μm)についても同じ発現パターンが観察される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:BBB特異的特性に関連するタンパク質を発現したマイクロ容器。神経血管ユニット内の内皮細胞(NVU)は、その固有のバリア特性(A)に関連するタンパク質によっても記述される。図に見られるように、内皮細胞は、VE−カドヘリン、CLDN5、ZO−1(A、イエロー)、およびアングリン−1(A、ティール)からなる接合を有する。また、GGT-1およびCXCL12(A、緑および赤色)を含む複数のタンパク質にアピコババル極性を示す。ニューロン、オリゴデンドロサイト、およびアストロサイト細胞体は、NVU(B)に固有のものではありませんが、単離された微小血管に含まれる場合があります。これらは、それぞれ NFM (赤)、OSP (シアン)、および GFAP (ライムグリーン) の式によって識別できます (B)。これらと一致して、当社の単離されたマイクロ容器は、接着タンパク質VE-カドヘリン(C、赤)、緊密接合タンパク質CLDN5およびZO-1(D、赤と緑、それぞれ結合=黄色)、三細胞接合タンパク質LSR(E、緑)、およびアピコバサルマーカーCXCL12およびGGT1(それぞれF、赤および緑色)を発現した。また、GFAP(A、、G、白)、OSP(G、緑)、NFM(H、赤)の限られた量を示し、非神経血管ユニット細胞(DAPI、核染色=青、スケールバー=10μm)の無視できる保持を示唆した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:ほとんどの単離されたマイクロ容器はαSMAを発現しない。神経血管ユニットは、動脈-毛細血管-静脈管からの洗練された移行を示す (A).αSMAの有形発現は動脈を明確に識別し、毛細血管になるにつれて、αSMA(B,赤色)発現が減少し、壁画マーカーNG2(B、緑色)を露出させる。αSMA+およびαSMA-血管(白角かっこ、n =20)の直径を測定し、動脈または毛細血管(DAPI、核染色=青色、スケールバー=10μm)として区別しました。αSMA+およびαSMA-血管の直径の対になっていないt検定分析は、高い統計的有意性を示した(C、αSMA+=赤、αSMA-赤/緑、****p < 0.0001)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図6:他のリッセンセファリック種からのCNS微小血管の正常な単離。CNSは、野生のカエル(8.2cm)、トカゲ(12.7cm)、タンク育ちのニジマス(2歳、35.6cm)、鳥類育ちのハト(生後9ヶ月、~300g)から採取した。カエル、魚、トカゲのマイクロ船をH&Eで染色した(マスのマイクロ船のみが表示され、スケールバー=20μm)。ハトマイクロ容器を免疫標識した。すべての地域の微小血管を、皮質(AH)、視葉(BI)、小脳(CJ)、下垂体(DL)、視床下部(EK)、脳幹(FM)、脊髄(GおよびN)にラベル付けされた状態で識別することができました。さらに、イソレクチンIB4(白)、AQP4(緑)を有する星値状端フィート、およびハトの単離された微小血管(DAPI、核染色=青、スケールバー=10μm)からNFM(赤色)を有する隣接するニューロンを有する内皮細胞を同定することができた。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 7
図7:ギレンセファリック種からのCNS小血管の単離脳と脊髄を、マイクロ血管の単離および免疫標識のために、農場で育てられた豚(生後6ヶ月、〜120kg)から解剖した。私たちは、IB4(白)、PDGFRβ(赤)、およびAQP4(緑)の標識が正のマイクロ血管を、コルチ(A)、心室周辺の白(B)、小脳(C)、下垂体(D)、視床下部(E)、脳幹(F)、脊髄(G、DAPI、核染色目、青色、青色、100m)の全領域で同定することができました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 8
図8:CNSマイクロ容器絶縁の他の適用例。JAB-BおよびVCAM-1の発現は、マウスEAEマイクロ容器について定量した。EAEのピーク段階および慢性段階でマウスの皮質、小脳、視床下部、下垂体、脳幹、および脊髄について任意の強度単位(AUI)を測定し、コントロールとしてシャム(n=4)を有する。各CNS領域について、マウスあたり12個のマイクロ容器を評価し、フルオロクロム当たりのAUIとマイクロ容器の直径(A)を決定した。白いブラケットは、VCAM-1(白)、VEカドヘリン(緑)、JAM-B(赤)、およびDAPI(青、スケールバー=10μm)のAUIを決定するために使用される共焦点顕微鏡ソフトウェア測定ツールの例を示しています。次いで、得られたAUIをミクロン(B)の直径に対してプロットし、各免疫標識タンパク質の曲線下面積(AUC)をタンパク質発現の推定値として算出した。その後、グループあたりの平均AUCを双方向ANOVAで分析し、続いてシダックのポストホックテストで、CNS領域あたり合計48個のマイクロ船について分析しました。下垂体微小血管を除き、疾患状態に関連する微小血管径(C,挿入)の間に大きな差は認められなかったが、EAEマウスにおける視床下部および脳幹からのVE−カドヘリン発現の有意な減少(C)。同様の統計分析は、脊髄におけるVCAM-1(D)およびJAM-B(E)の有意な増加を示し、EAEのピーク時の神経炎症状態と一致した。興味深いことに、視床下部、下垂体、脳幹でVCAM-1の変化を観察しました。これらの結果は調査中です (黒いバーとドット = シャム、赤いバーとドット = ピーク EAE、サーモン バーとドット = 慢性 EAE、*p<0.05、@p<0.01、#p<0.001、および &p<0.0001)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

MV-1 10 mM ヘペス
カルシウムとマグネシウムを含む1xハンクのバランスのとれた塩溶液(HBSS)
MV-2 18% 70 kDa 分子量 (MW) デキストラン
10 mM のヘーペ/HBSS (MV-1)
MV-2 20% 70 kDa MW デキストラン
10 mM のヘーペ/HBSS (MV-1)
MV-3 1% ウシ血清アルブミン (BSA)
10 mM のヘーペ/HBSS (MV-1)
固定 4% パラホルムアルデヒド (PFA)
1xリン酸緩衝生理食塩酸(PBS)pH 7.4で
洗浄バッファー 1x PBS pH 7.4
透過・ブロッキングバッファ 10% BSA
0.25% 非イオン性界面活性剤
1x PBS pH 7.4で
抗体希釈剤 5% BSA
0.25% 非イオン性界面活性剤
1x PBS pH 7.4で

表 1: プロトコルで使用されるソリューション

ステップ アクション
4.1 および 4.1.1 シングルエッジブレードを備えたMV-1ソリューションのミンチ
4.2~4.2.2 ポッターELVJ PTFEまたはマイクロチューブペストを用いたMV-1溶液中の均質化
5.1 2,000 x gでスピン , 4 °C, 10 分
5.1.1 ~ 5.1.1.2 MV-2溶液でペレットを再サスペンド
5.2 4,400 x gでスピン , 4 °C, 15 分
5.3~5.5 1 mL の MV-3 溶液でペレットを再サスペンドする
6.2~6.4.1 50 mL円錐形チューブを細胞ストレーナーで溶出し、MV-3溶液ですすす
6.5、6.5.1、6.6、および 6.7 変更されたフィルターホルダーに20μmのナイロンネットを備えたフィルター
6.8 ナイロンネットをMV-3溶液10mLで50 mLビーカーにロードし、30sのために振ります
6.9~6.10 15 mL円錐形チューブにデカン、2,000 x g、4°C、5分でスピン
6.10 MV-3溶液の1 mLで再サスペンド
6.10.1 1.7 mLマイクロチューブに移し、20,000 x gでスピン , 4 °C, 5 分
7.1~7.3 1x PBSで再サスペンドし、ウェルスライドにロード

表2:小さな脊椎動物マイクロ容器の絶縁のためのレイアウト。このチャートは、リッセンセファリック標本を使用する場合のプロトコルの簡約版です。

ステップ ソリューション アクション Ctx Cbl 選ぶ Bst Sc Hyp ピット
4.1 MV-1 料理のミンチ 100 mm x 20 mm ペトリ皿、1 mL N/a
4.2.1 および 4.2.2 MV-1 均質 5 mL、10 mL ポッター・エルヴェジェム、害虫 1 mL, ミクロペストル
5.1.1.1 および 5.1.1.2 MV-2 再中断 5 mL + 5 mL, 18% デキストラン 1 mL、20% デキストラン
5.5 および 6.4.1 MV-3 再中断 1 mL + 10-15 mL 1 mL
6.2 および 6.4.1 MV-3 ストレーナーサイズ 100μM 70μm 100μM 70μm 100μM
リンス 5 mL
6.5、6.5.1および6.7 MV-3 フィルターサイズ、リンス 25 mm フィルター, 10 mL 13ミリメートル、5 mL
6.8 MV-3 ビーカーでシェイク 10 mL
6.10 MV-3 再中断 1 mL
7.2 1x PBS 再中断 1.5 ~2.0 mL 0.5~1.0 mL 0.1~0.2 mL
7.3 1x PBS 井戸あたりの負荷 200°L 100°L 25~50°L
CTX =皮質、CBL=小脳、BST=脳幹、OPT=視葉(哺乳動物には存在しない)、HYP=視床下部、PIT=下垂体、SC=脊髄。推奨体積は、20g(若いマウス)から800g(成ラット)までのサイズの動物から組織全体に対する。

表 3: 推奨ボリューム/サイズこのアウトラインは、〜20〜〜800g、またはより具体的には、ビデオに示されている〜25gのマウスの範囲の小さな脊椎動物標本を使用するためのソリューションの推奨体積を有する。必要な体積の最終調整は、解剖後に得られた湿潤組織の特定量に応じて研究者によって決定されなければならない。練習とトラブルシューティングを強くお勧めします。CTX =皮質、CBL=小脳、BST=脳幹、OPT=視葉(哺乳動物には存在しない)、HYP=視床下部、PIT=下垂体、SC=脊髄。

ステップ アクション
4.1 および 4.1.2 シングルエッジブレード付きMV-1のミンチ
4.3~4.3.4 PTFE害虫を用いたポッター・エルベヘムグラインダーを用いたMV-1溶液中の均質化
5.1 2,000 x gでスピン , 4 °C, 10 分
5.1.2 ~5.1.2.2 MV-2溶液でペレットを再サスペンド
5.2 4,400 x gでスピン , 4 °C, 15 分
5.3~5.5 1 mL の MV-3 溶液でペレットを再サスペンドする
6.2~6.4 および 6.4.2 50 mL円錐形チューブを細胞ストレーナーで溶出し、MV-3溶液ですすす
6.5、6.5.2、6.6、6.7 変更されたフィルターホルダーに20μmのナイロンネットを備えたフィルター
6.8 ナイロンネットをMV-3溶液30mLのビーカーに積み込み、30sのために振る
6.9 および 6.10 50 mL円錐形チューブにデカン、2,000 x g、4°C、5分でスピン
6.10 MV-3溶液の1 mLで再サスペンド
6.10.2 5 mL マイクロチューブに転送し、2,000 x gでスピン , 4 °C, 5 分
7.1~7.3 1x PBSで再サスペンドし、ウェルスライドにロード

表4:大型脊椎動物マイクロ容器絶縁用レイアウトこのチャートは、ギレンセファリック標本を使用する場合のプロトコルの簡約版です。

ステップ サディオン アクション Ctx Cbl Wm Bst Sc Hyp ピット
4.1 MV-1 料理のミンチ 3−5 mL 1 mL
4.3~4.3.4 MV-1 均質 20−30 mL、55 mLポッター・エルヴェジェム、害虫とオーバーヘッドスターラー 5 mL、10 mL ポッター・エルヴェジェム、害虫
5.1.2 ~5.1.2.2 MV-2 再中断 >20 mL, 20% デキストラン 5 mL + 5 mL, 20% デキストラン
5.5、6.4および6.4.2 MV-3 再中断 1 mL + 20 mL 1 mL + 10 mL
6.2 および 6.4.2 MV-3 ストレーナーサイズ 100μM 70μm 100μM 70μm 100μM
リンス 10 mL
6.5、6.5.2 および 6.7 MV-3 フィルターサイズ、リンス 47 mm フィルター, 10 mL 25ミリメートル、10 mL
6.8 MV-3 ビーカーでシェイク 30 mL
6.10 および 6.10.2 MV-3 再中断 1 mL + 4 mL
7.2 1x PBS 再中断 2.0 ~4.0 mL 1.0 ~ 2.0 mL
7.3 1x PBS 井戸あたりの負荷 200°L 100°L
CTX = 皮質, CBL = 小脳, WM = 白質, BST = 脳幹, HYP = 視床下部, PIT = 下垂体, SC = 脊髄.推奨ボリュームは、CTX、CBL、BST および SC 全体の HYP および PIT 用に~45 cm3のサンプル用です。

表 5: 推奨ボリューム/サイズこのアウトラインは、大きな脊椎動物標本を使用するためのソリューションの推奨体積を有する。より具体的には、ビデオに示すように、皮質、小脳、白質、脳幹、脊髄、および視床下部および下垂体全体に対して〜45cm3のCNS組織生検に適用される。必要な体積の最終調整は、解剖後に得られた湿潤組織の特定量に応じて研究者によって決定されなければならない。練習とトラブルシューティングを強くお勧めします。CTX = 皮質, CBL = 小脳, WM = 白質, BST = 脳幹, HYP = 視床下部, PIT = 下垂体, SC = 脊髄.

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Discussion

BBBは、緊密な、付着物、"ペグソケット"-接合、およびCNS恒常性2、3、19に不可欠な接着プラークの洗練されたアーキテクチャによって結合された脳微小血管系内皮細胞のユニークな特性を含む。内皮細胞特性は、ペリサイトおよび周囲のアストログリア末脚注プロセス2、3、19によって誘導および維持される。BBB微小血管系は、極性(すなわち、発光またはアブルミナル内皮細胞表面に局在するタンパク質の非対称発現パターン)20を表示する。これは一時的にBBBを定義するかもしれませんが、実際には神経科学の中で最も謎めいた概念の一つです。例えば、NVU内の地域的、性別、年齢差は、CNSの地域的な脆弱性を外傷、毒性、感染、炎症に対して説明する可能性があり、これは主要な臨床結果を有する可能性があります。BBBの理解におけるもう一つの障害は、複数のタクサ7、8の間で観察される違いです。BBBを理解し、調査する上での主要なハードルの1つは、BBBを包含するNVUの分離に関連する難しさであり、その障壁特異的特性を維持しながら14.

BBB、CNSの地域差、種の違いについての理解を加速させる試みとして、我々は以前に公表された方法を適応した。我々は、これら、特にBoulay et al.21を適応させ、単一の皮質、小脳、視床下部、下垂体、脳幹、および脊髄組織から無数のリッセンセファリック小脊椎動物(魚、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類)から微小血管を得る(図3、図4、図5、6)。この方法の利点の1つは、その適応がCNS組織の全体的なサイズに基づいていることである:研究者は、種、性別、年齢に関係なく、湿った組織に応じて溶液の量、組織粉砕機のサイズ、円錐形チューブ、フィルターホルダーなどを選択する。免疫標識の経験では、約20gの標本は、皮質、小脳、視ローブ、脳幹、脊髄および脊髄当たり8ウェルスライドに十分なマイクロ容器を生じ、視床下部および下垂体当たり8ウェルスライドを生み出します。しかし、皮質および視葉の収率は、小脳、脳幹、脊髄に比べてはるかに高い。

図に示すように、ブタとマカクのCNS微小血管の単離および免疫標識に必要な適応を行い、より翻訳研究に関連するより大きなギレンセファリック哺乳動物(図7)。特に、これらの種のみに心室白色物質を含めることができた。これらの動物のCNSは大きいので、第2遠心分離中にミエリン層からマイクロ容器ペレットを分離するのに十分な白質を集めました(ステップ5.3、20%デキストランを用いたMV-2)。我々は、この分離を可能にするために重要な質量が必要であると推測し、我々は積極的にマウスCNS組織と同様の結果を得る方法を模索している。

簡潔さのために省略しましたが、鳥類、ブタ、マカクマイクロ容器のNVU正規マーカーを超えて免疫標識を行いました。特に、BBB機能(接合タンパク質VEカドヘリン、CLDN5、ZO-1、LSRおよびアピコバサルマーカーCXCL12およびGGT1)に関連する細胞マーカーおよび分子マーカーを、以前にマウスサンプルで共有していたか、またはNVU(NFM、OSP、およびGFAP)に近接している。繰り返しになりますが、これらの知見は、他の種に対するこの方法の使用を奨励し、NVUの正統学および種間の発散をさらに同定する。また、同種内のNVU株、性別、年齢差のさらなる調査の機会と、BBB生物医学研究のために他の生物を使用する可能性を開きます。また、神経炎症時のタンパク質発現レベルの変化を定量するために、このマイクロ血管単離法を使用した証拠を示す(図8)。この実験は概念実証として行いましたが、ここで使用されるアプローチは現在、当社の研究室で広く利用されています。我々は、発現レベルだけでなく、相対的なタンパク質の存在量、CXCL12および他のアピコバサルタンパク質の再配置、接合タンパク質の結合などに焦点を当てたいので、他の定量的方法(例えば、ウェスタンブロット)よりもこのアプローチを支持する。同様に、現在、NVU細胞成分(内皮細胞およびペリサイト)、RNA-seq、およびプロテオミクス23、24、25、26のさらなる単離など、他のアプリケーションに対する我々の方法のトラブルシューティングを行っています。

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Disclosures

著者たちは何も開示する必要はない。

Acknowledgments

クルーズ・オレンゴ博士は、カリフォルニア大学デービス獣医学部スタートアップファンドの支援を受けました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10X PBS ThermoFisher BP39920 Used for blocking and antibody diluent.
20% PFA Electron Microscopy Sciences 15713-S Used as fixative (4% PFA)
70,000 MW Dextran Millipore Sigma 9004-54-0 Used for MV-2 solution
Adson Forceps Fine Science Tools (FST) 11006-12 Used for removal of muscle and skin
Adson Forceps, student quality FST 91106-12 Same as above but cheaper
Bovine serum albumin (BSA) Millipore Sigma A7906-100G Used for MV-3 solution, blocking and antibody diluent
Corning 100 μm Cell strainer Millipore Sigma CLS431752-50EA
Corning 70 μm Cell strainer Millipore Sigma CLS431751-50EA
Corning Deskwork low-binding tips Millipore Sigma CLS4151 Same as below but cheaper.
Cultrex Poly-D-Lysine R&D 3439-100-01 Used for slide coating
Donkey anti-Goat IgG-ALEXA 555 Thermo A21432 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Donkey anti-Mouse IgG-ALEXA 488 Thermo A21202 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 488 Thermo A21206 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 647 Thermo A31573 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Donkey anti-Rat IgG-DyLight 650 Thermo SA5-10029 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Double-Pronged Tissue Pick FST 18067-11 Used for removal of meninges and choroid plexus
Dumont #3c Forceps FST 11231-20 Used for more delicate and/or small CNS tissue handling (like pituitary)
Dumont #7 Forceps FST 11274-20 Used for CNS tisssue dissection and handling
Dumont #7 Forceps, student FST 91197-00 Same as above but cheaper
ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention Tips Eppendorf 22493008 Better quality than the tips above (more expensive).
Extra Fine Graefe Forceps, serrated FST 11151-10 Used for bone removal
Fine Scissors, sharp FST 14060-09 Used for removal of pig and macaque dural sac
Glass Pestle 1.5 mL Microcentrifuge Tube Tissue Grinder Homogenizer, Pack of 10 Chang Bioscience Inc. (eBay) GP1.5_10 Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.
Goat anti-CXCL12, biotinylated PeproTech 500-P87BGBT Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution: 1:20.
Goat anti-JAM-B R&D AF1074 Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 488 Thermo A11001 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 555 Thermo A21424 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Goat anti-PDGFRβ R&D AF1042 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Goat anti-Rabbit IgG-ALEXA 555 Thermo A21249 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Goat anti-Rabbit IgG-DyLight 488 Thermo 35552 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Goat anti-Rat IgG-DyLight 650 Thermo SA5-10021 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Graefe Forceps, curved tip, 1X2 teeth FST 11054-10 Use for nylon filter net holding and shaking
HBSS, 1X buffer with calcium and magnesium Corning 21-022-CM Used for MV-1 solution
HEPES, 1M liquid buffer Corning 25-060-CI Used for MV-1 solution
Isolectin GS-IB4-Biotin-XX ThermoFisher Scientific (Thermo) I21414 Glycoprotein isolated from legume Griffonia simplicifolia that binds D-galactosyl residues of endothelial cell glycocalysx. Used for avian and porcine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 μg/mL.
LaGrange Scissors, serrated FST 14173-12 Used for skull dissection and laminectomy (except pig and macaque)
Millicell EZ slide 8-well unit Millipore Sigma PEZGS0816
Mouse anti-CLDN5 Thermo 35-2500 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Mouse anti-GGT1 Abcam ab55138 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Mouse anti-Human CD31 R&D BBA7 Used as primary antibody on primate CNS microvessels. Recommended concentration: 16.5 μg/mL.
Mouse anti-NFM Thermo RMO-270 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Mouse anti-αSMA Thermo MA5-11547 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.
Nylon Filter Net, roll Millipore Sigma NY6000010 Laser-cut to 13 mm diameter filter net discs. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.
Nylon Filter Nets, 25 mm Millipore Sigma NY2002500 Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.
Nylon Filter Nets, 47 mm Millipore Sigma NY2004700 Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.
ProLong Gold antifade reagent with DAPI ThermoFisher P36935 Used to coverslip slides.
Rabbit anti-AQP4 Millipore Sigma A5971 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.
Rabbit anti-LSR Millipore Sigma SAB2107967 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Rabbit anti-NG2 Millipore Sigma AB5320 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.
Rabbit anti-OSP Abcam ab53041 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 1 μg/mL.
Rabbit anti-VE-Cadherin Abcam ab33168 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Rabbit anti-ZO-1 Thermo 61-7300 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Rat anti-CD31 Becton Dickinson BD 550274 Used as primary antibody for murine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Rat anti-GFAP Thermo 13-0300 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.
Rat anti-VCAM-1 Becton Dickinson BD 553329 Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Sterile Ringer's Solution, Frog Aldon Corporation IS5066 Used for amfibian anesthesia
Streptavidin-ALEXA 555 Thermo S32355 Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500.
Streptavidin-ALEXA 647 Thermo S32357 Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500.
Surgical Scissors, sharp FST 14002-12 Used for removal of muscle and skin
Surgical Scissors, sharp-blunt FST 14001-16 Used for decapitation (except pig and macaque)
Swinnex Filter Holder, 13 mm Millipore Sigma SX0001300 Modified by laser-cut. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.
Swinnex Filter Holder, 25 mm Millipore Sigma SX0002500 Modified by laser-cut. Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.
Swinnex Filter Holder, 47 mm Millipore Sigma SX0004700 Modified by laser-cut. Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.
Triton X-100 ThermoFisher 50-165-7277 Used for blocking and antibody diluent.
Wheaton 120 Vac Overhead Stirrer VWR (Supplier DWK Life Sciences) 62400-904 (DWK #903475) Used for macaque and pig CNS tissues with 55 mL tissue grinder, except hypothalamus and pituitary.
Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 10 mL VWR (Supplier DWK Life Sciences) 14231-384 (DWK #357979) Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.
Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 55 mL VWR (Supplier DWK Life Sciences) 14231-372 (DWK #357994) Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.

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References

  1. Bundgaard, M., Abbott, N. J. All vertebrates started out with a glial blood-brain barrier 4-500 million years ago. Glia. 56, 699-708 (2008).
  2. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a020412 (2015).
  3. Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).
  4. Kealy, J., Greene, C., Campbell, M. Blood-brain barrier regulation in psychiatric disorders. Neuroscience Letters. (2018).
  5. Sweeney, M. D., Kisler, K., Montagne, A., Toga, A. W., Zlokovic, B. V. The role of brain vasculature in neurodegenerative disorders. Nature Neuroscience. 21, 1318-1331 (2018).
  6. Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back. Physiological Reviews. 99, 21-78 (2019).
  7. Wilhelm, I., Nyul-Toth, A., Suciu, M., Hermenean, A., Krizbai, I. A. Heterogeneity of the blood-brain barrier. Tissue Barriers. 4, e1143544 (2016).
  8. O'Brown, N. M., Pfau, S. J., Gu, C. Bridging barriers: a comparative look at the blood-brain barrier across organisms. Genes & Development. 32, 466-478 (2018).
  9. Cruz-Orengo, L., et al. CXCR7 influences leukocyte entry into the CNS parenchyma by controlling abluminal CXCL12 abundance during autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 208, 327-339 (2011).
  10. Serres, S., et al. VCAM-1-targeted magnetic resonance imaging reveals subclinical disease in a mouse model of multiple sclerosis. FASEB Journal. 25, 4415-4422 (2011).
  11. Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).
  12. Sohet, F., et al. LSR/angulin-1 is a tricellular tight junction protein involved in blood-brain barrier formation. Journal of Cell Biology. 208, 703-711 (2015).
  13. Cruz-Orengo, L., et al. Enhanced sphingosine-1-phosphate receptor 2 expression underlies female CNS autoimmunity susceptibility. Journal of Clinical Investigation. 124, 2571-2584 (2014).
  14. Dayton, J. R., Franke, M. C., Yuan, Y., Cruz-Orengo, L. Straightforward method for singularized and region-specific CNS microvessels isolation. Journal of Neuroscience Methods. 318, 17-33 (2019).
  15. Smyth, L. C. D., et al. Markers for human brain pericytes and smooth muscle cells. Journal of Chemical Neuroanatomy. 92, 48-60 (2018).
  16. Granberg, T., et al. In vivo characterization of cortical and white matter neuroaxonal pathology in early multiple sclerosis. Brain. 140, 2912-2926 (2017).
  17. Datta, G., et al. Neuroinflammation and its relationship to changes in brain volume and white matter lesions in multiple sclerosis. Brain. 140, 2927-2938 (2017).
  18. Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. Neuroimaging Techniques to Assess Inflammation in Multiple Sclerosis. Neuroscience. 403, 4-16 (2019).
  19. Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).
  20. Cornford, E., Hyman, S. Localization of brain endothelial luminal and abluminal transporters with immunogold electron microscopy. NeuroRx. 2, 27-43 (2005).
  21. Boulay, A. C., Saubamea, B., Decleves, X., Cohen-Salmon, M. Purification of Mouse Brain Vessels. Journal of Visualized Experiments. 53208 (2015).
  22. Paul, D., Cowan, A. E., Ge, S., Pachter, J. S. Novel 3D analysis of Claudin-5 reveals significant endothelial heterogeneity among CNS microvessels. Microvascular Research. (2012).
  23. Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels. Journal of Neuroscience Methods. 207, 80-85 (2012).
  24. Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Research. 1134, 1-11 (2007).
  25. Bourassa, P., Tremblay, C., Schneider, J. A., Bennett, D. A., Calon, F. Beta-amyloid pathology in human brain microvessel extracts from the parietal cortex: relation with cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 137, 801-823 (2019).
  26. Porte, B., et al. Proteomic and transcriptomic study of brain microvessels in neonatal and adult mice. PLoS One. 12, e0171048 (2017).

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