Um modelo pré-clínico do rato para o estudo da lesão da Isquemia-reperfusion na microcirurgia reconstrutiva

Medicine

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Summary

Aqui, descrevemos um modelo animal pré-clínico para estudar a fisiopatologia da lesão isquemia-reperfusão em microcirurgia reconstrutiva. Este modelo de retalho de pele livre baseado nos vasos epigátricos caudais superficiais no rato também pode permitir a avaliação de diferentes terapias e compostos para neutralizar danos relacionados à isquemia-reperfusão.

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Ballestín, A., Casado, J. G., Abellán, E., Vela, F. J., Campos, J. L., Martínez-Chacón, G., Bote, J., Blázquez, R., Sánchez-Margallo, F. M. A Pre-clinical Rat Model for the Study of Ischemia-reperfusion Injury in Reconstructive Microsurgery. J. Vis. Exp. (153), e60292, doi:10.3791/60292 (2019).

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Abstract

A lesão por isquemia-reperfusão é a principal causa de falha de retalho na microcirurgia reconstrutiva. O rato é o modelo animal pré-clínico preferido em muitas áreas de pesquisa biomédica devido à sua custo-eficácia e sua tradução para os seres humanos. Este protocolo descreve um método para criar um modelo livre pré-clínico da aleta da pele nos ratos com ferimento da isquemia-reperfusion. O modelo descrito da aleta livre da pele do rato de 3 cm x 6 cm é obtido facilmente após a colocação de diversas ligaduras vasculares e da seção do pedicle vascular. Então, 8 h após o insulto isquêmico e conclusão da anastomose microcirúrgica, a aleta livre da pele desenvolve os danos do tecido. Esses danos relacionados à isquemia-reperfusão podem ser estudados neste modelo, tornando-se um modelo adequado para avaliar agentes terapêuticos para tratar desse processo fisiopatológico. Além disso, duas técnicas principais de monitoramento são descritas no protocolo para a avaliação deste modelo animal: tecnologia de ultrassom em tempo de trânsito e análise de contraste de salpicos a laser.

Introduction

A microcirurgia tornou-se uma técnica cirúrgica comum de reconstrução que permite intervenções (por exemplo, transferências gratuitas de tecidos) para restaurar defeitos genéticos complexos, replantação de membros amputados e até mesmo alotransplantes de tecidocompostos.

Reconstruções microcirúrgicas são ideais para uma grande variedade de defeitos causados por lesões traumáticas, queimaduras ou ressecções oncológicas. No entanto, há uma baixa porcentagem de falha de retalho livre, entre as quais a lesão pela isquemia-reperfusão (I/R) é um dos principais fatores responsáveis. Todos os tecidos microcirurgicamente transferidos suportam um período obrigatório de isquemia seguido pela reperfusão. Este período de isquemia primária é geralmente bem tolerado; assim, a taxa de sucesso dos procedimentos microcirúrgicos excede 90%1,2. No entanto, apenas 63,7% dos retalhos que exigem revisão cirúrgica podem ser completamente salvos3. Além disso, em casos de replantação de lesões por vulsão dos dedos, a taxa de sucesso é de 66%4; e nos casos de alotransplante de tecido composto que sofrem de lesão i/r, os percentuais de rejeição são aumentados desde que a lesão de I/R ativa a imunidade inata5,6.

Portanto, o estudo desse fenômeno fisiopatológico é de interesse. Modelos animais são essenciais para investigar mecanismos fisiológicos e avaliar novas terapias antes que possam ser aplicados aos seres humanos7. A anatomia dos vasos e as semelhanças fisiológicas entre ratos e seres humanos fazem dos ratos um modelo ideal para a investigação de processos biológicos, como a lesão em I/R.

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para a criação de um modelo de retalho de pele sem ratos com lesão em I/R, bem como diferentes possibilidades de avaliações intra e pós-operatórias. O objetivo geral deste método é descrever um modelo pré-clínico útil para estudar lesão i/r e possíveis tratamentos para reduzir seus danos relacionados.

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Protocol

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com o comitê de ética do Centro de Cirurgia Minimamente Invasiva Jesús Usón e as diretrizes de bem-estar do governo regional que se baseiam na legislação europeia.

1. Preparação pré-cirúrgica e cirúrgica

  1. Ratos Wistar da casa que pesam 290-350 g nas gaiolas em 22-25 °C com acesso livre ao alimento e à água. Aclimatar-se por 1 semana antes da cirurgia para evitar problemas induzidos pelo estresse.
  2. Coloque um rato em uma câmara de indução anestésica, entregue 5 min de oxigênio (0,5-1 L/min) e use um vaporizador para entregar 5% de sevoflurane para induzir anestesia.
  3. Leve o rato para fora da câmara uma vez que a anestesia é induzida. Coloque a máscara facial inalação sobre o rato e fornecer uma taxa de fluxo de 2% sevoflurane para manter anestesia. Check for the lack of response to a toe pinch.
  4. Use uma pomada de proteção ocular para evitar a secagem e danos na córnea.
  5. Monitore o animal anestesia geral da seguinte forma: Coloque um termômetro retal (35,9-37,5 °C), verifique a cor da membrana mucosa e posicione um oxímetro de pulso de roedor para verificar a saturação O2 (>95%) e frequência cardíaca (250-450 bpm).
  6. Use um suporte térmico (almofadas de aquecimento elétrica ou cobertores de água circulantes) para evitar hipotermia e melhorar a recuperação pós-anestesia pós-processual.
  7. Injete 5 mL de solução fisiológica fisiológica fisiológica quente para manter a hidratação adequada.
  8. Fornecer analgesic e anti-inflamatórios (meloxicam 1 mg/kg/dia) e antibióticos profiláticos (enrofloxacin 7.5 mg/kg/dia) subcutâneosly antes do procedimento e por 5 dias pós-operatório.
  9. Raspe as áreas abdominais e inguinais do animal.
  10. Aplique povido-iodo tópico, seguido por 70% de etanol. Cubra o animal com uma cortina estéril.

2. Cirurgia gratuita do modelo da aleta da pele

  1. Usando um marcador cirúrgico, desenhe uma aba de 3 cm x 6 cm que combina um dos lados de 6 cm com a linha média do abdômen. Em seguida, faça uma incisão da pele de 6 cm na linha média do abdômen e duas incisões perpendiculares de 3 cm na parte superior e inferior da incisão de linha média de 6 cm.
  2. Para começar a dissecar o retalho de pele projetado de 3 cm x 6 cm, use tesouras e fórceps Adson para levantar a aba (em vez de um bisturi) devido à mobilidade da pele.
  3. Puxe delicadamente a aleta da área craniana para a área caudal para ajudar com a dissecação e para identificar o pedicle epigastric cercado pelo tecido conjuntivo frouxo abundante.
  4. Dissecar o pedicle da aleta sem tocá-lo ou agarrando o adventitia tão pouco como possível para evitar danificar a parede da embarcação.
  5. Use 8/0 suturas de nylon para oclude por ligaduras os vasos proximal caudal femoral, vasos femorais circumflexlatera laterais e vasos safenosos. Assim, a perfusão da aba é fornecida pela artéria femoral e continua diretamente através da artéria episórica caudal superficial, enquanto a drenagem venosa é realizada pela veia episórica caudal superficial em direção à veia femoral.
  6. Aperte o pépé vascular e corte-o para iniciar o período de isquemia de 8 h. Durante o procedimento, use cobertores elétricos para manter a temperatura. Duas injeções de 5 ml de solução salina quente (25°C) de 0,9% são administradas de forma subcutânea. A primeira administração é realizada 2 h após o início do procedimento; e o segundo no final do procedimento para obter uma recuperação adequada do animal.
  7. Use solução salina heparinizada (100 U/mL) para perfundir a aba e remover o sangue estagnado da microcirculação.
  8. Use 10/0 suturas de nylon para realizar o anastomoses microcirúrgico.
  9. Após 8 h de isquemia, reperfuse a aleta removendo as braçadeiras microvasculares e verific o patency vascular como descrito abaixo.

3. Avaliação Intraoperatória

  1. Realize um teste manual de patência (teste vazio e recarreguo) para a veia e a artéria. Para fazer isso, use duas fórceps microcirúrgicos, posicione-os distal à anastomose e realize a ordenha. Libere os fórceps mais próximos do local da anastomose primeiro. Se o fluxo sanguíneo continuar depois que uma seção vascular for esvaziada, então a anastomose é patente.
  2. Avalie o fluxo sanguíneo usando um flowmeter de ultra-som em tempo de trânsito e sondas microcirúrgicas.
    1. Medir o diâmetro das embarcações do pedicle a fim escolher o tamanho apropriado para as pontas de prova do fluxo.
      Nota: Uma sonda de fluxo de 0,7 mm pode medir embarcações que variam de 0,4 mm a 0,7 mm; uma sonda de fluxo de 1,0 mm pode medir embarcações que variam de 0,7 mm a 1,0 mm; uma sonda de fluxo de 1,5 mm pode medir vasos que variam de 1,0 mm a 1,5 mm.
    2. Coloque a embarcação alvo na janela de detecção ultrassônica (entre o refletor e os transdutores) da sonda de fluxo para quantificar o volume de fluxo.
      Nota: Segure a sonda neutra no plano da embarcação, para evitar qualquer tensão ou puxar.
    3. Verifique a qualidade do acoplamento acústico, observando que todas as barras são verdes na tela.
      Nota: Se difícil obter um bom acoplamento acústico, use gel ultra-sônico ou solução fisiológica salina topicamente.
    4. Quando um bom acoplamento é alcançado e o navio é colocado na janela acústica sem qualquer tensão, clique no botão Record no visor para armazenar os dados.
      Nota: Para obter uma medida confiável e correta, certifique-se de que o padrão de forma de onda é constantemente repetível.
  3. Uma vez feito, use ácido poliglicólico (PGA) 4-0 suturas trançadas absorvíveis (16mm 3/8 agulha triangular) para fechar a pele. Use um padrão simples interrompido para manter a força e a posição do tecido se parte da sutura for mordida pelo rato no pós-operatório.
  4. Avalie a microcirculação da aba usando análise de contraste de speckle a laser (LASCA).
    1. Faça uma nova gravação para cada animal e para cada acompanhamento do estudo. Para isso, clique em Arquivo/Nova Gravação. Uma nova janela se abre e o Painel de Configuração é exibido. Em seguida, eitifique as informações do nome do projeto, assunto, operador e nome de gravação.
    2. Para a reprodutibilidade máxima, padronizar os seguintes parâmetros: distância de trabalho, área de medição, densidade de pontos, taxa de quadros e condições de luz ambiente.
      1. Ajuste a distância de trabalho movendo o laser em relação ao tecido. Zoom dentro ou para fora da cabeça laser para o tecido de interesse. Para verificar se há o valor medido, clique na configuração de imagem. Aqui, fixado em 12,0 cm.
      2. Padronizar a área de medição, inserindo a largura desejada e altura na configuraçãode imagem . A aba projetada mede 3 cm x 6 cm. Para esta medida, selecione uma largura de 4,0 cm e uma altura de 7,0 cm para ter algum espaço extra.
      3. Defina a densidade de pontos tão alta na configuração de imagem. Alta, média e baixa são as três opções.
    3. Na configuração de captura de imagem, selecione a Taxa de Quadro (10 imagens/s) para a gravação e a Duração (1 min) da gravação.
      Nota: Tenha a mesma condição de luz ambiente na sala de cirurgia durante a operação ou realização das avaliações.
    4. Clique no botão Gravar para começar a gravar. O Painel de Configuração é substituído pelo Painel de Gravação. Os dados são salvos automaticamente. Tire instantâneos durante o procedimento para permitir uma comparação mais aprofundada.
      Nota: A escala de perfusão pode ser alterada para melhorar a visualização (Ferramentas de clique | Filtros e escalas de cores | Escala de perfusão | Manual 0 - 150),mas os valores medidos de perfusão não serão afetados. Antes e depois da gravação, diferentes regiões de interesse (ROIs) podem ser criadas para medir a perfusão dentro deles. Aqui, avaliamos apenas a área do retalho praticado (3 cm x 6 cm).
  5. Use o software ImageJ para medir as áreas de sobrevivência e necrose.
    1. Localizar uma régua ao lado da aba e, em seguida, tirar fotos de controle para medições macroscópicas da área de sobrevivência flap.
    2. Para avaliar as imagens, abra a interface do usuário ImageJ. Clique no Arquivo e abra a imagem a ser medida.
    3. Selecione linha reta na caixa de ferramentas e desenhe uma linha reta sobre 1 cm da régua. Clique na Análise | Definir escala e introduzir na caixa de texto para a distância conhecida o valor de 1 cm.
    4. Clique na Ferramenta de Seleção de Polígono e desenhe as linhas de polígono sobre a aba para calcular a área viável. Em última análise, clique em Analisar | Medida para obter o valor da área.
  6. Coloque um curativo pós-operatório sobre o animal antes da habitação para evitar a automutilação da área cirúrgica. Após os procedimentos, os animais estão alojados em gaiolas individualmente, em uma sala com controle de temperatura (22°C a 25°C).

4. Avaliação pós-operatória e amostragem de tecidos

  1. Anestesie o rato em 7 dias pós-operatórios para a avaliação da aba e amostragem de tecidos, seguindo os mesmos passos previamente descritos neste protocolo (passos 1.2 e 1.3). Verifique se há profundidade de anestesia pela falta de resposta à pitada do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do lado.
  2. Fotografe a área cirúrgica para permitir medições macroscópicas das áreas de sobrevivência e necrose da aleta. Faça as medições macroscópicas pós-operatórias seguindo as mesmas etapas da avaliação intraoperatória que foram explicadas anteriormente no protocolo (passo 3.5).
    Nota: Preste atenção ao usar a Ferramenta de Seleção de Poligão, desenhando as linhas na aba delimitando a área viável (medida em cm2). O percentual da área viável pode ser calculado como (cm2 de área viável/cm2 da área total da aba) × 100.
  3. Avalie a microcirculação do retalho utilizando a técnica LASCA (passo 3.4) para visualizar e quantificar as diferenças de perfusão
  4. Após a análise macroscópica, retire as suturas 4/0 e levante a aba para reavaliar o fluxo sanguíneo do pedicle vascular usando o ultra-som do trânsito-tempo.
  5. Realize a amostragem de tecidos dividindo longitudinalmente a aba em duas partes de 1,5 cm x 6 cm.
    1. Mergulhe uma parte em um recipiente de biópsia com paraformaldeído de 4% à temperatura ambiente para novas análises histológicas.
    2. Introduza a outra parte do tecido em um tubo de criopreservação, mergulhe-o em nitrogênio líquido e, em seguida, criopreserve o tubo armazenando-o a -80 °C para futuras análises moleculares.
  6. Eutanásia do rato anestesia de inalação geral usando uma injeção intracardíaca rápida de 2 M KCl/kg de acordo com as recomendações do comitê ético.

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Representative Results

Imediatamente após a criação do anastomoses microcirúrgico, obtivemos volumes mais elevados da circulação sanguínea do que os fluxos mínimos recomendados na literatura8; assim, todos os anastomoses microcirúrgicos foram patenteados 1 semana após a cirurgia (Figura 1).

Figure 1
Figura 1: Avaliação do fluxo sanguíneo de ultrassom em tempo de trânsito. posiçãoda sonda de fluxo microcirúrgico para avaliar o fluxo sanguíneo. (B) Padrão de fluxo sanguíneo e quantificação obtida dos vasos anastomosed do pedicle retalho. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

A observação da privação microcirculatória do fluxo sanguíneo durante o insulto isquêmico foi possível com a técnica LASCA, incluindo a hiperfusão imediata durante a reperfusão de retalhos, e, perioperatória, as diferentes áreas com menor perfusão e maior risco de aletas pós-operatórias que foram de fato necrotizadas 7 dias após o término do estudo (Figura 2).

Figure 2
Figura 2: Tecnologia de análise de contraste de speckle laser. (A)Visualização da perfusão de sangue do tecido microcirculatório na condição fisiológica. (B) Visualização da perfusão de sangue do tecido microcirculatório durante a isquemia. (C) Visualização da perfusão de sangue microcirculatório do tecido imediatamente após a reperfusão. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

A área de sobrevivência da aleta após 8 h do ischemia e sua reperfusão subseqüente era ao redor 40%. Os resultados publicados anteriormente9 mostraram diferenças estatisticamente significativas quando este modelo foi comparado com retalhos onde nenhum insulto isquêmico foi infligido.

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Discussion

Transferências de tecido livre microcirúrgicas tornaram-se o método de escolha para reconstruir grandes defeitos. Um período de isquemia ocorre durante tais transferências gratuitas de tecido. Quando este período excede a tolerância do tecido, i/ r lesão pode causar falha da falha prática livre retalho9. A descrição da metodologia para desenvolver um modelo pré-clínico econômico e translacional para estudar lesão i/r em microcirurgia reconstrutiva pode ajudar a liderar o estudo de diferentes compostos para neutralizar esse processo fisiopatológico.

No modelo animal descrito, depois que as ligaduras vasculares foram coloc e a aleta livre foi levantada, nenhum acordo do fluxo de sangue do hindlimb foi anotado, nem dor ou coxo. Como Kochi et al.10 descreveram, nosso modelo também deixou três rotas colaterais através de redes intramusculares.

O monitoramento de retalhos livres é de grande importância11,já que o resgate está inversamente relacionado à duração entre o início da isquemia e seu reconhecimento clínico. Para tanto, as abas gratuitas devem ser estudadas de forma intra e pós-operatória.

Intraoperatório, o teste de recarga vazio e de recarga amplamente utilizado ou o Doppler acústico permitem a identificação, mas não a quantificação da presença ou ausência do fluxo através de uma anastomose12. Por esta razão, usamos a tecnologia de ultra-som em tempo de trânsito, um novo método que permite aos cirurgiões quantificar o fluxo sanguíneo de anastomoses microcirúrgico13. Em nosso estudo, todos os anastomoses microcirúrgicos foram patenteapós 8 h de insulto isquêmico, bem como no final do estudo. Imediatamente após a criação do anastomoses microcirúrgico, nós anotamos uns volumes mais elevados da circulação sanguínea do que os mínimos recomendados na literatura8. Isso previu uma boa perfusão de pedicle no final do estudo, demonstrando que os resultados não foram influenciados pela técnica microcirúrgica, mas sim pela cascata de lesões de I/R dos eventos. No entanto, esta técnica não está livre de limitações. Para obter resultados confiáveis, as sondas microcirúrgicas devem ser mantidas neutras no plano da embarcação, não puxando-a ou criando qualquer tensão. Um bom acoplamento acústico é necessário para obter um sinal adequado, que pode ser alcançado usando gel ultrassônico ou soro fisiológico. Um sinal de acoplamento de alta qualidade, fornecido pelo equipamento, é um parâmetro importante a considerar durante as medições.

Usamos lasca, também conhecido como laser speckle contraste imagem ou laser speckle imagem, pós-operatório14. Esta tecnologia representa uma técnica valiosa para o mapeamento semi-quantitativo em tempo real do fluxo dentro de retalhos livres, como verificado aqui. Uma das limitações é que os resultados são fornecidos em unidades arbitrárias e não diretamente relacionados aos valores reais do fluxo. Nesse sentido, são necessárias mais pesquisas para validar essa correlação. A fluimetria do Laser Doppler é mais comumente usada, mas limitada pelo fato de que ela só mede a perfusão em um único ponto na aba, enquanto a LASCA permite a detecção de mudanças regionais na perfusão da pele dentro da aba15. Além disso, um estudo recente16 indicou que lasca pode prever perioperatórioas as regiões com alto risco de necrose retalho pós-operatório. Nossos resultados sugerem que lasca é uma técnica promissora para o monitoramento peri- e pós-operatório de retalhos livres.

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Disclosures

Os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgments

O projeto de pesquisa foi realizado no Centro de CirurgiaMinimalMente Invasiva (CCMIJU) de Jesús Usón, parte da TIC Nanbiosis. O estudo foi realizado com a assistência das seguintes unidades de Nanbiose: U21, sala de cirurgia experimental; U22, habitação animal; e U14, terapia celular. Este trabalho contou com o apoio do projeto PI16/02164 do ISCIII. O financiador não teve nenhum papel no projeto do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou preparação de manuscritos. Um agradecimento especial é estendido a María Pérez por preparar os números e a Fernanda Carrizosa por proporcionar incentivo constante e apoiar a bibliografia científica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AureFlo Unit Transonic (Ithaca, USA) N/A Transit-time ultrasound flowmeter equipment
Commbined Basic Hand- and Reconstructive Surgery Set (round handle) S&T AG (Neuhausen, Switzerland) RHR-SET. Art.No.00795 Set of microsurgical instruments
FLOW-i Maquet Critical Care AB (Solna, Sweeden) N/A Anesthesia Delivery System
Micro clamps ABB-1 S&T AG (Neuhausen, Switzerland) 00408V Double microvascular clamp with frame
Micro clamps ABB-11 S&T AG (Neuhausen, Switzerland) 00414V Double microvascular clamp without frame
Micro clamps B-1 S&T AG (Neuhausen, Switzerland) 00396V Sigle microvascular clamp
Nylon suture 10/0 Laboratorio Aragó (Barcelona, Spain) 19921 Microsurgical suture
OPMI Pentero 800 Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germany) N/A Surgical microscope
PeriCam PSI System Perimed AB (Järfälla, Sweden) N/A Laser speckle contrast analysis equipment
Philips Intellivue MX450 Philips Medizin Systeme (Böblingen, Germany) N/A Monitoring system
Protector posoperatorio para roedores Fundación Centro de Cirugía de Mínima Invasión Jesús Usón (Cáceres, Spain) P201400272 Postoperative protector for rodents

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