Децентрализованная (Ex Vivo) модель мочевого пузыря с детрусорной мышцей удалены для прямого доступа к suburothelium во время заполнения мочевого пузыря

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Модель мочевого пузыря, свободная от детрузозора, обеспечивает прямой доступ к субуротелию для изучения местных механизмов регулирования наличия биологически активного посредника в субуротелии/ламине проприи и опорожнение мочи. Препарат очень напоминает заполнение нетронутого мочевого пузыря и позволяет проводить исследования по объему давления без системного воздействия.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Durnin, L., Corrigan, R. D., Sanders, K. M., Mutafova-Yambolieva, V. N. A Decentralized (Ex Vivo) Murine Bladder Model with the Detrusor Muscle Removed for Direct Access to the Suburothelium during Bladder Filling. J. Vis. Exp. (153), e60344, doi:10.3791/60344 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Предыдущие исследования установили высвобождение химических веществ из листов слизистой оболочки плоского пузыря, прикрепленных в усинг-камерах и подверженных изменениям гидростатического давления или механического растяжения, а также из культивированных уротических клеток при гидростатических изменениях давления, растяжения, отеке клеток или сил перетаскивания, а также в просвете мочевого пузыря в конце заполнения. Такие выводы привели к предположению, что эти посредники также высвобождаются в субуротелиум (SubU)/lamina propria (LP) во время заполнения мочевого пузыря, где они влияют на клетки глубоко в стенке мочевого пузыря, чтобы в конечном счете регулировать возбудимость мочевого пузыря. В таких исследованиях есть по крайней мере два очевидных ограничения: 1) ни один из этих подходов не дает прямой информации о присутствии посредников в SubU/LP, и 2) используемые стимулы не являются физиологическими и не поддаются подлинному наполнению мочевого пузыря. Здесь мы обсуждаем процедуру, которая позволяет прямой доступ к субротелиальной поверхности слизистой оболочки мочевого пузыря в процессе заполнения мочевого пузыря. Препарат без минурного детрузора, который мы создали, очень напоминает заполнение нетронутого мочевого пузыря и позволяет проводить исследования по объему давления на мочевом пузыре при отсутствии путаницы, сигнализирующей от спинальных рефлексов и гладкой мышцы. Используя новую модель мочевого пузыря без детрузора, мы недавно продемонстрировали, что внутривежные измерения посредников не могут быть использованы в качестве прокси-сервера к тому, что было выпущено или присутствует в SubU/LP во время заполнения мочевого пузыря. Модель позволяет изучить уротелий полученных сигнальных молекул, которые высвобождаются, генерируются метаболизмом и / или транспортируются в SubU / LP в ходе заполнения мочевого пузыря для передачи информации в нейроны и гладкой мышцы мочевого пузыря и регулировать его возбудимость во время недержания и micturition.

Introduction

Цель этой модели заключается в том, чтобы обеспечить прямой доступ к подмукозной стороне слизистой оболочки мочевого пузыря во время различных фаз заполнения мочевого пузыря.

Мочевой пузырь должен воздерживаться от преждевременного сокращения во время заполнения и пустой, когда критический объем и давление достигаются. Аномальные недержания или аннулирования мочи часто связаны с ненормальной возбудимостью детрузор гладкой мышцы (DSM) в ходе заполнения мочевого пузыря. Возбудимость DSM определяется факторами, присущими гладким мышечным клеткам, и влияниями, генерируемыми различными типами клеток в стенке мочевого пузыря. Стенка мочевого пузыря состоит из уротелия (слизистая оболочка), субуротелия (SubU)/lamina propria (LP), детрузора гладкой мышцы (DSM) и серозы(рисунок 1A). Уротелий состоит из зонтичных клеток (т.е. внешнего слоя уротелия), промежуточных клеток и базальных клеток (т.е. внутреннего слоя уротелия). Различные типы клеток, в том числе интерстициальные клетки, фибробласты, афферентные нервные терминалы, мелкие кровеносные сосуды и иммунные клетки находятся в SubU/LP. Широко предполагается, что уротелиум мочевого пузыря является сенсорным органом, который инициирует рефлекс micturition и недержание инфекции, выпуская посредников в субмукозы, которые влияют на клетки в SubU / LP и DSM1,2,3. По большей части, такие предположения основаны на исследованиях, которые продемонстрировали высвобождение посредников: из кусочков слизистой оболочки подвергаются изменениям гидростатического давления4,5; от культурных уротелиальных клеток подвергаются растяжения6,7, гипотониность индуцированной клеточной опухоль7 или перетащить силы8; от изолированных полоски стенки мочевого пузыря на рецепторе или активации нерва9,10,11,12,13,14; и в просвет мочевого пузыря в конце мочевого пузыря заполнения15,16,17,18,19. Хотя такие исследования сыграли важную роль, чтобы продемонстрировать освобождение посредников при механической стимуляции сегментов стенки мочевого пузыря или культивируемых уротелиальных клеток, они должны быть подкреплены прямыми доказательствами для освобождения посредников в субмукозе, которая вызывается физиологическими стимулами, которые воспроизводят наполнение мочевого пузыря. Это сложная задача, учитывая, что SubU / LP находится глубоко в стенке мочевого пузыря препятствует простой доступ к окрестностям SubU / LP во время заполнения мочевого пузыря.

Здесь мы иллюстрируем децентрализованную (ex vivo) модель мочевого пузыря с детрусорной мышцей удалены13, которая была разработана для облегчения исследований на местных механизмов механотрансдукции, которые участвуют в сигнализации между мочевого пузыря уротели, DSM и других типов клеток в стенке мочевого пузыря. Этот подход превосходит использование плоских листов стенки мочевого пузыря, полосы стенки мочевого пузыря или культивированные уротелиальные клетки, потому что он позволяет прямые измерения в непосредственной близости от SubU / LP уротелия полученных посредников, которые высвобождаются или формируются в ответ на физиологические давления и объемы в мочевом пузыре и позволяет избежать потенциальных фенотипических изменений в культуре клеток. Он может быть использован для измерения доступности, выпуска, метаболизма и трансуротелиальной транспортировки посредников в SubU/LP на разных стадиях заполнения мочевого пузыря(рисунок 1B). Препарат также может быть использован для изучения уротелилиальной сигнализации и механотрансдукции в моделях гиперактивных и недостаточно активных синдромов мочевого пузыря.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры с участием животных, описанных в этой рукописи, были проведены в соответствии с Национальным руководством по охране здоровья для ухода и использования лабораторных животных и Институционального комитета по использованию и уходу за животными в Университете Невады.

ПРИМЕЧАНИЕ: Модель, представленная здесь, состоит из удаления мышцы детрузора в то время как уротелий и SubU/LP остаются нетронутыми(Рисунок 1B),чтобы позволить следователям прямой доступ к SubU / LP в ходе заполнения мочевого пузыря.

1. Рассечение бездетного препарата мочевого пузыря

  1. Поместите изолированный мочевой пузырь в рассекающее блюдо, наполненное холодом (10 градусов по Цельсию) и насыщенное кислородом 5% CO2/95 % O2 Кребс бикарбонатный раствор (KBS) со следующим составом (mM): 118,5 NaCl, 4.2 KCl, 1.2 MgCl2, 23.8 NaHCO3, 1.2 KH2PO4, 11.0 dextrose, 1.8 CaCl2 (pH 7.4)13.
  2. Прикрепите небольшую часть купола изолированного мочевого пузыря к покрытой Сильгардом рассекающей тарелке, наполненной KBS. Убедитесь, что штифт проходит через кусок serosa или внешний край мышцы детрузора далеко от внутреннего края мышцы, которая сталкивается с SubU / LP.
  3. С помощью микроскопа, определить уретры и мочеточники и приколоть каждый из них на дно рассекающей блюдо.
  4. Удалите избыток жировой и соединительной ткани так, чтобы все основное тело мочевого пузыря, уретры и оба мочеточника отображаются.
  5. Свяжите мочеточники 6-0 нейлоновыми швами. Затем прикрепите открытые концы мочеточников к нижней части рассекающей тарелки, чтобы обеспечить приготовление.
  6. Используя тонкие наконечникщицы, осторожно потяните кусок serosa на углу между мочеточник омичи и мочевого пузыря тела.
  7. Отрегулируйте свет микроскопа для того чтобы увеличить транспарентность и различить край submucosa под мышцей detrusor.
  8. Начните резки(не пилинг!) стенки мочевого пузыря с тонкой кончик ножницами вдоль внутренней поверхности слоя мышц детрузора при осторожно потянув сократить сегмент от подготовки. Во все времена убедитесь, что боковой край слизистой оболочки можно увидеть и не прикасаться к нему.
  9. Удалите мышцы детрузора полностью, оборачиваясь рассекая блюдо так, чтобы положение препарата удобно продолжать вскрытие детрузорной мышцы.
  10. Оставьте небольшой кусочек детрузорной мышцы на верхней части купола мочевого пузыря, чтобы обеспечить способность обездвиживать препарат во время оставшихся этапов протокола.
  11. Сделайте двойную петлю 6-0 нейлоновой нити, поместите его вокруг шеи приготовления мочевого пузыря, и оставить петлю свободно.
  12. Добавьте вторую двойную петлю из 6-0 шелковых нитей, поместите ее вокруг шеи приготовления мочевого пузыря и оставьте петлю проиграть. Наличие двух швов предотвращает утечки вокруг швов.
  13. Вырезать около 2 см 20 PE трубки (катетер), вспыхнуть кончик, медленно двигаясь кончик близко к пламени.
  14. Заполните катетер теплым (37 градусов по Цельсию) кислородом KBS.
  15. Вставьте катетер в норис мочевого пузыря уретры и осторожно нажмите катетер, пока кончик катетера достигает примерно в середине мочевого пузыря.
  16. Свяжите шов вокруг катетера и окружающих тканей шеи мочевого пузыря.
  17. Медленно заполните мочевой пузырь примерно 50-100 л тепла (37 градусов по Цельсию) оксигенированным KBS, поднимите его кратко (lt;10 s) над поверхностью KBS, и следите за утечками в швах и теле мочевого пузыря.
  18. Если утечки не наблюдается, препарат готов к эксперименту. Если наблюдается утечка вокруг шва, снимите шов и замените его. Если обнаружена утечка из отверстия в теле мочевого пузыря, отбросьте препарат.

2. Заполнение Denuded мочевого пузыря Подготовка

  1. Perfuse KBS (37 градусов по Цельсию) в камеру 3 мл воды (37 градусов по Цельсию) куртку орган блюдо с Сильгард дно.
  2. Отрегулируйте линии кислорода и всасывания.
  3. Поместите денонсированный препарат мочевого пузыря в камере.
  4. Закрепите катетер в сторону камеры, чтобы препарат не плавал над поверхностью перфузионного раствора.
  5. Подключите катетер мочевого пузыря к более длинной трубе PE20 (линия инфузии), соединенной с трехсторонним стоп-коном, используя примерку того же размера.
  6. Убедитесь, что линии между инфузионным насосом, преобразователем давления и мочевым пузырем открыты.
  7. Заполните настой шприц свежим, теплым (37 градусов по Цельсию) и кислородом KBS.
  8. Отрегулируйте параметры насоса: тип/объем шприца (т.е. 1 мл), эксплуатацию (т.е. инфуз), поток (т.е. постоянный) и скорость потока (т.е. 15 л/мин).
  9. Нажмите кнопку "Пуск" на шприц насос, чтобы заполнить мочевой пузырь.
  10. Мониторинг объема наполнения и внутривесического давления при заполнении мочевого пузыря.

3. Обнаружение посредников в Аспекте СубУ/ЛП по подготовке к денированному мочевому пузыри

  1. Сбор аликвотов раствора ванны в ледяные микроцентрифугные трубки или высокопроизводительные жидкие хроматографии (HPLC) вставки.
  2. Подготовка и обработка образцов в соответствии с соответствующим приложением обнаружения. В случае обнаружения доступности пурина, обработать образцы HPLC с флуоресценцией обнаружения13,18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Стена мурин детрузора подготовки мочевого пузыря нетронутыми и содержит все слои, кроме DSM и serosa. Доказательство принципа исследования показали, что DSM-свободной стенки мочевого пузыря включает в себя urothelium и SubU / LP в то время как туника muscularis и serosa отсутствуют (Рисунок 2)13.

Заполнение детрусора, свободного мочевого пузыря, приблизительно приближается к нормальному наполнению мочевого пузыря. На рисунке 3 показаны схемы экспериментальной установки для заполнения препаратов ex vivo мочевого пузыря с различными темпами заполнения, объемами и внутрилюминочным давлением. Murine ex vivo нетронутыми и оголенные препараты мочевого пузыря требуют широкого спектра объемов заполнения для достижения аннулирования давления13. Давление объем отношений удивительно похожи в нетронутых и оголенные подготовки (Фильм 1, Фильм 2, и рисунок 4). Поэтому препарат без ДСМ подходит для функциональных исследований роли уротелия и субу/ЛП в механосенсации мочевого пузыря и механотрансдукции.

Возможное использование модели мочевого пузыря без детрусора
Измерение наличия посредников в просвете мочевого пузыря и SubU/LP при заполнении мочевого пузыря
Экспериментальная установка для сбора экстралюминесцентных (EL; например, купание SubU/LP) и внутрилюминовенных (IL) образцов во время заполнения препаратов мочевого пузыря при мониторинге давления мочевого пузыря иллюстрируется на рисунке 5. Пригодность модели для измерения посредников, полученных из уротелия, которые высвобождаются в сторону SubU/LP во время заполнения, была проверена путем измерения выпуска пуриновых посредников (например, аденозин 5'-трифосфат, АТФ; аденозин 5'-дифосфат, ADP; никотинамид аденин динуклеотид, NAD; аденозин 5'-монофосфат, Amp; и аденозин, ADO) в растворе купания SubU/LP уденированного препарата. Как показано на рисунке 6A, незначительное количество пуринов были обнаружены в ванне, содержащей изолированный препарат мочевого пузыря с нетронутыми DSM в то время как количество этих пуринов были значительно выше в образцах, собранных из ванны, содержащей денонсированный препарат мочевого пузыря (Рисунок 6B). Примечательно, что распределение пуринов и метаболитов в образцах, собранных из просвета и SubU/LP в конце заполнения значительно отличалось(рисунок 6C).

Изучите внеклеточный метаболизм посредников в SubU/LP при заполнении мочевого пузыря
Добавление высокофлуоресцентного аналога АТФ, 1,N6-этено-АТП (ЗАТП), к субуротелиальной стороне бездетной подготовки привело к уменьшению АТП и увеличению продуктов ЗАТП, ЗАДП, ЗАДО и ЗАДО(Рисунок 7АА и Рисунок 7Аб). Аналогичным образом, добавление ЗАТП к подготовительному просвету привело к уменьшению зАТП и увеличению числа ЗАДП, ЗАМП и ЗАДО в просвете(Рисунок 7Ba и Рисунок 7Bb). Поэтому модель подходит для изучения метаболизма биологически активных посредников по обе стороны уротелия во время заполнения мочевого пузыря.

Изучить трансуротелиальный перенос посредников во время заполнения мочевого пузыря
Добавление КТП к стороне SubU/LP denuded подготовки привело к появлению ЗАМП, ЗАДО и некоторых ЗАДП в просвете, предполагая, что пурины могут быть транспортированы из SubU/LP в просвет13 (Рисунок 7Ac). Аналогичным образом, добавление АТП в просвет привело к появлению ЗАМП и ЗАДО в СубУ/LP13 (Рисунок 7Db). Обратите внимание, что на противоположной стороне приложения ЗАТП не наблюдалось НИКАКОГО ЗАТП. В совокупности эти наблюдения убедительно свидетельствуют о том, что препарат мочевого пузыря без детрусора подходит для изучения двусторонней трансуротелиальной транспортировки посредников во время заполнения.

Figure 1
Рисунок 1: Принцип модели мочевого пузыря, свободной от детрузора. (A) Стенка мочевого пузыря состоит из уротелия, субуротелия/ламины проприии (SubU/LP), детрузорной мышцы и серозы. Каждый из этих слоев содержит различные типы клеток, которые важны для функций мочевого пузыря во время хранения и аннулирования мочи. Во время заполнения мочевого пузыря, биологически активные посредники высвобождаются из уротелия в просвет мочевого пузыря и в SubU/LP, чтобы воздействовать на клетки глубоко в стенке мочевого пузыря, включая мышцу детрузора. Хотя доступ к просвету мочевого пузыря является относительно простым, нет прямого доступа к SubU / LP во время заполнения для обнаружения уротелия полученных посредников, которые могут повлиять на клетки в стенке мочевого пузыря и контроля детрузора возбудимости мышц. (B) Удаление детрузорных мышечных слоев вместе с serosa предоставляет всю поверхность SubU/LP, обеспечивающую прямой доступ к SubU/LP, где молекулы сигнализации, полученные из уротелия, могут быть измерены на разных фазах заполнения мочевого пузыря. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Гистология мурина нетронутыми и детрусор свободной стенки мочевого пузыря. Массон в трихромное окрашивание заполнены нетронутыми (А) и detrusor-бесплатно (B) стенки мочевого пузыря показывает, что оголенный препарат содержит нетронутые уротелия (U) и SubU / LP, но не detrusor мышцы (D) и serosa (S). Л. Эта цифра была воспроизведена из предыдущей публикации13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Схематическое представление экспериментальной установки, используемой при заполнении препаратов ex vivo мочевого пузыря. Препарат ex vivo intact или denuded urinary bladder (UB) помещается в теплую (37 градусов по Цельсию) водяную камеру, которая пропитана кислородом раствором Кребс-бикарбоната (KBS, 37 c, pH 7.4). Препарат мочевого пузыря проникнут KBS при различных темпах заполнения и объемах и внутрилюминовенного давления мочевого пузыря (ВР) регистрируется на протяжении всего эксперимента Эта цифра была воспроизведена из предыдущей публикации13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Отношения с объемом давления в нетронутых и бездетрусорных препаратах. ()и (B) являются репрезентативными записями внутривежного объема и давления ex vivo нетронутыми и оголенными препаратами мочевого пузыря, которые заполнены раствором Кребс-бикарбоната на уровне 15 л/мин. Как и ожидалось, нетронутая подготовка развивала переходные сокращения (ТЦ) из-за присутствия детрузора. В отличие от этого, оголенный препарат не хватало ТС . (C) и (D) показывают обобщенные данные давления объем отношений нетронутыми и оголенные препараты мочевого пузыря, которые вмещали йgt;250 л раствора. Обратите внимание, что объемы заполнения и внутривесическое давление были удивительно похожи в нетронутых и оголенных препаратов мочевого пузыря. Эта цифра была воспроизведена из предыдущей публикации13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Схематическая диаграмма изолированной модели мочевого пузыря, используемая для оценки наличия посредников, полученных из уротелия, в SubU/LP и просвете во время заполнения. Препарат мочевого пузыря помещается в камеру с водяными куртками и переливается кислородом кребсби-бикарбонатным раствором (KBS). Препарат мочевого пузыря (УБ) заполняется теплым кислородом KBS через катетер в мочеиспускательном канале, подключенном к инфузионному насосу. Давление мочевого пузыря (ВР) контролируется через трехсторонний разъем через инфузионную линию во время заполнения мочевого пузыря. Образцы внелюминальных (EL, органных ванн) и внутрилюмиальных (IL) растворов обрабатываются для обнаружения посредников (м) в соответствии с приложениями обнаружения. Эта цифра была воспроизведена из предыдущей публикации13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6: Препарат мочевого пузыря без детрузозора подходит для измерения наличия посредников в SubU/LP во время заполнения. Представительх хроматограмм, демонстрирующих наличие пуринов в экстралюминальных образцах в нетронутых(A)и бездетрузорных(B) препаратов мочевого пузыря. Обратите внимание, что пуриновые посредники лучше обнаруживаются в обнажили подготовки, чем в нетронутой подготовки. (C) Относительный вклад отдельных пуринов в пуриновые бассейны, обнаруженные в просвете и в SubU/LP огонесенный препарат значительно отличается. Эта цифра была воспроизведена из предыдущей публикации13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 7
Рисунок 7: Препарат мочевого пузыря без детрузозора подходит для изучения метаболизма и трансуротелиального переноса посредников во время заполнения мочевого пузыря. (A, B) Представитель хроматограммы, показывающие субстрат ATP(Aa,Ba). При применении субстрата либо к SubU/LP(Ab)или к просвету(Bb)«ATP» был уменьшен, а продукты «ADP», «AMP» и «ADO» были увеличены. Таким образом, ЗАТП деградирует по обе стороны приложения; однако, формирование продуктов ЗТП является асимметричным в СубУ/ЛП и просвете. Обратите внимание, что продукты ЗАТП ЗАПП и ЗАДО, но не субстрат ЗАТП, появились на противоположной стороне приложения ЗАТП (Ac,Bc). Таким образом, пурины, как представляется, транспортируются через стену бездетной подготовки во время подачи. Эта цифра была изменена с13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Video 1
Видео 1: Представитель записи нетронутой заполнения мочевого пузыря. Мочевой пузырь был заполнен на 15 л/мин. Видео было записано с помощью зум-стереомикроскопа с заряженной камерой совместного устройства (CCD) на 5 Гц; запись была остановлена по достижении 25 мм рт. т внутрилюмини. Полная продолжительность изображения составляет 64x в режиме реального времени. Это видео было воспроизведено из13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео (Право нажмите, чтобы скачать).

Video 1
Видео 2: Представитель записи детрузора заполнения мочевого пузыря. Мочевой пузырь был заполнен на 15 л/мин. Видео было записано с помощью зум-стереомикроскопа с камерой CCD на 5 Гц; Запись была остановлена по достижении 25 мм рт. см внутрилюмини. Полная продолжительность изображения в режиме реального времени составляет 64 раза. Это видео было воспроизведено из13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео (Право нажмите, чтобы скачать).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мочевой пузырь имеет две функции: хранение и аннулирование мочи. Нормальная работа этих функций требует надлежащего механического зондирования внутрилюмительного объема и давления и трансдукции сигналов через клетки в стенке мочевого пузыря для регулирования возбуждания мышц детрузора. Мочевого пузыря слизистой оболочки (уротелиум), как полагают, регулируют возбудимость мочевого пузыря, выпустив различные сигнальные молекулы в SubU / LP, которые влияют на многочисленные типы клеток в стенке мочевого пузыря. В настоящее время большинство попыток характеристики посредников, полученных из уротелия, связаны с использованием препаратов мочевого пузыря (например, плоские стенковые листы мочевого пузыря, полоски стенки мочевого пузыря или культивированные клетки), которые не воспроизводят физиологическое наполнение мочевого пузыря. Измерения посредников, которые высвобождаются в просвет мочевого пузыря в конце заполнения мочевого пузыря часто используются в качестве указания для освобождения этих посредников с противоположной стороны уротелия. Тем не менее, последние исследования показывают, что внутрилюминое содержание посредников не является репрезентативным того, что доступно глубоко в стенке мочевого пузыря13. Новые экспериментальные подходы, позволяющие получить доступ к SubU/LP во время заполнения мочевого пузыря, необходимы для дальнейшего понимания местных механизмов сигнализации между уротелием мочевого пузыря, SubU/LP и DSM.

Здесь мы демонстрируем новую модель животного мочевого пузыря, в которой мышца детрузора удаляется, чтобы обеспечить прямой доступ к посредникам, высвобождению уротелия в СубУ/ЛП во время заполнения13. Обнаженный препарат очень напоминает наполнение нетронутым мочевым пузырем13,18, предполагая, что отсутствие детрузорной мышцы не меняет механочувствительные свойства уротелия во время заполнения мочевого пузыря. Препарат позволяет проводить исследования по объему давления на мочевом пузыре при отсутствии путаницы сигнализации от спинальных рефлексов и детрузорной мышцы. Таким образом, посредники, выпущенные в СубУ/ЛП, могут быть измерены без системного воздействия или загрязнения из других источников. Возможность прямого доступа к окрестностям SubU/LP при различных объемах и давлении при заполнении мочевого пузыря делает модель пригодной для изучения высвобождения, метаболизма и трансуротелиальной транспортировки биологически активных посредников во время хранения и предварительной опустошительной стадии заполнения мочевого пузыря.

Наиболее важным шагом в этом протоколе является удаление детрузор гладкой мышцы при сохранении уротелия и СубУ / LP нетронутыми. Процедура особенно проста в мочевом пузыре мыши из-за свободной связи между мышцей детрузора и SubU/LP. Препараты показали отличную воспроизводимость с удивительно похожими характеристиками давления объема нетронутым мочевым пузырям13. Модель также осуществима в мочевых пузырях от крупных животных, в которых мышца детрузора может быть частично или полностью удалена. Например, мы ранее продемонстрировали, что модель может быть воспроизведена в мочевом пузыре от cynomolgus обезьяны Macaca fascicularis и продемонстрировали, что посредники могут быть измерены в SubU/LP во время подготовки заполнения13.

Потенциальным ограничением этой модели ex vivo является сама проблема, которая заключается в силе препарата, по сути, отсутствие системных эффектов центральной нервной системы и кровообращения позволяет тщательно изучить местные механизмы соединения слизистой оболочки во время заполнения мочевого пузыря. Отсутствие системных эффектов разделяют с многочисленными подходами ex vivo, втомь изолированные листы стены мочевого пузыря или прокладки или культивированные уротелиальные клетки. Модель мочевого пузыря без детрусора, однако, превосходит вышеупомянутые подходы в уротелилиальных исследований в том, что она позволяет прямой доступ к SubU / LP в ходе заполнения мочевого пузыря. Таким образом, использование этого подхода позволит улучшить понимание механочувствительных механизмов механотрансдукции, которые возникают в уротелии во время заполнения мочевого пузыря.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Часть этой работы была ранее опубликована в журнале физиологии (PMCID: PMC6418748; DOI:10.1113/JP27692413). Разрешение было предоставлено Wiley and Sons, Inc. на использование материалов этой публикации. Авторы не имеют финансовых или других конфликтов, чтобы раскрыть.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Национальным институтом диабета и заболеваний пищеварения и почек Грант DK41315.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CaCl2 Fisher C79 Source flexible
Dextrose Fisher D16 Source flexible
Dissecting pins Fine Science Tools 26002-20 Source flexible
Infusion Pump Kent Scientific GenieTouch Source flexible
KCl Fisher P217 Source flexible
KH2PO4 Fisher P284 Source flexible
Light source SCHOTT ACEI Source flexible
Microscope Olympus SZX7 Flexible to use any scope
MgCl2 Fisher M33 Source flexible
NaCl Fisher S671 Source flexible
NaHCO3 Fisher S233 Source flexible
Needles 25G Becton Dickinson 305122 Source flexible
Organ bath Custom made Flexible source; We made it from Radnoti dissecting dish
PE-20 tubing Intramedic 427405 Source flexible
Pressure transducer AD instrument Source flexible
S&T Forceps Fine Science Tools 00632-11 Source flexible
Software pressure-volume AD Instruments Power lab
Suture Nylon, 6-0 AD surgical S-N618R13 Source flexible
Suture Silk, 6-0 Deknatel via Braintree Scientific, Inc. 07J1500190 Source flexible
Syringes 1 mL Becton Dickinson 309602 Source flexible
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-08 Source flexible
Water circulator Baxter K-MOD 100 Source flexible

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. The uroepithelial-associated sensory web. Kidney International. 72, 1057-1064 (2007).
  2. Fry, C. H., Vahabi, B. The Role of the Mucosa in Normal and Abnormal Bladder Function. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 57-62 (2016).
  3. Merrill, L., Gonzalez, E. J., Girard, B. M., Vizzard, M. A. Receptors, channels, and signalling in the urothelial sensory system in the bladder. Nature Reviewes Urology. 13, 193-204 (2016).
  4. Ferguson, D. R., Kennedy, I., Burton, T. J. ATP is released from rabbit urinary bladder epithelial cells by hydrostatic pressure changes--a possible sensory mechanism? Journal of Physiology. 505, 503-511 (1997).
  5. Wang, E. C., et al. ATP and purinergic receptor-dependent membrane traffic in bladder umbrella cells. Journal of Clinical Investigation. 115, 2412-2422 (2005).
  6. Miyamoto, T., et al. Functional role for Piezo1 in stretch-evoked Ca(2)(+) influx and ATP release in urothelial cell cultures. Journal of Biological Chemistry. 289, 16565-16575 (2014).
  7. Mochizuki, T., et al. The TRPV4 cation channel mediates stretch-evoked Ca2+ influx and ATP release in primary urothelial cell cultures. Journal of Biological Chemistry. 284, 21257-21264 (2009).
  8. McLatchie, L. M., Fry, C. H. ATP release from freshly isolated guinea-pig bladder urothelial cells: a quantification and study of the mechanisms involved. BJU International. 115, 987-993 (2015).
  9. Birder, L. A., Apodaca, G., de Groat, W. C., Kanai, A. J. Adrenergic- and capsaicin-evoked nitric oxide release from urothelium and afferent nerves in urinary bladder. American Journal of Physiology Renal Physiology. 275, F226-F229 (1998).
  10. Birder, L. A., Kanai, A. J., de Groat, W. C. DMSO: effect on bladder afferent neurons and nitric oxide release. Journal of Urology. 158, 1989-1995 (1997).
  11. Birder, L. A., et al. Vanilloid receptor expression suggests a sensory role for urinary bladder epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 98, 13396-13401 (2001).
  12. Birder, L. A., et al. Beta-adrenoceptor agonists stimulate endothelial nitric oxide synthase in rat urinary bladder urothelial cells. Journal of Neuroscience. 22, 8063-8070 (2002).
  13. Durnin, L., et al. An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium. Journal of Physiology. 597, 1467-1485 (2019).
  14. Yoshida, M., et al. Non-neuronal cholinergic system in human bladder urothelium. Urology. 67, 425-430 (2006).
  15. Beckel, J. M., et al. Pannexin 1 channels mediate the release of ATP into the lumen of the rat urinary bladder. Journal of Physiology. 593, 1857-1871 (2015).
  16. Collins, V. M., et al. OnabotulinumtoxinA significantly attenuates bladder afferent nerve firing and inhibits ATP release from the urothelium. BJU International. 112, 1018-1026 (2013).
  17. Daly, D. M., Nocchi, L., Liaskos, M., McKay, N. G., Chapple, C., Grundy, D. Age-related changes in afferent pathways and urothelial function in the male mouse bladder. Journal of Physiology. 592, 537-549 (2014).
  18. Durnin, L., Hayoz, S., Corrigan, R. D., Yanez, A., Koh, S. D., Mutafova-Yambolieva, V. N. Urothelial purine release during filling of murine and primate bladders. American Journal of Physiology Renal Physiology. 311, F708-F716 (2016).
  19. Gonzalez, E. J., Heppner, T. J., Nelson, M. T., Vizzard, M. A. Purinergic signalling underlies transforming growth factor-beta-mediated bladder afferent nerve hyperexcitability. Journal of Physiology. 594, 3575-3588 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics