Medicine
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Стабилизированная продольная визуализация поджелудочной железы in vivo на клеточном уровне с мышиной моделью с окном приживной визуализации поджелудочной железы
Chapters
Summary May 6th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Визуализация поджелудочной железы in vivo с высоким разрешением облегчалась с помощью окна приживитой визуализации поджелудочной железы.
Transcript
Этот протокол описывает стабилизированную и повторяющуюся визуализацию поджелудочной железы in vivo на клеточном уровне с новым окном прижизальной визуализации поджелудочной железы. Основным преимуществом данной методики является то, что в поджелудочной железе живой мыши можно выполнять неподвижную, трехмерную визуализацию с разрешением до клеточного уровня в течение трех недель. Начните с подготовки хирургической платформы и дезинфекции поверхностей 70% этанолом.
После анестезии используйте ректальный зонд с гомеотермически контролируемой грелкой для контроля температуры тела. Удалите волосы с левого фланга мыши и нанесите спирт и йод альтернативно, вращаясь от места разреза к внешней поверхности, никогда не возвращаясь к месту разреза, и заканчивая йодом. Затем делают 1,5-сантиметровый разрез на левом боку мыши, рассекая кожу и мышцу.
Используйте черный или нейлоновый шов 4-0 для выполнения шва кошелька в разрезе разреза. Осторожно потяните селезенку кольцевыми щипцами и определите поджелудочную железу. Поставив окно по бокам мыши, пропустите селезенку и поджелудочную железу через открытое пространство окна.
Затем аккуратно поместите поджелудочную железу на пластину окна визуализации, поместив селезенку на открытое пространство окна. Вводят панклит панк-1 красного цвета непосредственно в поджелудочную железу. Используйте иглу катетера 31-го калибра для нанесения капель клея n-butyl cyanoacrylate на край окна визуализации, обеспечивая минимальное количество клея.
Аккуратно нанесите 12-миллиметровое круглое покровное стекло на край окна визуализации. Затем зажмите шовную петлю, чтобы она вписалась в боковую канавку окна и трижды завяжите ее. Наконец, чтобы предотвратить прерывание этих плотных швов, когда мыши бодрствуют, отрежьте максимальное проксимальное место галстука.
Начните с включения приживитого микроскопа, включая мощность лазера. Чтобы вставить сосудистый катетер, надавите на проксимальную сторону хвоста указательным и третьим пальцем. При необходимости обогреть хвост лампой.
Продезинфицируйте хвостовую вену с помощью 70%-ного этанолового спрея, затем вставьте катетер 30-го калибра в боковую хвостовую вену и визуализируйте срыгивание крови в трубке PE-10. Нанесите шелковую ленту на катетер, чтобы стабилизировать его. Впрыскивайте декстран FITC и декстран TMR или другие флуоресцентные зонды в зависимости от обстоятельств, в соответствии с комбинацией флуоресцентных зондов.
Вставьте ректальный зонд для автоматического контроля температуры тела с помощью системы гомеотермических грелок. Затем вставьте окно визуализации поджелудочной железы, подготовленное во время установки прижизальной микроскопии, в оконный держатель. Перенесите мышь с хирургической платформы на стадию визуализации.
Чтобы выполнить приживитую визуализацию, начните с визуализации поджелудочной железы с низким увеличением, например, в четыре раза, чтобы сканировать весь вид поджелудочной железы в окне визуализации поджелудочной железы. После того, как область интереса была определена, переключитесь на объектив с более высоким увеличением, например, в 20 или 40 раз, чтобы выполнить визуализацию на клеточном уровне с боковым и осевым разрешением примерно 0,5 микрометра и 3 микрометра соответственно. Выполняйте Z-стек или покадровую визуализацию для наблюдения за 3D-структурой или динамикой клеточного уровня, такой как миграция клеток.
Приживитая микроскопия в сочетании с окном визуализации прижизной поджелудочной железы обеспечивает долгосрочную стабильность тканей, что позволяет получать изображения с высоким разрешением для отслеживания отдельных островков в течение трех недель. Окно, имплантированное в черную мышь C57 6 N с внутривенно введенным анти-CD31 антителом, конъюгированным с флуорофором Alexa 647, облегчало широкоугольную визуализацию и увеличивало 3D-визуализацию поджелудочной железы. Ацинарные клетки были идентифицированы на усредненных изображениях ткани поджелудочной железы в соседней сосудистой клетке, визуализированных с использованием аутофлуоресценции и анти-CD31 антител соответственно.
Используя мозаичный метод визуализации, который сочетает в себе широкоугольный вид с изображением высокого разрешения, примерно от 40 до 50 островков с соседней сосудистой сетью были визуализированы в мыши MIP-GFP. Предыдущее исследование показало, что островки можно отслеживать в течение трех недель, используя этот стабильный метод визуализации. Для визуализации раковых клеток nuclite красные клетки PANC-1 были непосредственно имплантированы в поджелудочную железу мыши во время операции, а близлежащие сосуды были окрашены анти-CD31, конъюгированным с Alexa 647.
С помощью этого протокола были сгенерированы широкополые изображения рака поджелудочной железы. Это помогло очертить край опухоли, а также достичь 3D-изображений с высоким разрешением на уровне одной клетки. Наиболее важным шагом в этом методе является умелое имплантация окна визуализации поджелудочной железы в мышь.
Используя другие комбинации флуоресцентных клеток мыши и зондов антител, можно было идентифицировать динамическое взаимодействие близлежащих клеток с островками или отменными клетками. Этот метод может быть широко применен теми, кто исследует изменение островка в различных патофизиологических условиях и микросредах рака поджелудочной железы in situ.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
