Piattaforma lab-on-a-CD per la generazione di spheroid tridimensionali multicellulari

Bioengineering

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Summary

Vi presentiamo un dispositivo microfluidico centricomotore a motore in grado di coltivare sferoidi cellulari. Utilizzando questo dispositivo, sferoidi di tipo cellulare singolo o multiplo potrebbe essere facilmente costati in condizioni di alta gravità.

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Kim, D., Lee, G. H., Park, J., Lee, J. C., Park, J. Y. Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids. J. Vis. Exp. (153), e60399, doi:10.3791/60399 (2019).

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Abstract

Una coltura tridimensionale di cellule sferoidi può ottenere risultati più utili negli esperimenti cellulari perché può simulare meglio i microambienti cellulari del corpo vivente rispetto alla coltura cellulare bidimensionale. In questo studio, abbiamo fabbricato una piattaforma di laboratorio su un CD (disco compatto) azionata a motore elettrico, chiamata sistema di coltura di sferoidi a base microfugale centrifuga , per creare sferoidi cellulari tridimensionali (3D) che implementano una forza centrifuga ad alta dimensione. Questo dispositivo può variare la velocità di rotazione per generare condizioni di gravità da 1 g a 521 x g. Il sistema CMS ha un diametro di 6 cm, ha cento micropozzi di 400 m ed è realizzato stampando con polidimetilsilosa in uno stampo in policarbonato prefatto da una macchina di controllo numerico al computer. Una parete di barriera all'ingresso del canale del sistema CMS utilizza la forza centrifuga per diffondere le cellule in modo uniforme all'interno del chip. Alla fine del canale, c'è una regione di scorrimento che permette alle cellule di entrare nei micropozzi. Come dimostrazione, gli sferoidi sono stati generati dalla monocoltura e dalla cocultura delle cellule staminali derivate dall'adiposità umana e dei fibroblasti polmonari umani in condizioni di alta gravità utilizzando il sistema. Il sistema CMS ha utilizzato un semplice schema operativo per produrre sferoidi cocoltura di varie strutture concentriche, giano e sandwich. Il sistema CMS sarà utile negli studi di biologia cellulare e ingegneria tissutale che richiedono sferoidi e coltura organoide di tipi di cellule singole o multiple.

Introduction

È più facile simulare microambienti biologici in vivo con colture di cellule sferoidi tridimensionali (3D) che con colture cellulari bidimensionali (2D) (ad esempio, colture convenzionali di parabole di Petri) per produrre sperimentali più fisiologicamente realistici risultati1. I metodi di formazione degli sferoidi attualmente disponibili includono la tecnica di caduta appesa2, latecnica di sovrapposizione dei liquidi3, latecnicadi cellulosa carboxymetil bioreattori6. Anche se ogni metodo ha i suoi benefici, è necessario un ulteriore miglioramento della riproducibilità, della produttività e della generazione di sferoidi cocoltura. Ad esempio, mentre la tecnica microfluidica basata sulla forza magnetica5 è relativamente poco costosa, gli effetti dei forti campi magnetici sulle cellule viventi devono essere attentamente considerati. I benefici della cultura degli sferoidi, in particolare nello studio della differenziazione e della proliferazione delle cellule staminali mesenchymic, sono stati riportati in diversi studi7,8,9.

Il sistema microfluidico centrifugo, noto anche come lab-on-a-CD (compact disc), è utile per controllare facilmente il fluido all'interno e sfruttare la rotazione del substrato ed è stato quindi utilizzato in applicazioni biomediche come immunoasiste10, saggi colorimetrici per rilevare marcatori biochimici11, analisi dell'acido nucleico (PCR), sistemi automatizzati di analisi del sangue12e dispositivi microfluidici centrizici all-in-one13. La forza motrice che controlla il fluido è la forza centripeta creata dalla rotazione. Inoltre, più funzioni di missaggio, valving e suddivisione dei campioni possono essere eseguite semplicemente in questa singola piattaforma CD. Tuttavia, rispetto ai suddetti metodi di analisi biochimica, ci sono stati meno studi che hanno applicato piattaforme CD alle cellule di coltura, in particolare gli sferoidi14.

In questo studio, mostriamo le prestazioni del sistema di sferoidi a base microfluidica centrifuga (CMS) per monocoltura o cocultura di cellule staminali derivate da adiposi umane (hASC) e fibroblasti polmonari umani (MRC-5). Questo documento descrive in dettaglio la metodologia di ricerca del nostro gruppo15. Così, la piattaforma lab-on-a-CD di coltura sferoide può essere facilmente riprodotta. Viene presentato un sistema di generazione CMS che comprende un chip di coltura CMS, un supporto per chip, un motore DC, un supporto motore e una piattaforma rotante. Il supporto motore è stampato in 3D con acrylonitrile butadiene styrene (ABS). Il supporto del chip e la piattaforma rotante sono CNC (controllo numerico al computer) lavorati con il PC (policarbonato). La velocità di rotazione del motore è controllata da 200 a 4.500 rpm codificando un algoritmo PID (proporzionale-integrale-derivato) basato sulla modulazione larghezza-impulso. Le sue dimensioni sono 100 mm x 100 mm x 150 mm e pesa 860 g, rendendolo facile da maneggiare. Utilizzando il sistema CMS, gli sferoidi possono essere generati in varie condizioni di gravità da 1 x g a 521 x g, quindi lo studio della promozione della differenziazione cellulare sotto alta gravità può essere esteso da cellule 2D16,17 a 3D sferoide. La cocultura di vari tipi di cellule è anche una tecnologia chiave per imitare efficacemente l'ambiente in vivo18. Il sistema CMS può facilmente generare sferoidi monocoltura, così come sferoidi coculture di vari tipi di strutture (ad esempio, concentrico, Giano e sandwich). Il sistema CMS può essere utilizzato non solo in semplici studi sferoidi, ma anche in studi organoidi 3D, per considerare le strutture degli organi umani.

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Protocol

1. Fabbricazione di chip a base mistrali centrifuga (CMS)

  1. Crea stampi per PC per gli strati superiore e inferiore del chip di coltura CMS mediante lavorazione CNC. Le dimensioni dettagliate del chip sono riportate nella Figura 1.
  2. Mescolare la base PDMS e l'agente di polimerità PDMS ad un rapporto di 10:1 (w/w) per 5 min e mettere in un desiccatore per 1 h per rimuovere le bolle d'aria.
  3. Dopo aver versato la miscela PDMS negli stampi del chip di coltura CMS, rimuovere le bolle d'aria per 1 h di più e curare in una camera di calore a 80 gradi centigradi per 2 h.
  4. Metteteli nel detergente al plasma aspirato con le superfici da legare rivolto verso l'alto ed esposteli al plasma assistito dall'aria ad una potenza di 18 W per 30 s.
  5. Legare i due strati del chip di coltura CMS e metterlo nella camera di calore a 80 gradi centigradi per 30 minuti per aumentare la forza di adesione.
  6. Sterilizzare il chip di coltura CMS in uno sterilizzatore autoclave a 121 e 15 psi.

2. Preparazione delle cellule

  1. Scongelare il 1 mL della fiala contenente 5 x 105–1 - 106 cellule hASC o MRC-5s in un bagno d'acqua a 36,5 gradi centigradi per 2 min.
  2. Aggiungete 1 mL di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) su una fiala e mescolate delicatamente con una pipetta da 1.000 ll.
  3. Mettete 15 mL del DMEM preriscaldato a 36,5 gradi centigradi in una parabola Petri di 150 mm di diametro utilizzando una pipetta e aggiungete le cellule dalla fiala.
  4. Dopo 1 giorno, aspirare il DMEM e sostituire con 15 mL di DMEM fresco. Successivamente, cambiare i supporti ogni 2 o 3 giorni.
  5. Per staccare le cellule dalla parabola Petri, aggiungere 4 mL di prova ai piatti Petri e metterli in un'incubatrice a 36,5 gradi centigradi e il 5% di CO2 per 4 min.

3. Formazione di sferoidi monocoltura

  1. Mettere 2,5 mL di 4% (w/v) soluzione pluronica F-127 nel foro di ingresso del chip di coltura CMS (Figura 2A) durante la rotazione del chip a 500–1,000 rpm e quindi ruotare il chip a 4.000 rpm per 3 min utilizzando il sistema CMS (Figura 2B).
    NOTA: il rivestimento pluronico impedisce l'attacco cellulare alla porta di ingresso mentre il chip ruota. Assicurarsi che l'aria non sia intrappolata nei micropozzi.
  2. Incubare il chip di coltura CMS riempito con soluzione pluronnica durante la notte a 36,5 gradi centigradi nel 5% di CO2.
  3. Rimuovere la soluzione pluronica, lavare la soluzione pluronnica rimanente con DMEM e asciugare il chip per 12 h su una panca pulita.
  4. Aggiungere 2,5 mL di DMEM al chip di coltura CMS e ruotare il chip a 4.000 rpm per 3 min per la lunghezza dell'interno del chip.
  5. Interrompere la rotazione ed estrarre 100 L di DMEM per fare spazio all'iniezione della sospensione cellulare.
  6. Aggiungere 100 l di sospensioni cellulari che contengono 5 x 105 hASC o 8 x 105 MRC-5 tramite il pipettaggio Distribuisci uniformemente le celle conpipendo 3-5 volte per la sospensione.
  7. Ruotare il chip a 3.000 giri/m per 3 min per intrappolare le cellule in ogni microwell con forza centrifuga.
    NOTA: un'eccessiva velocità di rotazione può causare l'escape cellulare attraverso fori di espulsione della soluzione.
  8. Coltura le cellule per 3 giorni in incubatrice a 36,5 gradi centigradi, >95% di umidità, e 5% CO2, ruotando a 1.000-2.000 rpm. Cambiare la cultura media ogni giorno.

4. Formazione di sferoidi della cocultura

  1. Formazione di sferoidi concentrici
    1. Aggiungere le prime celle, 2,5 x 105 hASC, e ruotare il chip a 3.000 rpm. Dopo 3 min, aggiungere le seconde celle, 4 x 105 MRC-5s, e ruotare il chip a 3.000 rpm per 3 min. Iniettare un totale di 100 - L di sospensioni cellulari tramite pipettaggio. Quando le cellule vengono iniettate, spostare la velocità di rotazione a 500-1.000 rpm.
    2. Coltura le cellule nell'incubatrice a 36,5 gradi centigradi, >95% umidità%, e 5% CO2 ruotando a 1.000-2.000 rpm. Gli sferoidi concentrici vengono creati entro 24 ore. Per la cultura a lungo termine, cambiare il mezzo culturale ogni giorno.
  2. Formazione di Giano sferoidi
    1. Aggiungete 100 l di sospensioni cellulari contenenti le prime celle, 2,5 x 105 hASC, pipettando mentre il chip ruota a 500–1.000 giri/min. Quindi, ruotare il chip a 3.000 rpm per 3 min.
    2. Incubare il chip a 36,5 gradi centigradi, a >95% di umidità e 5% di CO2 ruotando a 1.000-2.000 giri/min per 3 h.
    3. Aggiungete 100 l di sospensioni cellulari contenenti il secondo set di celle, 4 x 105 MRC-5, pipettando mentre il chip ruota a 500–1.000 giri/min. Quindi, ruotare il chip a 3.000 rpm per 3 min.
    4. Coltura le cellule nell'incubatrice a 36,5 gradi centigradi, >95% di umidità, e 5% di CO2 ruotando a 1.000-2.000 rpm. Gli sferoidi di Giano vengono creati entro 24 ore. Per la cultura a lungo termine, cambiare il mezzo culturale ogni giorno.
  3. Formazione di sandwich sferoidi
    1. Aggiungete 100 l di sospensioni cellulari contenenti le prime celle, 1,5 x 105 hASC, pipettando mentre il chip ruota a 500–1.000 giri/min. Quindi, ruotare il chip a 3.000 rpm per 3 min.
    2. Incubare il chip a 36,5 gradi centigradi, a >95% di umidità e 5% di CO2 ruotando a 1.000-2.000 giri/min per 3 h.
    3. Aggiungete 100 l di sospensioni cellulari contenenti le seconde celle, 3 x 105 MRC-5, pipettando mentre il chip ruota a 500–1.000 giri/min. Quindi, ruotare il chip a 3.000 rpm per 3 min.
    4. Incubare il chip a 36,5 gradi centigradi, >95% di umidità% e 5% CO2 ruotando a 1.000-2.000 rpm per 3 h.
    5. Aggiungete 100 l di sospensioni cellulari contenenti le terze celle, 1,5 x 105 hASC, pipettando mentre il chip ruota a 500–1.000 giri/min. Quindi, ruotare il chip a 3.000 rpm per 3 min.
    6. Coltura le cellule nell'incubatrice a 36,5 gradi centigradi, >95% umidità%, e 5% CO2 ruotando a 1.000-2.000 rpm. Gli sferoidi sandwich vengono creati entro 12 h. Per la cultura a lungo termine, cambiare il mezzo culturale ogni giorno.

5. Colorazione delle cellule

  1. Riscaldare il colore a fluorescenza cellulare a temperatura ambiente (20 gradi centigradi).
  2. Aggiungere 20 l di metilsulfossido di anidroladide (DMSO) per fiala per creare una soluzione da 1 mM.
  3. Diluire la fluorescenza fino a una concentrazione di lavoro finale di 1 M utilizzando DMEM.
  4. Aggiungere la fluorescenza alla sospensione cellulare e sospendere delicatamente utilizzando una pipetta.
  5. Incubare 20 min a 36,5 gradi centigradi, umidità di >95% e 5% di CO2.

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Representative Results

Il chip di coltura CMS di 6 cm di diametro (Figura 2) è stato realizzato con successo seguendo il protocollo di cui sopra. In primo luogo, il chip è stato fatto separatamente da uno strato superiore e uno strato inferiore e poi legato insieme da incollaggio al plasma. Gli sferoidi risultanti possono essere facilmente raccolti staccando il chip. Il canale del chip di coltura CMS comprende una porta di ingresso e regioni centrali, scorrevoli e microwell (Figura 3). Le soluzioni cellulari, medie e pluroniche vengono iniettate attraverso un foro di inserimento con un diametro di 5 mm. Le cellule iniettate vengono distribuite uniformemente con la sospensione 3-5x nella regione del porto di inseridio. Le cellule sono soggette a forza centrifugha nella regione centrale e si diffondono verso l'esterno. Poiché la regione centrale è superiore al microwell, può contenere più supporti, permettendo agli sferoidi di sopravvivere più a lungo. L'altezza del micropo è di 0,4 mm e l'altezza della regione centrale è di 1,5 mm. La regione di scorrimento è un'area inclinata che collega la regione centrale e la regione del microwell. Le cellule si muovono lungo un pendio di 45 gradi e si depositano nella regione del microwell, dove le cellule si depositano, crescono e si aggrovigliano per formare sferoidi. I micropozzi situati a 14 mm dal centro del chip sono semicilindrici con un'altezza di 400 m e un diametro di 400 m. Un totale di 100 sferoidi possono essere generati contemporaneamente in 100 micropozzi.

Utilizzando il chip CMS preparato, gli sferoidi possono essere generati nell'ordine indicato nel protocollo (Figura 4). Gli sferoidi di monocoltura e cocultura sono stati generati con cellule hASC e MRC-5. Per generare uno sferoide monocoltura di ogni tipo di cellula, sono stati iniettati 5 x 105 hASC o 8 x 105 MRC-5. Il numero di cellule iniettate era indipendente dalle dimensioni della cella. Le immagini time-lapse di entrambi i tipi di cellule sono state scattate a 2.000 giri/min fino al terzo giorno dicolturacellulare ( Figura 5 ). Gli sferoidi di cocultura degli hASC e degli MRC-5 sono stati generati anche con strutture concentriche, giano e sandwich. Per fare sferoidi concentrici, sono state iniettate le prime celle (2,5 x 105 hASC) e le seconde cellule (4 x 105 MRC-5s) sono state iniettate 3 min più tardi (Figura 6A). Quando le prime cellule sono state iniettate, sono diventate a forma di U a causa dell'alta gravità, e quando le seconde cellule sono state iniettate, si sono spostate al centro della forma a U. Nel corso del tempo, le prime cellule a forma di U circondavano le seconde cellule e completavano gli sferoidi concentrici. Per fare sferoidi di Janus, sono state iniettate le prime celle (2,5 x 105 hASC) e le seconde cellule (4 x 105 MRC-5s) sono state iniettate 3 h più tardi(Figura 6B). Quando l'intervallo di iniezione tra le due cellule era lungo, la forma delle prime celle è cambiata da una forma a U a una forma ellittica mediante l'aggregazione delle cellule. Una volta che le seconde cellule sono state aggiunte alla forma ellittica delle prime cellule, sono stati generati gli sferoidi di Janus. Nel caso degli sferoidi sandwich, sono state iniettate le prime celle (1,5 x 105 hASC), le seconde celle (3 x 105 MRC-5) sono state iniettate 3 h più tardi e le terze celle (1,5 x 105 hASC) sono state iniettate dopo altri 3 h (Figura 6C ) ). Simile allo sferoide di Giano, ogni cellula si aggregava in una forma ellittica, e i tre strati impilati per generare sferoidi sandwich. Infine, per dimostrare la capacità di coltura a lungo termine del CMS, gli hASC sono stati coltivati, esposti ad alta gravità per 7 giorni seguiti da un saggio vivo / morto eseguito per dimostrare che la maggior parte delle cellule sono sopravvissute (Figura 7). Inoltre, le foto di tutti i micropozzi del CMS sono state scattate dopo 3 giorni di coltivazione MRC-5s per mostrare un'eccellente uniformità e sfluicità di sferoidi (Figura 8).

Figure 1
Figura 1: Dimensioni dei livelli superiore e inferiore di un chip di coltura CMS. Lo stampo del PC è stato realizzato utilizzando una macchina CNC e replicato con PDMS per creare un chip di coltura CMS basato sul disegno creato da un programma CAD 3D (computer-aided design). I quattro cerchi ai bordi dei livelli superiore e inferiore sono per allineare i due livelli. Le quote sono in millimetri. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Fotografie del sistema CMS. (A) Fotografie del chip di coltura CMS completato. Il diametro del chip è di 6 cm e il diametro del micropo è di 400 m. I numeri al di sopra dei micropozzi rappresentano i singoli numeri dei micropozzi da 1 a 100. Questi numeri sono stati incisi nello stampo. Barra della scala: 400 m. (B) Fotografia dell'intero sistema CMS. Il sistema CMS comprende il chip di coltura CMS, il supporto del chip, il motore DC e la piattaforma rotante. I dispositivi CMS possono generare condizioni di gravità fino a 521 x g attraverso la forza di rotazione. Il supporto del chip impedisce la separazione del chip di coltura CMS a causa dell'elevata gravità. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Componenti del canale del CMS. (A) Immagini schematiche e(B)fotografie di una sezione trasversale del chip di coltura CMS. Il chip di coltura CMS è costituito da una porta di ingresso e regioni centrali, scorrevoli e microwell. Poiché le cellule iniettate non passano attraverso la barriera ad una velocità di rotazione inferiore a 1.000 giri/min, la barriera aiuta nella risospensione della cellula e anche la distribuzione al microwell. Barra di scala - 2 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Processo di caricamento delle celle nel chip di coltura CMS. (A) Per evitare che le cellule si attacchino al fondo del chip, ricoprire con 2,5 mL della soluzione pluronica F-127 a 4.000 rpm. Attendere un giorno per l'applicazione del rivestimento. (B) Rimuovere la soluzione pluronica e preriempire il canale con 2,5 mL del mezzo DMEM. (C) Rimuovere 100 l del DMEM e aggiungere 100 l di sospensione cellulare. In questo momento, risospendere 3–5x in modo che le cellule sono distribuite in modo uniforme. (D) Spostare le cellule nel microporuotando il chip, quindi colturare le cellule per 3 giorni a 1.000 a 2.000 rpm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Fotografia time-lapse di sferoidi monocolturali di cellule hASC e MRC-5. Le cellule sono state coltivate per 24 h a 2.000 giri/min. Lo sferoide è stato generato entro 24 h. Barra della scala : 400 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Immagini di fluorescenza di sferoidi coculture. (A) Forme di sferoidi concentriche in cui le celle hASC (verde) circondano le celle MRC-5 (rosso). (B) Janus sferoide forma in cui due cellule sono simmetriche. (C) Forma sferoide sandwich in cui gli strati hASC sono impilati tra due strati MRC-5. Barra della scala: 400 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Saggio Live/Dead di hASC il giorno 7. Il colore fluorescente verde rappresenta le cellule viventi e il colore fluorescente rosso rappresenta le cellule morte. Barra della scala: 400 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8: sferoidi MRC-5 il giorno 3. Un numero relativamente costante di cellule entra in ogni micropolo e forma sferoidi con sfaffezione relativamente costante nel sistema CMS. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 9
Figura 9: Raccogliere sferoidi. Gli sferoidi coltivati possono essere raccolti dividendo i due strati del chip di coltura CMS. I due strati al plasma possono essere facilmente separati a mano. Quindi gli sferoidi vengono raccolti dai micropozzi nello strato inferiore semplicemente pipetting. Barra della scala: 400 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il CMS è un sistema chiuso in cui tutte le cellule iniettate entrano nel microwell senza rifiuti, rendendolo più efficiente ed economico rispetto ai metodi convenzionali di generazione di sferoidi a base di microwell. Nel sistema CMS, il supporto viene sostituito ogni 12-24 h attraverso un foro di aspirazione progettato per rimuovere il supporto nel chip (Figura 3A). Durante il processo di aspirazione dei supporti, a malapena qualsiasi supporto fuoriesce dall'interno del microposimo a causa della tensione superficiale tra il supporto e la parete del microwell. Un utente può facilmente rimuovere il supporto intrappolato premendo vicino alla regione microwell del chip con un dito, perché il chip in PDMS è elastico e flessibile. Le cellule del micropo rimangono stabili senza sfuggire, anche con più cambiamenti multimediali. Per ottenere la stessa qualità di sferoide in tutti i 100 micropozzi, la rotazione del dispositivo non dovrebbe essere eccentrica e il chip deve essere assidirezionale. In caso contrario, un numero variabile di celle può entrare ogni pozzo e la dimensione e la forma dello sferoide potrebbero differire. Nel sistema di microwell convenzionale, poiché l'aria è spesso intrappolata nel microwell, è necessario rimuovere le bolle d'aria. Tuttavia, il sistema CMS non richiede il processo di rimozione delle bolle perché l'elevata forza centrifuga generata dalla rotazione fa sì che i media spingano le bolle e le spremeggano dai micropozzi.

Il sistema CMS ha anche i suoi limiti rispetto ai metodi convenzionali. Il sistema CMS richiede uno spazio di coltura più ampio (ad esempio, grande spazio di incubazione) in quanto comprende un motore, una piattaforma rotante e un controller, e la sua dimensione totale è di circa 100 mm x 100 mm x 150 mm (Figura 2B). Inoltre, provoca una leggera ma persistente vibrazione. Ci aspettiamo che la miniaturizzazione del sistema (si spera simile alle dimensioni di 6 piastre di pozzo) risolverà questi problemi.

Va notato che gli sferoidi coltivati possono essere raccolti separando i due strati legati al plasma del sistema CMS (Figura 9). L'incollaggio dei due strati è abbastanza forte da impedire la fuoriuscita del supporto durante il funzionamento del sistema. Tuttavia, a causa della piccola area di incollaggio, è separabile a mano. Gli sferoidi possono essere semplicemente raccolti dallo strato inferiore tramite pipettaggio.

Il sistema CMS ha una migliore riproducibilità e produttività rispetto ai metodi convenzionali di generazione di sferoidi. I metodi convenzionali, come i normali metodi di microwell o gocciolamento appeso, sono laboriosi. Tuttavia, nel sistema CMS, è molto più facile aumentare il numero di sferoidi semplicemente aumentando la dimensione del chip. Con questo dispositivo, è anche possibile generare organoidi che richiedono la coltura di tipi multicellulari, che non è facile da fare nei metodi di coltura convenzionali. Oltre alle cellule di questo studio (hASC e MRC-5), CMS potrebbe essere utilizzato per la produzione di sferoidi utilizzando vari altri tipi di cellule che possono formare sferoidi.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questa ricerca è stata supportata dal Basic Science Research Program (2016R1D1A1B03934418) e dal Bio & Medical Technology Development Program (2018M3A9H1023141) della NRF e finanziata dal governo coreano MSIT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D printer Cubicon 3DP-210F
Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC) ATCC PCS-500-011
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240-062 Contained 1% of completed medium and buffer
CellTracker Green CMFDA Thermo Fisher Scientific C2925 10 mM
CellTracker Red CMTPX Thermo Fisher Scientific C34552 10 mM
Computer numerical control (CNC) rotary engraver Roland DGA EGX-350
DC motor Nurielectricity Inc. MB-4385E
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D2650
Dulbecco's modified eaggle's medium (DMEM) ATCC 30-2002
Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) ATCC 30-2200
Fetal bovine serum ATCC 30-2020 Contained 10% of completed medium
human lung fibroblasts (MRC-5) ATCC CCL-171
Inventor 2019 Autodesk 3D computer-aided design program
Petri dish Φ 150 mm JetBiofill CAD010150 Surface Treated
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Pluronic F-127 Sigma Aldrich 11/6/9003 Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution
Polycarbonate (PC) Acrylmall AC15PC 200 x 200 x 15 mm
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dowcorning Sylgard 184
Trypsin Gibco 12604021

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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