유비퀴틴 및 유비퀴틴과 같은 종속 적 번역 후 수정 및 중대한 변경 식별 프로파일링

Biochemistry

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Summary

이 프로토콜은 치료 또는 표현형과 같은 특정 조건과 관련된 이러한 종류의 번역 후 수정 (PTM)의 변경을 식별하기 위해 유비퀴틴 (Ub) 및 유비퀴틴 -좋아요 (Ubls) 특정 프로테오옴을 확립하는 것을 목표로합니다.

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Swayden, M., Dobric, A., Berthois, Y., Villalba, H., Audebert, S., Camoin, L., Iovanna, J., Soubeyran, P. Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations. J. Vis. Exp. (153), e60402, doi:10.3791/60402 (2019).

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Abstract

유비퀴틴(ub) 및 유비퀴틴과 같은 (유블) 단백질의 의존적인 번역 후 변형은 단백질 안정성, 활동, 상호 작용 및 세포내 국소화를 조절함으로써 세포 내에서 근본적인 생물학적 조절 역할을 합니다. 그들은 세포가 신호에 응답하고 환경의 변화에 적응할 수 있게 합니다. 이 기계장치 내의 변경은 신경 퇴행성 질병 및 암과 같은 가혹한 병리상황으로 이끌어 낼 수 있습니다. 여기에 설명된 기술의 목적은 배양된 세포주로부터 ub/ubls 종속 PTM 프로파일을 신속하고 정확하게 확립하는 것입니다. 상이한 조건에서 수득된 상이한 프로파일의 비교는 예를 들어 치료에 의해 유도된 것과 같은 특정 변경의 식별을 허용한다. 렌티바이러스 매개 세포 트랜스덕션은 수식어(SUMO1 또는 Nedd8와 같은 유비퀴틴 또는 유블)의 2태그(6His 및 Flag) 버전을 발현하는 안정적인 세포주를 생성하기 위해 수행된다. 이 꼬리표는 세포에서 유비퀴틴 및 그러므로 유비퀴틴 단백질의 정제를 허용합니다. 이것은 2 단계 정제 과정을 통해 수행됩니다 : 첫 번째는 6His 태그를 사용하여 변성 조건에서 수행되고 두 번째는 플래그 태그를 사용하여 기본 조건에서 수행됩니다. 이것은 이후에 확인되고 액체 크로마토그래피에 의해 반정화되고 탠덤 질량 분석법 (LC-MS/MS) 기술에 선행되는 수정된 단백질의 고도로 특이하고 순수한 격리로 이끌어 냅니다. Excel 소프트웨어를 사용하여 MS 데이터의 쉬운 정보학 분석을 통해 배경 신호를 제거하여 PTM 프로파일을 구축 할 수 있습니다. 이 단면도는 표준 생화학 기술에 의하여 그들의 검증으로 시작하여 그 때 더 구체적으로 공부될 특정 변경을 확인하기 위하여 각 조건 사이 비교됩니다.

Introduction

여기에서 제안된 방법은 특정 조건 (처리, 분화 등)와 관련되었던 잠재적인 변경을 확인하기 위하여 배양한 포유류 세포에서 유비퀴틴 가족 구성원에 의해 중재된 PTM을 공부하기 위하여 전념합니다. PTM은 단백질의 기능 조절의 마지막 단계를 나타냅니다1. 실제로, 일단 번역 기계에 의해 생성된, 대부분의 경우 모든 단백질은 그들의 활동, 분자 상호 작용 및 세포내 위치1을조절하는 PTM의 다른 종류를 겪는다. PTM의 과다 중에는 단백질의 유비퀴틴 패밀리에 의해 매개되는 것들, 유비퀴틴 자체 및 모든 유비퀴틴-좋아하는 것들, 모든 세포내 또는 부분적으로 세포질 단백질을 조절할 수 있는 잠재력을 가지고있다 2. 그(것)들은 그들 자신 단백질이기 때문에, 그(것)들은 각각 특정 조절 기능과 관련되었던 다양한 topologies의 균질하고 이질적인 사슬을 형성하는, 서로 공액될 수 있습니다2. 이 복잡한 기계를 해독하고 이해하려면 도구가 필요합니다. 많은 접근법은 그들의 자신의 장점과 단점을 가지고, 전 세계적으로 개발되었다, 여기에서 우리는 배양 세포에 적합한 고성능 하나를 제안한다.

이 방법의 주요 장점은 정확성입니다. 실제로, 분리된 변형 된 단백질의 순도는 두 개의 태그 (6His 및 Flag)와 두 단계 절차의 조합 사용에 의해 매우 향상되므로 단일 태그 융합 Ub / Ubl3,4보다훨씬 더 선택적입니다. 6His 태그의 존재는 유비퀴틴 결합 도메인 또는 유비퀴틴 에 결합하는 다른 단백질을 함유하는 단백질의 공동 정제를 피함으로써 완전히 변성 조건에서 정제의 첫 번째 단계를 가능하게 한다. 이는 특정 항체5 또는 탠덤 유비퀴틴 결합 요소(TUBEs)6을사용하여 유비퀴틴화 된 프로테오옴의 친화도 정제에 기초한 여러 가지 다른 접근법에 의해 발생하는 기술적 문제이다. 중요한 것은, 이 기술은 모노와 다른 종류의 폴리쿼터시네이션이 모두 확인되었기 때문에, 다른 접근법의 경우일 수 있기 때문에, 특정 유형의 유비퀴틴화의 정제에 찬성하여 편향되지 않는다7. 따라서, 일단 발견되면, 유비퀴틴의 변경은 관련시킨 유비퀴틴의 정확한 종류를 확인하기 위하여 표준 생화확적인 접근에 의해 더 상세한 에서 공부되어야 할 것입니다.

마지막으로, 이 프로토콜의 또 다른 기술적 이점은 렌티바이러스를 사용하여 정상적인 세포 거동을 방해하지 않고 적절한 수준의 태그된 수정자의 발현을 통해 안정적이고 빠르게 세포주를 발현하는 것을 용이하게 생성합니다.

유비퀴틴화의 한 가지 중요한 역할은 프로테아소말 분해를 위한 단백질을 표적으로 하는 것이지만, 이제는 잠재적으로 대부분의 세포내 또는 부분적으로 세포내 단백질에 대한 많은 다른 조절 특성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다1. 이 기능의 수는 단백질 같이 많은 유비퀴틴의 존재에 의해 더 증강되고, 거의 모든 세포 기계장치를 통제하는 단백질의 가족을형성합니다 1. 그들의 변경은 세포 생물학에 과감한 영향을 미칠 수 있고 암9와같은 병리학적인 상황8을지도하거나 참여할 수 있습니다. 그러므로, 공구는 이 광대한 풍경을 탐구하고 새로운 치료 표적으로 봉사할 수 있는 병리학적인 상태와 관련되었던 변경을 확인하기 위하여 필요합니다.

이 프로토콜은 외인성 태그Ub/Ubl을 표현하기 위해 변환되어야 하기 때문에 배양되는 세포에 전념합니다. 일단 생성되면, 이러한 안정한 세포주는 2D 또는 3D 또는 이종이식에서 배양으로부터 Ubl 프로파일을 생성하는데 사용될 수 있으며, 따라서 PTM 프로파일을 연구하기 위해 적용될 수 있는 다양한 실험 모델의 지평을 확장할 수 있다.

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Protocol

1. 6His-Flag-Ubl을 발현하는 안정적인 세포주 생성

참고 : pCCL-6HF-Ubl, pVSVG 및 델타 도우미와 HEK-293T 세포의 공동 변환.

  1. 일 0: 종자 293T 세포는 6웰 플레이트에서 50-70% 합류를 다음날 얻었다.
  2. 1일차: 50-70% 동시 세포를 pCCL-6HF-Ubl 또는 pCCL-GFP 1 μg, pVSVG 1 μg 및 델타 헬퍼 벡터 1 μg를 혼합하여 렌티바이러스 생산을 위한 트랜스펙션 시약 및 프로토콜을 사용한다. 6시간 의 형질전환 후, 환전될 세포에 해당하는 새로운 배지로 배지를 변경한다. 종자 세포는 다음날 10-20% 합류(형질전환개시일)을 얻기 위해 6웰 플레이트에서 트랜스듀렉될 수 있다.
  3. 2일째: 24시간 후, 렌티바이러스 입자를 함유하는 배지를 회수하고 0.45 μm 필터를 사용하여 필터를 사용한다. 필요한 경우, 렌티바이러스의 두 번째 배치를 생산하기 위해이 시점에서 신선한 매체를 추가합니다. 렌티바이러스를 함유한 세포(10-20% 합류)를 시차할 세포의 배지를 대체한다.
    참고: 렌티바이러스 배지는 전향 전 며칠 동안 +4°C에서 보관하거나 수개월 동안 -80°C에서 보관할 수 있습니다.
  4. 표준 인큐베이터 (37 °C, 5 %CO2)에서24 시간에서 72 시간 사이의 렌티 바이러스로 세포를 인큐베이션 한 다음 신선한 표준 인큐베이터에 대한 배지를 변경합니다. 가능하면, 반전형광 현미경을 사용하여 GFP 발현을 확인하여 세포 발현률과 세포당 상대적 발현 수준인 형질전환의 효율을 평가합니다. 형광이 검출되지 않으면, 형질전환할 세포 유형에 따라 발현이 더 오래 걸릴 수 있기 때문에 추가로 2-3일을 기다린다.
  5. GFP 대조가 양성인 경우, 항기항체를 사용하여 면역형광 및 웨스턴 블롯에 의한 6HF-Ubl의 발현 조절을 충분히 수행할 때까지 모든 세포를 성장시다.

2. 변형 된 단백질의 이중 정제

참고 : 버퍼 1 : 6 M Guanidinium-HCl, 0.1 M Na2HPO4/ NaH2PO4,pH 8.0, 0.5 % 트리톤 X-100.
버퍼 2 : 50 mM NaH2PO4,150 mM NaCl, 1 % Tween20, 5 % 글리세롤, pH 8.0.
버퍼 3: 100 mM NH4HCO3,pH 8.0.

  1. 세포 용해: 일단 준비되면, 실온(RT)에서 인산완충식염수(PBS)로 배양설을 적어도 한 번 씻고 세포 용해또는 액상N2에 플래시 동결을 진행하여 -80°C에 보관합니다. 용해의 경우 RT에서 15cm 접시당 2 mL의 버퍼 1을 추가하십시오.
  2. 용해를 30초 동안 3회 초음파 처리하여 1분 동안 일시 정지합니다.
  3. 15 분 동안 15,000 x g에서 초음파 처리 된 용해기를 원심 분리합니다.
  4. 세포 스트레이너 (40 μm)를 사용하여 상구체를 새로운 튜브로 옮김.
  5. 샘플의 농도를 결정하고 필요한 경우 동일한 양의 단백질과 동일한 부피를 얻기 위해 조정합니다. 50~100 mg(MiaPaCa-2 세포의 경우 직경 15cm의 10가지 요리)의 총 양의 단백질을 사용하십시오.
  6. Ni2+-NTA 구슬을 넣고 단백질 1 mg당 2 μL의 구슬을 사용하십시오.
  7. RT에서 2.5 시간 동안 30 rpm에서 회전하십시오.
  8. 500 x g에서 5 분 동안 구슬을 펠렛하십시오.
  9. 버퍼 1의 1 mL로 구슬을 세척하고 샘플을 1.5 mL 미세 원심 분리튜브로 옮은 다음 튜브를 얼음으로 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 합니다. 얼음 이나 4 °C에서 모든 다음 단계를 수행 합니다.
  10. 10 mM imidazole를 함유 한 얼음 차가운 버퍼 2 1 mL로 두 번 씻으하십시오.
  11. 결합 된 단백질을 용출하려면 250 mM 이미다졸을 함유 한 완충액 2 600 μL을 추가하고 4 °C에서 2 시간 동안 회전하십시오.
  12. 500 x g에서 원심분리하여 1분 동안 구슬을 펠렛.
  13. 4°C에서 2.5시간 동안 30rpm에서 회전한 다음 완충2 500 μL로 2회 세척한 다음 버퍼 3의 500 μL로 2회 세척합니다.
  14. 최종 용출의 경우, 0.1 μg/μL에서 플래그 펩타이드를 함유한 완충3의 100 μL을 추가하고 1.5시간 동안 4°C에서 회전합니다.
  15. 500 x g의 원심분리기를 1분 간, 초자연자를 새로운 사전 냉각 된 튜브로 옮긴다.
  16. SDS-PAGE에 10% (10 μL)를 적재하고 젤의 은 염색을 수행하여 정제 품질을 제어합니다. 정제가 양호해 보이는 경우 LC-MS/MS가 남긴 90%를 분석합니다.

3. Ub/Ubls PTM의 프로파일을 생성하고 이들 PTM 간의 중요한 차이점을 식별하기 위한 질량 분석 데이터 처리

참고: MS 분석의 결과는 각 샘플에서 확인된 각 단백질에 대한 피크 면적 값(TOP 3 펩티드 영역10의평균)뿐만 아니라 총 펩티드 수를 포함한 많은 정보를 포함합니다. 이들 데이터는 펩티드 카운트 수 또는 피크 영역 값, 또는 둘 다를 사용하여 처리될 수 있다. 피크 영역을 사용하여 계산하려면 이러한 값은 일반적으로 106의 범위에 있으므로 아래와 동일한 수식을 적용하기 전에 이 순서로 분할해야 합니다. 두 가지 계수 방법론을 모두 사용하여 얻은 결과는 일반적으로 와 같이 강한 상관 관계를 보여야 합니다. 확인된 각 단백질에 대해 다음 포뮬러를 사용하십시오.
비처리 된 유비퀴틴 샘플에서 v1 펩티드 값 (예를 들어, Ub - 약물)
젬시타빈 처리 된 유비퀴틴 샘플에서 v2 펩티드 값 (예를 들어, Ub + 약물)
비처리 대조군 GFP 샘플에서 k1 펩티드 값(예를 들어, GFP - 약물)
젬시타빈 처리된 대조군 GFP 샘플에서 k2 펩티드 값(예를 들어, GFP + 약물).

  1. 정규화: 다음 수식을 사용하여 유비퀴틴과 GFP에 대한 약물 처리 된 세포와 치료되지 않은 세포 사이의 값을 정상화하십시오. 정규화된 v = V 및 정규화된 k = K.
    V1=v1. (v1+ v2) / (2. v1) ; V2=v2. (v1+ v2) / (2. v2)
    K1=k1. (k1+ k2) / (2. k1) ; K2=k2. (k1+ k2) / (2. k2)
  2. 배경 제거: 다음 수식을 사용하여 유비퀴틴 샘플의 값에서 대조군 샘플(GFP)의 값을 빼서 두 조건에서 확인된 각 단백질에 대한 특정 값(V'1 및 V'2)을 얻습니다.
    V'1=V1-K1 경우 V1-K1≥0; V'1=0 경우 V1-K1<0
    V'2=V2-K2 경우 V2-K2≥0; V'2 =0 인 경우 V2-K2<0
  3. 유비퀴틴의 변형(Var). 약물에 의해 유도된 PTM의 양성 및 음성 변화에 대한 점수(-100에서 +100 사이)를 얻으려면, 치료된 샘플과 미처리 된 샘플의 특정 값 간의 차이를 포함 하 여 모든 값의 합계로 나누어 다음 공식을 사용 하 여 제어 (또한 제어 GFP에서 확인 된 단백질을 처벌하기 위해), 100곱.
    Var = (V'2-V'1)//(V1+K1+V2+K2)*100; -100-50(PTM의 억압) 이하 또는 50(PTM의 유도) 이하의 변화는 일반적으로 유의한 것으로 간주됩니다.
  4. 신뢰 (Conf). 다음 수식을 사용하여 0에서 100% 사이의 신뢰도 값을 얻습니다.
    Conf = ((V1+V2)2/(1+V1+V2+K1+K2)2)*100 - 100/(1+V'1+V'2) ; =0의 경우 <0
    50을 초과하는 값은 일반적으로 확신하는 것으로 간주됩니다.
  5. 유도/억압 값의 더 좋은 분포를 얻고 변형 및 신뢰도 매개 변수를 모두 고려하려면 다음 공식을 사용하여 Var 및 Conf 값을 곱합니다.
    =SI(V2>0;0;(((V2*C2)^2)//(10^6);-(V2*C2)^2)/(10^6))
    참고: 피크 면적 값은 일반적으로 펩타이드 계수보다 더 정확하기 때문에, 다음 의 Perseus (https://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus)와 같은 데이터의 이러한 종류의 해석에 전념하는 특정 소프트웨어를 사용할 수 있습니다. 사용 권장 사항.

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Representative Results

GFP 및 6HF-Ub 발현 세포를 생성하기 위해 배양 포유류 세포의 전이
나중에 MiaPaCa-2 세포를 변환하는 데 사용될 렌티바이러스를 생산하기 위해, 70% 콘립쿠스 HEK-293T 세포는 pCCL-6HF-유비퀴틴 또는 GFP/델타-도우미/pvSvG의 동일한 양으로 병입된다. 생산의 24 시간 후에, 렌티 바이러스 입자를 포함하는 배지는 회수되고 여과된다. 이 시점에서 반전된 현미경상에서 293T 세포를 발현하는 GFP의 녹색 형광을 확인함으로써 형질감염의 효율을 조절할 수 있다. 그것은 세포의 100 %에 가깝습니다. MiaPaCa-2 세포는 렌티바이러스 상류로 1-3일 동안 배양됩니다. 렌티바이러스 형질전환의 효능은 먼저 GFP 형질전환 세포의 GFP 형광을 보고 조절된다(도1A 상부 패널). GFP 발현 수준은 한 세포에서 다른 세포로 다양할 수 있지만 그 중 100%는 형광이어야 합니다. 이 컨트롤이 완료되면 플래그 유비퀴틴의 표현도 제어되어야 합니다. 이것은 항 기항체 (일반적으로 M2 모노클로날)를 사용하여 면역 형광 염색에 의해 행해집니다(그림 1하부 패널). 이것은 세포 배양의 미래 통로를 통해 안정한 발현을 보장하기 위하여 100%이어야 하는 변환한 세포의 백분율을 보여줄 것입니다. 외인성 기역 유비퀴틴의 발현 수준을 조절하기 위해, 트랜스듀렉트 세포로부터의 용해액은 SDS-PAGE에 의해 분석되고 그 다음에는 항기항체를 가진 웨스턴 블롯(그림1B). 두 세포주를 모두 고정할 수 있습니다.

SDS PAGE와 실버 염색에 의한 2단 정화 및 제어
안정한 발현 세포주가 검증되면, GFP 및 6HF-유비퀴틴 세포는 2단계 정제를 진행하기 위해 충분한 물질이 얻어질 때까지 증폭된다. 필요할 때 해동할 수 있도록 액체 질소에 냉동 재고로 이러한 세포주의 백업을 유지하는 것이 좋습니다. 36 h 처리 하기 전에, 세포의 절반 (절반 GFP 와 반 6HF-유비퀴틴) Gemcitabine의 10 μM으로 처리 됩니다. 준비되면, 유비퀴틴화된 단백질은 2단계 정제 프로토콜을 사용하여 6HF-유비퀴틴 및 GFP 대조군 세포로부터 정제된다(도2A). 최종 용출의 10%는 젤의 SDS-PAGE 및 은 염색에 의한 정제된 물질의 양 및 무결성을 조절하는 데 사용된다(도2B). 분자량 마커 밴드는 정제된 유비퀴틴화된 단백질의 양을 추정하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 공지된 양의 BSA 또는 다른 단백질은 정제된 단백질을 정량화하는 것을 돕기 위해 겔의 라인에 적재될 수 있다. 이 검증이 완료되면, 나머지 90%의 시료는 액체 크로마토그래피에 의해 질량 분석과 결합되어 정제된 단백질의 식별 및 반량화를 허용합니다.

배경 (GFP 샘플) 빼기에 의한 유비퀴틴화 단백질의 식별
샘플의 LC-MS/MS 분석에서 데이터는 GFP 및 6HF Ub 샘플에서 확인된 각 단백질의 이름 및 정량화(관찰된 펩티드의 피크 영역 및 개수)를 제공합니다. GFP 샘플에 비해 유비퀴틴 샘플에서 가장 높은 정량화를 갖는 단백질은 실제로 유비퀴트화될 가능성이 가장 높으며, 상기 방법에 기재된 수식을 적용하면 0에서 100%까지의 신뢰점수를 부여함으로써 그들의 분류를 허용합니다. . 50% 이상의 점수로 확인된 단백질은 유비퀴틴화된 단백질로간주됩니다(그림 3A).

기본적으로 유비퀴틴 샘플로부터 배경 단백질(GFP)을 제거하는 이 단계는 유비퀴틴화단백질 364개의 규각을 이끌어냈다(도 3B)7. 여기에서 가장 높은 점수로 확인된 단백질은 이 정제 방법의 효험을 증명하는 유비퀴틴화의 주요 표적으로 이미 알려져 있습니다.

그런 다음 이러한 유비퀴틴화 단백질의 유전자 세트 농축 분석(GSEA)을 수행하여 이들이 관여하는 생물학적 과정을 강조할 수있습니다(도 3C),그들의 분자 기능, 그들의 세포 구획, 또는 다른 유전자 온톨로지 분류. 가능하면 이 유비퀴틴화 된 프로테오메와 세포의 전체 프로테오메를 비교하는 것이 흥미 롭습니다. 실제로, 이 분석은 예를 들면 번역 또는 단백질 용해와 같은 특정 프로세스에 있는 이 편비퀴틴화한 단백질의 실제적인 기여를 제시합니다(그림 3C).

이러한 종류의 실험의 주요 목적은 예를 들어, 여기에 젬시타빈에 의해 유도된 유비퀴틴화 된 프로테오메 내의 변화를 식별하는 것이다. 특정 수식을 사용하여 처리 및 처리되지 않은 세포에서 유비퀴티노메(유비퀴틴화 된 특정 프로테오메)를 비교함으로써 -100 (유비퀴틴화의 억압)에서 +100 (유비퀴틴화 유도)의 값을 산출한다. -50 이하의 값만 을 고려하여 +50 이상이 유의한 것으로, 총 73개의 유도된 유분화 및 29개의 억압된 유분화가확인되었다(그림 4A). 유비퀴틴화의 이러한 변경에 대한 GSEA 분석은 DNA 복구 과정 또는 세포 주기의 특정 농축, 번역 및 RNA 대사 과정의 중요한 변이를 밝혀냈습니다(그림4B). gemcitabine는 DNA 합성을 차단하고 DNA 손상을 유발하는 기본 유사체이기 때문에 이 결과는 매우 논리적입니다.

더 나아가, 젬시타빈 유도된 유비퀴틴화의 변경에 의해 형성된 잠재적 상호 작용 네트워크를 탐구하고 검증하기 위해 상호 작용 단백질의 데이터베이스를 사용하는 것도 흥미롭다(그림5). 이것은 관련시킨 단백질의 증가 또는 감소보에 의해 강하게 영향을 받은 기능적인 상호 작용하는 네트워크의 확인으로 이끌어 냈습니다.

마지막으로, 변경된 유비퀴틴화 중, 몇몇은 문학에 따라 그들의 알려진 또는 잠재적인 기능 때문에, 가장 높은 관심의 단백질을 관련시킬 수 있습니다. 따라서, 한 가지 중요한 단계는 질량 분석법에 의해 관찰되는 것이 진짜이고 신뢰할 수 있는지 확인하는 것입니다. PCNA는 질량 분석 분석에 의해 검출된 젬시타빈 처리 시 가장 과도하게 유비퀴틴화된 단백질 중하나였다(도 4A). gemcitabine 실제로 PCNA의 유비퀴틴화를 유도하는 것을 확인하기 위하여, 6HF Ub 및 GFP를 발현하는 MiaPaCa-2 세포는 성장, 처리 또는 아닙니다, 변성 조건에서 Ni-NTA 정제 또는 플래그 뒤에 항 플래그 면역 침전의 대상이 됩니다 네이티브 조건에서 펩티드 용출, 해당 항체와 서쪽 얼룩 다음에 SDS 페이지에 해결. 도 6에 나타난 결과는 MiaPaCa-2 세포에서 젬시타빈 치료에 대한 반응으로 실제로 PCNA가 유비퀴틴화됨을 확인하였다.

Figure 1
그림 1: 6을 발현하는 안정된 세포주 확립그의-플래그-Ubl. (a) GFP 형화 세포에서 GFP 발현의 제어(상부 패널) 및 항-플래그-유비퀴틴에 의한 면역형광에 의한 항-플래그-유비퀴틴을 1차 및 알렉사-567 항마우스 이차 항체로서 항플래그(M2) 항체를 이용하여. DAPI는 핵을 염색하는 데 사용되었다. 스케일 바: 50 μm. (B) 반기 항체를 사용하여 서양 얼룩에 의해 세포 에서 6His-Flag-유비퀴틴 발현의 제어 (또는, 항-6his 항체를 사용할 수 있음) 및 반대로 유비퀴틴 항체, 오른쪽, 발현을 비교하기 위해 의 6His-플래그 유비퀴틴 (6HF-유비크) 내인성 유비퀴틴 (엔도. 우빅). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 유비퀴틴화 단백질의 2단계 정제. (A) 절차의 개략적 표현. (b) 최종 용출의 10%를 SDS PAGE를 실시한 다음, 단리단백질의 수량 및 순도(GFP와 비교)를 추정하기 위해 겔의 은 염색을 실시하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 유비퀴틴화 단백질의 식별(보나치 외에서 적응). 7). (a) 확인된 각 단백질에 대한 특이적(유비퀴틴 샘플) 및 비특이적(GFP 샘플) 펩티드의 상대적 양을 자신감 있는 점수의 함수로 플롯하였다. 도시된 바와 같이, 유비퀴틴화 된 단백질에 대한 비 특이적 인 비율은 50의 점수 보다 너무 중요해집니다. 따라서 50보다 우수한 점수로 확인된 단백질만이 유의한 것으로 간주됩니다. (b) 확인된 364개 총 단백질 중에서 20개의 최고의 유비퀴틴단백질을 나타낸 표. (C) 생물학적 과정 내에서 MiaPaCa-2 세포의 유비퀴틴화 단백질 및 총 단백질의 재분할 (값 > 1.5%만 고려되었다). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
도 4: 젬시타빈은 PTM 프로파일의 변경을 유도한다(보나치 외로부터 적응). 7). (a) 젬시타빈 치료 시 가장 높은 증가(총 73개) 또는 감소(총 29개) 유비퀴틴화를 가진 20개의 단백질의 목록(Conf: confidence; Ind: 유도; 담당자: 억압). (B) 젬시타빈의 재분할은 생물학적 과정 내에서 유도된 유비퀴틴화를 유발하고 비처리된 부분과의 비교를 유도하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
도 5: 젬시타빈의 기능적 상호작용은 유비퀴틴화를 유도한다. 유비퀴틴화의 유도된 변경을 가진 모든 단백질 사이 잠재적인 상호 작용은 단백질 단백질 상호 작용 데이터베이스를 사용하여 확인됩니다 (STRING: string-db.org). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
도 6: 흥미로운 젬시타빈의 생화학적 유효성 검사는 유비퀴틴화의 변경을 유도했다. 젬시타빈 처리 후 PCNA의 증가된 유비퀴틴화를 검증하기 위해, 6HF-유비퀴틴을 발현하는 세포의 용해물, 젬시타빈으로 처리되거나 하지 않음, 니켈 풀다운(Ni-NTA)을 실시하고 그 다음에 안티-PCNA 웨스턴 블롯을 실시하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

우리는 주요 유비퀴틴 가족 구성원에 의해 변형 된 단백질의 프로파일을 생성하는 강력하고 신뢰할 수있는 방법론을 개발했습니다. 실제로, 우리는 성공적으로 유비퀴틴에 의해 PTM의 프로파일을 생성하기 위해이 프로토콜을 적용하고, 또한 SUMO와 Nedd8에 의해, 및 치료와 관련된 변경을감지하기위해 7 , 특정 유전자의 과잉 발현 또는 녹다운에 대한 응답으로 (데이터는 다양한 화학요법 약물에 내성 표현형을 획득한 세포에서)

프로시저 중에 조작자가 주의해야 하는 중요한 단계는 거의 없습니다. 비드(Ni-NTA 또는 안티-플래그 결합)의 파이펫팅시, 점성 글리세롤 계 완충제에 현탁되기 때문에, 특히 반플래그 비드를 철저히 재중단하고, 팁을 증가시키기 위해 팁의 끝을 조금 절단하는 것이 중요하다. 또 다른 예방 조치는 구슬의 적층을 피하기 위해 천천히 파이펫하는 것입니다. 추가 중요한 단계는 imidazole를 가진 용출및 플래그 펩티드로 입니다. 깨끗한 해밀턴 주사기는 비특이적 단백질이 남아있는 구슬의 가능한 한 많은 피펫팅을 피하기 위해 용출 후 상류를 회복하는 데 사용되어야합니다.

질량 분석에 필요한 최종 물질의 세포 유형 및 양에 따라, 시작 물질은 그에 따라 증가 또는 감소될 수 있다. 그런 다음, 유일하게 중요한 조정은 용해에서 단백질 1 mg 당 2 μL이어야하므로 니켈 비드의 부피에 상주합니다. 정제 된 단백질의 양이 너무 낮을 수 있습니다. 태그된 Ub/Ubl의 발현 수준을 제어해야 하며, 너무 낮으면 동일한 렌티바이러스를 사용하여 세포를 다시 변환할 수 있습니다. 대안적으로, 시동 물질의 양을 증가시킬 수 있다. 때로는 GFP 또는 부모 세포에서 비특이적 정제 물질의 양이 너무 높습니다. 이 문제를 극복하기 위한 한 가지 해결책은 Ni-NTA 및 플래그 정제 단계 모두에서 양과 세안 횟수를 증가시키고 있다. 또한 구아니딘 완충액으로 씻어 내면 이미다졸의 농도를 최대 20 mM까지 증가시킬 수 있습니다. 반대로, 용출을 증가시키지 않기 때문에 최종 용출 단계에서 플래그 펩티드의 농도를 증가시킬 필요가 없다. 시간이 지남에 따라 신선한 펩티드를 사용하는 것이 더 중요하며, -20°C에서 보관하더라도 펩타이드의 효능이 감소할 수 있다.

이 프로토콜의 주요 제한사항은 원하는 태그가 지정된 Ubl을 발현하기 위해 트랜스듀덕화되어야 하기 때문에 배양된 세포에만 적합하다는 것입니다. 따라서, 조직 또는 종양 견본에 대한 어떤 연구든지 트립신 소화 후 diGly 펩티드 농축제 와 같은 대체 접근법을 사용하여 수행되어야 한다11,관심의 Ub/Ubl에 특이적인 항체를 이용한 면역 침전5,또는 사용 튜스6. 이들 모든 대체 방법은 배양된 세포에서의 적용에도 적합하다. 그들은 내인성 Ub / Ubls 기계를 사용하는 장점이 있습니다. 그러나 몇 가지 단점이 있습니다. 면역 침전은 낮은 배경으로 수행하기 어렵고, TUBEs 접근법과 같이 변형 된 단백질과 상호 작용하는 단백질, 심지어 수정자 자체조차도 실질적인 개선을 통해 얻을 수 있더라도 제거 할 수 없습니다. 더 엄격한 조건. DiGly 펩티드 농축은 매우 강력한 기술이지만 다른 종류의 PTM에 대응할 수 있습니다. 예를 들어, 트립신 소화 용해물로부터의 diGly 농축은 주로 유비퀴틴화된 단백질뿐만 아니라 neddylated 것들을 식별할 것이며, 네드8은 유비퀴틴과 동일한 잔재를 잎으로 남기며11.

이 프로토콜의 또 다른 제한은 6His-Flag 태그가 있으면 Ub/Ubl의 정상적인 기능이 변경될 수 있으며 자체적으로 과식으로 인해 기계가 변경될 수 있다는 것입니다. 이것은 예를 들어 폴리 유비퀴틴 사슬의 생성을 방해하고 단핵화를 선호 할 수 있습니다. 그러나, 모노 멀티 및 폴리 유비퀴틴 체인이 이 프로토콜을 사용하여 확인되었기 때문에, 그것은7의경우가 아닌 것 같습니다. N-종점에서 태그의 존재는 또한 유비퀴틴 의 N 말단 메티오닌을 통해 함께 연결되는 선형 유비퀴틴의 형성을 방지합니다. 그러나, 비록 6HF-udiquitin 그것의 첫 번째 Met 잔류물에서 유비퀴틴 수 없습니다, 그것은 여전히 체인의이 종류를 종료 하는 능력을 가지고.

또한, 렌티바이러스를 사용하면 1~2주 안에 안정적인 세포 라인을 생성할 수 있는 실질적인 장점이 있는 반면, 모든 세포가 원하는 구수를 발현하지는 않을 수 있다. 이것은 충분한 세포가 외인성 Ub/ubl을 표현하는 한 정제 절차에 대한 실제 문제가 아닐 수 있지만, 문제는 여러 구절을 통해 장기간 배양되어 적게 또는 전혀 없는 세포의 농축을 가진 클론 변이가 있을 수 있습니다. 식. 그러나 이러한 단점은 저항 선택 유전자 또는 유세포측정에 사용될 수 있는 형광 단백질을 함유하는 렌티바이러스를 사용하여 양성 세포만을 선택함으로써 쉽게 우회할 수 있다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

이 작품은 HV와 MS에 라 리그 콘트레 르 암에 의해 지원되었다, 그리고 ARC (협회는 PS에 라 recherche sur 르 암을 부어) PS, INCa (연구소 국립 두 암) 및 JI에 암로 폴 PACA. IBISA (인프라 바이오로지 산테 에 아그로노미), 플레이트포메 테크놀로지 엑스-마르세유, 칸세로폴레 PACA, 프로방스-알프스 코트 다쥐르가 지원하는 마르세유 프로테오믹스(marseille-proteomique.univ-amu.fr)의 질량 분석 시설 레지옹, 파올리-카메테스 연구소, 레체르슈 앙 칸세로로지 드 마르세유.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel Sigma-Aldrich A2220-5ML binds all Flag tagged proteins
anti-Flag M2 antibody Sigma-Aldrich F3165 to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl
Cell strainer 40 µm Falcon 352350 to remove floating pellet from guanidine lysed cells
Flag peptide Sigma-Aldrich F3290 elute flag tagged proteins from anti-flag beads
Guanidine hydrochloride Sigma-Aldrich 50933 chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate
Imidazole Sigma-Aldrich I5513 eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads
Lipofectamine 3000 ThermoFisher L3000015 to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses
Lobind tubes Sigma-Aldrich Z666491 avoids absorption of precious material
Membrane Filter, 0.45 µm Millipore HAWP04700F1 to filter the lentiviral supernantant
Ni-NTA Qiagen 30210 purification of the 6His tag

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References

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