Количественное измерение интратекалливых синтезированных белков у мышей

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Повышенный уровень белка спинномозговой жидкости может быть результатом распространения белка плазмы через измененный гематоэнцефалический барьер или внутритекаальный синтез. В этой статье представлен оптимизированный протокол тестирования, который помогает дискриминировать оба случая и обеспечивает количественные измерения синтезированных белков интратеколли.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Gilli, F., Welsh, N. C., Linzey, M. R., Royce, D. B., DiSano, K. D., Pachner, A. R. Quantitative Measurement of Intrathecally Synthesized Proteins in Mice. J. Vis. Exp. (153), e60495, doi:10.3791/60495 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Цереброспинальная жидкость (CSF), жидкость, найденная в головном и спинном мозге, имеет большое значение как для основных, так и для клинической науки. Анализ состава белка CSF предоставляет важную информацию в фундаментальных неврологических исследованиях, а также неврологических заболеваниях. Одно предостережение что протеины измеренные в CSF могут вытекать от обоих intrathecal синтеза и transudation от сыворотки, и анализ протеина CSF может только обусловить сумму этих 2 компонентов. Чтобы различать перенос протеина из крови и интратэколли, производимые белками в животных моделях, а также в организме человека, измерения профилирования белка CSF с использованием обычных инструментов анализа белка должны включать в себя расчет альбумина CSF/сыворотки коэффициента (qalbumin), маркер целостности интерфейса кровяного мозга (BBI), и индекс белка (qбелок/альбом) Этот протокол иллюстрирует всю процедуру, от CSF и сбора крови до расчетов коэффициентов и индексов, для количественного измерения синтеза внутриклеточного белка и нарушения BBI в моделях мыши неврологических расстройств.

Introduction

Цереброспинальная жидкость (CSF), прозрачная и бесцветная жидкость, окружающая мозг и спинной мозг, имеет большое клиническое и фундаментанное научное значение. CSF сохраняет электролитическую среду центральной нервной системы (ЦНС), уравновешивает системный кислотно-базовый статус, поставляет питательные вещества в нейрональные и глиальные клетки, функционирует как лимфатическая система для ЦНС, и транспортирует гормоны, нейротрансмиттеры, цитокины и другие нейропептиды по всей ЦНС1. Таким образом, поскольку состав CSF отражает активность ЦНС, эта жидкость предлагает ценный, хотя и косвенный, доступ к характеристике физиологического и патологического состояния ЦНС.

CSF был использован для диагностики заболеваний, которые влияют на ЦНС на протяжении более ста лет, и на протяжении большей части этого времени, он был в первую очередь изучался врачами в качестве диагностического инструмента. Однако в последние годы нейробиологи признали потенциал CSF для изучения патофизиологии ЦНС. В частности, несколько высокопроизводительных инструментов анализа белка были введены в области нейронауки, что позволяет детально изучить состав белка CSF, с расчетом на то, что этот анализ может помочь дать представление о динамических изменениях происходящих в ЦНС.

Технологические разработки в мультиплексных методах иммуноанализа, таких как Luminex и Simoa технологий2,3, предоставить исследователям сегодня возможность обнаружить сотни белков в очень низких концентрациях. Кроме того, эти же технологии позволяют использовать небольшие объемы выборки, тем самым способствуя исследованиям на мелких животных, в том числе мышах, в которых ограниченные объемы образцов CSF до недавнего времени исключали подробные характеристики жидкости.

Тем не менее, одно предостережение заключается в том, что белки, измеренные в CSF, могут вытекать из внутритебного синтеза и/или трансудаляции из сыворотки из-за поврежденного интерфейса кровеносного мозга (BBI). К сожалению, анализ белка CSF только может определить сумму этих двух компонентов. Чтобы различать трансудатии и интратеколли, измерения белка CSF с использованием любого доступного инструмента анализа белка должны быть скорректированы с учетом индивидуальной изменчивости концентраций в сыворотке крови, а также барьерной целостности. Однако, хотя эта корректировка широко используется в клинической практике, например, индекс CSF IgG, который имеет высокую чувствительность для обнаружения внутритекового синтеза IgG4,5,6, на сегодняшний день очень немногие исследования исправили концентрации белка CSF для концентрации сыворотки и барьерцелостности7,8.

В настоящее время подход Рейберграм является лучшим способом определения барьерной функции и внутритекового синтеза белков. Это графическая оценка в CSF / сыворотки фактор диаграммы, которая анализирует, в комплексном порядке, как барьер (дис) функции и синтез внутритебного белка, ссылаясь на исключительно кровеоток протеина9,10. Высоко обильный протеиновый альбумин обычно выбирается в качестве эталонного белка, потому что он производится только в печени и потому, что его размер, приблизительно 70 kDa, является промежуточным между малыми и большими белками11. Диаграмма анализа была впервые определена Рейбером и Фельгенгауэр в 1987 году для основных классов иммуноглобулинов (Igs)11, будучи эмпирически основана на результатах, полученных в результате анализа тысяч образцов человека9. Подход был впоследствии подтвержден применением двух законов Fick диффузии в теории молекулярной диффузии / скорости потока12. Такая теория демонстрирует диффузию белка через барьер имеет гиперболическое распределение и может количественно объяснить динамику белков в ЦНС9,13. В целом, преимущество использования Рейберграма для демонстрации синтеза внутритекового белка заключается в том, что он одновременно определяет белковую фракцию, которая попадает в CSF из сыворотки, а также количество белка, найденного в CSF из-за местного производства.

В настоящей статье и соответствующем протоколе описывается вся процедура, от CSF и сбора крови до окончательных расчетов коррекции уровней белка CSF, для количественного измерения синтеза внутритебного белка в моделях мыши неврологических Расстройств. Эта процедура обеспечивает базовый уклад, на основе которого для оценки (1) патофизиологического происхождения любого белка CSF и (2) стабильности и функциональной значимости барьерной целостности. Эта процедура и протокол не только полезны для оценки образцов мышь CSF, но также полезны в анализе CSF в множестве животных моделей неврологических заболеваний и человеческих пациентов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Вся работа животных использует протоколы, рассмотренные и одобренные Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) в Медицинской школе Гейзела в Дартмуте.

1. Сбор жидкостей

ПРИМЕЧАНИЕ: Требуется сыворотка и CSF. Для выживания и некропсии необходимы два протокола для каждой коллекции жидкости.

  1. Коллекция сыворотки и CSF с использованием процедур выживания
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для сбора жидкости выживания, сбор сыворотки должен предшествовать коллекции CSF, как это менее инвазивной процедурой. CSF должен быть получен в течение одной недели после розыгрыша сыворотки.
    1. Процедура ретро-орбитального кровотечения для сбора сыворотки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура для выживания кровотечение мышей14. Описанная процедура применяется к любому возрасту, полу и штамму мышей. Поскольку правила IACUC диктуют, что максимальный объем крови в 1% от массы тела может быть удален в виде одного анализа крови, рекомендуется, что процедура проводится только на мышах весом более 15 г.
      1. Переместите клетки, содержащие мышей из стойки в соответствующую рабочую зону. Подготовьте газодвигательную анестезию, включив счетчик потока кислорода до 1 л/мин.
      2. Поместите животное в индукционную камеру и плотно закройте крышку. Включите испаритель изофруран до 3,5% и следите за животным до лежачего.
      3. Выньте животное из камеры и оцените уровень анестезии с помощью педали рефлекса, т.е. твердой щепотки подножки. Обеспечьте достаточную глубину анестезии перед выполнением процедуры: отсутствие реакции на твердую щепотку указывает на адекватную анестезию.
      4. Сдержать обезопсаниваемых мышей, схватив свободную кожу за ушами большим и указательным пальцем не доминирующей руки. Выпуклость глаза с помощью указательного пальца, чтобы оттянуть кожу над глазом и большой палец, чтобы оттянуть кожу ниже глаз.
      5. Поместите кончик пипетки Pasteur в глазницу под глазным яблоком(рисунок 1, левая панель), направляя кончик примерно на 45 "к середине глазницы (Рисунок 1, правая панель). Поверните пипетку между пальцами во время переднего прохода. Применить мягкое давление, а затем отпустить, пока кровь входит пипетка.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальное количество крови, которая может быть снята в одно время из этого места составляет около 1% от массы тела, например, 0,2 мл из 20 г мыши.
      6. Аккуратно удалите капилляр, чтобы предотвратить повреждение глаза и поместите собранную кровь в центрифугу 1,5 мл. Закройте веко и нанесите мягкое давление марлей, чтобы предотвратить дальнейшее кровотечение. После полной боевой и мобильной связи (обычно 3,5 мин) верните мышь в клетку для хранения.
      7. Разрешить сгусток крови в течение 30-60 минут при комнатной температуре (RT), затем центрифуги крови в течение 10 минут при 2000 х г в 4 C охлажденной центрифуги. Используя чистую технику пипетки, соберите сыворотку в новый флакон с этикеткой 0,5 мл. Немедленно заморозить флакон сыворотки при -80 градусах Цельсия.
    2. Коллекция CSF с процедурой выживания
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура предназначена для хирургии выживания, и она основана на протоколе, опубликованном Лю и Даффом в 2008 году15. Мышей обезболивают кетамином (20 мг/мл), ксилазином (0,5 мг/мл) и ацепромазином (0,5 мг/мл) коктейль, вводимый интраперитонеально.
      1. Переместите клетки, содержащие мышей из стойки в назначенную рабочую зону хирургии. Подготовка хирургии пространство в стерильной среде. Убедитесь, что все инструменты и материалы, используемые стерилизованы до операции.
      2. Взвесьте мышь и расчислите необходимый объем анестезии (0,1 мл анестезии для 20 г мыши). Инъекционная анестезия интраперитонетически16. Через несколько минут, проверить мышь, щипать подножку, чтобы обеспечить адекватную анестезию. Если требуется больше анестезии, вводят дополнительно 0,01-0,03 мл анестезируемого коктейля.
      3. Используйте либо ножницы или бритву, чтобы побрить небольшую область головы, на каудальном конце, медиаль на черепе, чтобы разоблачить достаточно большую рабочую зону для коллекции CSF. Расположите мышь в положении лежа на стереотаксическом инструменте и стабилизировать голову с помощью ушных прутьев(рисунок 2A).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь заложена так, что голова образует почти 135 "угол с телом (Рисунок 2A). После того, как животное расположено, хирургическая драпировка используется для поддержания стерильного поля в хирургическом месте. Прозрачные клеевые шторы предпочтительнее для коллекции CSF у мышей, так как они позволяют для прямой и более целенаправленной визуализации животного.
      4. Swab хирургического сайта с 30% хлоргексидина диацетата. Используя стерильный скальпель, сделать сагитальный разрез кожи уступает occiput подвергать мышцы над цистерной magna.
      5. По тупой рассечение с щипками, отдельные подкожной ткани и мышц, чтобы разоблачить цистерны magna (Рисунок 2B). Используйте микроретракторы, чтобы держать мышцы друг от друга(Рисунок 2B) и разоблачить dura mater менингеального слоя над цистерна магна.
      6. Аккуратно промыть стерильным фосфатным сольниковым сольнием (PBS) для удаления любого возможного заражения крови. Подьем высушите дюрова с помощью стерильного ватного тампона и аккуратно проколить мембрану, покрывающую цистерну магна, иглой 30 Г. Быстро и осторожно вставьте небольшую стеклянную капиллярную трубку, чтобы собрать CSF(рисунок 2C).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Внутричерепное давление позволяет CSF самопроизвольно течь в капилляр(рисунок 2C). В зависимости от возраста и размера мыши, примерно от 5 до 12 л CSF получается от каждой мыши.
      7. Аккуратно снимите капиллярную трубку с мембраны. Подключите трубку к 3 мл шприца через полиэтиленовые трубки(Таблица материалов) и введите собранные CSF в помечены 0,5 мл трубки(рисунок 2D). Храните флаконы во льду.
      8. Закрыть разрез с помощью полидооксанона шов (PDS) с одноразовой иглой и с использованием похоронен швы17. Очистите область любой высохшей крови или ткани.
      9. Вводят мышей, подкожно или интраперитонеально16, с 0,05-0,1 мг/кг гидрохлорида бупренорфина в качестве обезболиващее лечение. Кроме того, вводят подкожно 1 мл стерильного сольядлядляго раствора для предотвращения обезвоживания.
      10. Поместите мышь обратно в чистую и теплую клетку для восстановления. После того, как мышь мобильна и сможет достичь пищи и воды, поместите клетку обратно на стойку.
      11. Центрифуга CSF в течение 10 мин при 1000 х г в охлажденной центрифуге 4 градусов По Цельсию. Проверьте степень загрязнения крови путем визуального осмотра для выявления ксантхохромии и наличие красного гранулы в нижней части трубки. Отбросьте зараженные кровью образцы.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Формула, используемая для коррекции количества белка CSF в зараженных кровью образцах, основана на параметрах уравнения, которые включают содержание белка в CSF и сыворотке крови, гематокрит (HCT), и красные кровяные клетки (РБК) в CSF и крови18. Однако такая стратегия коррекции не может быть легко применена к образцам CSF мыши из-за небольшого объема, что ограничивает стратегию коррекции визуальным осмотром.
      12. Используя чистую технику пипетки, соберите CSF в новую трубку 0,2 мл, оставив позади гранулы с клетками. Разбавить CSF 1:3 с PBS, чтобы уменьшить потери объема из-за аэрозоля. Немедленно заморозить флакон CSF при -80 градусах По Цельсию.
  2. Коллекция сыворотки и CSF с использованием процедур невыживания
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для не-выживания жидкости сбора, коллекция CSF предшествует коллекции сыворотки, как мышь должна иметь пульс.
    1. Коллекция CSF при некропсии
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура предназначена для операции без выживания, и примерно 10-20 Л CSF получается от каждой мыши. Рекомендуется стерильное хирургическое поле, но не обязательно для операции, не связанных с выживанием.
      1. Переместите клетки, содержащие мышей из стойки в удобное рабочее пространство. Выполните шаги 1.1.2.2-1.1.2.7 и 1.1.2.11-1.1.12 для коллекции CSF. Перейдите к разделу 1.2.2 для сбора сыворотки.
    2. Сбор крови через внутрикардийный прокол (открытый подход)
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объемы крови, как ожидается, составляет около 3% от массы тела, например, 0,6 мл от 20 г мыши.
      1. После коллекции CSF убедитесь, что мышь по-прежнему достаточно обезопадона, щипать подножку. Если какая-либо реакция наблюдается, вводят вторую дозу анестетика. Если реакции не наблюдается, продолжайте.
      2. Поместите животное на спину и тампон кожи на животе с 70% алкоголя. Хирургическими ножницами откройте грудную полость и разоблачите сердце. Вставьте 25 G иглу (прилагается к 3 мл шприца) в левый желудочек и осторожно нанесите отрицательное давление на шприц поршень. Снять иглу после того, как кровь была собрана.
      3. Выполните вторичный метод эвтаназии, такой как обезглавливание или вывих шейки матки, чтобы убедиться, что животное умер.
      4. Нажмите поршень шприца вниз и вводить собранную кровь в 1,5 мл флакон. Разрешить крови сгусток в течение 30-60 мин на RT, а затем центрифуги его в течение 10 минут при 2000 х г в 4 C охлажденной центрифуги.
      5. Используя чистую технику пипетки, соберите сыворотку в новый флакон с этикеткой 0,5 мл. Немедленно заморозить флакон сыворотки на -80 градусов морозильник.

2. Анализ белка

  1. Используйте предпочтительный метод, например, технологию Luminex, для количественной оценки целевого белка (ы) и альбумина в соответствующих образцах сыворотки и CSF.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь приводится пример с магнитной технологией Luminex, но практически любой метод, который измеряет количество белка, в том числе фермент-связанных иммуносорбентных анализов (ELISAs), могут быть применены к текущему протоколу. В идеале, CSF и сыворотки образцы запускаются как для альбумина и целевых белков на той же платформе. Условия асссея должны быть оптимизированы для важных шагов в протоколе, таких как концентрация сцепления антиген-бисера, разбавления образцов сыворотки и CSF, наиболее подходящие стандартные кривые для каждого анализа и буферный состав для уменьшения неспецифической реактивности. Если коммерческий комплект используется для измерения белка (ы), например, набор изотипификации иммуноглобулина (Таблица материалов) используется для получения данных, представленных вРисунок 3, инструкции производителей должны быть выполнены.
    1. При оттаивании и до анализа, центрифуга CSF и сыворотки образцов (2000 х г в течение 10 мин) и использовать супернатант, чтобы предотвратить засорение фильтра пластин и / или зонда. Следуйте процедуре ассеа, предоставленной комплектом для соответствующего разбавления образцов. В противном случае определите соответствующее разбавление для каждого анализа и жидкости. Разбавить образцы в PBS соответственно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если нет конкретных указаний или инструкций, разбавления для каждого анализа и жидкости должны быть установлены до проведения исследования, путем определения соответствующих диапазонов разбавления, необходимых для получения оценок концентрации, которые подпадают под наиболее надежный диапазон стандартной кривой. Зная характеристики биологического образца для анализа, например, физиологические и патологические концентрации в жидкости, позволяет пробовать различные разбавления с образцами низкого, среднего и высокого содержания анализа. Если ожидаемый диапазон концентраций в образцах известен априори, разбавления могут быть выбраны после расчета, сколько раз образец должен быть разбавлен, чтобы быть в пределах выбранного стандартного диапазона кривой.
      ПРЕДЕСЛЕНгИЯ: Вычисляя факторы разбавления, помните, что CSF уже разбавлен 1:3.
    2. Подготовьте стандартную кривую для каждого интересующего белка, например, альбумина и IgG, используемую для генерации данных на рисунке 3,путем последовательного разбавления эталонных стандартных белков. Во время подготовки стандартных кривых тщательно перемешайте каждую более высокую концентрацию перед следующим разбавлением.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Независимо от выбранного метода количественной оценки, важно включать стандартную кривую каждый раз, когда анализ выполняется для оценки концентрации белка (ы) в образцах. Лучшим выбором для эталонного стандарта является очищенная, известная концентрация интересуемого белка. Решение о конкретных разбавлениях, а также количество точек данных и репликаций, используемых для определения стандартной кривой, зависит от степени нелинейности в стандартной кривой.
    3. Выберите подходящие наборы из магнитного биса, связанного с антителами(Таблица материалов). Для отдельных флаконов из бисера, sonicate каждый флакон для 30 с и вихрь в течение 1 мин. Подготовка "рабочий шарик смеси" путем разбавления запасов бисера до окончательной концентрации 50 шариков каждого набора / Л в обзоре / мытье буфера (PBS, 1% бычьей сыворотки альбомов "BSA"). Добавьте 50 кл смешанных шариков к каждому колодцу в плоской нижней 96-хорошо пластины(Таблица материалов).
      ВНИМАНИЕ: флуоресцентные бусы светочувствительны. Таким образом, они должны быть защищены от длительного воздействия света на протяжении всей процедуры.
    4. Диаграмма размещения фонов, стандартов и образцов на листе карты скважины.
    5. Добавьте 50 юл буфера асссея/мытья к каждому фону скважины и 50 кЛ каждого стандарта к скважинам для стандартной кривой. Загрузите 50 мл каждого разбавленного образца в соответствующие скважины в последнюю силу. Оберните тарелку фольгой и нависните с возбуждением (800 об/мин) на шейкере на 30 мин на РТ.
    6. Поместите пластину на портативный магнит(Таблица материалов) и остальные пластины на магнит для 60 с, чтобы обеспечить полное установление магнитных бусинок. Удалите содержимое скважины, аккуратно декантируя пластину и кран пластины на абсорбирующие прокладки, чтобы удалить остаточную жидкость.
    7. Вымойте пластину, удалив его из магнита, добавив 200 злицита / мыть буфера, встряхивая для 30 с, и, наконец, прикрепив его к магниту. Повторите стирку 3x.
    8. Разбавить биоинтинилафтированных антител обнаружения, т.е. биотин-маркированные антитела, поднятые против белковых видов хозяина, до 4 мкг/мл в анализе / мыть буфер. Добавьте 50 зл разбавленных антител обнаружения к каждому колодцу. Накройте тарелку и инкубировать в течение 30 минут на RT на тарелке шейкер на 800 евро в минуту. Поместите пластину на магнит и повторите шаги 2.1.6 и 2.1.7.
    9. Разбавленный фикоэритрин (PE)-конъюгированный стрептавидин (SAPE) до 4 мкг/мл в буфере асссе/мытья. Добавьте 50 л разбавленного SAPE к каждой скважине. Накройте тарелку и инкубировать в течение 30 минут на RT на тарелке шейкер на 800 евро в минуту. Поместите пластину на магнит и повторите шаги 2.1.6 и 2.1.7.
    10. Снимите пластину с магнита и resuspend шарики в 100 зл исссечения / мыть буфера. Читайте скважины с двойным лазерным прибором обнаружения потока, который позволяет обнаруживать величину интенсивности ФЛуоресценции PE (FI).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сигнал, например, FI, генерируемый пропорционально количеству целевого антигена, прикрепленного к поверхности бисера.
    11. Экспортировать необработанные данные и создавать стандартные кривые, нагноивая сигнал обнаружения FI по сравнению со стандартными концентрациями белка. Используйте стандартную кривую (ы) для расчета концентрации аналита (ы) в образцах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Альбумин преимущественно выражается в g/dL, в то время как белки, представляющие интерес, преимущественно выражены в мг/дл.

3. Расчеты внутрииндексного индекса

  1. Организуйте значения концентрации белка в электронную таблицу и проанализируйте результаты, применяя следующие формулы.
  2. Рассчитайтеи альбумин:
    Equation 1
    где csFальбумин и сывороточныйальбумин являются концентрации альбумина в соответствующих образцов сыворотки и CSF, соответственно.
  3. Рассчитайтебелок:
    Equation 2
    гдебелок CSF ибелок сыворотки являются концентрациями целевого белка (ы) в соответствующих образцах сыворотки и CSF, соответственно.
  4. Рассчитайте индекс белка:
    Equation 3

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Этот репрезентативный эксперимент был направлен на сравнение внутриклеточного синтеза IgG в двух клинически значимых моделях грызунов рассеянного склероза (МС): PLP139-151-индуцированныйрецидивирующий экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (R-EAE) и хронический прогрессивный, вирус энцефаломиелит аиР. R-EAE является полезной моделью для понимания повторного ремиттирующего MS, в то время как модель TMEV-IDD имеет хронический прогрессивный MS19.

Для настоящего исследования был проведен количественный анализ внутритекового синтеза IgG в R-EAE (n No 12) и TMEV-IDD (n No 28). Обе группы были проанализированы на пике их заболевания. Дополнительная группа из 10 мышей подверглась фиктивной обработке и служила возрастной контрольной группой (cR-EAE n No 4, cTMEV-IDD sham n no 6).

Магнитный бисер на основе подхода с коммерчески доступным комплектом (Таблица материалов) был использован для измерения общего IgG в соответствие с сыворотки и CSF образцов. Общая стоимость IgG была получена из суммы значений подкласса IgG1, IgG2a, IgG2b и IgG3. Альбумин был измерен с коммерческой мыши альбумин ELISA комплект (Таблица материалов), потому что Luminex анализа для альбумина не было доступно в то время. Все измерения проводились тщательно по указанию производителей. Коэффициент альбумина(яблочник)и индекс IgG (яп.igG/ qalbumin)были затем использованы для дифференцирования крови по сравнению с ЦНС-производным IgG в CSF.

Как показано на рисунке 3A, фактические уровни общего IgG значительно увеличены в CSF обеих моделей грызунов MS по сравнению с соответствующими возрастных шам-контроля(стр. 0,026). Тем не менее, мышами R-EAE показывают значительно улучшенные значенияальбумина 0.019), что указывает на повышенную проницаемость барьера у этих мышей(рисунок 3B). И наоборот, никаких различий вальбумине не существует между TMEV-IDD и фиктивными мышами(стр. 0,49), тем самым подтверждая наше предыдущее нахождение нетронутого барьера в мышах TMEV-IDD7,8. Для дальнейшего дискриминировать трансудат и интратэколли производства IgG в R-EAE и TMEV-IDD, индекс IgG был измерен, показывая значительно более высокие значения в TMEV-IDD мышей(стр. 0,0006), и, следовательно, внутриклеточный IgG производства в этой модели (Рисунок 3C).

Нетронутый барьер в tmEV-IDD мышей наряду с высоким индексом IgG предполагает, что в этой модели, антитела производится в ЦНС. И наоборот, в R-EAE, значительный прорыв барьера и низкий индекс IgG свидетельствуют о том, что CSF IgG в основном производится периферических, а не внутриклеточными клетками B, также предполагая, что в этой острой модели MS, CSF IgG в основном происходит от сыворотки.

Figure 1
Рисунок 1: Ретро-орбитальное кровотечение мышей. Слева: правильное размещение иглы относительно ретро-орбитальной синусовой, глазного яблока и задней части орбиты. Справа: Расположение Пипетты начинается в медиальной кантоне глаза и скользит к дорсальном аспекту орбиты. Капилляр вставляется под углом 45 градусов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Коллекция CSF у мышей. (A) Ухо баров поддержки головы мыши, и мышь кладется так, что голова образует 135 "угол с телом. Стрелка указывает на открытые цистерны magna. (B) По тупой вскрытия с щипками, мышцы разделены подвергать цистерны magna (указал на стрелку). Микроретракторы используются для удержания мышц друг от друга. (C) Небольшая стеклянная капиллярная трубка используется для сбора CSF из цистерны magna. CSF самопроизвольно вливается в капилляр из-за внутричерепного давления. Стрелка указывает на собранный CSF в капилляре. (D) CSF передается в трубку 0,5 мл через модифицированный 3 мл шприца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Функция кроветворного барьера и внутритекаменной синтез igG в R-EAE и TMEV-IDD. Dot пятно, представляющие (A) уровни CSF общего IgG (мг / дл) измеряется Luminex технологии, (B) альбумин CSF / сыворотки коэффициентов (яальбумин), и(( C ) IgG индексы (ЯIg/й альбумин) в R-EAE и TMEV-IDD мышей, а также возрастных контрольных мышей (cR-EA. Горизонтальные линии представляют среднее значение для этой группы. р Злт; 0.0001; р Злт; 0,001; п. з.л.; 0,01; -стр. 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Количественные методы оценки повышенной концентрации белка CSF являются полезными инструментами в характеристике физиологического и патологического состояния ЦНС. Однако, помимо надежной количественной оценки уровней белка CSF, обнаружение белков CSF требует выражения результатов, которые различают кровяные и цНС-производные фракции в CSF. Однако, на сегодняшний день, широко используемые анализы количественной оценки белка не позволяют дискриминации между двумя белковыми компонентами, даже с помощью инструментов с высокой пропускной стоимостью. Таким образом, были предложены конкретные корректировки измерений белка для того, чтобы различать белки, синтезированные в отсеке ЦНС, и белки, полученные из крови. Такие коррекции компенсируют индивидуальную изменчивость как концентрации сыворотки, так и барьерную целостность. В целом, эти коррекции основаны на расчетах коэффициента CSF/сыворотки(я. белок),который снижает изменчивость из-за различий в индивидуальной концентрации белка сыворотки. Вариациябелка, связанного с индивидуальными различиями в функции барьера, может быть дополнительно снижена, связавбелок с коэффициентом csF/сыворотки альбумина (qalbumin). Комбинация обеих коррекций, как правило, известна как индекс белка и рассчитывается какбелок/альбумин соотношение4,6.

Альбумин, синтезированный и выделяемый печенью, является основным белка плазмы, который циркулирует в крови. Поскольку альбумин производится исключительно за пределами ЦНС и его уровни в CSF являются низкими (0,15 г/дл), повышение уровня альбумина CSF указывает либо на повреждение BBI, либо на заражение крови из-за внутрифекционного кровоизлияния или травматического собрания CSF. В любом из этих условий альбумин трансудатирует из сыворотки в CSF пропорционально концентрации сыворотки. Таким образом, при отсутствии заражения крови,альбумин может быть использован в качестве индикатора барьерной функции20. И наоборот,альбумин остается неизменным в пределах нормальных диапазонов у людей и животных с нетронутыми BBI21. Фундаментальное предположение для использования этого фактора4,6 в расчете синтеза внутритебного белка заключается в том, что увеличение количества белка CSF в присутствии вытекающей барьер пропорциональна увеличению концентрации альбумина CSF. Это предположение было экспериментально подтверждено в исследовании 19774, в котором авторы отслеживали у пациентов с рассеянным склеёром прохождение крови и CSF радиомаркированных IgG и альбумина, полученных из здоровой человеческой сыпи.

Как и в альбумине, любой белок в крови может пересекать BBI. Когда барьер не поврежден,белок кон относительно констант. В отличие от альбумина, однако, многие белки также могут быть синтезированы в рамках ЦНС. Как следствие, измененныйбелок может возникнуть в результате повреждения барьера и/или увеличения внутритекового белка. Тем не менее, когда повышенная концентрация белка CSF обусловлена только скомпрометированным BBI, значения длябелка иальбумина увеличиваются, по сравнению со значениями для этих же коэффициентов у животных с нетронутым барьером. В отличие от этого, когда барьер не поврежден, увеличение концентрации белка CSF, скорее всего, из-за увеличения внутритекового синтеза, и толькобелок q в конечном счете увеличивается.

Использование индекса белка может быть частично ограничено пятью факторами: 1) большая изменчивость концентрации альбумина CSF у здоровых животных, 2) различный гидродинамический радиус белков, 3) эндогенное выражение ЦНС белков, 4) различные методы отбора проб и 5) морфологические различия BBI. Большая изменчивость концентрации альбумина CSF у здоровых животных приводит к значительной изменчивости значений для конечного индекса белка. Например, у людейальбумин является возрастным, так как он увеличивается с22лет. В предыдущем докладе также упоминается секс-различия вальбумин у здорового населения23. Аналогичным образом, у мышей альбумин концентрации зависят от возраста и мыши штамм24, например,альбумин для молодых, мужчин, C57Bl/6 мышей может отличаться отальбумина для старых, женщин, DBA/1J мышей. Поэтому стандартизированные справочные интервалы для барьерной целостности не могут быть установлены между видами и внутри них, и соответствующие пороговые значения должны быть рассчитаны на основе конкретных экспериментальных условий.

Другим фактором, вызывающим изменчивость нормальных индексов среди белков, является их молекулярный размер. Прохождение белков сыворотки через BBI зависит от их молекулярного размера, и корреляция между скоростью клиренса и молекулярным весом (MW) широко используется для оценки проницаемости BBI. Общие белковые структуры варьируются в размерах от десятков до нескольких тысяч аминокислот. Некоторые белки имеют относительно небольшой молекулярный размер, такие как хемокины, с молекулярным весом от 8 до 20 кДа. Такой низкий МВт способствует пересечению BBI, в конечном счете, в результате чего более высокие нормальные индексы белка. По-разному, другие протеины, как IgM, очень большие (900-950 kDa), поэтому показывают очень низкие индексы в нормальных условиях6. Однако, это не всегда так, так как, несмотря на аналогичные МВт, некоторые белки пронизывают барьер гораздо лучше, чем другие белки, возможно, из-за другой формы. Таким образом, коэффициент диффузии белка, а значит, и гидродинамические радиусы, рассчитанные из него, зависят как от размера, так и от формы молекул25. Фундаментальное различие между геометрическим и гидродинамическим объемом белка становится наиболее очевидным при больших белках выше 150 кДа. Снижение темпов расчистки, например, керуполазмина (132 кДа), IgG (150 kDa) и IgA (150 kDa) отражает гидродинамическую неоднородность этих трех белков, которые имеют аналогичные MW25. Также возможно, что внутритекачее производство белков при нормальных обстоятельствах. Некоторые хемокины, например, CXCL10, как правило, производятся интратеколли, в то время как другие, например, CXCL13, не26,27. Это означает, что интерпретация белковых индексов в большинстве экспериментальных условий обычно требует анализа возрастных, половых и ссожных необработанных элементов управления.

Уровни белка в жидкостях также могут быть затронуты различными методами отбора проб. Хотя это не может быть проблемой для коллекции CSF, как описано здесь- нет никаких различий в выборке CSF между описанными процедурами выживания и невыживания, различные методы сбора крови могут оказать влияние на общее количество белка сыворотки. Некоторые методы сбора крови дают артериальную кровь, другие дают венозную кровь, в то время как другие дают смесь как14. Образец, полученный из выживаемого ретро-орбитального кровотечения, представляет собой смесь венозной крови и тканевой жидкости, в то время как неизлечимый сбор крови из сердечного прокола может дать венозную или артериальную кровь или смесь обоих14. У здоровых животных, общее содержание белка и альбумина артериальной сыворотки крови может быть немного выше, чем те же фракции венозной сыворотки крови28. Это следует принимать во внимание при сравнении образцов выживания и невыживания.

Наконец, важной особенностью для рассмотрения является неоднороденная морфологическая структура BBI, которая включает в себя по крайней мере два различных барьеров, гематоэнцефалический барьер (BBB), расположенный в эндотелии микрососудов мозга и крови CSF барьер (BCSF), расположенный в эпителии сотлика29. Оба барьера ограничивают и регулируют прохождение молекул и клеток между периферийными и спинномозговой отсеками, хотя они делают это различными механизмами. В то время как BBB является реальным физическим барьером, характеризующимся сложным взаимодействием между клетками, BCSF является скорее физиологическим барьером, который в основном зависит от потока CSF. Снижение производства CSF, релиз, и скорость потока из-за неврологических заболеваний и / или травмы ухудшают функцию BCSF, тем самым увеличиваяй альбумин9,30,31,32. Таким образом,альбумин служит лучшим маркером проницаемости BCSF, а не BBB или вообще проницаемости BBI.

Таким образом, расчет индекса белка является относительно простым и хорошо охарактеризованным методом дискриминации между трансудатиями и интратеколли, вырабатываемыми белками. Преимущество применения этой формулы для коррекции общего измерения белков в образцах CSF состоит в том, что она генерирует объективную переменную для количественной оценки внутритебного синтеза белков и измерения BBI, в частности BCSF, (dys)function. Учитывая надежность этого подхода, коррекция количества белка CSF черезальбумин и протеиновый индекс q обеспечивает базовый уровень, на основе которого можно оценить (1) патофизиологическом уходе любого белка CSF и (2) стабильность и функциональное значение барьерной целостности. Здесь представлен подробный протокол, от CSF и сбора крови до окончательных расчетов коррекции общего количества белка CSF, который применяется к моделям мыши для неврологических заболеваний. Однако, тот же протокол может быть легко адаптирован к изучению CSF и внутритебного синтеза белков у любого животного, включая человека. Индексальбумина и IgG уже широко используется в клинической практике для диагностики воспалительных неврологических заболеваний6. Эти же параметры также успешно используются для оценки широкого спектра цитокинов и хемокинув у пациентов с воспалительными демиелинизирующихзаболеваниями 26,33,34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы благодарят сотрудников Центра сравнительной медицины и исследований (CCMR) в Дартмуте за их экспертную заботу о мышах, используемых для этих исследований. Научно-исследовательский фонд Борнштейна финансировал это исследование.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL insulin syringe BD 329650
1 mL syringe BD 329622
25 gauge needle BD 305122
3 mL syringe BD 309582
30 gauge insulin needle BD 305106
Absorbent pads Any suitable brand
Acepromazine Patterson Vet Supply Inc
BioPlex Handheld Magnetic Washer BioRad 171020100 Magnet
BioPlex MAGPIX Multiplex Reader BioRad 171015001
BioPlex Pro Flat Bottom Plates BioRad 171025001
Biotinilated detection antibody Any suitable source The antibody has to be directed against the species of the protein of interest.
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A4503
Buprenorphine hydrochloride PAR Pharmaceutical NDC 42023-179-05
Capillary Tubes Sutter Instrument B100-75-10 OD: 1.0 mm, ID: 0.75 mm Borosilicate glass 10 cm; drawn over Bunsen to make ID smaller.
Centrifuge tube, 0.2 mL VWR 20170-012
Centrifuge tube, 0.5 mL VWR 87003-290
Centrifuge tube, 1.5 mL VWR 87003-294
Chlorhexidine diacetate Nolvasan E004272
Disposable pipettes tips Any suitable brand
Ear bars KOPF Instruments 1921 or 1922
Ethanol Kopter V1001
Freezer VWR VWR32086A
Gauze Medline NON25212
Heating pad Sunbeam XL King Size SoftTouch, 4 Heat Settings with Auto-Off, Teal, 12-Inch x 24-Inch
Induction Chamber VETEQUIP
Isoflurane Patterson Vet Supply Inc NDC 14043-704-06
Ketamine (KetaVed) Patterson Vet Supply Inc
MagPlex Microspheres (antibody-coupled) BioRad Antibody-coupled magnetic bead
Microplate Shaker Southwest Scientific SBT1500
Microretractors Carfill Quality ACD-010 Blunt - 1 mm
Microsoft Office (Excel) Microsoft
MilliPlex MAP Mouse Immunoglobulin Isotyping Magnetic Bead Panel EMD Millipore MGAMMAG-300K Commercial kit for the quantification through Luminex of a panel of immunoglobulin isotypes and subclasses in mouse fluids.
Mouse Albumin capture ELISA kit Novus Biological NBP2-60484 Commercial kit for the quantification through ELISA of albumin in mouse fluids.
Multichannel pipette Eppendorf 3125000060
Non-Sterile swabs MediChoice WOD1002 Need to be autoclaved for sterility
Oxygen AIRGAS OX USPEA
Pasteur Pippettes Fisher 13-678-20A 5 & 3/4"
PDS suture with disposable needle, 6-0 Prolen Patterson Vet 8695G P-3 Reverse Cutting, 18"
PE-Streptavidin BD Biosciences 554061
Pipetters Eppendorf Research seriers
Polyethylene tubing
Refrigerated Centrifuge Beckman Coulter ALLEGRA X-12R
Scale Uline H2716
Scalpel Feather EF7281
Shaver Harvard Apparatus 52-5204
Standard proteins Any suitable source The best choice for a reference standard is a purified, known concentration of the protein of interest.
Stereotaxic instrument KOPF Instruments Model 900LS Standard Accessories
Sterile 1 x PBS Corning Cellgro 21-040-CV
Sterile saline Baxter 0338-0048-02 0.9 % Sodium Chloride Irrigation USP
Surgical Forceps Curved, 7 (2) Fine Science Tools 11271-30 Dumont
Surgical Scissors Fine Science Tools 14094-11 Stainless 25x
Vaporizer + Flow meter Moduflex Anhestesia Instruments
Vortex Fisher 02-215-414
Warming pad Kent Scientific Corporation RT-JR-20
Water Sonicator Cole Parmer EW-08895-01
Xylazine Patterson Vet Supply Inc

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Whedon, J. M., Glassey, D. Cerebrospinal fluid stasis and its clinical significance. Alternative Therapies in Health and Medicine. 15, (3), 54-60 (2009).
  2. Kang, J. H., Vanderstichele, H., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M. Simultaneous analysis of cerebrospinal fluid biomarkers using microsphere-based xMAP multiplex technology for early detection of Alzheimer's disease. Methods. 56, (4), 484-493 (2012).
  3. Barro, C., et al. Fluid biomarker and electrophysiological outcome measures for progressive MS trials. Multiple Sclerosis. 23, (12), 1600-1613 (2017).
  4. Tourtellotte, W. W., et al. Multiple sclerosis: measurement and validation of central nervous system IgG synthesis rate. Neurology. 30, (3), 240-244 (1980).
  5. Bonnan, M. Intrathecal IgG synthesis: a resistant and valuable target for future multiple sclerosis treatments. Multiple Sclerosis International. 2015, 296184 (2015).
  6. Reiber, H. Cerebrospinal fluid--physiology, analysis and interpretation of protein patterns for diagnosis of neurological diseases. Multiple Sclerosis. 4, (3), 99-107 (1998).
  7. DiSano, K. D., Linzey, M. R., Royce, D. B., Pachner, A. R., Gilli, F. Differential neuro-immune patterns in two clinically relevant murine models of multiple sclerosis. Journal of Neuroinflammation. 16, (1), 109 (2019).
  8. Pachner, A. R., Li, L., Lagunoff, D. Plasma cells in the central nervous system in the Theiler's virus model of multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology. 232, (1-2), 35-40 (2011).
  9. Reiber, H. Flow rate of cerebrospinal fluid (CSF)--a concept common to normal blood-CSF barrier function and to dysfunction in neurological diseases. Journal of Neurological Sciences. 122, (2), 189-203 (1994).
  10. Reiber, H., Zeman, D., Kusnierova, P., Mundwiler, E., Bernasconi, L. Diagnostic relevance of free light chains in cerebrospinal fluid - The hyperbolic reference range for reliable data interpretation in quotient diagrams. Clinica Chimica Acta. 497, 153-162 (2019).
  11. Reiber, H., Felgenhauer, K. Protein transfer at the blood cerebrospinal fluid barrier and the quantitation of the humoral immune response within the central nervous system. Clinica Chimica Acta. 163, (3), 319-328 (1987).
  12. Dorta-Contreras, A. J. Reibergrams: essential element in cerebrospinal fluid immunological analysis. Revista de Neurologia. 28, (10), 996-998 (1999).
  13. Metzger, F., Mischek, D., Stoffers, F. The Connected Steady State Model and the Interdependence of the CSF Proteome and CSF Flow Characteristics. Frontiers Neuroscience. 11, 241 (2017).
  14. Wolforth, J. Methods of blood collection in the mouse. Laboratory Animals. 29, 47-53 (2000).
  15. Liu, L., Duff, K. A technique for serial collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in mouse. Journal of Visualized Experiments. (21), e960 (2008).
  16. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), e2771 (2012).
  17. Johnston, S. A., Tobias, K. M. Veterinary Surgery: Small Animal Expert Consult - E-Book. Elsevier Health Sciences. (2017).
  18. Nigrovic, L. E., Shah, S. S., Neuman, M. I. Correction of cerebrospinal fluid protein for the presence of red blood cells in children with a traumatic lumbar puncture. Journal of Pediatrics. 159, (1), 158-159 (2011).
  19. McCarthy, D. P., Richards, M. H., Miller, S. D. Mouse models of multiple sclerosis: experimental autoimmune encephalomyelitis and Theiler's virus-induced demyelinating disease. Methods in Molecular Biology. 900, 381-401 (2012).
  20. Link, H., Tibbling, G. Principles of albumin and IgG analyses in neurological disorders. II. Relation of the concentration of the proteins in serum and cerebrospinal fluid. Scandinavian Journal of Clinical Laboratory Investigation. 37, (5), 391-396 (1977).
  21. Tibbling, G., Link, H., Ohman, S. Principles of albumin and IgG analyses in neurological disorders. I. Establishment of reference values. Scandinavian Journal of Clinical Laboratory Investigation. 37, (5), 385-390 (1977).
  22. Deisenhammer, F., et al. Guidelines on routine cerebrospinal fluid analysis. Report from an EFNS task force. European Journal of Neurology. 13, (9), 913-922 (2006).
  23. Johanson, C. E., Stopa, E. G., McMillan, P. N. The blood-cerebrospinal fluid barrier: structure and functional significance. Methods in Molecular Biology. 686, 101-131 (2011).
  24. Zaias, J., Mineau, M., Cray, C., Yoon, D., Altman, N. H. Reference values for serum proteins of common laboratory rodent strains. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48, (4), 387-390 (2009).
  25. Felgenhauer, K., Renner, E. Hydrodynamic radii versus molecular weights in clearance studies of urine and cerebrospinal fluid. Annals of Clinical Biochemistry. 14, (2), 100-104 (1977).
  26. Pachner, A. R., DiSano, K., Royce, D. B., Gilli, F. Clinical utility of a molecular signature in inflammatory demyelinating disease. Neurology, Neuroimmunology & Neuroinflammation. 6, (1), 520 (2019).
  27. Pachner, A. R., Li, L., Gilli, F. Chemokine biomarkers in central nervous system tissue and cerebrospinal fluid in the Theiler's virus model mirror those in multiple sclerosis. Cytokine. 76, (2), 577-580 (2015).
  28. Gerbi, C. Protein concentration in the arterial and venous renal blood serum of the rabbit. Archives of Biochemistry and Biophysics. 31, (1), 49-61 (1951).
  29. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37, (1), 13-25 (2010).
  30. Reiber, H. Proteins in cerebrospinal fluid and blood: barriers, CSF flow rate and source-related dynamics. Restorative Neurology and Neuroscience. 21, (3-4), 79-96 (2003).
  31. Reiber, H. Knowledge-base for interpretation of cerebrospinal fluid data patterns. Essentials in neurology and psychiatry. Arquivos de Neuropsiquiatria. 74, (6), 501-512 (2016).
  32. Kuehne, L. K., Reiber, H., Bechter, K., Hagberg, L., Fuchs, D. Cerebrospinal fluid neopterin is brain-derived and not associated with blood-CSF barrier dysfunction in non-inflammatory affective and schizophrenic spectrum disorders. Journal of Psychiatric Research. 47, (10), 1417-1422 (2013).
  33. Bromader, S., et al. Changes in serum and cerebrospinal fluif cytokines in response to non-neurological surgery: an observational study. Journal of Neuroinflammation. 9, 242 (2012).
  34. Starhof, C., et al. Cerebrospinal fluid pro-inflammatory cytokines differentiate parkinsonian syndromes. Journal of Neuroinflammation. 15, (1), 305 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics