एनएफ-बी-निर्भर लूसिफ़ेरास सक्रियण और साल्मोनेला संक्रमित ऊतक संस्कृति कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति की मात्रा

Immunology and Infection

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Summary

यहां, हम एनएफ-बी को व्यक्त करने वाली सेल लाइनों में सक्रिय बी कोशिकाओं (एनएफ-बी) सक्रियण के परमाणु कारक कापा-लाइट-चेन-एन्हांसमेंट को जल्दी और आसानी से मापने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं:: ल्यूसिफ़ेरे रिपोर्टर का निर्माण, सेल लाइसेट में ल्यूमिनेस के माप के माध्यम से। इसके अतिरिक्त, जीन अभिव्यक्ति साल्मोनेला टाइथिमुरीम से संक्रमित कोशिकाओं से अलग आरटी-क्यूपीसीआर के माध्यम से निर्धारित की जाती है।

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Mendez, J. M., Keestra-Gounder, A. M. NF-κB-dependent Luciferase Activation and Quantification of Gene Expression in Salmonella Infected Tissue Culture Cells. J. Vis. Exp. (155), e60567, doi:10.3791/60567 (2020).

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Abstract

डिमेरिक ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर एनएफ-बी कई सेलुलर रिस्पांस पाथवे को नियंत्रित करता है, जिसमें विभिन्न साइटोकिन्स और केमोकिन्स की अभिव्यक्ति को प्रेरित करके भड़काऊ रास्ते शामिल हैं। एनएफ-बी बी कोशिकाओं अवरोधक, अल्फा (IοBαα) में कापा प्रकाश पॉलीपेप्टाइड जीन बढ़ाने वाले अवरोधक प्रोटीन परमाणु कारक द्वारा साइटोसोल में संविलियन व्यक्त किया जाता है और इसे तनहा किया जाता है। एनएफ-बी के सक्रियण के लिए IfBα के क्षरण की आवश्यकता होती है, जो तब एनएफ-बी पर परमाणु स्थानीयकरण संकेत को उजागर करता है और नाभिक के लिए अपनी तस्करी को बढ़ावा देता है। एक बार नाभिक में, एनएफ-बी बी अपनी अभिव्यक्ति को बढ़ावा देने के लिए, इंटरल्यूकिन 6 (आईएल-6) और आईएल-23 जैसे एनएफ-ए-बी लक्ष्य जीन के प्रचार क्षेत्र से बांधता है।

एनएफ-बी की सक्रियता प्रतिलेखन या अनुवाद से स्वतंत्र रूप से होती है। इसलिए, एनएफ-बी बी की सक्रियता स्थिति को या तो एनएफ-बी बी को विशेष रूप से नाभिक में, या एनएफ-बी लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति की मात्रा निर्धारित करके मापा जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में, कोशिकाओं को एक NF-inB से छेड़छाड़: ल्यूसिफ़ेरेस रिपोर्टर निर्माण इन विट्रो ऊतक संस्कृति तकनीकों का उपयोग कर एनएफ-बी सक्रियण के लिए परखे हैं। ये कोशिकाएं एनएफ-बी को सक्रिय करने के लिए साल्मोनेला टाइथिमुरियम से संक्रमित हैं, जो नाभिक के लिए यातायात करती है और लूसिफ़ेरेज़ के प्रमोटर क्षेत्र में साइटों को बांधती है, जो इसकी अभिव्यक्ति को प्रेरित करती है। कोशिकाओं को लूसिफ़ेरेज़ परख प्रणाली के साथ विश्लेषण किया जाता है और विश्लेषण किया जाता है। कोशिकाओं द्वारा उत्पादित लूसिफ़ेरेज़ की मात्रा ल्यूमिनेसेंस सिग्नल की तीव्रता से संबंधित है, जिसका पता प्लेट रीडर द्वारा लगाया जाता है। इस प्रक्रिया द्वारा उत्पन्न ल्यूमिनेसेंस सिग्नल एक त्वरित और अत्यधिक संवेदनशील विधि प्रदान करता है जिसके द्वारा कई शर्तों के तहत एनएफ-बी सक्रियण का आकलन किया जाता है। यह प्रोटोकॉल जीन अभिव्यक्ति के संकेत देने वाले सापेक्ष एमआरएनए स्तरों का पता लगाने के लिए मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर (आरटी-क्यूपीसीआर) का भी उपयोग करता है।

Introduction

प्रोटीन का न्यूक्लियर फैक्टर-बी (एनएफ-बी) परिवार महत्वपूर्ण ट्रांसक्रिप्शन एक्टिवेटर है जो विभिन्न जैविक रास्तों में जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करता है । एनएफ-बी की सक्रियता लक्ष्य जीन के प्रतिलेखन को प्रेरित करती है, जिनमें से कई प्रतिरक्षा और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं, कोशिका प्रसार, तनाव प्रतिक्रियाओं और कैंसर प्रगति1,2के लिए महत्वपूर्ण हैं। एनएफ-बी रोगजनक निकासी के लिए प्रारंभिक भड़काऊ परिणामों की मध्यस्थता करने में एक अभिन्न भूमिका निभाता है। एनएफ-बी सक्रियण द्वारा मध्यस्थता की गई कई जैविक प्रक्रियाओं को देखते हुए, इसके सिग्नलिंग में व्यवधान स्वास्थ्य और रोग के लिए गंभीर परिणाम हो सकते हैं। एनएफ-बी सिग्नलिंग में फंक्शन म्यूटेशन की हानि कई प्रतिरक्षा कमी फेनोटाइप में जुड़ी हुई है, जबकि फंक्शन म्यूटेशन का लाभ बी-सेल लिंफोमा और स्तन कैंसर3सहित कई प्रकार के कैंसर से जुड़ा हुआ है। इसके अतिरिक्त, कई रोगजनकों को उग्रता कारकों की अभिव्यक्तिकेमाध्यम से एनएफ-बी की सक्रियता की स्थिति को सीधे रूप से मिलाना दिखाया गया है4,5,6,7।

एनएफ-बी की सक्रियता को कई चर उत्तेजनाओं का परिणाम माना जाता है जिसमें जीवाणु उत्पादों जैसे लिपोपॉलीसैक्चराइड्स (एलपीएस), फ्लैगेलिन और पेप्टिडोग्लिकन जैसे रोगजनक-संबद्ध आणविक पैटर्न (पीम्प्स) के रूप में जाना जाता है। इन पीम्पों का पता पैटर्न रिकग्निशन रिसेप्टर्स (पीआरआरएस) जैसे टोल-लाइक रिसेप्टर्स (टीएलआर) और नोड जैसे रिसेप्टर्स (एनएलआर) द्वारा लगाया जाता है जिससे एनएफ-बी की सक्रियता और एनएफ-बी-निर्भर भड़काऊ जीन8की एक सरणी की बाद की अभिव्यक्ति होती है। पीएआरपी द्वारा पीआरआर एक्टिवेशन के अलावा अन्य बैक्टीरियल प्रॉडक्ट्स जैसे बैक्टीरियल इफेक्टर प्रोटीन एनएफ-बी की एक्टिवेशन को प्रेरित कर सकते हैं । दिलचस्प बात यह है कि बैक्टीरिया प्रभावक प्रोटीन को भी व्यक्त करते हैं जो एनएफ-बी मार्ग को सक्रिय रूप से क्षीण करते हैं और उनकी रोगजनकता को बढ़ाते हैं, जो प्रतिरक्षा9के एक आवश्यक मध्यस्थ के रूप में एनएफ-बी बी के महत्व को रेखांकित करते हैं।

पांच अलग-अलग उपइकाइयां हैं जो एनएफ-बी डिमर्स बनाती हैं; p50, p52, Rela (p65), RelB और cRel । दो मुख्य एनएफ-बी हेटेरोडिमर पी50: रेला और p52: RelB dimers हैं । सक्रिय एनएफ-बी डिमर्स विभिन्न लक्षित जीन के प्रमोटर और बढ़ाने वाले क्षेत्रों में डीएनए साइटों, जिसे बी साइटों के रूप में जाना जाता है, को बांधते हैं। सामान्य होमोस्टैटिक स्थितियों के तहत, एनएफ-बी निष्क्रिय रहने के लिए इफ्ब प्रोटीन के रूप में जाने जाने वाले अवरोधक प्रोटीन के परिवार के साथ बातचीत करता है। उत्तेजना पर, IaB IinB Kinase (IKK) द्वारा फॉस्फोरेटेड है, जो इसे सर्वव्यापकता के लिए लक्षित करने की अनुमति देता है, और बाद में गिरावट। IinB के क्षरण एक परमाणु स्थानीयकरण संकेत का खुलासा करके एनएफ-बी को सक्रिय करता है । एनएफ-बी बी तब नाभिक में स्थानांतरित हो जाता है, जहां यह लक्ष्य जीन के प्रमोटर क्षेत्र में बी साइटों को बांधता है और प्रतिलेखन10को बढ़ावा देता है। इस प्रकार, एनएफ-बी बी की सक्रियता एनएफ-ए-बी लक्ष्य जीन की एमआरएनए अभिव्यक्ति को नियंत्रित करती है, और इस परिवर्तन को आरटी-क्यूपीसीआर11जैसे आरएनए क्वाटिफिकेशन परख के माध्यम से मापा जा सकता है।

कई तरीके मौजूद हैं और आमतौर पर एनएफ-बी एक्टिवेशन के माप नमाप के लिए उपयोग किए जाते हैं, जिसमें इलेक्ट्रोफोरेटिक मोबिलिटी शिफ्ट परख (ईएमएसए), परमाणु स्थानांतरण और जीन रिपोर्टर परख शामिल हैं। ईएमएसए का उपयोग न्यूक्लिक एसिड के साथ प्रोटीन परिसरों का पता लगाने के लिए किया जाता है। उत्तेजित कोशिकाओं को परमाणु प्रोटीन को अलग करने के लिए आंशिक किया जाता है, जिसमें ट्रांसवेल्ड एनएफ-बी बी शामिल है, जिसे फिर एनएफ-बी बाध्यकारी डोमेन वाले रेडियोलेबल न्यूक्लियोटाइड्स के साथ इनक्यूबेटेड किया जाता है। नमूनों को एक जेल पर चलाया जाता है और 32पी-लेबल वाले न्यूक्लिक एसिड की ऑटोरेडियोग्राफी द्वारा इमेजकिया जाता है। यदि एनएफ-बी प्रोटीन अंश में मौजूद है, तो यह न्यूक्लियोटाइड्स को बांध देगा, जो जेल के माध्यम से धीमी गति से माइग्रेट करेगा और असतत बैंड के रूप में मौजूद होगा। सक्रिय एनएफ-बी (जैसे, अउत्तेजित नियंत्रण कोशिकाओं) की कमी कोशिकाओं के परमाणु अंश कोई बैंड का उत्पादन नहीं करेंगे क्योंकि न्यूक्लियोटाइड्स जेल के अंत तक तेजी से माइग्रेट करते हैं। इस विधि की एक बड़ी खामी यह है कि यह बाइनरी अर्थों में काफी हद तक मात्रात्मक है (यानी, ऑन या ऑफ) और एनएफ-बी बाध्यकारी क्षमता में सार्थक मतभेदों को पर्याप्त रूप से कैप्चर नहीं करता है। इसके अतिरिक्त, यह विधि क्रोमेटिन संरचनाओं पर विचार नहीं करती है जो एनएफ-ए-बी लक्ष्य जीन12,13के लिए कार्यात्मक रूप से महत्वपूर्ण हैं।

पिछली विधि के समान, एक "गैर-शिफ्ट" परख है जिसमें बहु-अच्छी प्लेटों को एनएफ-बी बाध्यकारी अनुक्रम वाले न्यूक्लियोटाइड्स के साथ लेपित किया जाता है। प्रोटीन के परमाणु अंशों के साथ कोशिकाओं के उपचार के बाद, एनएफ-बी कुएं से बंधे न्यूक्लियोटाइड्स को बांध देगा। इसके बाद एंटी-एनएफ-बी एंटीबॉडी जोड़े जाते हैं, जो बाउंड एनएफ-बी के साथ बातचीत करेंगे और एनएफ-बी की मात्रा के आनुपातिक रंग-वेीयमेट्रिक सिग्नल का उत्पादन करेंगे, जो एनएफ-बी एक्टिवेशन की डिग्री का संकेत देता है। यह विधि ईएमएसए पर लाभप्रद है जिसमें इसे रेडियोलेबल न्यूक्लिक एसिड की आवश्यकता नहीं होती है और इसकी तुलना में मात्रात्मक है। हालांकि, इस विधि की एक चेतावनी यह है कि यह फिर से एनएफ-बी लक्ष्य जीन14के क्रोमेटिन राज्यों के बीच अंतर नहीं करता है।

एक अन्य विधि जिसके द्वारा एनएफ-बी सक्रियण का पता लगाया जा सकता है वह क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिसिप्रिटेशन (सीआईपी) द्वारा है, जिससे डीएनए और इंटरैटिंग प्रोटीन फॉर्मलडिहाइड के साथ क्रॉस-लिंक होते हैं और विशिष्ट एंटी-एनएफ-बी एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोप्रिसिपिटेटेड होते हैं। विशिष्ट न्यूक्लियोटाइड टुकड़ों को तब पीसीआर प्रवर्धन या प्रत्यक्ष उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण के माध्यम से शुद्ध और पहचाना जाता है। इस विधि से उत्पन्न परिणाम लक्ष्य जीन के साथ एनएफ-बी बाध्यकारी गतिविधि के अर्ध-मात्रात्मक परिणाम प्रदान करते हैं। हालांकि, परिणाम प्रत्येक चरण15पर निर्धारण की स्थिति और शुद्धिकरण प्रक्रियाओं पर अत्यधिक निर्भर हैं।

परमाणु स्थानांतरण परखों में, कोशिकाओं को एनएफ-बी सक्रियण को प्रेरित करने के लिए प्रेरित किया जाता है और फिर तय किया जाता है। एंटी-पी65 एंटीबॉडी को फिक्स्ड कोशिकाओं में जोड़ा जाता है। वैकल्पिक रूप से, p65 सबयूनिट को फ्लोरोसेंट पेप्टाइड जैसे ग्रीन फ्लोरोसेंट ग्रीन (जीएफपी) के साथ टैग किया जा सकता है। किसी भी मामले में, प्रतिरक्षण सेलुलर वितरण निर्धारित करने के लिए p65 के स्थानीयकरण की इमेजिंग की अनुमति देगा। साइटोसोलिक और परमाणु स्थानीयकृत प्रोटीन के अनुपात को मापने के द्वारा, जांचकर्ता एनएफ-बी के सापेक्ष सक्रियण राज्य का निर्धारण कर सकते हैं। इस विधि की एक खामी यह है कि प्रतिरक्षण तुलनात्मक रूप से समय लेने वाला है, महंगे एंटीबॉडी की आवश्यकता होती है, और अपेक्षाकृत अधिक तकनीकी विशेषज्ञता16की आवश्यकता होती है।

रिपोर्टर जीन आमतौर पर ब्याज के एक जीन के नियामक और अभिव्यक्ति पैटर्न का अध्ययन करने के लिए उपकरण ों का इस्तेमाल किया जाता है । आमतौर पर, रिपोर्टर जीन एक आसानी से पता लगाने योग्य प्रोटीन के लिए एक जीन कोडिंग के लिए जुड़े ब्याज के एक जीन के प्रमोटर अनुक्रम से निर्माण कर रहे हैं । एंजाइमैटिक गतिविधियों, फ्लोरेसेंस, या ल्यूमिनेसेंस गुणों वाले प्रोटीन को आमतौर पर उनकी परखऔर मात्रा निर्धारित करने की क्षमता के लिए चुना जाता है। इस प्रकार, रीड-आउट (उदाहरण के लिए, ल्यूमिनेसेंस, फ्लोरेसेंस) जीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए एक संकेत के रूप में कार्य करता है। इन रिपोर्टर निर्माण ों को विभिन्न सेल प्रकारों में पेश किया जा सकता है, जैसे कि एपिथेलियल कोशिकाएं या मैक्रोफेज।

प्रोटोकॉल में वर्णित एक क्लोन हेला सेल लाइन (HeLa 57A) का उपयोग है जो एक लूसिफ़ेरेस रिपोर्टर से छेड़छाड़ करता है जिसमें इम्यूनोग्लोबुलिन-चेन प्रमोटर क्षेत्र17की तीन प्रतियां होती हैं। लूसिफ़ेरेज़ की अभिव्यक्ति एनएफ-बी की सक्रियता पर निर्भर है, जो कोशिका उत्तेजना के बाद होता है। उत्तेजित कोशिकाओं को आसानी से ल्यूसिफ़ेरेज़ परख किट में प्रदान की जाने वाली सेल लिसिस बफर का उपयोग करके प्रेरित किया जाता है। सेल लाइसेट के एक हिस्से को लूसिफ़ेरेज़ परख बफर के साथ मिलाया जाता है जिसमें लूसिफ़ेरिन होता है। लूसिफ़ेरिन लूसिफ़ेरेज़ का सब्सट्रेट है और लूसिफ़ेरेज़ की उपस्थिति में प्रकाश की पीढ़ी के लिए आवश्यक है। परख बफर को लायसैट के साथ मिलाने के बाद, समाधान ल्यूमिनेसेंस के रूप में जानी जाने वाली प्रक्रिया में प्रकाश उत्सर्जित करेगा। ल्यूमेंस में उत्पादित प्रकाश की मात्रा, लाइसेट में मौजूद लूसिफ़ेरेज़ की मात्रा के आनुपातिक है और एनएफ-बी एक्टिवेशन के उपाय के रूप में कार्य करती है। ल्यूमेन रीडिंग की व्याख्या बेसलाइन एनएफ-बी गतिविधि के लिए खाते में एक अउत्तेजित मानक की तुलना में की जाती है और विश्वसनीय माप के लिए अनुमति देने के लिए संकेत कई मिनट तक स्थिर होता है। इसके अलावा, वाघेला 57A सेल लाइन एक NF-nF-nF-स्वतंत्र-galactosidase रिपोर्टर से छेड़छाड़ से ट्रांसफुटी है । इस रिपोर्टर को संविलियन रूप से व्यक्त किया जाता है, और सेल व्यवहार्यता या सेल संख्या17में भिन्नता के लिए नियंत्रण करने के लिए मापा जा सकता है। लूसिफ़ेरेज़ मूल्यों को तब -गैलेक्टोसिदास मूल्यों में समायोजित किया जा सकता है और अउत्तेजित नियंत्रण कोशिकाओं पर गुना वृद्धि के रूप में सूचित किया जा सकता है।

चूंकि एनएफ-बी बी एनएफ-बी-निर्भर लक्ष्य जीन की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति के लिए जिम्मेदार एक प्रतिलेखन कारक है, इसलिए एनएफ-निर्भर जीन अभिव्यक्ति के लिए नियंत्रण के लिए एक अनुवर्ती प्रयोग मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पॉलीमरेज चेन रिएक्शन है ( आरटी-क्यूपीसीआर) । आरटी-क्यूपीसीआर एक अत्यधिक संवेदनशील तरीका है जिसके द्वारा जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन परिमाण के कई आदेशों पर मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। फेनॉल-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण के माध्यम से आरएनए के लिए उत्तेजित और नियंत्रण कोशिकाओं को काटा जाता है। चरण जुदाई के बाद, आरएनए जलीय परत के प्रमुख घटक के रूप में निकाला जाता है। आरएनए तो उपजी है और एक शुद्ध गोली का उत्पादन करने के लिए धोया जाता है । इस गोली का पुनर्गठन किया जाता है और DNase उपचार के माध्यम से संदूषक डीएनए से आगे साफ किया जाता है। शुद्ध आरएनए तो पूरक डीएनए (सीडीएनए) बनाने के लिए लिखित रिवर्स है। इस सीडीएनए का विश्लेषण मात्रात्मक पीसीआर तकनीकों के माध्यम से किया जा सकता है, जहां जीन अभिव्यक्ति निर्धारित करने के लिए एक विशिष्ट एमआरएनए अनुक्रम की बहुतायत निर्धारित की जाती है। यह तकनीक ट्रांसलेशनल कंट्रोल, पोस्ट ट्रांसलेशनल संशोधन, प्रोटीन बहुतायत या प्रोटीन गतिविधि को स्पष्ट नहीं करती है। हालांकि, कई जीन, विशेष रूप से समर्थक भड़काऊ प्रक्रियाओं में शामिल लोगों को एनएफ-बी के माध्यम से विनियमित किया जाता है और उनकी एमआरएनए बहुतायत उनकी अभिव्यक्ति का संकेत है।

यहां प्रस्तावित विधि एक तेज और सरल तरीके का उपयोग करती है जिसके द्वारा एनएफ-बी सक्रियण का पता सेलुलर lysate के ल्यूमिनेसेंस परख के माध्यम से लगाया जा सकता है। एनएफ-बी लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति के आरटी-क्यूपीसीआर का उपयोग विशेष जीन की अभिव्यक्ति की मात्रा निर्धारित करने के साथ-साथ एनएफ-बी एक्टिवेशन की कार्यात्मक गतिविधि को मान्य करने के लिए किया जा सकता है। इस तरह की प्रणाली के प्रमुख फायदे इसकी सादगी और गति हैं, जो एनएफ-बी सक्रियण को मिलाने वाली शर्तों की एक श्रृंखला की उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देता है। यह प्रोटोकॉल एनएफ-बी को व्यक्त करने वाली अन्य सेल लाइनों के लिए उपयुक्त है:: लूसिफ़ेरेज़ रिपोर्टर, और18को स्थिर रूप से ट्रांससंक्रमित RAW264.7 कोशिकाओं में प्रदर्शित किया गया है। नमूनों को संभालने के लिए आवश्यक समय की मात्रा, सेल लिसिस से शुरू करने के लिए एक ल्यूमिनेसेंस संकेत पैदा करने के लिए, कम से कम है और लगभग एक घंटे की अवधि लेता है। एनएफ-बी के मापके के लिए केवल बुनियादी प्रयोगशाला उपकरणों जैसे अपारदर्शी प्लेटों, ल्यूमिनेसेंस को मापने में सक्षम प्लेट रीडर, और स्प्रेडशीट प्रोग्राम जैसे सरल डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर की आवश्यकता होती है।

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Protocol

1. सेल पासिंग और सीडिंग

  1. एक 75 सेमी2 फ्लास्क में वाला 57A कोशिकाओं को बनाए रखें जिसमें डुल्बेकको के संशोधित ईगल के मीडिया (डीएमईएम) के 10 मिलीएल शामिल हैं, जो 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ पूरक हैं।
  2. एस्पिरेट सेल कल्चर मीडिया और 0.05% ट्राइप्सिन-ईटीए समाधान के 1 मिलील के साथ धोएं। एस्पिरेट ट्रिप्सिन और एक अतिरिक्त 1 mL के साथ बदलें। फ्लास्क को 4-5 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें ताकि कोशिकाओं को फ्लास्क से अलग करने की अनुमति दी जा सके।
  3. सेल संस्कृति मीडिया के 9 mL जोड़ें और धीरे से कुप्पी के नीचे धोने के लिए कई बार कोशिकाओं को उखाड़ फेंकना और एक समरूप निलंबन फार्म ।
  4. पतला HeLa 57A कोशिकाओं 1:6 या 1:8 ताजा मीडिया और बीज में नए flasks में । मार्ग कोशिकाओं जब वे 90% अनुकूल या हर तीन दिन कर रहे हैं और 25% संदेह की एक ंयूनतम पर कोशिकाओं को बनाए रखने.
  5. सेल उत्तेजना से एक दिन पहले, ट्रिपसिनिंग हेला 57A कोशिकाओं और विकास मीडिया के 10 mL में निलंबित । एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग कर निलंबन में कोशिकाओं की गणना और एक ५० मीटर शंकुट्यूब में २.५ x १० कोशिकाओं/mL की अंतिम एकाग्रता के लिए कोशिकाओं को कमजोर करने के लिए विकास मीडिया का उपयोग करें ।
  6. सेल निलंबन के 250 μL (~ 6.25 x 104 कोशिकाओं) एक 48 अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से स्थानांतरित करें। समय-समय पर कैप करें और एक समरूप सेल निलंबन सुनिश्चित करने के लिए शंकुई ट्यूब को चालू करें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाएं कुओं में समान रूप से वितरित करती हैं, इसके लिए प्लेट को धीरे-धीरे साइड पर टैप करें।
  7. प्लेट को 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित करें और कोशिकाओं को रात भर संलग्न और बढ़ने की अनुमति दें।

2. बैक्टीरिया की तैयारी

  1. संक्रमण से दो दिन पहले, पौंड आगर प्लेटों पर साल्मोनेला के लकीर जमे हुए स्टॉक एकल कालोनियों का उत्पादन करने के लिए । प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस सेट करने के लिए एक इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें और रातोंरात विकास की अनुमति दें।
  2. संक्रमण से एक दिन पहले, बाँझ जीवाणु संस्कृति ट्यूबों के लिए lysogeny शोरबा (पौंड) के 3 mL जोड़ें, मीडिया के लिए उपयुक्त एंटीबायोटिक दवाओं को जोड़ने ।
  3. बाँझ टीका पाश का उपयोग करना, लकीर जीवाणु संस्कृतियों से एक ही कॉलोनी लेने और पौंड मीडिया के लिए पाश को छूने । इनोकुलेशन के बाद ट्यूबों को कैप करें और लूप को त्याग दें।
  4. ट्यूबों को 37 डिग्री सेल्सियस, 180 आरपीएम पर सेट किए गए एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में रखें, और रात भर बढ़ने की अनुमति दें।
  5. संक्रमण के दिन, इनक्यूबेटर से रात भर बैक्टीरियल संस्कृतियों को पुनः प्राप्त करें।
  6. उचित होने पर एंटीबायोटिक दवाओं युक्त ताजा पौंड के 3 mL जोड़कर उपसंस्कृति के लिए ट्यूब तैयार करें।
  7. ताजा तैयार मीडिया को रातोंरात बैक्टीरियल कल्चर (1 में 1 इन 1) के 30 माइक्रोन ट्रांसफर करें। ट्यूबों को 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में रखें।
  8. 3 एच ऊष्मायन के बाद, खाली के रूप में सेवा करने के लिए बाँझ पौंड शोरबा के 1 mL को प्लास्टिक क्यूवेट में स्थानांतरित करें। नमूना विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले अन्य क्यूवेट में एलबी के 900 माइक्रोन को स्थानांतरित करें।
  9. बैक्टीरियल सबकल्चर के 100 माइक्रोन को एक क्यूवेट में स्थानांतरित करें जिसमें एलबी का 900 माइक्रोन युक्त हो और मिश्रण करने के लिए कई बार ऊपर और नीचे पिपेट करें। प्रत्येक बैक्टीरियल निलंबन के लिए इसे दोहराएं।
  10. 600 एनएम (ओडी600)की तरंगदैर्ध्य पर बैक्टीरियल संस्कृतियों के ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) को मापने के लिए स्पेक्ट्रोफोटोमीटर चालू करें।
  11. ब्लैंक को स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में रखें। अभिविन्यास पर ध्यान दें, क्योंकि शीर्ष की ओर एक निशान होना चाहिए जो इस तरह का संकेत देता है।
  12. ढक्कन बंद करें और पृष्ठभूमि अवशोषण प्राप्त करने के लिए स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर ब्लैंक बटन दबाएं।
  13. एक ही अभिविन्यास में एक नमूना क्यूवेट के साथ खाली क्यूवेट को बदलें और पढ़ें प्रेसकरें।
  14. इन नमूनों के ओडी600 मूल्यों को रिकॉर्ड करें। कमजोर पड़ने वाले कारक के लिए खाते में 10 से मूल्य गुणा करें।
  15. लगभग 1.0 के अवशोषण मूल्य को प्राप्त करने के लिए ताजा एलबी के साथ बैक्टीरियल उपसंस्कृति को पतला करें, जो मोटे तौर पर 1 x 109 सीएफयू/एमएल के साथ मेल खाती है। इस निलंबन को एक क्यूवेट में 1:10 पतला करें और अवशोषक को मापें - जो ~ 0.1 का मूल्य देना चाहिए।
  16. एक नई ट्यूब में, एक इनोकुलम के रूप में उपयोग किए जाने वाले 1 x 108 सीएफयू/एमएल के निलंबन को प्राप्त करने के लिए ताजा पौंड में पतला उपसंस्कृति की उचित मात्रा जोड़ें।
  17. लगभग 102 सीएफयू/एमएल के अंतिम कमजोर होने तक बाँझ पीबीएस (10 गुना कमजोर पड़ने) के 450 माइक्रोन युक्त ट्यूब पर बैक्टीरियल सस्पेंशन के 50 माइक्रोन को स्थानांतरित करके इनोकुलम के धारावाहिक कमजोरपड़ तैयार करें।
  18. दो सबसे कम कमजोर के 100 μL (102 और 103 क्रमशः 10 और 100 कॉलोनी बनाने इकाइयों के साथ इसी) एक पौंड आगर प्लेट के लिए और एक सेल स्प्रेडर के साथ निलंबन फैल करने के लिए एक कालोनियों प्राप्त करने के लिए । इन प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें और रातोंरात इनक्यूबेट करें।
  19. अगले दिन उपनिवेशों की गिनती और वास्तविक इनोकुलम एकाग्रता निर्धारित करने के लिए प्रारंभिक इनोकुलम की जीवाणु एकाग्रता की गणना करें।

3. कोशिकाओं का संक्रमण

नोट: इस बिंदु पर, कोशिकाओं के बारे में 90% प्रवाह पर होना चाहिए. 48-अच्छी प्लेट में वाला 57A कोशिकाओं के लिए, यह लगभग 1 x 105 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से है। कोशिकाएं 10, या 106 सीएफयू/वेल के संक्रमण (एमओआई) की बहुलता से संक्रमित होंगी।

  1. प्रत्येक अच्छी तरह से उपयोग की जाने वाली संक्रमण स्थितियों के अनुसार प्लेट के ढक्कन को लेबल करें, प्रत्येक स्थिति के साथ ट्रिपललीकेट में किया जा रहा है।
  2. उपयुक्त कुओं में इनोकुलम के 10 माइक्रोन जोड़ें। असंक्रमित नियंत्रण कुओं के लिए बाँझ पौंड के 10 μL जोड़ें ।
  3. संक्रमण के समय को सिंक्रोनाइज करने के लिए, प्लेट को टेबलटॉप अपकेंद्रित्र में रखें और 5 मिन के लिए 500 x ग्राम पर स्पिन करें, यह सुनिश्चित करें कि प्लेट काउंटर संतुलित है।
  4. संक्रमित कोशिकाओं को 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें।
  5. अगले चरण में उपयोग के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में सेल संस्कृति मीडिया का एक बहाना रखें।
  6. संक्रमण के समय के एक घंटे बाद, पानी के स्नान से सेल संस्कृति मीडिया को हटा दें और बाहरी को 70% इथेनॉल के साथ मिटा दें। बायोसेफ्टी कैबिनेट में टिश्यू कल्चर प्लेट ट्रांसफर करें।
  7. बाँझ तकनीक का उपयोग करना, कुओं से एस्पिरेट मीडिया और ताजा, गर्म सेल संस्कृति मीडिया के २५० μL के साथ बदलें ।
  8. अतिरिक्त 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 इनक्यूबेटर पर प्लेटें वापस करें।
  9. सीओ2 इनक्यूबेटर से प्लेटें हटाएं और कुओं से मीडिया को एस्पिरेट करें। लूसिफ़ेरेज़ विश्लेषण के लिए 4.1 कदम जारी है। आरएनए अलगाव के लिए 5.1 कदम आगे बढ़ें।

4. लूसिफ़ेरेस विश्लेषण

  1. कुओं में 1x सेल लिसिस बफर के 100 माइक्रोन जोड़ें। बफर को अभिकर्ता के आधार पर पहले कामकाजी एकाग्रता के लिए पतला करने की आवश्यकता हो सकती है।
  2. प्लेट को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्थानांतरित करें और कुशल सेल लाइसेसिस सुनिश्चित करने के लिए कम से कम 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. एक बेंच पर जमे हुए सेल lysate युक्त थाली रखें गल और निर्माता सिफारिशों के अनुसार सब्सट्रेट अभिकर्मकों को तैयार करने के लिए ।
  4. ल्यूसिफ़ेरेज सब्सट्रेट रिएजेंट्स को कमरे के तापमान से अलग होने की अनुमति दें।
  5. प्लेट रीडर चालू करें और इसी पाठक कार्यक्रम को खोलें। चिकनाई को मापने के लिए मशीन सेट करें।
  6. प्रत्येक नमूने के 10 माइक्रोन को एक अपारदर्शी 96-अच्छी तरह से प्लेट के कुएं में स्थानांतरित करें।
  7. अपारदर्शी प्लेट के प्रत्येक कुएं में मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके लूसिफ़ेरेज़ परख रिएजेंट के 50 माइक्रोन जोड़ें।
  8. कुओं को मिलाने के लिए प्लेट को धीरे-धीरे टैप करें और यह सुनिश्चित करें कि नीचे की सतह तरल से ढकी हुई है। प्लेट रीडर में थाली रखें और पढ़ना शुरू करें।
  9. एक स्प्रेडशीट प्रोग्राम में ल्यूमिनेसेंस मूल्यों को कॉपी करें और परिणामों को प्लॉट करें।

5. आरएनए अलगाव

  1. प्रत्येक कुएं में 500 माइक्रोन जोड़ें और पूरी तरह से लिसिस सुनिश्चित करने के लिए कई बार ऊपर और नीचे पिपेट करें।
  2. सामग्री को लेबल वाली माइक्रोसेंरिफ्यूज ट्यूब पर स्थानांतरित करें। आरएनए गुणवत्ता बनाए रखने के लिए जितना संभव हो बर्फ पर नमूने बनाए रखें।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस के लिए एक टेबलटॉप अपकेंद्रित्र सेट और प्रोटोकॉल के शेष के लिए इस तापमान पर अपकेंद्री बनाए रखें ।
  4. प्रत्येक नमूना ट्यूब के लिए, क्लोरोफॉर्म के 100 माइक्रोन जोड़ें, कसकर कैप करें, और 10 कमरे के तापमान पर 15 एस इनक्यूबेट के लिए हिलाएं।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिन के लिए 12,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। इस समय के दौरान, नई ट्यूबों लेबलिंग द्वारा आरएनए शुद्धि के अगले चरण के लिए तैयार करें।
  6. ऊपरी जलीय चरण को आइसोप्रोपेनॉल के 250 माइक्रोन वाले नए ट्यूब पर स्थानांतरित करें, मध्य या निचली परतों को परेशान न करें।
  7. अप्रयुक्त उत्पाद को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें, जिसका उपयोग प्रोटीन विश्लेषण के लिए भी किया जा सकता है। अवशिष्ट जलीय परत भी एक बैकअप के रूप में काम कर सकते है अगर आरएनए बाद में जरूरत है ।
  8. भंवर जलीय परत और आइसोप्रोपेनॉल का मिश्रण और नमूनों को 10 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर बैठने की अनुमति दें।
  9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए 12,000 x ग्राम पर नमूने सेंट्रलाइज।
  10. अपकेंद्रित्र से ट्यूब निकालें। आरएनए उपजी ट्यूब के किनारे और नीचे एक सफेद गोली बनाती है। ट्यूब खोलें और ध्यान से एक बेकार कंटेनर में डालने के द्वारा अतिशयोक्ति को हटा दें।
  11. 75% इथेनॉल और भंवर के 500 माइक्रोन जोड़कर आरएनए गोली को धोएं।
  12. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 8,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
  13. बाहर डालने का कार्य करके अधिनायक को हटा दें और फिर से पैलेट को 75% इथेनॉल से धोएं।
  14. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 8,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
  15. एक छोटी मात्रा पिपेट (जैसे, 10-200 μL मात्रा), जितना संभव हो उतना अधिनायक का उपयोग करना, सावधान किया जा रहा है कि किसी भी तरल को ट्यूब में वापस धक्का न दिया जाए या पिपेट टिप के साथ गोली को उखाड़ फेंकें। यदि गोली उखाड़ दी जाती है, तो संक्षेप में अपकेंद्रित्र और फिर से अलौकिक को हटाने की कोशिश करें।
    1. आरएनए छर्रों को हवा-सुखाएं। यदि छर्रों किसी भी नमूने के लिए दिखाई दे रहे हैं, समय-समय पर (हर 5 मिनट) उन पर जांच करने के लिए अगर वे सफेद से स्पष्ट करने के लिए बदल जाते हैं, यह दर्शाता है कि वे सूखी हैं । एक बार छर्रों स्पष्ट मोड़ शुरू, अल्ट्राप्योर के 20 μL जोड़ें, आरएनए मुक्त पानी के लिए RNase मुक्त पानी ।
    2. यदि छर्रों शुरू में किसी भी नमूने के लिए दिखाई नहीं थे, बस supernatant हटाने के बाद अल्ट्राप्यूरी पानी 5 मिन जोड़ें ।
  16. घुलनशीलता बढ़ाने के लिए, एक पिपेट टिप के माध्यम से कई बार समाधान पारित करें और 55-60 डिग्री सेल्सियस पर 10 न्यूनतम के लिए इनक्यूबेट करें।

6. आरएनए का DNase उपचार

  1. आरएनए अखंडता को बनाए रखने के लिए, बर्फ पर आरएनए नमूनों की दुकान जब तक अंयथा उल्लेख किया । इस समय, 10x DNase बफर फ्रीजर से हटाया जा सकता है और बर्फ पर गल करने की अनुमति दी ।
  2. एक लिंट मुक्त कपड़े के साथ सभी नमूना विश्लेषण सतहों की सफाई करके नमूना विश्लेषण के लिए स्पेक्ट्रोफोटोमीटर तैयार करें।
  3. विश्लेषण से पहले पृष्ठभूमि माप लें। ऐसा करने के लिए, आरएनए छर्रों को भंग करने के लिए उपयोग किए जाने वाले उसी अल्ट्राप्योर पानी के 1.5 माइक्रोन के साथ सेंसर लोड करें। बैकग्राउंड रीड जेनरेट करने के लिए रीड ब्लैंक बटन दबाएं।
  4. उपकरण के नमूना लोडिंग सतह को मिटाने के लिए लिंट मुक्त कपड़े का उपयोग करें। प्रत्येक नमूना पढ़ने के बाद इस चरण को दोहराएं।
  5. नमूना धारक को पुनः निलंबित आरएनए का 1.5 माइक्रोन लोड करें और पढ़ें नमूनाचुनें। सभी नमूनों को तब तक दोहराएं जब तक कि सभी नमूने नहीं पढ़े जाते।
  6. 1.5 मिलीएम माइक्रोसेन्ट्राइज ट्यूब में 10x DNase बफर के 2.4 माइक्रोन और DNase के 1 μL के संयोजन से DNase मास्टर मिश्रण तैयार करें। दो अतिरिक्त खंडों के लिए मास्टर मिश्रण तैयार करें।
  7. कई बार ट्यूब को फ्लिक करके मास्टर मिक्स मिलाएं। संक्षेप में ट्यूब के तल पर सामग्री इकट्ठा करने के लिए ट्यूब अपकेंद्रित। आरएनए नमूने के 20 माइक्रोन में मास्टरमिक्स के 3.4 माइक्रोन जोड़ें। पहले की तरह संक्षेप में फ़्लिकिंग और अपकेंद्रित्र द्वारा सामग्री मिलाएं।
  8. नमूनों को 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट हीट ब्लॉक में स्थानांतरित करें। DNase निष्क्रियअभिकरण को फ्रीजर से हटा दें और कमरे के तापमान पर गल जाएं।
  9. 20 मिन हीट ब्लॉक पर सैंपल रखने के बाद नमूनों को वर्क बेंच पर रखे ट्यूब रैक में ट्रांसफर करें।
  10. धीरे-धीरे DNase निष्क्रियता अभिकर्मक की सामग्री को भंवर करें। आरएनए युक्त ट्यूबों के लिए DNase निष्क्रियता अभिकर्मक के 2.6 μL स्थानांतरित करें और फिर एक समरूप मिश्रण बनाने के लिए ट्यूबों को झटका दें।
  11. 1 मिन के लिए 12,000 x ग्राम पर नमूने अपकेंद्रित्र।
  12. ध्यान से एक नया, लेबल ट्यूब के लिए supernatant पिपेट।

7. सीडीएनए के लिए एमआरएनए का रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन

  1. नमूनों की मात्रा के आधार पर एक मास्टर मिश्रण तैयार करें और पाइपिंग(टेबल 1)के माध्यम से नुकसान के लिए खाते में दो अतिरिक्त। आरएनए के 1 μg का उपयोग करें और 50 μL कुल की मात्रा में एच2ओ जोड़ें।
अभिकर्मक वॉल्यूम (μL) अंतिम एकाग्रता
एमजीसीएल2 (25mM) 3.5 1.75 एमएम
रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन बफर (10x) 5 1x
डीएनटीपी मिक्स (10 माइक्रोन, प्रत्येक) 2.5 500 एनएम
यादृच्छिक हक्केसर (100 माइक्रोन) 1.25 2.5 माइक्रोन
बहुमुंशी रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज़ (50 यू/μL) 1 1 यू/माइक्रोन
RNase अवरोधक (20 U/μL) 1.25 1.25 यू/माइक्रोन
आरएनए (1 μg) 20 एनजी/यूएल
एच2 टॉप अप अप अप 50 तक

तालिका 1: रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन मास्टर मिश्रण के लिए घटक और नुस्खा।

  1. नमूनों को कसकर कैप करें और पीसीआर ट्यूबों को साइड में लेबल करें क्योंकि ढक्कन पर लेबल बाद में थर्मोसाइकिलर के गर्म ढक्कन से हटाया जा सकता है। भंवर से मिलाएं।
  2. संक्षेप में पीसीआर ट्यूबों को ट्यूब के नीचे तक नमूने एकत्र करने के लिए अपकेंद्रित करें।
  3. पीसीआर ट्यूबों को थर्मोसाइकिलर में रखें और निम्नलिखित सेटिंग्स के तहत नमूने चलाएं:
    10 मिन के लिए 25 डिग्री सेल्सियस, 30 मिन के लिए 48 डिग्री सेल्सियस, 5 मिन के लिए 95 डिग्री सेल्सियस और फिर 10 डिग्री सेल्सियस पर पकड़।
  4. नए संश्लेषित सीडीएनए वाले ट्यूबों को -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्थानांतरित करें या क्यूपीसीआर विश्लेषण में तुरंत उपयोग करें।

8. आरटी-क्यूपीसीआर विश्लेषण के लिए प्लेट तैयार करना और लोड करना

  1. शुरू करने से पहले, नमूना विश्लेषण के लिए 384-अच्छी तरह से क्यूपीसीआर प्लेट के सेटअप की योजना बनाएं।
  2. बर्फ पर गल प्राइमर और सीडीएनए।
  3. एक मास्टर मिश्रण तैयार करें (टेबल 2देखें), साथ ही पाइपिंग के माध्यम से नुकसान के लिए खाते में लगभग 10% अतिरिक्त।
अभिकर्मक वॉल्यूम (μL)
10 माइक्रोन एफ प्राइमर 1
10 μM आर प्राइमर 1
अल्ट्रापुरेएच2 4
2x SYBR ग्रीन 10

तालिका 2: क्यूपीसीआर मास्टर मिश्रण के लिए घटक और नुस्खा।

  1. भंवर मास्टर मिश्रण और एक रिपीटर पिपेट का उपयोग कर 384 अच्छी तरह से प्लेट के कुओं में 8 μL बांटना। नमूनों का विश्लेषण प्रत्येक प्राइमर और सीडीएनए नमूना संयोजन के लिए डुप्लिकेट में किया जाएगा।
  2. एक P10 (या छोटे) पिपेट का उपयोग करना, प्रत्येक प्राइमर सेट के लिए डुप्लिकेट कुओं के लिए सीडीएनए के 2 μL हस्तांतरण का विश्लेषण किया जाएगा । क्रॉस संदूषण से बचने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से सुझावों को बदलें।
  3. चिपकने वाली फिल्म को सतह पर सावधानीपूर्वक लागू करके प्लेट को सील करें, यह सुनिश्चित करें कि सभी कुओं को कवर किया जाए। मजबूती से सील करने के लिए एक सीलिंग पैडल या रोलर का उपयोग कर फिल्म दबाएं।
  4. प्लेट को एक अपकेंद्री में रखें, जिसमें एक खाली प्लेट को प्रतिसंतुलन के रूप में रखें। 5 मिन के लिए 500 x ग्राम पर प्लेट को सेंट्रलाइज किया।

9. क्यूपीसीआर विश्लेषण के लिए थर्मोसाइकिलर चलाना

  1. कंप्यूटर और रियल टाइम पीसीआर इंस्ट्रूमेंट पर पावर।
  2. आरटी-क्यूपीसीआर सॉफ्टवेयर खोलें और नए प्रयोगका चयन करें।
  3. सेटअप टैब के तहत, प्रयोग गुण ोंका चयन करें, जहां रन के लिए पैरामीटर सेट किए जा सकते हैं।
  4. प्रयोग नामको परिभाषित करें, जो परिणामों को संग्रहीत करने के लिए उपयोग किए जाने वाले फ़ाइल नाम और सेटिंग्स सेट करेगा।
  5. साधन चयनके लिए, वर्तमान में जुड़े उपकरण का चयन करें जो विश्लेषण चला रहा होगा। तुलनात्मक सीटी (10सीटी) रन विधि का चयन करें।
  6. फ्लोरोसेंट डीएनए रंग का उपयोग किया जा करने के लिए और रैंप की गति के रूप में मानक के रूप में SYBR ग्रीन रिएजेंट्स का चयन करें।
  7. सुनिश्चित करें कि पिघल वक्र को शामिल करने के लिए बगल में बॉक्स की जांच की जाती है।
  8. परिभाषित टैब के तहत, लक्ष्य (यानी, जीन को परिलक्षित किया जाना) और नमूने (यानी, प्रायोगिक स्थितियां) आवंटित करें।
  9. असाइन टैब का चयन करें। उचित लक्ष्य ों और नमूनों के साथ कुओं को लेबल करें, क्योंकि वे 384-अच्छी प्लेट की लोडिंग योजना के अनुरूप हैं।
  10. रन विधिका चयन करें । में सूचीबद्ध विश्लेषण के लिए मापदंडों का उपयोग करें(तालिका 3)
होल्ड स्टेज पीसीआर स्टेज पिघलवक्र चरण
चरण 1 चरण 2 चरण 1 चरण 2 चरण 1 चरण 2 चरण 3
Temp 50 डिग्री सेल्सियस 95 डिग्री सेल्सियस 95 डिग्री सेल्सियस 60 डिग्री सेल्सियस 95 डिग्री सेल्सियस 60 डिग्री सेल्सियस 95 डिग्री सेल्सियस
समय 2:00 10:00 0:15 1:00 0:15 1:00 0:15
डेटा संग्रह हाँ हाँ
चक्रों की संख्या 1x 40x 1x

तालिका 3: थर्मोसाइकिलर के लिए चक्र पैरामीटर।

  1. थर्मोसाइकिलर में 384-कूप प्लेट रखें और विश्लेषण शुरू करें।

10. डेल्टा-डेल्टा सीटी विधि के साथ क्यूपीसीआर परिणामों का विश्लेषण (2-10Ct)

  1. उन त्रुटियों के लिए क्यूपीसीआर प्रतिक्रिया से उत्पन्न परिणामों का विश्लेषण करें जो डाउनस्ट्रीम विश्लेषण में हस्तक्षेप कर सकते हैं। कई त्रुटियों को सिस्टम द्वारा स्वचालित रूप से हरी झंडी दिखाई जाएगी।
  2. ठीक से निर्मित प्राइमर के लिए, पिघल करघट केवल एक चोटी होनी चाहिए। आगे के विश्लेषण से एक से अधिक चोटी के साथ एक पिघल वक्र युक्त किसी भी कुओं को बाहर करें ।
  3. सीटी मूल्यों को स्प्रेडशीट प्रोग्राम में निर्यात करें ताकि डेटा का विश्लेषण किया जा सके। एक सुझाए गए प्रारूप प्रदान किया जाता है(तालिका 4)। अंतिम स्तंभ नियंत्रण नमूनों के सापेक्ष, नमूने का गुना अभिव्यक्ति परिवर्तन है।
हाउसकीपिंग जीन(GAPDH) ब्याज जीन(IL6)
सीटी1 सीटी2 Ave सीटी सीटी1 सीटी2 Ave सीटी Ave इस तरह की बातें की जा रही हैं। 2 ^-(()) जियोमीन
नियंत्रण 1 15.33 15.37 15.35 26.81 26.91 26.86 11.51 10.51 1.00 0.50 1.00
नियंत्रण 2 16.83 16.77 16.80 26.89 26.92 26.91 10.11 10.51 -0.41 1.33
नियंत्रण 3 17.56 17.53 17.54 27.38 27.56 27.47 9.93 10.51 -0.59 1.50
Sl1344 1 15.50 15.41 15.45 22.15 22.13 22.14 6.69 10.51 -3.83 14.21 13.23
SL1344 2 16.02 15.98 16.00 23.01 22.96 22.98 6.98 10.51 -3.53 11.57
SL1344 3 17.27 17.30 17.28 23.99 23.98 23.98 6.70 10.51 -3.82 14.09
सीपा सोपब सोप2 1 15.38 15.41 15.39 23.31 23.09 23.20 7.80 10.51 -2.71 6.56 7.29
सीपा सोपब सोप2 2 16.01 16.05 16.03 23.89 23.92 23.91 7.88 10.51 -2.64 6.23
सीपा सोपब सोप2 3 16.78 16.78 16.78 24.02 24.06 24.04 7.27 10.51 -3.25 9.49
सीपा सोपबी सोप2 सोप2 सोप 1 15.52 15.60 15.56 27.04 27.03 27.03 11.47 10.51 0.96 0.51 0.79
सीपा सोपब सोप2 सोप 2 15.56 15.59 15.57 26.37 26.42 26.39 10.82 10.51 0.31 0.81
सीपा सोपबी सोप2 सोप2 सोप 3 15.91 15.92 15.91 26.24 26.12 26.18 10.27 10.51 -0.25 1.19

तालिका 4: क्यूपीसीआर डेटा का विश्लेषण करने के लिए प्रारूप।

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Representative Results

यहां वर्णित परख ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर एनएफ-ए-बी की सक्रियता पर केंद्रित है, जो एनएफ-ए-बी-निर्भर ल्यूसिफ़ेरेस रिपोर्टर का उपयोग करता है जो वाला कोशिकाओं की एक पंक्ति में स्थिर रूप से ट्रांसकट किया जाता है। सक्रिय एनएफ-बी नाभिक में स्थानांतरित हो जाता है जहां यह लक्ष्य जीन की बाध्यकारी साइटों को बांधता है, जिसमें प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स आईएल 6 और आईएल23शामिल हैं। एनएफ-बी एक्टिवेशन का एक सामान्य सिंहावलोकन चित्रित 1में दर्शाया गया है। ग्राम-नकारात्मक जीवाणु साल्मोनेला आंत्रकारि सेरोवर टाइथिमुरियम का उपयोग इस अध्ययन में एनएफ-बी के सक्रियकर्ता और आईएल 6 (चित्र ा 2)की अभिव्यक्ति के रूप में किया गया था। रोगजनन के लिए आवश्यक मुख्य उग्रता कारकों में से एक प्रकार III स्राव प्रणाली-1 (T3SS-1) है जो एसकी अनुमति देता है। कोशिकाओं को संक्रमित करने और एनएफ-बी सक्रियण को प्रेरित करने के लिए टाइपिमुरिनियम। T3SS-1 का कार्य बैक्टीरियल प्रोटीन, कहा प्रभावकों, मेजबान कोशिकाओं में वितरित करने के लिए है। यहां प्रभावक प्रोटीन मेजबान एपिथेलियल कोशिकाओं के आक्रमण में मध्यस्थता करने के लिए कई सेलुलर सिग्नलिंग रास्तों को लक्षित करते हैं। एनएफ-बी एक्टिवेशन एसद्वारा प्रेरित किया गया । टाइजिमुरियाम ज्यादातर T3SS-1 प्रभावक प्रोटीन सोप, सियापा, सोप्बी और सोपई218पर निर्भर है। यहां, वाला 57A कोशिकाओं जंगली प्रकार एससे संक्रमित थे । Typhimurium तनाव SL1344 और दो उत्परिवर्ती उपभेदों या तो तीन(सीपा, सोपब, SopE2)या चार(SipA, सोपब, SopE2, सोप)प्रभावक प्रोटीन की कमी । चित्रा 2 एनएफ-बी-निर्भर ल्यूसिफ़ेरे सक्रियण(चित्रा 2ए)और आईएल6 जीन अभिव्यक्ति(चित्रा 2बी)का एक प्रतिनिधि प्रयोग है जो हेला57A कोशिकाओं में एस से संक्रमित है। टाइथिमुरियम उपभेदों। जंगली प्रकार SL1344 तनाव के साथ संक्रमण एक मजबूत ल्यूसिफ़ेरे संकेत है जो सीपा, सोपबी, सोप2 ट्रिपल उत्परिवर्ती (सोप-निर्भर प्रतिक्रिया) से संक्रमित कोशिकाओं में कमी आई है, और सिपा, सोपब, सोपई 2, सोप चौगुनी उत्परिवर्ती के साथ नियंत्रण स्तर को कम करता है। सापेक्ष ल्यूमिनेसेंस इकाइयां (आरबीयू) आईएल 6 अभिव्यक्ति स्तर(चित्रा 2)के साथ संबंधित हैं। चित्रा 3 आरटी-क्यूपीसीआर विश्लेषण से उत्पन्न परिणामों का प्रतिनिधित्व करता है।

Figure 1
चित्रा 1: एनएफ-बी एक्टिवेशन और डाउनस्ट्रीम रीडआउट की योजनाबद्ध। ऊपर उल्लिखित, एनएफ-बी को अवरोधक प्रोटीन IοBα द्वारा निष्क्रिय स्थिति में साइटोसोल में बनाए रखा जाता है। आंतरिक और बाहरी उत्तेजनाएं आईकेके के सक्रियण में योगदान दे सकती हैं, जो IοBα को फॉस्फोरलेट्स करती है और इसके बाद के प्रोटेसोमल क्षरण का कारण बनती है। IοBα के क्षरण एनएफ-बी के परमाणु स्थानीयकरण संकेत का पता चलता है, जो स्थानांतरण को बढ़ावा देता है । नाभिक में, सक्रिय एनएफ-बी लक्षित जीन की बाध्यकारी साइटों को बांधता है, जिससे उनके प्रतिलेखन और अभिव्यक्ति को बढ़ावा मिलता है। साइटोकिन्स आईएल 6 और आईएल23जैसे लक्षित जीन को आरटी-क्यूपीसीआर के माध्यम से व्यक्त और निर्धारित किया जाता है। वाघेला 57A कोशिकाओं में ल्यूसिफ़ेरेज़ एनएफ-बी एक्टिवेशन के बाद व्यक्त किया जाता है, जिसे ल्यूमिनेसेंस परख के माध्यम से निर्धारित किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एस के बाद ल्यूमिनेसेंस परख और आरटी-क्यूपीसीआर विश्लेषण के प्रतिनिधि डेटा। वाघेला 57A कोशिकाओं का टाइथिमुरियाम संक्रमण। 1 x 105 वाला 57A कोशिकाओं को लॉग चरण एस के 106 सीएफयू (एमओआई = 10) से संक्रमित किया गया था। टाइथिमुरियम जंगली प्रकार SL1344, या सियापा, सोप्बी और सोपई 2 की कमी वाले उत्परिवर्ती उपभेदों, और सियापा, सोपब, सोपई 2 और सोप। 1 घंटे के बाद, मीडिया को बदल दिया गया था, और ऊष्मायन एक अतिरिक्त चार घंटे के लिए जारी रखा । (A)कोशिकाओं को ल्यूमिनेसेंस परखों के माध्यम से लूसिफ़ेरेज़ की अभिव्यक्ति के लिए संसाधित किया गया था। (ख)कोशिकाओं को आरएनए के निकाले गए थे, जिनका उपयोग आरटी-क्यूपीसीआर विश्लेषण के लिए किया गया था । डेल्टा-डेल्टा सीटी विधि (2-100Ct)का उपयोग करके लक्षित जीन की सापेक्ष अभिव्यक्ति दिखाई गई है। त्रिपालीय कुओं का मतलब और मानक विचलन दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: आरटी-क्यूपीसीआर विश्लेषण से उत्पन्न सारांश परिणाम। (क)एस से संक्रमित वाघेला 57A कोशिकाओं से GAPDH बढ़ाने वाले कुओं के लिए एक प्रवर्धन भूखंड दिखाया गया है । टाइथिमुरियम। (ख)GAPDH प्राइमर युक्त कुओं के पिघल वक्र कथानक लगभग ८४ डिग्री सेल्सियस के अनुरूप एक ही पिघल चोटी से पता चलता है । (ग)आईएल-6 के लिए प्राइमर युक्त डुप्लीकेट कुएं । कुओं में से एक एक दूसरे पिघल चोटी प्रदर्शित करता है, के रूप में एक काले तीर से निरूपित है, और विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

वर्णित प्रोटोकॉल का प्रमुख योगदान यह है कि यह कोशिकाओं में एनएफ-बी सक्रियण का पता लगाने के लिए एक तेज और आसान तरीका प्रदान करता है, जो एनएफ-बी एक्टिवेशन को प्रभावित करने वाली कई उत्तेजक स्थितियों या दवाओं के उच्च थ्रूपुट विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। यहां, हम साल्मोनेला-संक्रमितवाला कोशिकाओं में एनएफ-बी सक्रियण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इन कोशिकाओं का उपयोग अन्य रोगजनकों के साथ संक्रमण के लिए किया जा सकता है और साथ ही एनएफ-बी एक्टिवेशन पर बैक्टीरियल संक्रमण के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है। इसके अलावा, एनएफ-बी-निर्भर ल्यूसिफ़ेरेस एक्टिवेशन इन हेला 57A कोशिकाओं का उपयोग एनएफ-बी एक्टिवेशन के लिए अग्रणी सिग्नलिंग रास्तों के सक्रियकों या अवरोधकों के लिए स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है। यहां, हम ४८-अच्छी तरह से प्लेटों में HeLa 57A कोशिकाओं बीज, लेकिन इन प्रयोगों को ९६ तक पहुंचाया जा सकता है-और यहां तक कि ३८४-अच्छी तरह से प्लेटों प्रयोग प्रति अधिक नमूनों के लिए अनुमति देने के लिए । HeLa 57A कोशिकाओं का गठन संवित लैक्ज़ व्यक्त करते हैं, जिसे कोशिका संख्या और व्यवहार्यता के लिए आंतरिक नियंत्रण के रूप में मापा जा सकता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल सेल लाइनों में उपयोग के लिए लागू होता है या तो एक NF-से भरा-एक B:: लूसिफ़ेरास रिपोर्टर निर्माण । RAW264.7 मैक्रोफेज सेल लाइन पहले से ही इस तरह के एक उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया गया है18. महत्वपूर्ण बात यह है कि यह विधि पांच अलग-अलग एनएफ-बी उपइकाइयों के विभिन्न होमो/हेटेरोडिमर की सक्रियता के बीच अंतर नहीं करती है। विभिन्न एनएफ-बी होमो-हेटेरोडिमर परिसरों में प्रमोटर दृश्यों के लिए अलग-अलग समानताएं हैं, साथ ही ट्रांसक्रिप्शनल परिणाम21भिन्न हैं। यह संभव है कि इम्यूनोग्लोबुलिन-चेन प्रमोटर क्षेत्र से बी बाध्यकारी साइटों के लिए बाध्यकारी कम आत्मीयता के कारण यहां वर्णित रिपोर्टर का उपयोग करके एक विशिष्ट एनएफ-बी-बी डिमर की सक्रियता याद की जाती है।

यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि एक सेल लाइन को उत्तेजित करने के लिए उपयुक्त स्थितियां सीधे दूसरे पर लागू नहीं हो सकती हैं। इसलिए, यह अत्यधिक अनुशंसा की जाती है कि प्रत्येक परख प्रणाली में परख की स्थिति को अनुकूलित किया जाए। संक्रमण का समय, एमओआई, दवा उपचार की अवधि, दवा की खुराक, और सीडिंग की स्थिति एनएफ-बी सक्रियण का आकलन करते समय ध्यान में रखना सभी महत्वपूर्ण विचार हैं। उदाहरण के लिए, RAW264.7 मैक्रोफेज साल्मोनेला संक्रमण के प्रति अधिक संवेदनशील होते हैं, जिसमें विभिन्न स्थितियों को एक समान ल्यूमिनेसेंस सिग्नल का उत्पादन करने की आवश्यकता होती है जैसा कि वाला 57A कोशिकाओं18के साथ देखा जाता है।

ल्यूमिनेसेंस मापन के दौरान, किनारे के कुओं के लिए अन्य कुओं की तुलना में काफी अलग मूल्य होना असामान्य नहीं है जो इसी तरह उत्तेजित थे। यह आम तौर पर थाली पर किनारे कुओं की उच्च वाष्पीकरण दरों के कारण होता है जिससे दवा एकाग्रता में वृद्धि होती है। यह कुओं के बीच अंतरिक्ष के लिए सीरम मुक्त मीडिया जोड़कर संबोधित किया जा सकता है, प्लेटों के लिए है कि यह अनुमति देते हैं, ढक्कन में फेरबदल/

स्तनधारी कोशिकाओं में व्यक्त, जुगनू लूसिफ़ेरेज़ कई घंटों का आधा जीवन है और आम तौर पर सबसे रिपोर्टर परख22के प्रयोजनों के लिए स्थिर माना जाता है । यहां वर्णित लोगों की तुलना में लंबे समय तक उपचार अवधि मज़बूती से की जा सकती है। हालांकि, यहां इस्तेमाल किया जाने वाला लूसिफ़ेरेज़ परख प्रणाली केवल पहले मिनट के लिए एक स्थिर संकेत पैदा करती है और उसके बाद जल्दी से खराब हो जाती है। इसलिए, यह अत्यंत महत्वपूर्ण है कि ल्यूमिनेसेंस उपाय को सेल लाइसेट और सब्सट्रेट मिलाने के बाद जल्दी से बनाया जाए।

एनएफ-बी साइटोकिन्स और केमोकिन्स (यानी, इल6 और इल्23)सहित जीन की एक बड़ी सरणी के लिए एक प्रतिलेखन कारक है। एनएफ-बी-निर्भर लूसिफ़ेरेज गतिविधि को मापने का मतलब यह नहीं है कि इन साइटोकिन्स और केमोकिन्स व्यक्त किए जाते हैं। यह विधि एनएफ-बी गतिविधि को प्रभावित करने वाली स्थितियों के लक्षण वर्णन के लिए संभावित पहली स्क्रीन के रूप में सेवा करके मौजूदा आणविक क्वांटिफिकेशन तकनीकों को पूरक कर सकती है, जिसे आरटी-क्यूपीसीआर के माध्यम से कार्यात्मक रूप से मान्य किया जा सकता है। एनएफ-बी एक्टिवेशन का कार्यात्मक सत्यापन पश्चिमी दाग विश्लेषण या कार्यात्मक उन मामलों में ब्याज के प्रोटीन के लिए विशिष्ट परखों के माध्यम से भी किया जा सकता है जहां एमआरएनए क्वांटिफिकेशन उचित नहीं हो सकता है। यह इंटरल्यूकिन-बीटा(Il1b)के लिए मामला है, एक जीन जिसका प्रतिलेखन एनएफ-बी बाइंडिंग द्वारा प्रेरित किया जाता है, लेकिन प्रोटीन उत्पाद को परिपक्व उत्पाद23,24बनाने के लिए पोस्ट ट्रांसलेशनल संशोधन की आवश्यकता होती है।

यहां वर्णित विशिष्ट आरएनए आइसोलेशन प्रोटोकॉल केवल एक ही नहीं है जिसे आरटी-क्यूपीसीआर विश्लेषण में उपयोग के लिए नियोजित किया जा सकता है, और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट जैसे अन्य पसंदीदा तरीकों का उपयोग किया जा सकता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि आरएनए की गुणवत्ता प्रक्रिया के लिए बहुत महत्वपूर्ण है और इसलिए आरएनए को गिरावट को रोकने के लिए जितना संभव हो उतना बर्फ पर रखा जाना चाहिए। यह पता लगाने के लिए कि पीसीआर प्रतिक्रियाओं लगातार कर रहे हैं, आरटी-qPCR प्रतिक्रियाओं में डुप्लिकेट प्रतिक्रियाओं को चलाने के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में इस तरह के छोटे संस्करणों की पाइपिंग जब ३८४ अच्छी तरह से थाली लोड हो रहा है अक्सर त्रुटि के लिए कारण हो सकता है । हाउसकीपिंग जीन के सीटी मूल्य नमूनों के बीच सुसंगत होने चाहिए, और इससे विचलन रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के दौरान आरएनए सांद्रता में अक्षम सफाई कदम या विसंगतियों का संकेत हो सकता है जो अंतिम परिणामों को प्रभावित कर सकता है। प्रत्येक क्यूपीसीआर प्रयोग के बाद पिघलने वाले वक्र की जांच करना भी महत्वपूर्ण है। एक चोटी की उपस्थिति से पता चलता है कि क्यूपीसीआर प्राइमर एक ही जीन को बढ़ा रहे हैं। कई घटता सुझाव है कि वहां बंद लक्ष्य जीन प्रवर्धन या प्राइमर dimers की उपस्थिति है । या तो मामले में, पिघलवक्र में मौजूद कई चोटियों से पता चलता है कि प्राइमर को विशिष्टता सुनिश्चित करने के लिए बदल दिया जाना चाहिए। परिवर्तनशीलता के लिए इतना कमरे के साथ, व्यायाम और हर कदम पर अच्छी तकनीक के शोधन सटीक और प्रजनन योग्य परिणाम पैदा करने के लिए आवश्यक हैं ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

कीस्ट्रा-गौंडर लैब में अनुसंधान पुरस्कार संख्या R21AI122092 के तहत NIH के NIAID से अनुदान द्वारा समर्थित है और पुरस्कार संख्या 1-18-JDF-035 के तहत अमेरिकन डायबिटीज एसोसिएशन से ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adhesive film VWR International 60941-070
Chloroform Fisher Bioreagents C298-500
DMEM Thermo Fisher 11665092
DNAse treatment kit Qiagen 79254
dNTPs Promega U1511
Ethanol Fisher Bioreagents BP2818100 molecular grade
FBS Sigma-Aldrich F0926
HeLa 57A cells Ref # 15
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems 4368814
Isopropanol Fisher Bioreagents BP26181
Kanamycin Fisher Bioreagents BP906-5
LB agar Fisher Bioreagents BP1425-500
Lysogeny broth Fisher Bioreagents BP1426-500
MgCl2 Fisher Chemical
NanoDrop ND-1000 Thermo Scientific spectrophotometer
Promega luciferase assay system Promega E1501 Cell lysis buffer & luciferin substrate
Random Hexamers Thermo Scientific SO142
Real-time GAPDH forward primer 5'-CCAGGAAATGAGCTTGAC
AAAGT-3'
Real-time GAPDH reverse primer 5-'CCCACTCCTCCACCT
TTGAC-3'
Real-time IL-23 forward primer 5-'GAGCCTTCTCTGCTCCC
TGAT-3'
Real-time IL-23 reverse primer 5'-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3'
Real-time IL-6 forward primer 5'-GTAGCCGCCCCACACAGA-3'
Real-time IL-6 reverse primer 5'-CATGTCTCCTTTCTCAGG
GCTG-3'
Reverse Transcriptase Applied Biosystems 4308228
RNAse inhibitor Thermo Scientific EO0381
RT buffer Promega A3561
SL1344 Ref # 17
SL1344 ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039 Ref # 18
SL1344 ΔsopE ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039 Ref # 18
SYBR green Applied Biosystems 4309155 2x mastermix
Tri-reagent Molecular Research Center TR 118 guanidine thiocyanate
Trypsin -EDTA Thermo Fisher 25300054 0.05% Trypsin-EDTA
Ultrapure water Fisher Bioreagents BP248450
Well plate for PCR VWR International 89218-294 384-well plate

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References

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