Activación y cuantificación de la expresión génica dependiente de NF--B en células de cultivo de tejido infectado por Salmonella

Immunology and Infection

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Summary

Aquí, presentamos un protocolo para medir rápida y fácilmente el factor nuclear kappa-light-chain-enhancer de la activación de células B activadas (NF--B) en líneas celulares que expresan las construcciones de reporteronf-B::luciferase, a través de mediciones de luminiscencia en el lisado celular. Además, la expresión génica se determina a través de RT-qPCR aislado de células infectadas con Salmonella Typhimurium.

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Mendez, J. M., Keestra-Gounder, A. M. NF-κB-dependent Luciferase Activation and Quantification of Gene Expression in Salmonella Infected Tissue Culture Cells. J. Vis. Exp. (155), e60567, doi:10.3791/60567 (2020).

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Abstract

El factor de transcripción dimerica NF--B regula muchas vías de respuesta celular, incluyendo vías inflamatorias induciendo la expresión de varias citoquinas y quimioquinas. NF--B se expresa constitutivamente y es secuestrado en el citosol por el factor nuclear de proteína inhibitoria del potenciador del gen de polipéptido ligero kappa en el inhibidor de las células B, alfa (I-B). La activación de NF--B requiere la degradación de I-B, que luego expone una señal de localización nuclear en NF-B y promueve su tráfico al núcleo. Una vez en el núcleo, NF-B se une a la región promotora de los genes diana NF-B, como la interleucina 6 (IL-6) y la IL-23, para promover su expresión.

La activación de NF-B se produce independientemente de la transcripción o la traducción. Por lo tanto, el estado de activación de NF-B debe medirse mediante la cuantificación de NF-B específicamente en el núcleo, o mediante la cuantificación de la expresión de los genes diana NF-B. En este protocolo, las células transfectó de forma estable con una construcción de reportero NF-B::luciferase para la activación de NF-B utilizando técnicas de cultivo de tejido in vitro. Estas células están infectadas con Salmonella Typhimurium para activar NF-B, que se trafica con el núcleo y se une a los sitios B en la región promotora de la luciferasa, induciendo su expresión. Las células se lysed y analizan con el sistema de ensayo luciferase. La cantidad de luciferasa producida por las células se correlaciona con la intensidad de la señal de luminiscencia, que es detectada por un lector de placas. La señal de luminiscencia generada por este procedimiento proporciona un método rápido y altamente sensible para evaluar la activación NF-B bajo una serie de condiciones. Este protocolo también utiliza PCR de transcripción inversa cuantitativa (RT-qPCR) para detectar niveles relativos de ARNm que son indicativos de expresión génica.

Introduction

La familia de proteínas del factor nuclear B (NF-B) son importantes activadores de transcripción que regulan la expresión génica en varias vías biológicas. La activación de NF-B induce la transcripción de genes diana, muchos de los cuales son importantes para las respuestas inmunitarias e inflamatorias, la proliferación celular, las respuestas al estrés y la progresión del cáncer1,2. Nf--B desempeña un papel integral en la mediación de los primeros resultados inflamatorios para el aclaramiento de patógenos. Dados los muchos procesos biológicos mediados por la activación nf-B, las interrupciones en su señalización pueden tener graves consecuencias para la salud y la enfermedad. La pérdida de mutaciones de la función en la señalización NF-B se asocia en varios fenotipos de deficiencia inmune, mientras que la ganancia de mutaciones de función se asocia con varios tipos de cáncer, incluyendo linfomas de células B y cánceres de mama3. Además, se ha demostrado que muchos patógenos modulan directamente el estado de activación de NF-B a través de la expresión de factores de virulencia4,5,6,7.

Se sabe que la activación de NF--B es una consecuencia de muchos estímulos variables, incluidos productos bacterianos como lipopolisacáridos (LPS), flagelina y peptidoglicanos conocidos como patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP). Estos MTP son detectados por receptores de reconocimiento de patrones (PRR) tales como los receptores similares a los peajes (TIR) y los receptores similares a Nod (NRM) que conducen a la activación de NF-B y la posterior expresión de una matriz de genes inflamatorios dependientes de NF-B8. Además de la activación de PRR por Los PamP, otros productos bacterianos, como las proteínas efectoras bacterianas, pueden inducir la activación de NF-B. Curiosamente, las bacterias también expresan proteínas efectoras que atenúan activamente la vía NF-B y mejoran su patogenicidad, subrayando la importancia de NF-B como mediador esencial de la inmunidad9.

Hay cinco subunidades diferentes que forman los dimers NF-B; p50, p52, RelA (p65), RelB y cRel. Los dos heterodímeros principales NF-B son los dimers p50:RelA y p52:RelB. Los dimers NF-B activados se unen a sitios de ADN, conocidos como sitios B, en las regiones promotoras y potenciadoras de varios genes diana. En condiciones homeostáticas normales, NF-B interactúa con una familia de proteínas inhibidoras conocidas como proteínas I-B para permanecer inactivas. Tras la estimulación, el I-B es fosforilado por la Kinasa (IKK, por sus cuales) es blanco de la ubiquitinación y, posteriormente, de la degradación. La degradación de I-B activa NF-B al revelar una señal de localización nuclear. A continuación, NF--B se traslada al núcleo, donde se une a los sitios B en la región promotora de los genes diana y promueve la transcripción10. Por lo tanto, la activación de NF--B regula la expresión de ARNm de los genes diana NF-B, y este cambio se puede medir a través de ensayos de cuantificación de ARN como RT-qPCR11.

Existen varios métodos que se utilizan comúnmente para la medición de la activación NF-B, incluyendo ensayos de cambio de movilidad electroforética (EMSA), translocación nuclear y ensayos de reporteros genéticos. EMSA se utiliza para detectar complejos proteicos con ácidos nucleicos. Las células estimuladas se fraccionan para aislar las proteínas nucleares, incluyendo la NF-B transubicada, que luego se incuba con nucleótidos radiomarcados que contienen el dominio de unión NF-B. Las muestras se ejecutan en un gel e imágenes por autoradiografía de ácido nucleico etiquetado 32P. Si la NF-B está presente en la fracción proteica, unirá los nucleótidos, que migrarán más lentamente a través del gel y se presentarán como bandas discretas. Las fracciones nucleares que carecen de NF-B activado (por ejemplo, células de control no estimuladas) no producirán bandas a medida que los nucleótidos migran más rápido hasta el final del gel. Un inconveniente importante de este método es que es en gran medida cuantitativo en el sentido binario (es decir, encendido o desactivado) y no captura adecuadamente diferencias significativas en la capacidad de enlace NF-B. Además, este método no tiene en cuenta las estructuras de cromatina que son funcionalmente importantes para los genes diana NF-B12,13.

Al igual que el método anterior, hay un ensayo "sin desplazamiento" en el que las placas multipozo están recubiertas con nucleótidos que contienen la secuencia de unión NF-B. Después del tratamiento de las células con fracciones nucleares de proteína, NF-B se unirá a los nucleótidos unidos al pozo. A continuación, se añaden anticuerpos anti-NF-B, que interactuarán con el NF-B enlazado y producirán una señal colorimétrica proporcional a la cantidad de NF-B, indicando el grado de activación NF-B. Este método es ventajoso sobre la EMSA en el que no requiere ácidos nucleicos radiomarcados y es cuantitativo, en comparación. Sin embargo, una advertencia de este método es que de nuevo no diferencia entre los estados de cromatina de los genes diana NF-B14.

Otro método por el cual se puede detectar la activación NF-B es mediante la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), mediante el cual el ADN y las proteínas que interactúan se reticulan con el formaldehído y se inmunoprecipitan con anticuerpos específicos anti-NF-B. Los fragmentos de nucleótidos específicos se purifican e identifican a través de la amplificación de PCR o la secuenciación directa de alto rendimiento. Los resultados generados a partir de este método proporcionan resultados semicuantitativos de la actividad de unión NF-B con genes diana. Sin embargo, los resultados dependen en gran medida de las condiciones de fijación y los procesos de purificación en cada paso15.

En los ensayos de translocación nuclear, las células se estimulan para inducir la activación NF-B y luego se fijan. Los anticuerpos anti-p65 se añaden a las células fijas. Alternativamente, la subunidad p65 en sí se puede etiquetar con un péptido fluorescente como verde fluorescente verde (GFP). En cualquier caso, la inmunofluorescencia permitirá la localización de la localización de p65 para determinar la distribución celular. Mediante la medición de la proporción de proteína termosólica y nuclear localizada, los investigadores pueden determinar el estado de activación relativa de NF-B. Un inconveniente de este método es que la inmunofluorescencia es comparativamente lenta, requiere anticuerpos caros, y necesita una experiencia técnica relativamente mayor16.

Los genes reporteros son herramientas comúnmente utilizadas para estudiar los patrones regulatorios y de expresión de un gen de interés. Por lo general, los genes reporteros se construyen a partir de la secuencia promotora de un gen de interés fusionado con un gen que codifica para obtener una proteína fácilmente detectable. Las proteínas con actividades enzimáticas, fluorescencia o propiedades luminiscencias se eligen comúnmente por su capacidad de ensayo y cuantificación. Por lo tanto, la lectura (por ejemplo, luminiscencia, fluorescencia) sirve como una señal para la detección de la expresión génica. Estas construcciones de reportero se pueden introducir en diferentes tipos de células, como células epiteliales o macrófagos.

En el protocolo se describe el uso de una línea celular Clonada HeLa (HeLa 57A) que está establemente transfectó con un reportero de luciferasa que contiene tres copias del consenso b de la región promotora de la cadena de inmunoglobulina17. La expresión de la luciferasa depende de la activación de NF-B, que se produce después de la estimulación celular. Las células estimuladas se lysed fácilmente utilizando tampón de lisis celular proporcionado en el kit de ensayo luciferasa. Una porción del lisado celular se mezcla con el tampones de ensayo de luciferasa que contiene luciferina. Luciferin a is the substrate of luciferase and is required for the generation of light in the presence of luciferase. Después de combinar el tampón de ensayo con el isla, la solución emitirá luz en un proceso conocido como luminiscencia. La cantidad de luz producida, dada en lúmenes, es proporcional a la cantidad de luciferasa presente en el lisado y sirve como una medida de activación NF-B. Las lecturas de lumen se interpretan en comparación con un estándar no estimulado para tener en cuenta la actividad de referencia NF-B y la señal en sí es estable durante varios minutos para permitir una medición confiable. Además, la línea celular HeLa 57A está establemente transtrinfectada con un reportero de nf--B-independiente de la galactosidasa. El reportero de galactosidasa se expresa constitutivamente, y la actividad de la galactosidasa se puede medir para controlar la viabilidad celular o la variación en los números de celda17. Los valores de luciferasa se pueden ajustar a los valores de la galactosidasa y notificarse como aumento del pliegue sobre las células de control no estimuladas.

Dado que NF--B es un factor de transcripción responsable del aumento de la expresión de los genes diana dependientes de NF-B, un experimento de seguimiento para controlar el aumento de la expresión génica dependiente de NF-B es la reacción en cadena cuantitativa de la transcripción inversa de la polimerasa ( RT-qPCR). RT-qPCR es un método altamente sensible por el cual los cambios en la expresión génica se pueden cuantificar en varios órdenes de magnitud. Las células estimuladas y de control se cosechan para el ARN a través de la extracción de fenol-cloroformo. Después de la separación de fase, el ARN se extrae como el componente principal de la capa acuosa. El ARN se precipita y se lava para producir un pellet puro. Este pellet se reconstituye y limpia aún más el ADN contaminante a través del tratamiento con DNase. El ARN puro se transcribe a la inversa para crear ADN complementario (ADNc). Este ADNc puede ser analizado a través de técnicas cuantitativas de PCR, donde la abundancia de una secuencia de ARNm específica se cuantifica para determinar la expresión génica. Esta técnica no dilucida el control traslacional, la modificación post traslacional, la abundancia de proteínas o la actividad proteica. Sin embargo, muchos genes, particularmente los involucrados en procesos pro-inflamatorios, están regulados a través de NF-B y su abundancia de ARNm es indicativa de su expresión.

El método propuesto aquí utiliza una forma rápida y sencilla por la cual la activación NF-B se puede detectar a través de ensayos de luminiscencia de lisato celular. RT-qPCR de la expresión génica diana NF-B se puede utilizar para cuantificar la expresión de genes particulares, así como para validar la actividad funcional de la activación NF-B. Las principales ventajas de un sistema de este tipo son su simplicidad y velocidad, lo que permite el cribado de alto rendimiento de una gama de condiciones que modulan la activación NF-B. Este protocolo es adecuado para otras líneas celulares que expresan un reportero NF-B::luciferase, y se ha demostrado en células RAW264.7 transotrófilos estables18. La cantidad de tiempo necesario para manejar las muestras, desde la lisis celular hasta la generación de una señal de luminiscencia, es mínima y ocupa aproximadamente una hora. La medición de NF-B requiere sólo equipos básicos de laboratorio como placas opacas, un lector de placas capaz de medir la luminiscencia y un software de análisis de datos simple, como un programa de hoja de cálculo.

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Protocol

1. Passaging y Sembrado celular

  1. Mantener las células HeLa 57A en un matraz de 75 cm2 que contenga 10 ml de medios Eagle 's modificados de Dulbecco (DMEM) complementados con un 5% de suero bovino fetal activado por calor (FBS) a 37 oC en una incubadora de CO2 al 5%.
  2. Aspirar los medios de cultivo celular y lavar con 1 ml de solución de trippsina-EDTA al 0,05%. Aspirar trippsina y reemplazar con 1 mL adicional. Colocar el matraz en una incubadora de 37oC durante 4-5 min para permitir que las células se sepárense del matraz.
  3. Agregue 9 ml de medios de cultivo celular y lave suavemente la parte inferior del matraz unas cuantas veces para desalojar las células y formar una suspensión homogénea.
  4. Diluir las células HeLa 57A 1:6 o 1:8 en medios frescos y semilla en matraces nuevos. Pasar las células cuando son 90% confluentes o cada tres días y mantener las células en un mínimo de 25% de confluencia.
  5. Un día antes de la estimulación celular, intente trippsinizar las células HeLa 57A y suspender en 10 ml de medios de crecimiento. Cuente las células en suspensión usando un hemocitómetro y utilice medios de crecimiento para diluir las células a una concentración final de 2.5 x 105 células/ml en un tubo cónico de 50 ml.
  6. Transfiera 250 l de suspensión celular (6,25 x 104 células) a cada pocal de una placa de 48 pocillos. Tapar y girar periódicamente el tubo cónico para asegurar una suspensión celular homogénea. Toque suavemente la placa en el lado para asegurarse de que las células se distribuyen uniformemente en los pocillos.
  7. Transfiera la placa a 37 oC en una incubadora de CO2 al 5% y permita que las células se adhieran y crezcan durante la noche.

2. Preparación de bacterias

  1. Dos días antes de la infección, raya las existencias congeladas de Salmonella en las placas de agar LB para producir colonias individuales. Transfiera las placas a una incubadora a 37oC y permita el crecimiento nocturno.
  2. Un día antes de la infección, añadir 3 ml de caldo de lisógenia (LB) a los tubos de cultivo bacteriano estériles, añadiendo los antibióticos adecuados a los medios.
  3. Usando un bucle de inoculación estéril, elija una sola colonia de cultivos bacterianos rayados y toque el bucle a los medios LB. Tapar los tubos después de inocular y desechar el bucle.
  4. Colocar los tubos en una incubadora de agitación a 37 oC, 180 rpm, y dejar crecer durante la noche.
  5. El día de la infección, recuperar los cultivos bacterianos durante la noche de la incubadora.
  6. Preparar tubos para la subcultura añadiendo 3 ml de LB fresco, que contiene antibióticos cuando sea apropiado.
  7. Transfiera 30 l del cultivo bacteriano nocturno (1 de cada 100 dilución) al medio recién preparado. Colocar los tubos en una incubadora de agitación a 37oC durante 3 h.
  8. Después de la incubación de 3 h, transfiera 1 ml de caldo LB estéril a una cubeta de plástico para que sirva como blanco. Transfiera 900 l de LB a las otras cubetas que se utilizarán para el análisis de la muestra.
  9. Transfiera 100 ml de subcultivo bacteriano a una cubeta que contenga 900 ml de LB y pipeta hacia arriba y hacia abajo varias veces para mezclar. Repita esto para cada suspensión bacteriana.
  10. Encienda el espectrofotómetro para medir la densidad óptica (OD) de los cultivos bacterianos a una longitud de onda de 600 nm (OD600).
  11. Coloque el espacio en blanco en el espectrofotómetro. Tome nota de la orientación, ya que debe haber una marca hacia la parte superior que indica tal.
  12. Cierre la tapa y pulse el botón Blank del espectrofotómetro para obtener la absorbancia de fondo.
  13. Sustituya la cubeta en blanco por una cubeta de muestra en la misma orientación y pulse Leer.
  14. Registre los valores OD600 de estas muestras. Multiplique el valor por 10 para tener en cuenta el factor de dilución.
  15. Diluir el subcultivo bacteriano con LB fresco para lograr un valor de absorbancia de aproximadamente 1,0, que se corresponde aproximadamente con 1 x 109 cfu/mL. Diluir esta suspensión 1:10 en una cubeta y medir la absorbancia, que debe dar un valor de 0,1.
  16. En un tubo nuevo, agregue un volumen apropiado del subcultivo diluido a la LB fresca para lograr una suspensión de 1 x 108 cfu/ml para ser utilizado como un inóculo.
  17. Preparar las diluciones en serie del inóculo transfiriendo 50 ml de suspensión bacteriana a un tubo que contenga 450 ml de PBS estéril (dilución de 10 veces) hasta que se realice una dilución final de aproximadamente 102 cfu/ml.
  18. Transferir 100 l de las dos diluciones más bajas (102 y 103 correspondientes con 10 y 100 unidades formadoras de colonias, respectivamente) a una placa de agar LB y extender la suspensión con un esparcidor celular para obtener colonias individuales. Transfiera estas placas a una incubadora de 37oC e incubadurante durante la noche.
  19. Al día siguiente contar las colonias y calcular la concentración bacteriana del inóculo inicial para determinar la concentración real de inóculo.

3. Infección de células

NOTA: En este punto, las celdas deben tener aproximadamente un 90% de confluencia. Para las células HeLa 57A en una placa de 48 pocillos, esto es aproximadamente 1 x 105 células por pozo. Las células se infectarán con multiplicidad de infección (MOI) de 10, o 106 cfu/pozo.

  1. Etiquetar la tapa de la placa de acuerdo con las condiciones de infección que se utilizarán para cada pocil, con cada condición se realiza en triplicado.
  2. Añadir 10 l del inóculo a los pozos apropiados. Añadir 10 l de LB estéril a los pozos de control no infectados.
  3. Para sincronizar el tiempo de infección, coloque la placa en una centrífuga de mesa y gire a 500 x g durante 5 min, asegurándose de que la placa esté contraequilibrada.
  4. Transfiera las células infectadas a una incubadora deCO2 al 5% a 37 oC durante 1 h.
  5. Coloque una alícuota de medios de cultivo celular en un baño de agua de 37 oC para su uso en el siguiente paso.
  6. Una hora después de la infección, retire los medios de cultivo celular del baño de agua y limpie el exterior con 70% de etanol. Transfiera la placa de cultivo de tejido saque al gabinete de bioseguridad.
  7. Usando una técnica estéril, aspirar los medios de los pozos y reemplazarlo con 250 s de medios de cultivo celular frescos y cálidos.
  8. Devuelva las placas a la incubadora deCO2 del 5% a 37oC durante 4 h adicionales.
  9. Retire las placas de la incubadora de CO2 y aspire el medio de los pozos. Para el análisis de luciferasa continúe en el paso 4.1. Para el aislamiento del ARN proceda al paso 5.1.

4. Análisis de la Luciferasa

  1. Agregue 100 l de tampón de lisis de células 1x a los pozos. El tampón puede necesitar ser diluido primero a una concentración de trabajo, dependiendo del reactivo.
  2. Transfiera la placa a un congelador de -80 oC e incubar durante al menos 30 minutos para garantizar una lisis celular eficiente.
  3. Coloque la placa que contiene el lisado de células congeladas en un banco para descongelar y preparar los reactivos de sustrato de luciferasa de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
  4. Permita que los reactivos de sustrato de luciferas se equilibren a temperatura ambiente.
  5. Encienda el lector de placas y abra el programa de lectura correspondiente. Ajuste la máquina para medir la luminiscencia.
  6. Transfiera 10 ml de cada muestra a un pozo de una placa opaca de 96 pocillos.
  7. Añadir 50 l del reactivo de ensayo de Luciferase utilizando una pipeta multicanal a cada pocal de la placa opaca.
  8. Toque suavemente la placa en el lado para mezclar pozos y asegúrese de que la superficie inferior está cubierta de líquido. Coloque la placa en un lector de placas e inicie la lectura.
  9. Copie los valores de luminiscencia en un programa de hoja de cálculo y trace los resultados.

5. Aislamiento de ARN

  1. Añadir 500 s de tiocianato de guanidio a cada pocayzón y pipetear varias veces para asegurar una lisis completa.
  2. Transfiera el contenido a un tubo de microcentrífuga etiquetado. Mantenga las muestras en hielo tanto como sea posible para mantener la calidad del ARN.
  3. Ponga una centrífuga de mesa a 4 oC y mantenga la centrífuga a esta temperatura para el resto del protocolo.
  4. A cada tubo de muestra, añadir 100 ml de cloroformo, tapar firmemente, y agitar durante 15 s. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
  5. Centrífuga a 12.000 x g durante 15 min a 4oC. Durante este tiempo, prepárese para el siguiente paso de la purificación del ARN etiquetando nuevos tubos.
  6. Transfiera la fase acuosa superior al nuevo tubo que contiene 250 ml de isopropanol, teniendo cuidado de no molestar a las capas media sin eliminar o en la parte inferior.
  7. Almacene el producto no utilizado en un congelador de -80 oC, que también se puede utilizar para el análisis de proteínas. La capa acuosa residual también puede servir como respaldo si se necesita ARN más adelante.
  8. Vortex la mezcla de capa acuosa e isopropanol y dejar que las muestras se sente a temperatura ambiente durante 10 min.
  9. Centrifugar las muestras a 12.000 x g durante 10 min a 4oC.
  10. Retire los tubos de la centrífuga. El precipitado de ARN forma un pellet blanco en el lado y la parte inferior del tubo. Abra los tubos y retire cuidadosamente el sobrenadante derramándose en un contenedor de residuos.
  11. Lave el pellet de ARN añadiendo 500 ml de etanol y vórtice al 75%.
  12. Centrífuga a 8.000 x g durante 5 min a 4oC.
  13. Retire el sobrenadante vertiendo y vuelva a lavar el pellet con 75% de etanol.
  14. Centrífuga a 8.000 x g durante 5 min a 4oC.
  15. Usando una pipeta de pequeño volumen (p. ej., 10-200 l de volumen), aspirar la mayor cantidad posible del sobrenadante, teniendo cuidado de no empujar ningún líquido de nuevo en el tubo o desalojar el pellet con la punta de la pipeta. Si el pellet se desaloja, centrifugar brevemente y volver a tratar de eliminar el sobrenadante.
    1. Seque al aire los pellets de ARN. Si los pellets son visibles para cualquier muestra, revise periódicamente (cada 5 minutos) para ver si cambian de blanco a claro, lo que indica que están secos. Una vez que los pellets comiencen a girarse claros, agregue 20 s de agua libre de RNase ultrapura para disolver el ARN.
    2. Si los pellets no eran inicialmente visibles para ninguna muestra, simplemente agregue agua ultrapura 5 min después de eliminar el sobrenadante.
  16. Para aumentar la solubilidad, pase la solución unas cuantas veces a través de una punta de pipeta e incubar durante 10 min a 55-60 oC.

6. Tratamiento dNase del ARN

  1. Para mantener la integridad del ARN, almacene las muestras de ARN en hielo a menos que se indique lo contrario. En este momento, el buffer 10x DNase se puede quitar del congelador y permitir que se descongele sobre hielo.
  2. Prepare el espectrofotómetro para el análisis de muestras limpiando todas las superficies de análisis de muestras con un paño libre de pelusas.
  3. Realice una medición de fondo antes del análisis. Para ello, cargue el sensor con 1,5 ml de la misma agua ultrapura utilizada para disolver los gránulos de ARN. Pulse el botón Leer en blanco para generar una lectura en segundo plano.
  4. Utilice el paño libre de pelusas para limpiar la superficie de carga de muestras del instrumento. Repita este paso después de cada lectura de muestra.
  5. Cargue 1,5 l de ARN resuspendido en el portamuestras y seleccione Leer muestra. Repita el proceso hasta que se hayan leído todas las muestras.
  6. Preparar la mezcla maestra de DNase combinando 2,4 ml de tampón de 10 x DNase y 1 l de DNase, por muestra, en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Prepare la mezcla maestra para dos volúmenes adicionales.
  7. Mezcle la mezcla maestra moviendo el tubo varias veces. Centrifugar brevemente el tubo para recoger el contenido en la parte inferior del tubo. Añadir 3,4 l de mastermix a 20 s de muestra de ARN. Mezclar el contenido moviendo y centrifugando brevemente, como antes.
  8. Transfiera las muestras a un bloque de calor fijado a 37 oC durante 20 minutos. Retire el reactivo de inactivación DNase del congelador y descongele a temperatura ambiente.
  9. 20 minutos después de colocar muestras en el bloque de calor, transfiera las muestras a un bastidor de tubo colocado en el banco de trabajo.
  10. Reorticice suavemente el contenido del reactivo de inactivación DNase. Transfiera 2,6 l de reactivo de inactivación DNase a los tubos que contienen ARN y luego deslice los tubos para crear una mezcla homogénea.
  11. Centrifugar las muestras a 12.000 x g durante 1 min.
  12. Pipetee cuidadosamente el sobrenadante a un tubo nuevo y etiquetado.

7. Transcripción inversa del ARNm al ADNc

  1. Preparar una mezcla maestra en función de la cantidad de muestras más dos adicionales para contabilizar la pérdida a través del pipeteo(Tabla 1). Utilice 1 g de ARN y añada H2O a un volumen de 50 s en total.
Reactivo Volumen (L) Concentración final
MgCl2 (25mM) 3.5 1,75 mM
Búfer de transcripción inversa (10x) 5 1x
mezcla dNTP (10 m, cada una) 2.5 500 nm
hexamer al azar (100 m) 1.25 2,5 m
Transcriptasa inversa multiscribe (50 U/L) 1 1 U/L
Inhibidor de la RNase (20 U/L) 1.25 1.25 U/L
ARN (1 g) 20 ng/uL
H2O arriba hasta 50

Tabla 1: Componentes y receta para la mezcla maestra de transcripción inversa.

  1. Tapar las muestras firmemente y etiquetar los tubos PCR en el lado como etiquetas en la tapa se pueden retirar de la tapa calentada del termociclador más tarde. Mezclar por vórtice.
  2. Centrifugar brevemente los tubos PCR para recoger muestras en la parte inferior del tubo.
  3. Coloque los tubos PCR en un termociclador y ejecute las muestras bajo los siguientes ajustes:
    25 oC durante 10 min, 48oC durante 30 min, 95oC durante 5 min y, a continuación, mantener a 10oC.
  4. Transfiera tubos que contengan ADNC recién sintetizado a un congelador de -20 oC o utilícelos inmediatamente en el análisis qPCR.

8. Preparación y carga de la placa para el análisis RT-qPCR

  1. Antes de comenzar, planifique la configuración de la placa qPCR de 384 pocillos para el análisis de muestras.
  2. Imprimaciones de descongelación y ADNc en hielo.
  3. Prepare una mezcla maestra (ver Tabla 2), más aproximadamente un 10% adicional para tener en cuenta las pérdidas a través del pipeteo.
Reactivo Volumen (L)
Imprimación de 10 M F 1
Imprimación de 10 M R 1
Ultrapure H2O 4
2x SYBR verde 10

Tabla 2: Componentes y receta para la mezcla maestra qPCR.

  1. Vortex la mezcla maestra y dispensar 8 l en los pocillos de la placa de 384 pocillos utilizando una pipeta repetidora. Las muestras se analizarán por duplicado para cada combinación de muestras de imprimación y ADNr.
  2. Usando una pipeta P10 (o más pequeña), transfiera 2 l de ADNc a pozos duplicados para cada conjunto de imprimación que se analizará. Sustituya las puntas después de cada poca para evitar la contaminación cruzada.
  3. Selle la placa aplicando cuidadosamente la película adhesiva en la superficie, asegurándose de que todos los pocillos estén cubiertos. Presione la película con una paleta de sellado o un rodillo para sellar firmemente.
  4. Coloque la placa en una centrífuga, con una placa vacía como contrapeso. Centrifugar la placa a 500 x g durante 5 min.

9. Ejecución del termociclador para el análisis qPCR

  1. Encienda el ordenador y el instrumento PCR en tiempo real.
  2. Abra el software RT-qPCR y seleccione Nuevo experimento.
  3. En la pestaña Configuración, seleccione Propiedades del experimento, donde se pueden establecer los parámetros de la ejecución.
  4. Defina el nombre del experimento,que establecerá el nombre de archivo y la configuración que se usa para almacenar los resultados.
  5. Para la selección de instrumentos, seleccione el instrumento conectado actualmente que va a ejecutar el análisis. Seleccione método de ejecución de CT comparativo (Ct).
  6. Seleccione Reactivos verdes SYBR como el tinte de ADN fluorescente que se utilizará y Estándar como la velocidad de rampa.
  7. Asegúrese de que la casilla situada junto a Incluir curva de fusión esté marcada.
  8. En la pestaña Definir, asigne objetivos (es decir, genes que se van a amplificar) y muestras (es decir, condiciones experimentales).
  9. Seleccione la ficha Asignar.
  10. Seleccione Método de ejecución. Utilice los parámetros para el análisis enumerados en (Tabla 3).
Hold Stage Etapa PCR Etapa de curva de fusión
Paso 1 Paso 2 Paso 1 Paso 2 Paso 1 Paso 2 Paso 3
Temp 50 oC 95 oC 95 oC 60 oC 95 oC 60 oC 95 oC
hora 2:00 10:00 0:15 1:00 0:15 1:00 0:15
Recopilación de datos
Número de ciclos 1x 40x 1x

Tabla 3: Parámetros de ciclo para termociclador.

  1. Coloque la placa de 384 pocillos en el termociclador e inicie el análisis.

10. Análisis de los resultados de qPCR con el método Delta-delta Ct (2-C)

  1. Analice los resultados generados a partir de la reacción qPCR en busca de errores que puedan interferir con el análisis posterior. El sistema marcará automáticamente muchos errores.
  2. Para imprimaciones correctamente construidas, las curvas de fusión solo deben tener un pico. Excluya los pozos que contengan una curva de fusión con más de un pico del análisis posterior.
  3. Exporte los valores de Ct a un programa de hoja de cálculo para analizar los datos utilizando el método de la c.Ct. Se proporciona un formato sugerido (Tabla 4). La última columna es el cambio de expresión de pliegue de la muestra, en relación con los ejemplos de control.
Gene de limpieza (GAPDH) Gene de interés (IL6)
Ct1 Ct2 Ave Ct Ct1 Ct2 Ave Ct •Ct Ave -Ct ctrls • Ct 2o(Ct) Geomean
Control 1 15.33 15.37 15.35 26.81 26.91 26.86 11.51 10.51 1.00 0.50 1.00
Control 2 16.83 16.77 16.80 26.89 26.92 26.91 10.11 10.51 -0.41 1.33
Control 3 17.56 17.53 17.54 27.38 27.56 27.47 9.93 10.51 -0.59 1.50
Sl1344 1 15.50 15.41 15.45 22.15 22.13 22.14 6.69 10.51 -3.83 14.21 13.23
SL1344 2 16.02 15.98 16.00 23.01 22.96 22.98 6.98 10.51 -3.53 11.57
SL1344 3 17.27 17.30 17.28 23.99 23.98 23.98 6.70 10.51 -3.82 14.09
sipA sopB sopE2 1 15.38 15.41 15.39 23.31 23.09 23.20 7.80 10.51 -2.71 6.56 7.29
sipA sopB sopE2 2 16.01 16.05 16.03 23.89 23.92 23.91 7.88 10.51 -2.64 6.23
sipA sopB sopE2 3 16.78 16.78 16.78 24.02 24.06 24.04 7.27 10.51 -3.25 9.49
sipA sopB sopE2 sopE 1 15.52 15.60 15.56 27.04 27.03 27.03 11.47 10.51 0.96 0.51 0.79
sipA sopB sopE2 sopE 2 15.56 15.59 15.57 26.37 26.42 26.39 10.82 10.51 0.31 0.81
sipA sopB sopE2 sopE 3 15.91 15.92 15.91 26.24 26.12 26.18 10.27 10.51 -0.25 1.19

Tabla 4: Formato para analizar datos qPCR.

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Representative Results

El ensayo descrito aquí se centra en la activación del factor de transcripción NF-B utilizando un reportero de luciferasa dependiente de NF-B que está establemente transctado en una línea de células de HeLa. La NF-B activada se traslada al núcleo donde se une a los sitios de unión B de los genes diana, incluidas las citoquinas proinflamatorias IL6 e IL23. En la Figura 1se muestra una descripción general de la activación NF-B. La bacteria gramnegativa Salmonella enterica serovar Typhimurium se utilizó en este estudio como un activador de NF-B y la posterior expresión de IL6 (Figura 2). Uno de los principales factores de virulencia requeridos para la patogénesis es el Sistema de Secreción Tipo III-1 (T3SS-1) que permite S. Typhimurium para infectar las células e inducir la activación NF-B. La función del T3SS-1 es suministrar proteínas bacterianas, llamados efectores, en las células huésped. Aquí las proteínas efectoras se dirigen a numerosas vías de señalización celular para mediar la invasión de las células epiteliales del huésped. La activación NF-B inducida por S. Typhimurium depende principalmente de las proteínas efectoras T3SS-1 SopE, SipA, SopB y SopE218. Aquí, las células de HeLa 57A se infectaron con el tipo salvaje S. La cepa Typhimurium SL1344 y dos cepas mutantes que carecen de tres(SipA, SopB, SopE2)o cuatro(SipA, SopB, SopE2, SopE)proteínas efectoras. La Figura 2 es un experimento representativo de activación de luciferasa dependiente de NF-B(Figura 2A)y expresión génica IL6 (Figura 2B) en células HeLa 57A infectadas con la S. Strains Typhimurium. La infección con la cepa silvestre SL1344 induce una señal de luciferasa fuerte que se reduce en las células infectadas con el SipA, SopB, SopE2 triple mutante (respuesta dependiente de SopE), y reducida a niveles de control con el SipA, SopB, SopE2, SopE 2, SopE mutant quadruple mutant. Las unidades de luminiscencia relativa (RLU) se correlacionan con los niveles de expresión IL6 (Figura 2). La Figura 3 representa los resultados generados a partir del análisis RT-qPCR.

Figure 1
Figura 1: Esquema de la activación NF-B y lecturas descendentes. Descrito anteriormente, NF-B se retiene en el citosol en un estado inactivo por la proteína inhibitoria I-B. Tanto los estímulos internos como externos pueden contribuir a la activación del IKK, que fosforila el I-B y causa su posterior degradación proteosomal. La degradación de I-B revela la señal de localización nuclear de NF-B, que promueve la translocación. En el núcleo, la NF-B activada se une a los sitios de unión B de los genes diana, promoviendo su transcripción y expresión. Los genes objetivo, como las citoquinas IL6 e IL23,se expresan y cuantifican a través de RT-qPCR. En las células HeLa 57A luciferasa se expresa después de la activación NF-B, que se puede cuantificar a través de ensayos de luminiscencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Datos representativos del ensayo de luminiscencia y análisis RT-qPCR siguientes a S. Infección por Typhimurium de células HeLa 57A. 1 x 105 HeLa 57A células fueron infectadas con 106 cfu (MOI 10) de la fase de registro S. Typhimurium wild tipo SL1344, o las cepas mutantes que carecen de SipA, SopB y SopE2, y SipA, SopB, SopE2 y SopE. Después de 1 h, los medios de comunicación fueron reemplazados, y la incubación continuó durante cuatro horas adicionales. (A) Las células se procesaron para la expresión de luciferasa a través de ensayos de luminiscencia. (B) Se extrajeron células de ARN, que se utilizó para el análisis RT-qPCR. Se muestra la expresión relativa de los genes diana utilizando el método delta-delta Ct (2-. Se muestra nalquéla desviación media y estándar de los pozos triplicados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Resumen de resultados generados a partir del análisis RT-qPCR. (A) Se muestra una gráfica de amplificación para los pozos que amplifican GAPDH a partir de células HeLa 57A infectadas con S. Typhimurium. (B) La gráfica de curva de fusión de los pozos que contienen imprimaciones GAPDH muestra un único pico de fusión correspondiente a aproximadamente 84 oC. (C) Duplicar pozos que contengan imprimaciones para IL-6. Uno de los pozos muestra un segundo pico de fusión, como se indica mediante una flecha negra, y debe excluirse del análisis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La contribución principal del protocolo descrito es que proporciona un método rápido y fácil para detectar la activación NF-B en las células, lo que permite un análisis de alto rendimiento de múltiples condiciones estimulantes o fármacos que afectan a la activación NF-B. Aquí, describimos un protocolo para la activación NF-B en las células HeLa infectadas por Salmonella. Estas células se pueden utilizar para la infección con otros patógenos, así como para estudiar el impacto de la infección bacteriana en la activación de NF-B. Además, la activación de la luciferasa dependiente de NF-B en las células HeLa 57A se puede utilizar para detectar activadores o inhibidores de las vías de señalización que conducen a la activación NF-B. Aquí, sembramos células HeLa 57A en placas de 48 pocillos, pero estos experimentos se pueden escalar hasta placas de 96 o incluso 384 pocillos para permitir más muestras por experimento. Las células HeLa 57A expresan constitutivamente LacZ, que se puede medir como un control interno para el número de celda y la viabilidad utilizando ensayos de gal. El protocolo descrito aquí es aplicable para su uso en líneas celulares, ya sea de forma estable o transfigurada transitoriamente con una construcción de reportero NF-B::luciferase. La línea de células de macrófagos RAW264.7 ya se ha utilizado para tal fin18. Es importante destacar que este método no distingue entre la activación de los diferentes homo/heterodímeros de las cinco subunidades NF-B distintas. Los diferentes complejos homo heterodimeros NF-B tienen diferentes afinidades para las secuencias promotoras, así como diferentes consecuencias transcripcionales21. Es posible que se pierda la activación de un dimer NF-B específico utilizando el reportero descrito aquí debido a la baja unión de afinidad a los sitios de unión de B desde la región promotora de la cadena de inmunoglobulina.

Es importante tener en cuenta que las condiciones adecuadas para estimular una línea celular pueden no ser directamente aplicables a otra. Por lo tanto, se recomienda encarecidamente que las condiciones del ensayo se optimizen en cada sistema de ensayo. El tiempo de infección, el MOI, la duración del tratamiento farmacológico, la dosis de medicamentos y las condiciones de sembración son consideraciones importantes a tener en cuenta a la hora de evaluar la activación de NF-B. Por ejemplo, los macrófagos RAW264.7 son más sensibles a la infección por Salmonella que requieren diferentes condiciones para producir una señal de luminiscencia similar como se ve con las células HeLa 57A18.

Durante las mediciones de luminiscencia, no es raro que los pozos de borde tengan valores considerablemente diferentes a los otros pozos que fueron estimulados de manera similar. Esto es típicamente debido a las mayores tasas de evaporación de los pozos de borde en la placa que conduce a una mayor concentración de drogas. Esto se puede abordar mediante la adición de medios libres de suero al espacio entre los pozos, para las placas que lo permiten, alterar las combinaciones de tapa / placa para reducir la evaporación, u omitir los pozos de borde completamente si persisten los problemas.

Expresado en células de mamíferos, la lucilelucifera tiene una vida media de varias horas y generalmente se considera estable para los propósitos de la mayoría de los ensayos de reportero22. Las duraciones de tratamiento más largas que las descritas aquí pueden llevarse a cabo de forma fiable. Sin embargo, el sistema de ensayo luciferasse utilizado aquí produce una señal estable sólo durante el primer minuto y se deteriora rápidamente después de eso. Por lo tanto, es muy importante que la medida de luminiscencia se haga rápidamente después de mezclar el lisado celular y el sustrato.

Nf--B es un factor de transcripción para una gran variedad de genes, incluyendo citoquinas y quimioquinas (es decir, Il6 e Il23). La medición de la actividad de luciferasa dependiente de NF-B no significa necesariamente que se expresen estas citoquinas y quimioquinas. Este método puede complementar las técnicas de cuantificación molecular existentes sirviendo como una posible primera pantalla para la caracterización de las condiciones que afectan a la actividad NF-B, que luego se puede validar funcionalmente a través de RT-qPCR. La validación funcional de la activación NF-B también se puede realizar mediante análisis de manchas occidentales o ensayos funcionales específicos de una proteína de interés en los casos en que la cuantificación del ARNm puede no ser adecuada. Este es el caso de la interleucina-beta (Il1b), un gen cuya transcripción es inducida por la unión NF-B, pero el producto proteico requiere modificación post traslacional para formar el producto maduro23,24.

El protocolo específico de aislamiento de ARN descrito aquí no es el único que se puede emplear para su uso en el análisis RT-qPCR, y otros métodos preferidos, como los kits disponibles comercialmente, se pueden utilizar en su lugar. Es importante tener en cuenta que la calidad del ARN es muy importante para el proceso, por lo que el ARN debe mantenerse en hielo tanto como sea posible para evitar la degradación. Es importante ejecutar reacciones duplicadas en las reacciones RT-qPCR para determinar que las reacciones PCR son consistentes, ya que el pipeteo de volúmenes tan pequeños al cargar la placa de 384 pocillos a menudo puede ser causa de error. Los valores ct del gen de limpieza deben ser coherentes entre las muestras, y las desviaciones de esto pueden ser indicativas de pasos de limpieza ineficientes o discrepancias en las concentraciones de ARN durante la transcripción inversa que pueden afectar a los resultados finales. También es importante comprobar la curva de fusión después de cada experimento qPCR. La presencia de un pico sugiere que las imprimaciones qPCR están amplificando un solo gen. Múltiples curvas sugieren que hay amplificación de genes fuera del objetivo o presencia de dimers de imprimación. En cualquier caso, varios picos presentes en la curva de fusión sugieren que las imprimaciones deben ser rediseñadas para asegurar la especificidad. Con tanto espacio para la variabilidad, el ejercicio y el refinamiento de una buena técnica en cada paso son esenciales para generar resultados precisos y reproducibles.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

La investigación en el laboratorio Keestra-Gounder está respaldada por subvenciones del NIAID del NIH bajo el número de premio R21AI122092 y de la Asociación Americana de la Diabetes bajo el Premio Número 1-18-JDF-035.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adhesive film VWR International 60941-070
Chloroform Fisher Bioreagents C298-500
DMEM Thermo Fisher 11665092
DNAse treatment kit Qiagen 79254
dNTPs Promega U1511
Ethanol Fisher Bioreagents BP2818100 molecular grade
FBS Sigma-Aldrich F0926
HeLa 57A cells Ref # 15
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems 4368814
Isopropanol Fisher Bioreagents BP26181
Kanamycin Fisher Bioreagents BP906-5
LB agar Fisher Bioreagents BP1425-500
Lysogeny broth Fisher Bioreagents BP1426-500
MgCl2 Fisher Chemical
NanoDrop ND-1000 Thermo Scientific spectrophotometer
Promega luciferase assay system Promega E1501 Cell lysis buffer & luciferin substrate
Random Hexamers Thermo Scientific SO142
Real-time GAPDH forward primer 5'-CCAGGAAATGAGCTTGAC
AAAGT-3'
Real-time GAPDH reverse primer 5-'CCCACTCCTCCACCT
TTGAC-3'
Real-time IL-23 forward primer 5-'GAGCCTTCTCTGCTCCC
TGAT-3'
Real-time IL-23 reverse primer 5'-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3'
Real-time IL-6 forward primer 5'-GTAGCCGCCCCACACAGA-3'
Real-time IL-6 reverse primer 5'-CATGTCTCCTTTCTCAGG
GCTG-3'
Reverse Transcriptase Applied Biosystems 4308228
RNAse inhibitor Thermo Scientific EO0381
RT buffer Promega A3561
SL1344 Ref # 17
SL1344 ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039 Ref # 18
SL1344 ΔsopE ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039 Ref # 18
SYBR green Applied Biosystems 4309155 2x mastermix
Tri-reagent Molecular Research Center TR 118 guanidine thiocyanate
Trypsin -EDTA Thermo Fisher 25300054 0.05% Trypsin-EDTA
Ultrapure water Fisher Bioreagents BP248450
Well plate for PCR VWR International 89218-294 384-well plate

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References

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