Attivazione e quantificazione dell'espressione genica infette da NF-B nelle cellule di coltura dei tessuti infetti

Immunology and Infection

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Summary

Qui, presentiamo un protocollo per misurare rapidamente e facilmente il fattore nucleare kappa-luce-catena-potenziatore delle cellule B attivate (NF-B) attivazione in linee cellulari che esprimono NF-B::luciferate reporter costruisce, attraverso misurazioni di luminescenza nel lisato di cella. Inoltre, l'espressione genica viene determinata tramite RT-qPCR isolata da cellule infettate da Salmonella Typhimurium.

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Mendez, J. M., Keestra-Gounder, A. M. NF-κB-dependent Luciferase Activation and Quantification of Gene Expression in Salmonella Infected Tissue Culture Cells. J. Vis. Exp. (155), e60567, doi:10.3791/60567 (2020).

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Abstract

Il fattore di trascrizione dimerico NF-B regola molte vie di risposta cellulare, comprese le vie infiammatorie inducendo l'espressione di varie citochine e chemiochine. La NF-B è espressa in modo conforme ed è sequestrata nel citosol dal fattore nucleare della proteina inibitoria del potenziatore del gene del polipeptide a luce kappa nell'inibitore delle cellule B, alfa (IB). L'attivazione di NF-B richiede la degradazione di I'B, che espone poi un segnale di localizzazione nucleare su NF-B e promuove il suo traffico al nucleo. Una volta nel nucleo, NF-B si lega alla regione promotore dei geni bersaglio NF-B come l'interleumina 6 (IL-6) e l'IL-23, per promuoverne l'espressione.

L'attivazione di NF-B si verifica indipendentemente dalla trascrizione o dalla traduzione. Pertanto, lo stato di attivazione di NF-B deve essere misurato quantificando nF-B in modo specifico nel nucleo, sia quantificando l'espressione dei geni bersaglio NF-B. In questo protocollo, le cellule trattate stabilmente con un costrutto reporter NF-B::luciferate vengono analisi per l'attivazione di NF-B utilizzando tecniche di coltura dei tessuti in vitro. Queste cellule sono infettate da Salmonella Typhimurium per attivare NF-B, che traffica verso il nucleo e si lega a siti bB nella regione promotrice di luciferasi, inducendone l'espressione. Le cellule vengono lisci e analizzate con il sistema di analisi luciferasi. La quantità di luciferasi prodotta dalle cellule è correlata all'intensità del segnale di luminescenza, che viene rilevato da un lettore di piastre. Il segnale di luminescenza generato da questa procedura fornisce un metodo rapido e altamente sensibile mediante il quale valutare l'attivazione di NF-B in una serie di condizioni. Questo protocollo utilizza anche la trascrizione inversa quantitativa PCR (RT-qPCR) per rilevare i livelli relativi di mRNA che sono indicativi dell'espressione genica.

Introduction

La famiglia di proteine a fattore nucleare B (NF-B) sono importanti attivatori di trascrizione che regolano l'espressione genica in vari percorsi biologici. L'attivazione di NF-B induce la trascrizione dei geni bersaglio, molti dei quali sono importanti per le risposte immunitarie e infiammatorie, la proliferazione cellulare, le risposte allo stress e la progressione del cancro1,2. La NF-B svolge un ruolo fondamentale nella mediazione degli esiti infiammatori precoci per la bonicccanazione degli agenti patogeni. Considerati i numerosi processi biologici mediati dall'attivazione di NF-B, le interruzioni nella segnalazione possono avere gravi conseguenze per la salute e la malattia. La perdita di mutazioni di funzione nella segnalazione di NF-B è associata in diversi fenotipi di carenza immunitaria, mentre il guadagno delle mutazioni di funzione è associato a diversi tipi di cancro, tra cui linfomi a cellule B e tumori al seno3. Inoltre, molti patogeni hanno dimostrato di modulare direttamente lo stato di attivazione di NF-B attraverso l'espressione di fattori di virulenza4,5,6,7.

L'attivazione di NF-B è nota per essere una conseguenza di molti stimoli variabili, tra cui prodotti batterici come lipopolioaccharides (LPS), flagellina e peptidoglycans noti come modelli molecolari associati a patogeni (PUP). Questi PPR sono rilevati dai recettori di riconoscimento dei pattern (PRR), come i recettori simili a pedoni (TLR) e i recettori simili a Nod (NLR) che portano all'attivazione di NF-B e alla successiva espressione di una serie di geni infiammatori dipendenti daNF-B 8. Oltre all'attivazione da parte dei PUP, altri prodotti batterici, come le proteine degli effetti batterici, possono indurre l'attivazione di NF-B. È interessante notare che i batteri esprimono anche proteine efmarcatori che attenuano attivamente il percorso NF-EB e ne migliorano la patogenicità, sottolineando l'importanza di NF-B come mediatore essenziale dell'immunità9.

Ci sono cinque diverse sottounità che formano i dimeri NF-B; p50, p52, RelA (p65), RelB e cRel. I due principali eterodimeri NF-B sono i dimeri p50:RelA e p52:RelB. I dimeri NF -B attivati si legano a siti di DNA, noti come siti B, nelle regioni promotrice ed potenziatore di vari geni bersaglio. In condizioni omeostatiche normali, La NF-B interagisce con una famiglia di proteine inibitori note come proteine IB per rimanere inattive. Al momento della stimolazione, ioB è fosforillato da IB Kinase (IKK), che permette di essere mirato per l'ubiquitinazione, e successivamente la degradazione. La degradazione di I'B attiva NF-B rivelando un segnale di localizzazione nucleare. La NF-B si trasferisce quindi nel nucleo, dove lega i siti B nella regione promotrice dei geni bersaglio e promuove la trascrizione10. Pertanto, l'attivazione dell'NF-B upregulatee l'espressione dell'mRNA dei geni bersaglio NF-B, e questo cambiamento può essere misurato attraverso analisi di quantificazione dell'RNA come RT-qPCR11.

Esistono diversi metodi e sono comunemente utilizzati per la misurazione dell'attivazione di NF-B, tra cui i saggi elettroforici del cambio di mobilità (EMSA), la traslocazione nucleare e i saggi dei reporter genici. EMSA viene utilizzato per rilevare complessi proteici con acidi nucleici. Le cellule stimolate sono frazionate per isolare le proteine nucleari, compreso il translocare NF-B, che viene poi incubato con nucleotidi radioetichettati contenenti il dominio di legame NF-B. I campioni sono eseguiti su un gel e immagini per autoradiografia dell'acido nucleico con etichetta 32P. Se nella frazione proteica è presente NF-B, i nucleotidi mischiano più lentamente attraverso il gel e presenti come bande discrete. Le frazioni nucleari di cellule prive di NF-B (ad esempio, cellule di controllo non stimolate) non produrranno bande in quanto i nucleotidi migrano più velocemente verso la fine del gel. Uno dei principali inconvenienti di questo metodo è che è in gran parte quantitativo in senso binario (cioè, on o off) e non cattura adeguatamente differenze significative nella capacità di associazione NF-EB. Inoltre, questo metodo non considera le strutture di cromatina che sono funzionalmente importanti per i geni bersaglioNF-B 12,13.

Simile al metodo precedente, c'è un saggio "non-shift" in cui le piastre multi-bene sono rivestite con nucleotidi contenenti la sequenza di rilegatura NF-B. Dopo il trattamento delle cellule con frazioni nucleari di proteine, l'NF-B si legherà ai nucleotidi legati al pozzo. Vengono quindi aggiunti anticorpi anti-NF-B, che interagiranno con il limite NF-B e produrranno un segnale colorimetrico proporzionale alla quantità di NF-B, indicando il grado di attivazione di NF-B. Questo metodo è vantaggioso rispetto all'EMSA in quanto non richiede acidi nucleici radioetichettati ed è in confronto. Tuttavia, un'avvertenza di questo metodo è che ancora una volta non distingue tra gli stati cromatina dei geni bersaglio NF-B14.

Un altro metodo con cui può essere rilevata l'attivazione di NF-B è l'immunoprecipitazioni della cromatina (ChIP), in base al quale il DNA e le proteine interagenti sono collegati tra formaldeide e sono dotati di anticorpi anti-NF-B specifici. I frammenti di nucleotide specifici vengono quindi purificati e identificati tramite amplificazione PCR o sequenziamento diretto ad alta produttività. I risultati generati da questo metodo forniscono risultati semi-quantitativi dell'attività di legame NF-B con geni bersaglio. Tuttavia, i risultati dipendono fortemente dalle condizioni di fissazione e dai processi di purificazione ad ogni passaggio15.

Nei saggi di traslocazione nucleare, le cellule vengono stimolate a indurre l'attivazione di NF-B e quindi a fissarle. Gli anticorpi anti-p65 vengono aggiunti alle cellule fisse. In alternativa, la sottounità p65 stessa può essere etichettata con un peptide fluorescente come verde fluorescente verde (GFP). In entrambi i casi, l'immunofluorescenza consentirà l'imaging della localizzazione di p65 per determinare la distribuzione cellulare. Misurando la percentuale di proteine localizzate citosoliche e nucleari, gli investigatori possono determinare lo stato di attivazione relativo di NF-B. Uno svantaggio di questo metodo è che l'immunofluorescenza richiede relativamente tempo, richiede anticorpi costosi e richiede relativamente maggiore competenza tecnica16.

I geni reporter sono strumenti comunemente usati per studiare i modelli regolatori ed espressivi di un gene di interesse. Tipicamente, i geni reporter sono costruiti dalla sequenza promotrice di un gene di interesse fuso in una codifica genica per una proteina facilmente rilevabile. Le proteine con attività enzimatiche, fluorescenza o proprietà di luminescenza sono comunemente scelte per la loro capacità di essere sapienti e quantificate. Pertanto, la lettura (ad esempio, luminescenza, fluorescenza) serve come segnale per la rilevazione dell'espressione genica. Questi costrutti reporter possono quindi essere introdotti in diversi tipi di cellule, come cellule epiteliali o macrofagi.

Descritto nel protocollo è l'uso di una linea cellulare HeLa clonata (HeLa 57A) che viene sfrattata stabilmente con un reporter luciferasi contenente tre copie del consenso di B della regione promotrice della catena immunoglobulina17. L'espressione di luciferasi dipende dall'attivazione di NF-B, che si verifica dopo la stimolazione cellulare. Le cellule stimolate sono facilmente lised utilizzando cell lysis buffer fornito nel kit di analisi luciferasi. Una parte della cella lysate viene quindi mescolata con lucidferase assay buffer che contiene luciferina. Luciferina è il substrato della luciferasi ed è necessaria per la generazione di luce in presenza di luciferasi. Dopo aver combinato il buffer di analisi con il lisato, la soluzione emetterà luce in un processo noto come luminescenza. La quantità di luce prodotta, data nei lumamen, è proporzionale alla quantità di luciferasi presente nel lisato e serve come misura dell'attivazione di NF-B. Le letture del lume vengono interpretate rispetto a uno standard non stimolato per tenere conto dell'attività di base di NF-B e il segnale stesso è stabile per diversi minuti per consentire misurazioni affidabili. Inoltre, la linea cellulare HeLa 57A è stata sfettata con un reporter NF-galactosidase indipendente da NF. Il reporter z-galactosidase è espresso in modo stitutive, e l'attività di galactosidasi può essere misurata per controllare la vitalità cellulare o la variazione nei numeri di cella17. I valori di luciferasi possono quindi essere regolati in base ai valori di galactosidasi z e segnalati come aumento di piegatura rispetto alle cellule di controllo non stimolate.

Dal momento che l'NF-B è un fattore di trascrizione responsabile della maggiore espressione dei geni bersaglio dipendenti da NF-B, un esperimento di follow-up per il controllo dell'espressione genica aumentata dipendente da NF-B è una reazione quantitativa della sequenza inversa alla catena della polimerasi ( RT-qPCR). RT-qPCR è un metodo molto sensibile con il quale i cambiamenti nell'espressione genica possono essere quantificati su diversi ordini di grandezza. Le cellule stimolate e di controllo vengono raccolte per l'RNA attraverso l'estrazione del fenolo-cloroformio. Dopo la separazione di fase, l'RNA viene estratto come componente principale dello strato acquoso. L'RNA viene quindi precipitato e lavato per produrre un pellet puro. Questo pellet viene poi ricostituito e ulteriormente pulito dal DNA contaminante attraverso il trattamento DNase. L'RNA puro viene quindi invertito trascritto per creare DNA complementare (cDNA). Questo cDNA può quindi essere analizzato attraverso tecniche di PCR quantitativa, dove l'abbondanza di una specifica sequenza di mRNA viene quantificata per determinare l'espressione genica. Questa tecnica non chiarisce il controllo traslazionale, la modifica post-traduzionale, l'abbondanza di proteine o l'attività proteica. Tuttavia, molti geni, in particolare quelli coinvolti nei processi pro-infiammatori, sono regolati tramite NF-B e la loro abbondanza di mRNA è indicativa della loro espressione.

Il metodo qui proposto utilizza un modo semplice e veloce con cui l'attivazione di NF-B può essere rilevata tramite saggi di luminescenza del lisato cellulare. Rt-qPCR dell'espressione genica bersaglio NF-B può essere utilizzato per quantificare l'espressione di particolari geni, nonché per convalidare l'attività funzionale dell'attivazione di NF-B. I principali vantaggi di un tale sistema sono la sua semplicità e velocità, che consente uno screening ad alta produttività di una serie di condizioni che modulano l'attivazione di NF-B. Questo protocollo è adatto per altre linee cellulari che esprimono un reporter NF-B::luciferase ed è stato dimostrato in celle RAW264.7 trascurabili stabilmente18. La quantità di tempo necessaria per gestire i campioni, a partire dalla lisi cellulare alla generazione di un segnale di luminescenza, è minima e richiede l'arco di circa un'ora. La misurazione di NF-B richiede solo attrezzature di laboratorio di base come piastre opache, un lettore di lastre in grado di misurare la luminescenza e un semplice software di analisi dei dati come un programma di fogli di calcolo.

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Protocol

1. Passaggio cellulare e seeding

  1. Mantenere le cellule HeLa 57A in un flacone da 75 cm2 contenente 10 mL del supporto Aquila (DMEM) modificato di Dulbecco, integrato con il 5% di calore inattivato dal siero bovino fetale (FBS) a 37 gradi centigradi in un incubatore di CO2 del 5%.
  2. Supporti di coltura cellulare aspirati e lavare con 1 mL di 0.05% soluzione trypsin-EDTA. Pioppo e sostituire con un ulteriore 1 mL. Collocare il pallone in un'incubatrice di 37 gradi centigradi per 4-5 min per consentire alle cellule di staccarsi dal flacone.
  3. Aggiungere 9 mL di coltura cellulare e lavare delicatamente il fondo del pallone un paio di volte per spostare le cellule e formare una sospensione omogenea.
  4. Diluire le cellule HeLa 57A 1:6 o 1:8 in supporti freschi e seme in nuovi flaconi. Passare le cellule quando sono 90% confluente o ogni tre giorni e mantenere le cellule ad un minimo di 25% confluenza.
  5. Un giorno prima della stimolazione cellulare, provare le cellule HeLa 57A e sospendere in 10 mL di mezzi di crescita. Contare le cellule in sospensione utilizzando un emocitometro e utilizzare mezzi di crescita per diluire le cellule ad una concentrazione finale di 2,5 x 105 cellule / mL in un tubo conico da 50 mL.
  6. Trasferire 250 l di sospensione cellulare (6,25 x 104 celle) in ogni pozzo di una piastra di 48 pozze. Periodicamente capovolgere e girare il tubo conico per garantire una sospensione cellulare omogenea. Toccare delicatamente la piastra sul lato per assicurarsi che le cellule si distribuiscano uniformemente nei pozzi.
  7. Trasferire la piastra a 37 gradi centigradi in un'incubatrice di CO2 del 5% e consentire alle cellule di attaccarsi e crescere durante la notte.

2. Preparazione dei batteri

  1. Due giorni prima dell'infezione, striscia scorte congelate di Salmonella su l'Agar LB per produrre singole colonie. Trasferire le piastre su un'incubatrice impostata a 37 gradi centigradi e consentire la crescita durante la notte.
  2. Un giorno prima dell'infezione, aggiungere 3 mL di brodo di lisogenesi (LB) ai tubi di coltura batterica sterili, aggiungendo gli antibiotici appropriati ai media.
  3. Utilizzando un ciclo di inoculazione sterile, scegliere una singola colonia da colture batteriche striate e toccare il ciclo al supporto LB. Capovolgete i tubi dopo l'inoculazione e scartate il cappio.
  4. Collocare i tubi in un'incubatrice agitante fissata a 37 , 180 giri/min e lasciare crescere durante la notte.
  5. Il giorno dell'infezione, recuperare le colture batteriche notturne dall'incubatrice.
  6. Preparare i tubi per la sottocoltura aggiungendo 3 mL di LB fresco, contenente antibiotici quando appropriato.
  7. Trasferire 30 - L della coltura batterica durante la notte (1 su 100 diluizione) ai supporti appena preparati. Collocare i tubi in un'incubatrice agitante a 37 gradi per 3 h.
  8. Dopo l'incubazione di 3 h, trasferire 1 mL di brodo LB sterile in una cuvette di plastica per servire come vuoto. Trasferire 900 LL di LB nelle altre cuvette da utilizzare per l'analisi del campione.
  9. Trasferire 100 llitri di sottocoltura batterica in una cuvette contenente 900 L l di LB e pipette su e giù più volte per mescolare. Ripetere questa operazione per ogni sospensione batterica.
  10. Accendere lo spettrofotometro per misurare la densità ottica (OD) delle colture batteriche ad una lunghezza d'onda di 600 nm (OD600).
  11. Posizionare lo spazio vuoto nello spettrofotometro. Prendere nota dell'orientamento, come ci dovrebbe essere un segno verso l'alto che indica tale.
  12. Chiudere il coperchio e premere il pulsante Vuoto sullo spettrofotometro per ottenere l'assorbimento dello sfondo.
  13. Sostituire la cuvette vuota con una cuvette campione nello stesso orientamento e premere Leggi.
  14. Registrare i valori OD600 di questi campioni. Moltiplicare il valore per 10 per tenere conto del fattore di diluizione.
  15. Diluire la sottocoltura batterica con LB fresco per ottenere un valore di assorbimento di circa 1,0, che corrisponde approssimativamente a 1 x 109 cfu/mL. Diluire questa sospensione 1:10 in una cuvette e misurare l'assorbimento - che dovrebbe dare un valore di 0,1 dollari.
  16. In un nuovo tubo, aggiungere un volume appropriato della sottocoltura diluita a LB fresco per ottenere una sospensione di 1 x 108 cfu/mL da utilizzare come inoculum.
  17. Preparare le diluizioni seriali dell'inoculum trasferendo 50 litri di sospensione batterica in un tubo contenente 450 -L di diluizione sterile (10 volte di luita) fino a quando non viene effettuata una diluizione finale di circa 102 cfu/mL.
  18. Trasferire 100 L delle due diluizioni più basse (102 e 103 corrispondenti rispettivamente a 10 e 100 unità formanti colonie) in una piastra di agar LB e diffondere la sospensione con uno spalmatore di cellule per ottenere singole colonie. Trasferire queste piastre su un'incubatrice di 37 gradi centigradi e incubarle durante la notte.
  19. Il giorno seguente conta le colonie e calcola la concentrazione batterica dell'inoculo iniziale per determinare l'effettiva concentrazione di inoculo.

3. Infezione delle cellule

NOTA: A questo punto, le cellule dovrebbero essere a circa il 90% di confluenza. Per le cellule HeLa 57A in una piastra di 48 pozzetti, si tratta di circa 1 x 105 cellule per pozzo. Le cellule saranno infettate da molteplicità di infezione (MOI) di 10, o 106 cfu/bene.

  1. Etichettare il coperchio della piastra in base alle condizioni di infezione che verranno utilizzate per ogni pozzo, con ogni condizione in triplice copia.
  2. Aggiungere 10 l'inoculum ai pozze appropriati. Aggiungere 10 L di LB sterile a pozzi di controllo non infetti.
  3. Per sincronizzare il tempo dell'infezione, posizionare la piastra in una centrifuga da tavolo e ruotare a 500 x g per 5 min, assicurando che la piastra sia controbilanciata.
  4. Trasferire le cellule infette a un'incubatrice di CO2 del 5% a 37 gradi centigradi per 1 h.
  5. Posizionare un'aliquota dei mezzi di coltura cellulare in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi per l'uso nel passaggio successivo.
  6. Un'ora dopo il momento dell'infezione, rimuovere i mezzi di coltura cellulare dal bagno d'acqua e pulire l'esterno con 70% di etanolo. Trasferire la piastra di coltura dei tessuti all'armadietto della biosicurezza.
  7. Utilizzando una tecnica sterile, aspirare i supporti dai pozzi e sostituire con 250 litri di supporti di coltura cellulare freschi e caldi.
  8. Riportare le piastre all'incubatore di CO2 del 5% a 37 gradi centigradi per ulteriori 4 h.
  9. Rimuovere le piastredall'incubatrice di CO 2 e aspirare i supporti dai pozzi. Per l'analisi luciferase continuare con il passaggio 4.1. Per l'isolamento dell'RNA procedere al passaggio 5.1.

4. Luciferase Analisi

  1. Aggiungere 100 lun di 1x buffer di lisi cella ai pozzi. Potrebbe essere necessario diluire il buffer prima a una concentrazione di lavoro, a seconda del reagente.
  2. Trasferire la piastra in un congelatore a -80 gradi centigradi e incubare per almeno 30 min per garantire una lisi cellulare efficiente.
  3. Posizionare la piastra contenente illisate congelato a cellule su una panca per scongelare e preparare reagenti di substrato luciferasi secondo le raccomandazioni del produttore.
  4. Consentire ai reagenti del substrato luciferano di essere equilibrati a temperatura ambiente.
  5. Accendere il lettore di lastre e aprire il programma di lettura corrispondente. Impostare la macchina per misurare la luminescenza.
  6. Trasferire 10 l di ogni campione in un pozzo di una piastra opaca di 96 pozze.
  7. Aggiungete 50 l del Reagente Luciferase Assay utilizzando una pipetta multicanale ad ogni pozzetto della piastra opaca.
  8. Toccare delicatamente la piastra sul lato per mescolare i pozze e assicurarsi che la superficie inferiore sia coperta di liquido. Posizionare la piastra in un lettore di lastre e avviare la lettura.
  9. Copiare i valori di luminescenza in un foglio di calcolo e stampare i risultati.

5. Isolamento dell'RNA

  1. Aggiungere 500 l' l di ghiaccio tiocianato ad ogni pozzo e pipetta su e giù più volte per garantire una lisi completa.
  2. Trasferire il contenuto in un tubo di microcentrifuga etichettato. Mantenere i campioni sul ghiaccio il più possibile per mantenere la qualità dell'RNA.
  3. Impostare una centrifuga da tavolo a 4 gradi centigradi e mantenere la centrifuga a questa temperatura per il resto del protocollo.
  4. Ad ogni tubo campione, aggiungere 100 l of chloroform, cungere e agitare per 15 s. Incubare a temperatura ambiente per 10 min.
  5. Centrifuga a 12.000 x g per 15 min a 4 gradi centigradi. Durante questo periodo, prepararsi alla fase successiva della purificazione dell'RNA etichettando nuovi tubi.
  6. Trasferire la fase acquosa superiore al nuovo tubo contenente 250 l of isopropanol, facendo attenzione a non disturbare gli strati intermedi o inferiori.
  7. Conservare il prodotto inutilizzato in un congelatore a -80 gradi centigradi, che può essere utilizzato anche per l'analisi delle proteine. Lo strato acquoso residuo può anche servire come backup se l'RNA è necessario in seguito.
  8. Vorticare la miscela di strato acquoso e isopropanolo e consentire ai campioni di sedersi a temperatura ambiente per 10 min.
  9. Centrifugare i campioni a 12.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi.
  10. Rimuovere i tubi dalla centrifuga. Il precipitato nell'RNA forma un pellet bianco sul lato e sul fondo del tubo. Aprire i tubi e rimuovere con cura il supernatante versando in un contenitore di rifiuti.
  11. Lavare il pellet di RNA aggiungendo 500 lun del 75% di etanolo e vortice.
  12. Centrifuga a 8.000 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.
  13. Togliere il supernatante versando lo stiro e lavare di nuovo il pellet con il 75% di etanolo.
  14. Centrifuga a 8.000 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.
  15. Utilizzando una pipetta di piccolo volume (ad es. 10-200 l di volume), aspirare il più possibile il supernatante, facendo attenzione a non spingere indietro alcun liquido nel tubo o a spostare il pellet con la punta della pipetta. Se il pellet si sloga, centrifugare brevemente e di nuovo provare a rimuovere il supernatante.
    1. Asciugare all'aria i pellet di RNA. Se i pellet sono visibili per qualsiasi campione, periodicamente (ogni 5 minuti) controllarli per vedere se passano da bianco a chiaro, indicando che sono asciutti. Una volta che i pellet iniziano a diventare limpidi, aggiungete 20 - L di acqua ultrapura e libera di RNase per sciogliere l'RNA.
    2. Se i pellet non erano inizialmente visibili per tutti i campioni, è sufficiente aggiungere acqua ultrapura 5 min dopo la rimozione supernatant.
  16. Per aumentare la solubilità, passare la soluzione un paio di volte attraverso una punta di pipetta e incubare per 10 minuti a 55-60 gradi centigradi.

6. DNase Trattamento dell'RNA

  1. Per mantenere l'integrità dell'RNA, conservare campioni di RNA sul ghiaccio se non diversamente specificato. In questo momento, il buffer 10x DNase può essere rimosso dal congelatore e può scongelare sul ghiaccio.
  2. Preparare lo spettrofotometro per l'analisi del campione pulendo tutte le superfici di analisi del campione con un panno privo di lani.
  3. Eseguire una misurazione in background prima dell'analisi. Per farlo, caricare il sensore con 1,5 gradi della stessa acqua ultrapura utilizzata per sciogliere i pellet di RNA. Premere il pulsante Leggi vuoto per generare una lettura di sfondo.
  4. Utilizzare il panno senza laminetta per pulire la superficie di carico del campione dello strumento. Ripetere questo passaggio dopo ogni lettura di esempio.
  5. Caricare 1,5 l di RNA risospeso sul supporto del campione e selezionare Leggi campione. Ripetere l'operazione fino a quando tutti i campioni non sono stati letti.
  6. Preparare il master mix DNase combinando 2,4 litri di 10 x tampone DNase e 1 L L di DNase, per campione, in un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL. Preparare il master mix per due volumi aggiuntivi.
  7. Mescolare il mix master facendo scorrere il tubo più volte. Centrifugare brevemente il tubo per raccogliere i contenuti nella parte inferiore del tubo. Aggiungere 3,4 - L di mastermix a 20 - L di campione di RNA. Mescolare i contenuti sfogliando e centrifugando brevemente, come prima.
  8. Trasferire i campioni in un blocco di calore a 37 gradi centigradi per 20 min. Rimuovere il reagente di inattivazione DNase dal congelatore e scongelarsi a temperatura ambiente.
  9. 20 min dopo aver posizionato i campioni sul blocco di calore, trasferire i campioni in un rack di tubi posto sul banco di lavoro.
  10. Vorticare delicatamente il contenuto del reagente di inattivazione DNase. Trasferire 2,6 -L di Reagente di inattivazione DNase ai tubi contenenti RNA e quindi far scorrere i tubi per creare una miscela omogenea.
  11. Centrifugare i campioni a 12.000 x g per 1 min.
  12. Attentamente pipette il supernatante a un nuovo tubo etichettato.

7. Trascrizione inversa di mRNA a cDNA

  1. Preparare un master mix a seconda della quantità di campioni più due in più per tenere conto della perdita attraverso il pipetting (Tabella 1). Utilizzare 1 g di RNA e aggiungere H2O ad un volume di 50 .L totale.
Reagente Volume (L) Concentrazione finale
MgCl2 (25m) 3.5 1,75 mM
Buffer di trascrizione inversa (10x) 5 1x (in modo non il
miscela dNTP (10 m, ciascuno) 2.5 500 nm
esamero casuale (100 M) 1.25 2,5 M
Trascrizione inversa multiscriba (50 U/L) 1 1 U/L
Inibitore di RNase (20 U/L) 1.25 1,25 U/L
RNA (1 g) 20 ng/uL
H2O superiore fino a 50

Tabella 1: Componenti e ricetta per il mix master di trascrizione inversa.

  1. Capovolgete i campioni ed etichettate i tubi PCR sul lato in quanto le etichette sul coperchio possono essere rimosse dal coperchio riscaldato del termociclore in un secondo momento. Mescolare vortice.
  2. Centrifugare brevemente i tubi PCR per raccogliere i campioni sul fondo del tubo.
  3. Posizionare i tubi PCR in un termociclore ed eseguire i campioni nelle seguenti impostazioni:
    25 gradi centigradi per 10 min, 48 gradi centigradi per 30 min, 95 gradi centigradi per 5 min, quindi tenere a 10 gradi centigradi.
  4. Trasferire i tubi contenenti cDNA appena sintetizzato in un congelatore -20 gradi centigradi o utilizzare immediatamente nell'analisi qPCR.

8. Preparazione e caricamento della piastra per l'analisi RT-qPCR

  1. Prima di iniziare, pianificare la configurazione della piastra qPCR 384 pozzetto per l'analisi del campione.
  2. Scongelare primer e cDNA sul ghiaccio.
  3. Preparare un master mix (vedere Tabella 2), più circa il 10% in più per tenere conto della perdita attraverso il pipettaggio.
Reagente Volume (L)
10 - M F primer 1
10 R primer 1
Ultrapure H2O 4
2x verde SYBR 10

Tabella 2: Componenti e ricette per il master mix qPCR.

  1. Vorticare il master mix e erogare 8 .L nei pozzi della piastra 384-po' utilizzando una pipetta ripetitore. I campioni verranno analizzati in duplicati per ogni combinazione di campioni di primer e cDNA.
  2. Utilizzando una pipetta P10 (o più piccola), trasferire 2 l di cDNA in pozze per duplicare i pozzi per ogni primer impostato da analizzare. Sostituire le punte dopo ogni pozzo per evitare la contaminazione incrociata.
  3. Sigillare la piastra applicando con cura la pellicola adesiva sulla superficie, assicurando si è verificato un platro. Premere la pellicola con una pagaia o un rullo di sguarsione per sigillare saldamente.
  4. Posizionare la piastra in una centrifuga, con una piastra vuota come controbilanciamento. Centrifugare la piastra a 500 x g per 5 min.

9. Esecuzione del Termociclore per l'analisi qPCR

  1. Accendere il computer e lo strumento PCR in tempo reale.
  2. Aprire il software RT-qPCR e selezionare Nuovo esperimento.
  3. Nella scheda Impostazioni selezionare Proprietà esperimento, in cui è possibile impostare i parametri per l'esecuzione.
  4. Definire il nome dell'esperimento, che imposterà il nome file e le impostazioni utilizzate per archiviare i risultati.
  5. Per Selezione strumento, selezionare lo strumento attualmente connesso che eseguirà l'analisi. Selezionare il metodo di conduzione CT comparativo (zct).
  6. Selezionare SYBR Green Reagents come coloranti di DNA fluorescente da utilizzare e Standard come velocità di rampa.
  7. Assicurarsi che la casella accanto a Includi curva di fusione sia selezionata.
  8. Nella scheda Definisci, assegnare bersagli (cioè geni da amplificare) e campioni (ad es. condizioni sperimentali).
  9. Selezionare la scheda Assegna. Etichettare i pozze con gli obiettivi e i campioni appropriati, in quanto corrispondono allo schema di caricamento della piastra di 384 pozze.
  10. Selezionare Esegui metodo. Utilizzare i parametri per l'analisi elencati nellatabella 3.
Tenere lo stage Fase PCR Fase di fusione della curva
Fase 1 Fase 2 Fase 1 Fase 2 Fase 1 Fase 2 Fase 3
Temp 50 gradi centigradi 95 gradi centigradi 95 gradi centigradi 60 gradi centigradi 95 gradi centigradi 60 gradi centigradi 95 gradi centigradi
Tempo 2:00 10:00 0:15 1:00 0:15 1:00 0:15
Raccolta dati
Numero di cicli 1x (in modo non il 40x 1x (in modo non il

Tabella 3: Parametri di ciclo per termociclista.

  1. Posizionare la piastra 384-well nel termociclore e avviare l'analisi.

10. Analisi dei risultati di qPCR con il metodo Ct Delta-delta (2- - )

  1. Analizzare i risultati generati dalla reazione qPCR per individuare eventuali errori che possono interferire con l'analisi a valle. Molti errori verranno contrassegnati automaticamente dal sistema.
  2. Per i primer adeguatamente costruiti, le curve di fusione dovrebbero avere un solo picco. Escludere eventuali pozzi contenenti una curva di fusione con più di un picco da ulteriori analisi.
  3. Esportare i valori Ct in un programma di foglio di calcolo per analizzare i dati utilizzando il metodo .Net. Viene fornito un formato suggerito(tabella 4). L'ultima colonna è la modifica dell'espressione di piegatura del campione, relativa ai campioni di controllo.
Gene delle pulidi (GAPDH) Gene di interesse (IL6)
Ct1 Ct2 Ave Ct Ct1 Ct2 Ave Ct Ct Ave - Ct ctrls - Ct 2-(z-Ct) Geome
Controllo 1 15.33 15.37 15.35 26.81 26.91 26.86 11.51 10.51 1.00 0.50 1.00
Controllo 2 16.83 16.77 16.80 26.89 26.92 26.91 10.11 10.51 -0.41 1.33
Controllo 3 17.56 17.53 17.54 27.38 27.56 27.47 9.93 10.51 -0.59 1.50
Sl1344 1 15.50 15.41 15.45 22.15 22.13 22.14 6.69 10.51 -3.83 14.21 13.23
SL1344 2 16.02 15.98 16.00 23.01 22.96 22.98 6.98 10.51 -3.53 11.57
SL1344 3 17.27 17.30 17.28 23.99 23.98 23.98 6.70 10.51 -3.82 14.09
sipA sopB sopE2 1 15.38 15.41 15.39 23.31 23.09 23.20 7.80 10.51 -2.71 6.56 7.29
sipA sopB sopE2 2 16.01 16.05 16.03 23.89 23.92 23.91 7.88 10.51 -2.64 6.23
sipA sopB sopE2 3 16.78 16.78 16.78 24.02 24.06 24.04 7.27 10.51 -3.25 9.49
sipA sopB sopE2 sopE 1 15.52 15.60 15.56 27.04 27.03 27.03 11.47 10.51 0.96 0.51 0.79
sipA sopB sopE2 sopE 2 15.56 15.59 15.57 26.37 26.42 26.39 10.82 10.51 0.31 0.81
sipA sopB sopE2 sopE 3 15.91 15.92 15.91 26.24 26.12 26.18 10.27 10.51 -0.25 1.19

Tabella 4: Formato per l'analisi dei dati qPCR.

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Representative Results

L'analisi qui descritta si concentra sull'attivazione del fattore di trascrizione NF-B utilizzando un giornalista lucidferasi dipendente da NF che viene scambialmente trasvenuto in una linea di cellule HeLa. Attivato NF-B trasloca nel nucleo dove lega i siti di legame B dei geni bersaglio, comprese le citochine pro-infiammatorie IL6 e IL23. Una panoramica generale dell'attivazione di NF-B è illustrata nella figura 1. Il batterio gram-negativo Salmonella enterica sierovar Typhimurium è stato utilizzato in questo studio come attivatore di NF-B e successiva espressione di IL6 (Figura 2). Uno dei principali fattori di virulenza necessari per la patogenesi è il sistema di segretone di tipo III-1 (T3SS-1) che consente S. Typhimurium per infettare le cellule e per indurre l'attivazione di NF-B. La funzione del T3SS-1 è quella di fornire proteine batteriche, definite effettitrici, nelle cellule ospiti. Qui le proteine effluenti prendono di mira numerose vie di segnalazione cellulare per mediare l'invasione delle cellule epiteliali ospiti. L'attivazione di NF-B indotta da S. Typhimurium dipende principalmente dalle proteine degli effetti T3SS-1 SopE, SipA, SopB e SopE218. Qui, le cellule HeLa 57A sono state infettate dal tipo selvaggio S. Ceppo di Typhimurium SL1344 e due ceppi mutanti privi di tre (SipA, SopB, SopE2) o quattro (SipA, SopB, SopE2, SopE) proteine degli effetti. La figura 2 è un esperimento rappresentativo dell'attivazione di luciferasi dipendente da NF(Figura 2A)e dell'espressione genica IL6 (Figura 2B) nelle cellule HeLa 57A infettate dalla S. Ceppi di typhimurium. L'infezione con il ceppo di tipo selvatico SL1344 induce un forte segnale luciferasi che è diminuito nelle cellule infettate con sipA, SopB, SopE2 triplo mutante (risposta dipendente da SopE), e ridotto a livelli di controllo con il SipA, SopB, SopE2, Mutante quadrupla DiPE. Le unità di luminescenza relativa (RLU) sono correlate ai livelli di espressione IL6 (Figura 2). La figura 3 rappresenta i risultati generati dall'analisi RT-qPCR.

Figure 1
Figura 1: Schematico dell'attivazione di NF-B e letture a valle. Descritto in precedenza, la Proteina B viene mantenuta nel citosol in stato di inattività dalla proteina inibitrice IB. Sia gli stimoli interni che quelli esterni possono contribuire all'attivazione di IKK, che il fosforila IB e provoca la sua successiva degradazione proteosomica. La degradazione dell'I-B- rivela il segnale di localizzazione nucleare di NF-B, che favorisce la traslocazione. Nel nucleo, l'NF-B attivato si lega ai siti di legame dei geni bersaglio, promuovendo la loro trascrizione ed espressione. I geni bersaglio, come le citochine IL6 e IL23, sono espressi e quantificati tramite RT-qPCR. Nelle cellule HeLa 57A la lucidferasi è espressa dopo l'attivazione di NF-B, che può essere quantificata tramite saggi di luminescenza. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Dati rappresentativi di analisi della luminescenza e analisi RT-qPCR dopo S. Infezione da Typhimurium delle cellule HeLa 57A. 1 x 105 Cellule HeLa 57A sono state infettate da 106 cfu (MOI - 10) della fase di log S. Typhimurium tipo selvaggio SL1344, o i ceppi mutanti privi di SipA, SopB e SopE2, e SipA, SopB, SopE2 e SopE. Dopo 1 h, i media sono stati sostituiti e l'incubazione è proseguita per altre quattro ore. (A) Le cellule sono state elaborate per l'espressione di luciferata tramite saggi di luminescenza. (B) Sono state estratte cellule di RNA, che è stato utilizzato per l'analisi RT-qPCR. Viene mostrata l'espressione relativa dei geni bersaglio utilizzando il metodo Delta-delta Ct (2-- zCt). Viene mostrata la deviazione media e standard dei pozze di triplice. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Risultati di riepilogo generati dall'analisi RT-qPCR. (A) Viene mostrato un grafico di amplificazione per i pozzi che amplificano le cellule GAPDH da HeLa 57A infettate da S. Typhimurium. (B) La plotdiazione della curva di fusione dei pozzi contenenti primer GAPDH mostra un singolo picco di fusione corrispondente a circa 84 gradi centigradi. (C) Duplicare pozzi contenenti primer per IL-6. Uno dei pozzi mostra un secondo picco di fusione, come indicato da una freccia nera, e dovrebbe essere escluso dall'analisi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il principale contributo del protocollo descritto è che fornisce un metodo semplice e veloce per rilevare l'attivazione di NF-B nelle cellule, che consente un'analisi ad alta produttività di più condizioni di stimolazione o farmaci che influiscono sull'attivazione di NF-B. In questo caso, descriviamo un protocollo per l'attivazione di NF-B nelle cellule HeLa infettate da Salmonella. Queste cellule possono essere utilizzate per l'infezione da altri patogeni, nonché per studiare l'impatto dell'infezione batterica sull'attivazione di NF-B. Inoltre, l'attivazione di luciferasi dipendenti da NF nelle cellule HeLa 57A può essere utilizzata per lo screening di attivatori o inibitori di vie di segnalazione che portano all'attivazione di NF-B. Qui, abbiamo seminato cellule HeLa 57A in piastre 48-bene, ma questi esperimenti possono essere scalati fino a 96- e anche 384-bene piastre per consentire più campioni per esperimento. Le cellule HeLa 57A esprimono in modo di esclusiva lac, che può essere misurato come controllo interno per il numero di cellule e la fattibilità utilizzando i saggi z-gal. Il protocollo qui descritto è applicabile per l'uso in linee cellulari sia stabilmente o transitoriamente trascurato con un costrutto reporter NF-B::luciferase. La linea cellulare del macrofago RAW264.7 è già stata utilizzata per tale scopo18. È importante sottolineare che questo metodo non distingue tra l'attivazione dei diversi omo/eterodimeri delle cinque distinte sottounità NF-B. I diversi complessi di eterodimeri NF-B hanno affinità diverse per le sequenze promotrabili, nonché diverse conseguenze trascrizionali21. È possibile che l'attivazione di uno specifico dimero NF-B venga persa utilizzando il reporter qui descritto a causa della bassa affinità vincolante per i siti di legame di .

È importante notare che le condizioni adatte per stimolare una linea cellulare potrebbero non essere direttamente applicabili a un'altra. Pertanto, è altamente raccomandato che le condizioni di saggio siano ottimizzate in ogni sistema di test. Il tempo di infezione, MOI, durata del trattamento farmacologico, dose di droga e condizioni di seeding sono tutte considerazioni importanti da prendere in considerazione quando si valuta l'attivazione di NF-B. Ad esempio, i macrofagi RAW264.7 sono più sensibili all'infezione da Salmonella che richiedono condizioni diverse per produrre un segnale di luminescenza simile a quello visto con le cellule HeLa 57A18.

Durante le misurazioni della luminescenza, non è raro che i pozzi di bordo abbiano valori notevolmente diversi rispetto agli altri pozzi che sono stati stimolati allo stesso modo. Ciò è in genere dovuto a tassi di evaporazione più elevati dei pozzi di bordo sulla piastra che porta ad una maggiore concentrazione di droga. Questo può essere affrontato aggiungendo supporti liberi di siero allo spazio tra i pozzetti, per le piastre che lo permettono, alterando le combinazioni coperchio/piastra per ridurre l'evaporazione, o omettere completamente i pozzi dei bordi se i problemi persistono.

Espresso in cellule di mammiferi, lucciola luciferasi ha un'emivita di diverse ore ed è generalmente considerato stabile ai fini della maggior parte dei saggi reporter22. Le durate del trattamento più lunghe di quelle qui descritte possono essere eseguite in modo affidabile. Tuttavia, il sistema di analisi luciferasi utilizzato qui produce un segnale stabile solo per il primo minuto e si deteriora rapidamente dopo che. Pertanto, è molto importante che la misura di luminescenza venga effettuata rapidamente dopo la miscelazione di lisa cellule e substrato.

NF-B è un fattore di trascrizione per una vasta gamma di geni, tra cui citochine e chemiochine (cioè Il6 e Il23). Misurare l'attività di luciferasi dipendente da NF non significa necessariamente che queste citochine e chemiochine siano espresse. Questo metodo può integrare le tecniche di quantificazione molecolare esistenti fungendo da potenziale primo schermo per la caratterizzazione delle condizioni che influenzano l'attività di NF-B, che può quindi essere convalidata funzionalmente attraverso RT-qPCR. La convalida funzionale dell'attivazione di NF-B può essere eseguita anche tramite l'analisi delle macchie occidentali o i saggi funzionali specifici di una proteina di interesse nei casi in cui la quantificazione dell'mRNA potrebbe non essere appropriata. Questo è il caso dell'interleuchino-beta (Il1b), un gene la cui trascrizione è indotta dal legame NF-B, ma il prodotto proteico richiede una modifica post traduzionale per formare il prodotto maturo23,24.

Il protocollo specifico di isolamento dell'RNA qui descritto non è l'unico che può essere impiegato per l'uso nell'analisi RT-qPCR, e possono invece essere utilizzati altri metodi preferiti, come i kit disponibili in commercio. È importante notare che la qualità dell'RNA è molto importante per il processo e quindi l'RNA dovrebbe essere mantenuto sul ghiaccio il più possibile per prevenire la degradazione. È importante eseguire reazioni duplicate nelle reazioni RT-qPCR per accertare che le reazioni PCR sono coerenti, poiché il pipettaggio di tali piccoli volumi durante il caricamento della piastra 384-well può spesso essere causa di errore. I valori Ct del gene delle pulizie devono essere coerenti tra i campioni, e le deviazioni da questo possono essere indicative di fasi di pulizia inefficienti o discrepanze nelle concentrazioni di RNA durante la trascrizione inversa che possono influenzare i risultati finali. È anche importante controllare la curva di fusione dopo ogni esperimento qPCR. La presenza di un picco suggerisce che i primer qPCR stanno amplificando un singolo gene. Curve multiple suggeriscono che c'è amplificazione genica fuori bersaglio o presenza di dimeri primer. In entrambi i casi, più picchi presenti nella curva di fusione suggeriscono che i primer devono essere riprogettati per garantire la specificità. Con così tanto spazio per la variabilità, l'esercizio e la raffinatezza di una buona tecnica in ogni fase sono essenziali per generare risultati accurati e riproducibili.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

La ricerca nel laboratorio Keestra-Gounder è supportata dalle sovvenzioni del NIAID del NIH sotto il premio Number R21AI122092 e dall'American Diabetes Association sotto il premio numero 1-18-JDF-035.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adhesive film VWR International 60941-070
Chloroform Fisher Bioreagents C298-500
DMEM Thermo Fisher 11665092
DNAse treatment kit Qiagen 79254
dNTPs Promega U1511
Ethanol Fisher Bioreagents BP2818100 molecular grade
FBS Sigma-Aldrich F0926
HeLa 57A cells Ref # 15
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems 4368814
Isopropanol Fisher Bioreagents BP26181
Kanamycin Fisher Bioreagents BP906-5
LB agar Fisher Bioreagents BP1425-500
Lysogeny broth Fisher Bioreagents BP1426-500
MgCl2 Fisher Chemical
NanoDrop ND-1000 Thermo Scientific spectrophotometer
Promega luciferase assay system Promega E1501 Cell lysis buffer & luciferin substrate
Random Hexamers Thermo Scientific SO142
Real-time GAPDH forward primer 5'-CCAGGAAATGAGCTTGAC
AAAGT-3'
Real-time GAPDH reverse primer 5-'CCCACTCCTCCACCT
TTGAC-3'
Real-time IL-23 forward primer 5-'GAGCCTTCTCTGCTCCC
TGAT-3'
Real-time IL-23 reverse primer 5'-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3'
Real-time IL-6 forward primer 5'-GTAGCCGCCCCACACAGA-3'
Real-time IL-6 reverse primer 5'-CATGTCTCCTTTCTCAGG
GCTG-3'
Reverse Transcriptase Applied Biosystems 4308228
RNAse inhibitor Thermo Scientific EO0381
RT buffer Promega A3561
SL1344 Ref # 17
SL1344 ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039 Ref # 18
SL1344 ΔsopE ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039 Ref # 18
SYBR green Applied Biosystems 4309155 2x mastermix
Tri-reagent Molecular Research Center TR 118 guanidine thiocyanate
Trypsin -EDTA Thermo Fisher 25300054 0.05% Trypsin-EDTA
Ultrapure water Fisher Bioreagents BP248450
Well plate for PCR VWR International 89218-294 384-well plate

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