NF-κB-beroende Luciferasaktivering och kvantifiering av genuttryck i salmonellasmittade vävnadskultur celler

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att snabbt och enkelt mäta kärnkrafts faktorn kappa-ljus-Chain-Enhancer av aktiverade B-celler (NF-κb) aktivering i cellinjer som uttrycker NF-κb:: luciferase reporter konstruktioner, via mätningar av luminiscens i cellen lysate. Dessutom är genuttryck bestäms via RT-qPCR isolerade från celler infekterade med salmonella typhimurium.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Mendez, J. M., Keestra-Gounder, A. M. NF-κB-dependent Luciferase Activation and Quantification of Gene Expression in Salmonella Infected Tissue Culture Cells. J. Vis. Exp. (155), e60567, doi:10.3791/60567 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Den dimeriskt transkriptionsfaktorn NF-κb reglerar många cellulära reaktionsvägar, inklusive inflammatoriska vägar genom att inducera uttrycket av olika cytokiner och chemokiner. NF-κB är konstitutivt uttryckt och binds i Cytosol av den hämmande protein nukleära faktorn kappa ljus polypeptid gen förstärkare i B-celler inhibitor, alfa (IκBα). Aktivering av NF-κB kräver nedbrytning av IκBα, som sedan exponerar en nukleär lokaliserings signal på NF-κB och främjar dess människohandel till kärnan. En gång i kärnan, NF-κB binder till promotor regionen NF-κB målgener såsom interleukin 6 (IL-6) och IL-23, att främja deras uttryck.

Aktiveringen av NF-κB sker oberoende av transkription eller översättning. Därför måste aktiveringstillståndet för NF-κB mätas antingen genom att kvantifiera NF-κB specifikt i kärnan, eller genom att kvantifiera uttrycket av NF-κB-målgener. I detta protokoll, celler stabilt transfekterade med en NF-κb:: luciferase reporter konstruera analyseras för NF-κb aktivering med in vitro vävnad kultur tekniker. Dessa celler är infekterade med salmonella typhimurium att aktivera NF-κb, som trafikerar till kärnan och binder till κb platser i promotorn i luciferase, inducera dess uttryck. Celler lyseras och analyseras med luciferas assay system. Mängden luciferas som produceras av cellerna korrelerar med intensiteten av luminiscens signalen, som upptäcks av en Plattläsare. Luminiscens signal som genereras av detta förfarande ger en snabb och mycket känslig metod för att bedöma NF-κb aktivering under en rad olika förhållanden. Detta protokoll utnyttjar också kvantitativ omvänd Transkription PCR (RT-qPCR) för att upptäcka relativa mRNA nivåer som tyder på genuttryck.

Introduction

Den nukleära Factor-κB (NF-κB) protein familjen är viktiga transkription aktivatorer som reglerar genuttryck i olika biologiska vägar. Aktivering av NF-κb inducerar transkription av målgener, av vilka många är viktiga för immun-och inflammatoriska reaktioner, cellproliferation, stressresponser och cancerprogression1,2. NF-κB spelar en viktig roll i att förmedla tidiga inflammatoriska utfall för patogen clearance. Med tanke på de många biologiska processer medieras av NF-κB aktivering, störningar i dess signalering kan få allvarliga konsekvenser för hälsa och sjukdom. Förlust av funktion mutationer i NF-κB signalering är associerade i flera immunbrist fenotyper, medan vinst av funktion mutationer är förknippade med flera typer av cancer, inklusive B-cells lymfom och bröstcancer3. Dessutom, många patogener har visat sig direkt modulera aktiveringstillståndet för NF-κb genom uttryck av virulensfaktorer4,5,6,7.

Aktivering av NF-κb är känd för att vara en följd av många variabla stimuli inklusive bakteriella produkter såsom lipopolysackarider (LPS), flagellin och peptidoglykaner kallas patogen-associerade molekylära mönster (PAMPs). Dessa PAMPs upptäcks av mönsterigenkänning receptorer (PRRs) såsom Toll-liknande receptorer (TLRs) och nicka-liknande receptorer (NLRs) som leder till aktivering av NF-κB och det efterföljande uttrycket av en matris av NF-κB-beroende inflammatoriska gener8. Förutom PRR aktivering av PAMPs, andra bakteriella produkter, såsom bakteriella effektorproteiner, kan inducera aktiveringen av NF-κB. Intressant, bakterier också uttrycka effektor proteiner som aktivt dämpa NF-κB väg och förbättra deras patogenicitet, understryker vikten av NF-κB som en viktig medlare av immunitet9.

Det finns fem olika subenheter som bildar NF-κB dimers; P50, P52, RelA (P65), RelB och cRel. De två största NF-κb heterodimerer är P50: RelA och P52: relb dimers. De aktiverade NF-κB-dimererna binder till DNA-platser, kända som κB-platser, i promotorn och förstärkare regioner av olika målgener. Under normala homeostatiska förhållanden interagerar NF-κB med en familj av hämmare av proteiner som kallas IκB-proteiner för att förbli inaktiva. Vid stimulering, är IκB fosforyleras av IκB Kinas (IKK), vilket gör att den kan riktas mot ubiquitination, och därefter nedbrytning. Nedbrytning av IκB aktiverar NF-κB genom att avslöja en nukleär lokaliserings signal. NF-κB translokerar sedan till kärnan, där den binder κB-platser i promotionsregionen av målgener och främjar transkription10. Således, aktivering av NF-κb uppreglerar mRNA uttryck för NF-κb målgener, och denna förändring kan mätas genom RNA kvantifiering analyser såsom RT-qPCR11.

Flera metoder finns och används ofta för mätning av NF-κB aktivering, inklusive elektroforetiska Mobility Shift analyser (EMSA), nukleär translocation, och Gene reporter analyser. EMSA används för att detektera proteinkomplex med nukleinsyror. Stimulerade celler fraktioneras för att isolera nukleära proteiner, inklusive translokaliserat NF-κB, som sedan inkuberas med radiomärkade nukleotider som innehåller den bindande domänen NF-κB. Proverna körs på en gel och avbildas av autoradiografi av 32P-märkt nukleinsyra. Om NF-κB finns i protein fraktionen, kommer det att binda nukleotider, som kommer att migrera långsammare genom gelen och närvarande som diskreta band. Kärn fraktioner av celler som saknar aktiverad NF-κB (t. ex. ostimulerade kontrollceller) kommer inte att producera några band eftersom nukleotider migrerar snabbare till änden av gelen. En stor nackdel med denna metod är att det är till stor del kvantitativa i binär bemärkelse (dvs, på eller av) och inte tillräckligt fånga meningsfulla skillnader i NF-κB bindande kapacitet. Dessutom anser denna metod inte kromatin strukturer som är funktionellt viktiga för NF-κb målgener12,13.

I likhet med den tidigare metoden finns det en "non-Shift"-analys där Multiwell-plattor är belagda med nukleotider som innehåller bindningssekvens av NF-κB. Efter behandling av celler med nukleära fraktioner av protein, NF-κB kommer att binda till nukleotider bunden till brunnen. Anti-NF-κB-antikroppar tillsätts sedan, som kommer att interagera med den bundna NF-κB och producera en kolorimetrisk signal proportionell mot mängden NF-κB, vilket indikerar graden av NF-κB-aktivering. Denna metod är fördelaktig över EMSA i att den inte kräver radioaktivt märkt nukleinsyror och är kvantitativ, i jämförelse. Emellertid är ett förbehållet av denna metod att det igen inte gör åtskillnad mellan mellan kromatin påstår av NF-κb riktar gener14.

En annan metod genom vilken NF-κB aktiveringen kan upptäckas är kromatin immunoprecipitation (ChIP), varvid DNA och samverkande proteiner är tvärbunden med formaldehyd och immunoprecipitated med specifika anti-NF-κB antikroppar. De specifika nukleotidfragmenten renas och identifieras genom PCR-amplifiering eller direkt sekvensering av högt dataflöde. Resultat som genereras från denna metod ger semikvantitativa resultat av NF-κB bindnings aktivitet med målgener. Resultaten är dock i hög grad beroende av fixeringsförhållanden och reningsprocesser vid varje steg15.

I nukleära flyttning analyser, celler stimuleras att inducera NF-κb aktivering och sedan fast. Anti-P65-antikroppar tillsätts till fasta celler. Alternativt kan själva P65-subenheten taggas med en fluorescerande peptid som grön fluorescerande grön (GFP). I båda fallen, immunofluorescens kommer att möjliggöra avbildning av lokalisering av P65 att bestämma cellulära distributionen. Genom att mäta andelen cytosoliska och nukleärt lokaliserat protein kan utredarna bestämma det relativa aktiveringstillståndet för NF-κb. En nackdel med denna metod är att immunofluorescenen är jämförelsevis tidskrävande, kräver dyra antikroppar, och behöver relativt större teknisk expertis16.

Reporgengener är ofta använda verktyg för att studera reglerings-och uttrycksmönster för en gen av intresse. Typiskt, reporter gener är konstruerade från Promotorn sekvens av en gen av intresse smält till en gen kodning för ett lätt detekterbart protein. Proteiner med enzymatiska aktiviteter, fluorescens, eller luminiscens egenskaper väljs ofta för deras förmåga att analyseras och kvantifieras. Således fungerar den avlästa (e.g. luminescence, Fluorescence) som en signalera för upptäckt av gen uttryckt. Dessa reporter konstruktioner kan sedan införas i olika celltyper, såsom epitelceller eller makrofager.

Beskrivs i protokollet är användningen av en klonade hela cellinjer (hela 57a) som är stabilt transfekterade med en luciferas reporter som innehåller tre kopior av κb konsensus av immunglobulin κ-kedjan promotor region17. Uttrycket av luciferas är beroende av aktiveringen av NF-κb, som sker efter cell stimulering. Stimulerade celler lätt lyseras med hjälp av celllysis buffert som tillhandahålls i luciferas assay kit. En del av cellen lysate blandas sedan med luciferas analysbuffert som innehåller Luciferin. Luciferin är substrat för luciferas och krävs för generering av ljus i närvaro av luciferas. Efter att ha kombinerat analysbufferten med lysate, kommer lösningen att avge ljus i en process som kallas luminescence. Mängden ljus som produceras, ges i lumen, är proportionell mot mängden av luciferas som finns i lysat och fungerar som ett mått på NF-κb aktivering. Lumen avläsningar tolkas i jämförelse med en ostimulerad standard för att redogöra för baseline NF-κB aktivitet och signalen i sig är stabil i flera minuter för att möjliggöra tillförlitlig mätning. Dessutom är hela 57a cellinjer stabilt transfekterade med en NF-κb-oberoende β-galaktosidas reporter. Den β-galaktosidas reporter är konstitutivt uttryckt, och β-galaktosidas aktivitet kan mätas för att kontrollera cellernas lönsamhet eller variation i cell nummer17. Den luciferas värden kan sedan justeras till β-galaktosidas värden och rapporteras som faldig ökning över de ostimulerade kontrollceller.

Eftersom NF-κb är en transkriptionsfaktor som är ansvarig för det ökade uttrycket av NF-κb-beroende målgener, är ett uppföljningsexperiment för att kontrollera för NF-κb-beroende ökat genuttryck kvantitativ omvänd Transkription av polymeras kedjereaktion ( RT-qPCR). RT-qPCR är en mycket känslig metod genom vilken förändringar i genuttrycket kan kvantifieras över flera storleksordningar. Stimulerade och kontrollceller skördas för RNA via fenol-kloroformextraktion. Efter fasseparation extraheras RNA som den viktigaste komponenten i vattenskiktet. RNA fälls sedan ut och spolas för att producera en ren pellet. Denna pellet är sedan rekonstituerad och ytterligare rengöras av förorenat DNA via DNase behandling. Den rena RNA är sedan omvänd transkriberas att skapa kompletterande DNA (cDNA). Detta cDNA kan sedan analyseras genom kvantitativa PCR-tekniker, där överflödet av en specifik mRNA-sekvens kvantifieras för att bestämma genuttryck. Denna teknik belyser inte translationella kontroll, post translationella modifiering, protein överflöd, eller protein aktivitet. Men många gener, särskilt de som är involverade i pro-inflammatoriska processer, regleras via NF-κB och deras mRNA-överflöd är ett tecken på deras uttryck.

Den metod som föreslås här använder ett snabbt och enkelt sätt som NF-κb aktivering kan upptäckas via luminiscens analyser av cellulära lysate. RT-qPCR av NF-κB-målgenuttrycket kan användas för att kvantifiera uttryck för specifika gener, samt validera funktionell aktivitet av NF-κB-aktivering. De stora fördelarna med ett sådant system är dess enkelhet och snabbhet, vilket möjliggör hög genomströmning screening av en rad villkor som modulera NF-κB aktivering. Detta protokoll är lämpligt för andra cellinjer som uttrycker en NF-κb:: luciferase reporter, och har visats i stabilt transfekterade rå 264.7 celler18. Den tid som krävs för att hantera prover, från cell lysis till att generera en luminiscens signal, är minimal och tar loppet av ungefär en timme. Mätning av NF-κB kräver endast grundläggande laboratorieutrustning såsom ogenomskinliga plattor, en Plattläsare som kan mäta luminescence, och enkla dataanalysprogram som ett kalkylprogram.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. cell Passaging och seedning

  1. Behåll HeLa 57A-celler i en 75 cm2 -kolv innehållande 10 ml av Dulbecco ' s modifierade Eagle ' s media (DMEM) kompletterat med 5% värmeinaktiverat foster bovint serum (FBS) vid 37 ° c i en 5% Co2 -inkubator.
  2. Aspirera cell odlingsmedier och tvätta med 1 mL 0,05% trypsin-EDTA-lösning. Aspirera trypsin och Ersätt med ytterligare 1 mL. Placera kolven i en inkubator på 37 ° c i 4-5 min så att cellerna kan lossna från kolven.
  3. Tillsätt 9 mL cell odlingsmaterial och tvätta försiktigt botten av kolven några gånger för att få bort cellerna och bilda en homogen suspension.
  4. Späd HeLa 57A-celler 1:6 eller 1:8 i färska medier och frö till nya flaskor. Passage celler när de är 90% konfluenta eller var tredje dag och underhålla celler vid minst 25% confluency.
  5. En dag före cell stimulering, trypsinize HeLa 57A celler och suspendera i 10 mL av tillväxtmedia. Räkna celler i suspension med hjälp av en hemocytometern och använda tillväxtmedia för att späda ut celler till en slutlig koncentration av 2,5 x 105 celler/ml i en 50 ml koniskt rör.
  6. Överför 250 μL cellsuspension (~ 6,25 x 104 celler) till varje brunn på en 48-brunn tallrik. Regelbundet locket och vänd över det koniska röret för att säkerställa en homogen cellsuspension. Knacka på plattan försiktigt på sidan för att säkerställa att cellerna fördelas jämnt i brunnarna.
  7. Överför plattan till 37 ° c i en 5% CO2 inkubator och låt cellerna att fästa och växa över natten.

2. beredning av bakterier

  1. Två dagar före infektion, strimma frysta bestånd av salmonella på lb agar plattor för att producera enstaka kolonier. Överför plattorna till en inkubator som är inställd på 37 ° c och möjliggör tillväxt över natten.
  2. En dag före infektion, tillsätt 3 mL lysogeny buljong (LB) till sterila bakteriella kultur rör, lägga till lämpliga antibiotika till medierna.
  3. Med hjälp av en steril inympningslinga, Välj en enda koloni från strimmiga bakteriekulturer och vidrör slingan till LB-mediet. Locket rören efter vaccinera och kassera slingan.
  4. Placera rören i en skakande inkubator inställd på 37 ° c, 180 rpm, och låt växa över natten.
  5. På infektions dagen, Hämta över natten bakteriekulturer från inkubatorn.
  6. Förbered rören för subkulturen genom att tillsätta 3 mL färskt LB, som innehåller antibiotika när så är lämpligt.
  7. Överför 30 μL av den över natten bakteriekulturen (1 i 100 utspädning) till det nyberedda mediet. Placera rören i en skakande inkubator inställd på 37 ° c i 3 h.
  8. Efter 3 h inkubering, överför 1 mL steril LB buljong till en plast kuvette att fungera som den tomma. Överför 900 μL LB till de andra cuvetterna som ska användas för provanalysen.
  9. Överför 100 μl av bakteriell subkultur till en kyvetten som innehåller 900 μl lb och Pipettera upp och ner flera gånger för att blanda. Upprepa detta för varje bakteriesuspension.
  10. Slå på spektrofotometern för att mäta bakterie kulturernas optiska densitet (OD) med en våglängd på 600 Nm (OD600).
  11. Placera det tomma i spektrofotometern. Ta del av inriktningen, eftersom det bör finnas en markering mot toppen som indikerar sådan.
  12. Stäng locket och tryck på den tomma knappen på spektrofotometern för att få bakgrunds absorbans.
  13. Ersätt den tomma kuvette med ett prov kyvetten i samma orientering och tryck på Läs.
  14. Registrera OD600 -värdena för dessa exempel. Multiplicera värdet med 10 för att redovisa utspädningsfaktorn.
  15. Späd den bakteriella subkulturen med Fresh LB för att uppnå ett absorbansvärde på cirka 1,0, vilket ungefär motsvarar 1 x 109 CFU/ml. Späd denna suspension 1:10 i en kuvette och Mät absorbansen-som bör ge ett värde på ~ 0,1.
  16. I ett nytt rör, tillsätt en lämplig volym av den utspädda subkulturen till Fresh LB att uppnå en suspension av 1 x 108 CFU/ml som skall användas som ett inoculum.
  17. Bered seriella utspädningar av inokulum genom att överföra 50 μl bakteriell suspension till ett rör som innehåller 450 μl steril PBS (10-faldig utspädning) tills en slutlig spädning av ca 102 CFU/ml görs.
  18. Överför 100 μL av de två lägsta spädningar (102 och 103 motsvarande 10 respektive 100 kolonibildande enheter) till en LB-agarplatta och sprid fjädringen med en cell spridare för att erhålla enstaka kolonier. Överför dessa plåtar till en inkubator på 37 ° c och inkubera över natten.
  19. Följande dag räknas kolonierna och beräkna den bakteriella koncentrationen av den initiala inokulum att bestämma den faktiska inokulum koncentrationen.

3. infektion av celler

ANMÄRKNINGAR: vid denna punkt bör cellerna vara på cirka 90% confluency. För HeLa 57A celler i en 48-brunn plattan, detta är ungefär 1 x 105 celler per brunn. Celler kommer att infekteras med en mångfald av infektion (MOI) av 10, eller 106 CFU/brunn.

  1. Märk locket på plattan enligt de infektions förhållanden som kommer att användas för varje brunn, med varje tillstånd som görs i tre exemplar.
  2. Tillsätt 10 μl av inokulum till lämpliga brunnar. Tillsätt 10 μL sterilt LB till icke-infekterade kontrollbrunnar.
  3. För att synkronisera tiden för infektion, placera plattan i en bordscentrifug och snurra på 500 x g i 5 min, se till att plattan är motviktat.
  4. Överför infekterade celler till en 5% CO2 inkubator vid 37 ° c i 1 h.
  5. Placera en alikvot av cell odlingsmedier i ett 37 ° c vattenbad för användning i nästa steg.
  6. En timme efter infektions tid, ta bort cell odlingsmediet från vattenbadet och torka av utsidan med 70% etanol. Överför vävnads odlingsplattan till biosäkerhets skåpet.
  7. Använd steril teknik, aspirera media från brunnar och Ersätt med 250 μL av färska, varma cell odlingsmedier.
  8. Retur plattor till 5% CO2 inkubator vid 37 ° c för ytterligare 4 h.
  9. Ta bort plattorna från Co2 inkubator och aspirera media från brunnarna. För luciferas analys Fortsätt till steg 4,1. För RNA-isolering gå vidare till steg 5,1.

4. luciferase analys

  1. Tillsätt 100 μL 1x celllysbuffert i brunnarna. Bufferten kan behöva spädas först till en fungerande koncentration, beroende på reagensen.
  2. Överför plattan till a-80 ° c frys och inkubera i minst 30 min för att säkerställa effektiv cell Lys.
  3. Placera plattan som innehåller fryst cell lysate på en bänk för att Tina och förbereda luciferas substrat reagenser enligt tillverkarens rekommendationer.
  4. Låt luciferas substrat reagenser att jämvikt till rumstemperatur.
  5. Slå på plattläsaren och öppna motsvarande läsarprogram. Ställ in enheten på att mäta Luminescens.
  6. Överför 10 μL av varje prov till en brunn av en täckande platta med 96-brunn.
  7. Tillsätt 50 μL av Luciferase assay reagens med hjälp av en flerkanalspipett till varje brunn på den ogenomskinliga plattan.
  8. Knacka försiktigt på plattan på sidan för att blanda brunnar och se till att bottenytan är täckt med vätska. Placera plattan i en Plattläsare och starta läsningen.
  9. Kopiera luminiscens-värdena till ett kalkylbladsprogram och rita upp resultaten.

5. RNA-isolering

  1. Tillsätt 500 μL av guanidium tiocyanat till varje brunn och Pipettera upp och ner flera gånger för att säkerställa fullständig Lys.
  2. Överför innehållet till ett märkt microcentrifugerör. Underhåll prover på is så mycket som möjligt för att bibehålla RNA-kvalitet.
  3. Ställ in en bordscentrifug på 4 ° c och behåll centrifugen vid denna temperatur under återstoden av protokollet.
  4. Till varje provrör, tillsätt 100 μL kloroform, keps tätt, och skaka för 15 s. Inkubera i rumstemperatur i 10 min.
  5. Centrifugera vid 12 000 x g i 15 min vid 4 ° c. Under denna tid, förbereda för nästa steg i RNA rening genom att märka nya rör.
  6. Överför den övre vattenfasen till det nya röret som innehåller 250 μL isopropanol, var noga med att inte störa de mellersta eller nedre lagren.
  7. Förvara oanvända produkter i a-80 ° c frys, som även kan användas för proteinanalys. Det resterande vattenskiktet kan också fungera som en säkerhetskopia om RNA behövs senare.
  8. Vortex blandningen av vatten skikt och isopropanol och låt proverna att sitta vid rumstemperatur i 10 min.
  9. Centrifugera proverna vid 12 000 x g i 10 min vid 4 ° c.
  10. Ta bort rören från Centrifugera. RNA fällningen bildar en vit pellet på sidan och botten av röret. Öppna rören och ta försiktigt bort supernatanten genom att hälla ut i en avfallsbehållare.
  11. Tvätta RNA-pelleten genom att tillsätta 500 μL 75% etanol och Vortex.
  12. Centrifugera vid 8 000 x g i 5 min vid 4 ° c.
  13. Ta bort supernatanten genom att hälla ut och tvätta igen pelleten med 75% etanol.
  14. Centrifugera vid 8 000 x g i 5 min vid 4 ° c.
  15. Med hjälp av en liten volympipett (t. ex. 10-200 μL volym), aspirera så mycket av supernatanten som möjligt, var noga med att inte trycka tillbaka vätskan i röret eller ta bort pelleten med pipettspetsen. Om pelleten blir disingat, Centrifugera kort och igen försöka ta bort supernatanten.
    1. Lufttorka RNA pellets. Om pellets är synliga för ett prov, regelbundet (var 5 minuter) kontrollera om dem för att se om de ändras från vitt till klart, vilket indikerar att de är torra. När pellets börjar vrida klart, tillsätt 20 μL ultrapure, RNase fritt vatten för att lösa upp RNA.
    2. Om pellets var inte initialt synlig för några prover, helt enkelt lägga ultrarent vatten 5 min efter avlägsnande supernatanten.
  16. För att öka lösligheten, passera lösningen några gånger genom en pipett spets och inkubera i 10 min vid 55-60 ° c.

6. DNase behandling av RNA

  1. Förvara RNA-prover på is om inget annat anges för att bibehålla RNA-integriteten. Vid denna tid, den 10X DNase buffert kan tas bort från frysen och får Tina på is.
  2. Förbered spektrofotometern för provanalys genom att rengöra alla provanalys ytor med en luddfri trasa.
  3. Ta en bakgrundsmätning före analys. För att göra detta, Ladda sensorn med 1,5 μl av samma ultrarent vatten som används för att lösa upp RNA-pellets. Tryck på knappen Läs tom för att skapa en bakgrunds läsning.
  4. Använd den luddfria duken för att torka instrumentets prov lastning yta. Upprepa det här steget efter varje provläsning.
  5. Ladda 1,5 μL resuspenderat RNA till provhållaren och välj Läs prov. Upprepa tills alla prover har lästs.
  6. Förbered DNase Master Mix genom att kombinera 2,4 μL av 10X DNase buffert och 1 μL DNase, per prov, i en 1,5 mL microcentrifug tub. Förbered Master Mix för två extra volymer.
  7. Blanda Master Mix genom att snärta röret flera gånger. Kort Centrifugera röret för att samla in innehåll på botten av röret. Tillsätt 3,4 μL Mastermix till 20 μL RNA-prov. Blanda innehållet genom att snärta och centrifugera kort, som förut.
  8. Överför proverna till ett värmeblock som är inställt på 37 ° c i 20 minuter. ta bort DNase-inaktiveringsreagens från frysen och Tina vid rumstemperatur.
  9. 20 min efter att ha placerat proverna på värmeblocket, överför proverna till ett rör rack som placerats på arbetsbänken.
  10. Skaka försiktigt innehållet i DNase-inaktiveringsreagens. Överför 2,6 μL av DNase-inaktiveringsreagens till rören som innehåller RNA och svep sedan rören för att skapa en homogen blandning.
  11. Centrifugera proverna vid 12 000 x g i 1 min.
  12. Pipettera försiktigt supernatanten till ett nytt, etikettmärkt rör.

7. omvänd Transkription av mRNA till cDNA

  1. Förbered en Mastermix beroende på mängden prover plus två extra för att redovisa förlust genom pipettering (tabell 1). Använd 1 μg RNA och tillsätt H2O till en volym på 50 μl totalt.
Reagens Volym (μL) Slutliga koncentrationen
MgCl2 (25mm) 3,5 1,75 mM
Omvänd Transkription buffert (10X) 5 1x
dNTP mix (10 μM, vardera) 2,5 500 Nm
slumpmässig hexamer (100 μM) 1,25 2,5 μM
Multiscribe omvänt transkriptas (50 U/μL) 1 1 U/μL
Rnashämmare (20 U/μL) 1,25 1,25 U/μL
RNA (1 μg) 20 ng/uL
H2O upp till 50

Tabell 1: komponenter och recept för omvänd Transkription Master Mix.

  1. Locket proverna tätt och märk PCR-rören på sidan som etiketter på locket kan avlägsnas från den uppvärmda locket på termocycler senare. Blanda genom vortexing.
  2. Centrifugera PCR-rören för att samla in prover till botten av röret.
  3. Placera PCR-rören i en termocycler och kör proverna under följande inställningar:
    25 ° c för 10 min, 48 ° c i 30 min, 95 ° c i 5 min, och sedan hålla vid 10 ° c.
  4. Överför rör som innehåller nyligen syntetiserade cDNA till en-20 ° c frys eller Använd omedelbart i qPCR-analys.

8. förberedelse och lastning plåt för RT-qPCR analys

  1. Innan du börjar, planera installationen av 384-väl qPCR plattan för provanalys.
  2. Thaw primers och cDNA på is.
  3. Förbered en Mastermix (se tabell 2), plus cirka 10% extra för att redovisa förlust genom pipettering.
Reagens Volym (μL)
10 μM F-primer 1
10 μM R-primer 1
Ultrapure H2O 4
2x SYBR grön 10

Tabell 2: komponenter och recept för qPCR Master Mix.

  1. Vortexblanda Master Mix och fördela 8 μL i brunnarna på 384-brunnsplattan med hjälp av en repeterpipett. Prover kommer att analyseras i två exemplar för varje primer och cDNA prov kombination.
  2. Använd en P10 (eller mindre) pipett och överför 2 μL cDNA för att duplicera brunnar för varje primeruppsättning som ska analyseras. Ersätt tips efter varje brunn för att undvika korskontaminering.
  3. Täta plattan genom att försiktigt applicera den självhäftande filmen på ytan, så att alla brunnar täcks. Tryck på filmen med en tätning paddel eller rulle för att täta ordentligt.
  4. Placera plattan i en centrifug med en tom platta som motvikt. Centrifugera plattan vid 500 x g i 5 min.

9. köra ThermoCycler för qPCR-analys

  1. Slå på datorn och realtids PCR-instrumentet.
  2. Öppna RT-qPCR-programvaran och välj nytt experiment.
  3. Under fliken Inställningar väljer du experiment egenskaper, där parametrarna för körningen kan ställas in.
  4. Definiera experimentets namn, som anger filnamnet och inställningarna som används för att lagra resultat.
  5. För Val av instrumentväljer du det för tillfället anslutna instrumentet som ska köra analysen. Välj jämförande CT (ΔΔCt) Run metod.
  6. Välj SYBR gröna reagenser som fluorescerande DNA-färg som ska användas och standard som ramphastighet.
  7. Kontrollera att rutan bredvid Inkludera smält kurva är markerad.
  8. Under fliken definiera tilldelar du mål (d.v.s. gener som ska amplifieras) och prover (t. ex. experimentella förhållanden).
  9. Välj fliken tilldela . Märk brunnarna med lämpliga mål och prover, eftersom de motsvarar Lastningssystemet på 384-brunnsplattan.
  10. Välj Kör metod. Använd parametrarna för analys som anges i (tabell 3).
Håll scenen PCR-steg Smält kurva
Steg 1 Steg 2 Steg 1 Steg 2 Steg 1 Steg 2 Steg 3
Temp 50 ° c 95 ° c 95 ° c 60 ° c 95 ° c 60 ° c 95 ° c
Tid 2:00 10:00 0:15 1:00 0:15 1:00 0:15
Data insamling Ja Ja
Antal cykler 1x 40x 1x

Tabell 3: cykel parametrar för ThermoCycler.

  1. Placera 384-brunnen plattan i termocyklern och starta analysen.

10. analys av qPCR-resultat med delta-delta CT-metoden (2-δδct)

  1. Analysera resultat som genererats från qPCR-reaktionen för fel som kan störa efterföljande analys. Många fel flaggas automatiskt av systemet.
  2. För korrekt konstruerade primers bör smält kurvor endast ha en topp. Utesluta eventuella brunnar som innehåller en smält kurva med mer än en topp från ytterligare analys.
  3. Exportera CT-värdena till ett kalkylbladsprogram för att analysera data med hjälp av metoden ΔΔCt. Ett föreslaget format tillhandahålls (tabell 4). Den sista kolumnen är den vik uttrycks ändring av provet, i förhållande till kontrollproverna.
Städning Gene (GAPDH) Gen av intresse (IL6)
CT1 CT2 Ave CT CT1 CT2 Ave CT ΔCt Ave ΔCt CtrlS ΔΔCt 2 ^-(ΔΔCt) Att
Kontroll 1 15,33 15,37 15,35 26,81 26,91 26,86 11,51 10,51 1,00 0,50 1,00
Kontroll 2 16,83 16,77 16,80 26,89 26,92 26,91 10,11 10,51 -0,41 1,33
Kontroll 3 17,56 17,53 17,54 27,38 27,56 27,47 9,93 10,51 -0,59 1,50
Sl1344 1 15,50 15,41 15,45 22,15 22,13 22,14 6,69 10,51 -3,83 14,21 13,23
SL1344 2 16,02 15,98 16,00 23,01 22,96 22,98 6,98 10,51 -3,53 11,57
SL1344 3 17,27 17,30 17,28 23,99 23,98 23,98 6,70 10,51 -3,82 14,09
SIPA sopB sopE2 1 15,38 15,41 15,39 23,31 23,09 23,20 7,80 10,51 -2,71 6,56 7,29
SIPA sopB sopE2 2 16,01 16,05 16,03 23,89 23,92 23,91 7,88 10,51 -2,64 6,23
SIPA sopB sopE2 3 16,78 16,78 16,78 24,02 24,06 24,04 7,27 10,51 -3,25 9,49
SIPA sopB SopE2 sopE 1 15,52 15,60 15,56 27,04 27,03 27,03 11,47 10,51 0,96 0,51 0,79
SIPA sopB SopE2 sopE 2 15,56 15,59 15,57 26,37 26,42 26,39 10,82 10,51 0,31 0,81
SIPA sopB SopE2 sopE 3 15,91 15,92 15,91 26,24 26,12 26,18 10,27 10,51 -0,25 1,19

Tabell 4: format för att analysera qPCR-data.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Analysen beskrivs här fokuserar på aktivering av transkriptionsfaktorn NF-κb med hjälp av en NF-κb-beroende luciferas reporter som är stabilt transfekterade till en linje av hela celler. Aktiverade NF-κb receptorn till kärnan där det binder κb bindningsställen för målgener, inklusive de pro-inflammatoriska cytokinerna IL6 och IL23. En allmän översikt över NF-κB-aktiveringen avbildas i figur 1. Den gramnegativa bakterien salmonella SalmonellaentericaSerovar serovar typhimurium användes i denna studie som en aktivare av NF-κb och efterföljande uttryck av IL6 (figur 2). En av de viktigaste virulensfaktorerna som krävs för patogenes är typ III sekretion system-1 (T3SS-1) som tillåter S. Typhimurium att infektera celler och inducera NF-κB aktivering. Funktionen av T3SS-1 är att leverera bakterie-proteiner, kallat effectors, in i värdceller. Här mål effektor proteiner många cellulära signalering vägar att medla invasionen av värd epitelceller. Aktiveringen av NF-κB induceras av S. Typhimurium är oftast beroende av T3SS-1 effektor proteiner sope, SIPA, sopb och SopE218. Här var HeLa 57A celler infekterade med Wild Type S. Typhimurium stam SL1344 och två muterade stammar som saknar antingen tre (SIPA, sopb, SopE2) eller fyra (SIPA, Sopb, SopE2, sope) effektorproteiner. Figur 2 är ett representativt experiment av NF-κb-beroende luciferas aktivering (figur 2a) och IL6 genuttryck (figur 2B) i hela 57a celler infekterade med S. Typhimurium stammar. Infektion med den vilda typen SL1344 stam inducerar en stark luciferas signal som minskar i celler infekterade med SIPA, sopb, SopE2 Triple Mutant (sope-beroende svar), och reduceras till kontrollnivåer med SIPA, sopb, SopE2, sope fyrdubbla Mutant. De relativa luminescensenheterna (RLU) korrelerar med IL6 -uttrycksnivåer (figur 2). Figur 3 representerar de resultat som genereras från RT-qPCR-analys.

Figure 1
Figur 1: Schematisk av NF-κB aktivering och nedströms avläsning. Som beskrivs ovan, är NF-κB kvar i cytosolen i inaktivt tillstånd av det hämmande proteinet IκBα. Både inre och yttre stimuli kan bidra till aktivering av IKK, som fosforylerar IκBα och orsakar dess efterföljande proteosomal nedbrytning. Nedbrytning av IκBα avslöjar den nukleära lokaliserings signalen NF-κB, som främjar translokationen. I kärnan binder aktiverad NF-κB till κB bindningsställen för målgener och främjar deras transkription och uttryck. Målgener, såsom cytokinerna IL6 och IL23, uttrycks och kvantifieras via RT-qPCR. I hela 57a celler luciferas uttrycks efter NF-κb aktivering, som kan kvantifieras via luminiscens analyser. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: representativa data för Luminiscens assay och RT-qPCR Analysis efter S. Typhimurium infektion av HeLa 57A celler. 1 x 105 hela 57a celler var infekterade med 106 CFU (Moi = 10) i log fas S. Typhimurium Wild typ SL1344, eller mutant stammar som saknar SipA, SopB och SopE2, och SipA, SopB, SopE2 och SopE. Efter 1 h, media ersattes, och inkubering fortsatte i ytterligare fyra timmar. A) cellerna bearbetades för att uttrycka luciferas via luminescensanalyser. (B) celler extraherades av RNA, som användes för RT-qPCR-analys. Relativ uttryck för målgener med hjälp av metoden delta-delta CT (2-δδct) visas. Medelvärdet och standardavvikelsen för tre exemplar-brunnarna visas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: sammanfattande resultat genererade från RT-qPCR-analys. Aen förstärkningsplan visas för de brunnar som förstärker GAPDH från hela 57a celler infekterade med S. Typhimurium. B) smält kurva för brunnar som innehåller GAPDH-primers visar en enda smält topp motsvarande cirka 84 ° c. C) dubbla brunnar som innehåller primrar för Il-6. En av brunnarna visar en andra smält topp, som betecknas med en svart pil, och bör uteslutas från analysen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det viktigaste bidraget från protokollet beskrivs är att det ger en snabb och enkel metod för att upptäcka NF-κB aktivering i celler, vilket möjliggör hög genomströmning analys av flera stimulerande villkor eller läkemedel som påverkar NF-κB aktivering. Här, vi beskriver ett protokoll för NF-κB aktivering i salmonella-infekterade hela celler. Dessa celler kan användas för infektion med andra patogener samt för att studera effekten av bakteriell infektion på NF-κB aktivering. Dessutom, NF-κb-beroende luciferas aktivering i hela 57a celler kan användas för att skärmen för aktivatorer eller hämmare av signalering vägar som leder till NF-κb aktivering. Här fröer vi HeLa 57A celler i 48-bra tallrikar, men dessa experiment kan skalas upp till 96-och även 384-bra tallrikar för att möjliggöra fler prover per experiment. HeLa 57A celler konstitutivt uttrycka LacZ, som kan mätas som en intern kontroll för cell nummer och lönsamhet med hjälp av β-gal analyser. Det protokoll som beskrivs här är tillämpligt för användning i cellinjer antingen stabilt eller transitivt transfekterade med en NF-κb:: luciferase reporter konstruera. Den råa 264.7 makrofag cellinjer har redan använts för ett sådant ändamål18. Viktigare är att denna metod inte skiljer mellan aktivering av de olika homo/heterodimers av de fem distinkta NF-κB subunits. Det olikt NF-κb homo-heterodimer komplex har olik tillhörighet för promotorn ordnar, as well as olika transkriptionell reglering följder21. Det är möjligt att aktivering av en specifik NF-κb dimer missas med hjälp av reportern som beskrivs här på grund av låg affinitet bindning till κb bindningsställen från den immunglobulin κ-kedjan promotor regionen.

Det är viktigt att notera att de villkor som är lämpliga för att stimulera en cellinjer inte kan vara direkt tillämpliga på en annan. Därför, det rekommenderas starkt att analysen villkor optimeras i varje analyssystem. Tid för infektion, MOI, varaktigheten av läkemedelsbehandling, läkemedelsdos, och seedning villkor är alla viktiga överväganden att ta hänsyn till vid bedömningen NF-κB aktivering. Till exempel, rå 264.7 makrofager är känsligare för salmonella infektion som kräver olika villkor för att producera en liknande luminiscens signal som ses med hela 57a celler18.

Under Luminescens mätningar är det inte ovanligt att kantbrunnar har betydligt olika värden än de andra brunnar som stimulerades på liknande sätt. Detta beror oftast på högre avdunstnings hastigheter på kantbrunnar på plattan som leder till ökad läkemedelskoncentration. Detta kan åtgärdas genom att tillsätta serum fria medier till utrymmet mellan brunnarna, för plattor som tillåter det, ändra locket/plattan kombinationer för att minska avdunstning, eller utelämna kant brunnar helt om problem kvarstår.

Uttryckt i däggdjursceller, har Firefly luciferas en halveringstid på flera timmar och anses allmänt som stabil för de flesta reporter analyser22. Längre behandlingstider än de som beskrivs här kan utföras på ett tillförlitligt sätt. Emellertid, den luciferas assay system som används här ger en stabil signal endast för den första minuten och snabbt försämras efter det. Därför är det mycket viktigt att luminiscens åtgärden görs snabbt efter blandning cell lysate och substrat.

NF-κB är en transkriptionsfaktor för ett stort antal gener, inklusive cytokiner och chemokiner (dvs. Il6 och Il23). Mätning av NF-κB-beroende luciferasaktivitet innebär inte nödvändigtvis att dessa cytokiner och chemokiner uttrycks. Denna metod kan komplettera befintliga molekylär kvantifiering tekniker genom att tjäna som en potentiell första skärm för karakterisering av förhållanden som påverkar NF-κB aktivitet, som sedan kan funktionellt valideras genom RT-qPCR. Funktionell validering av NF-κB-aktivering kan också utföras via Western blot-analys eller funktionella analyser som är specifika för ett protein av intresse i fall där mRNA-kvantifieringen kanske inte är lämplig. Detta är fallet för interleukin-beta (Il1b), en gen vars transkription induceras av NF-κb-bindning, men protein produkten kräver posttranslationell modifiering för att bilda den mogna produkten23,24.

Det specifika RNA-isolerings protokoll som beskrivs här är inte det enda som kan användas för användning i RT-qPCR-analysen, och andra föredragna metoder, såsom kommersiellt tillgängliga byggsatser, kan istället användas. Det är viktigt att notera att kvaliteten på RNA är mycket viktigt för processen och så RNA bör hållas på is så mycket som möjligt för att förhindra nedbrytning. Det är viktigt att köra dubbla reaktioner i RT-qPCR-reaktionerna för att förvissa sig om att PCR-reaktionerna är konsekventa, eftersom pipettering av sådana små volymer vid lastning av 384-well plattan ofta kan orsaka fel. CT-värden för Housekeeping-genen bör överensstämma mellan proverna, och avvikelser från detta kan tyda på ineffektiva rengöringssteg eller avvikelser i RNA-koncentrationer under omvänd Transkription som kan påverka de slutliga resultaten. Det är också viktigt att kontrollera smält kurvan efter varje qPCR-experiment. Närvaron av en topp antyder att qPCR primers förstärker en enda gen. Flera kurvor tyder på att det finns off-Target genamplifiering eller förekomst av primer dimers. I båda fallen antyder flera toppar som finns i smält kurvan att primers bör omformas för att säkerställa specificitet. Med så mycket utrymme för variation, motion och förfining av bra teknik vid varje steg är avgörande för att generera exakta och reproducerbara resultat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Forskning i Keestra-Gounder Lab stöds av bidrag från NIAID av NIH under tilldelning nummer R21AI122092 och från American Diabetes Association under tilldelning nummer 1-18-JDF-035.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adhesive film VWR International 60941-070
Chloroform Fisher Bioreagents C298-500
DMEM Thermo Fisher 11665092
DNAse treatment kit Qiagen 79254
dNTPs Promega U1511
Ethanol Fisher Bioreagents BP2818100 molecular grade
FBS Sigma-Aldrich F0926
HeLa 57A cells Ref # 15
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems 4368814
Isopropanol Fisher Bioreagents BP26181
Kanamycin Fisher Bioreagents BP906-5
LB agar Fisher Bioreagents BP1425-500
Lysogeny broth Fisher Bioreagents BP1426-500
MgCl2 Fisher Chemical
NanoDrop ND-1000 Thermo Scientific spectrophotometer
Promega luciferase assay system Promega E1501 Cell lysis buffer & luciferin substrate
Random Hexamers Thermo Scientific SO142
Real-time GAPDH forward primer 5'-CCAGGAAATGAGCTTGAC
AAAGT-3'
Real-time GAPDH reverse primer 5-'CCCACTCCTCCACCT
TTGAC-3'
Real-time IL-23 forward primer 5-'GAGCCTTCTCTGCTCCC
TGAT-3'
Real-time IL-23 reverse primer 5'-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3'
Real-time IL-6 forward primer 5'-GTAGCCGCCCCACACAGA-3'
Real-time IL-6 reverse primer 5'-CATGTCTCCTTTCTCAGG
GCTG-3'
Reverse Transcriptase Applied Biosystems 4308228
RNAse inhibitor Thermo Scientific EO0381
RT buffer Promega A3561
SL1344 Ref # 17
SL1344 ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039 Ref # 18
SL1344 ΔsopE ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039 Ref # 18
SYBR green Applied Biosystems 4309155 2x mastermix
Tri-reagent Molecular Research Center TR 118 guanidine thiocyanate
Trypsin -EDTA Thermo Fisher 25300054 0.05% Trypsin-EDTA
Ultrapure water Fisher Bioreagents BP248450
Well plate for PCR VWR International 89218-294 384-well plate

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, T., Zhang, L., Joo, D., Sun, S. C. NF-kappaB signaling in inflammation. Signal Transduction and Targeted Therapy. 2, (2017).
  2. Piva, R., Belardo, G., Santoro, M. G. NF-kappaB: a stress-regulated switch for cell survival. Antioxidants & Redox Signaling. 8, (3-4), 478-486 (2006).
  3. Lawrence, T. The nuclear factor NF-kappaB pathway in inflammation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1, (6), a001651 (2009).
  4. Hargett, D., Rice, S., Bachenheimer, S. L. Herpes simplex virus type 1 ICP27-dependent activation of NF-kappaB. Journal of Virology. 80, (21), 10565-10578 (2006).
  5. Zaragoza, C., et al. Viral protease cleavage of inhibitor of kappaBalpha triggers host cell apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences United States of America. 103, (50), 19051-19056 (2006).
  6. Gao, X., et al. Bacterial effector binding to ribosomal protein s3 subverts NF-kappaB function. PLOS Pathogens. 5, (12), e1000708 (2009).
  7. Kravchenko, V. V., et al. Modulation of gene expression via disruption of NF-kappaB signaling by a bacterial small molecule. Science. 321, (5886), 259-263 (2008).
  8. Kawai, T., Akira, S. Signaling to NF-kappaB by Toll-like receptors. Trends in Molecular Medicine. 13, (11), 460-469 (2007).
  9. Pinaud, L., Sansonetti, P. J., Phalipon, A. Host Cell Targeting by Enteropathogenic Bacteria T3SS Effectors. Trends in Microbiology. 26, (4), 266-283 (2018).
  10. Karin, M. How NF-kappaB is activated: the role of the IkappaB kinase (IKK) complex. Oncogene. (1999).
  11. Berti, R., et al. Quantitative real-time RT-PCR analysis of inflammatory gene expression associated with ischemia-reperfusion brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 22, (9), 1068-1079 (2002).
  12. Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 9, (23), 6505-6525 (1981).
  13. Holden, N. S., Tacon, C. E. Principles and problems of the electrophoretic mobility shift assay. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 63, (1), 7-14 (2011).
  14. Renard, P., et al. Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB. Nucleic Acids Research. 29, (4), E21 (2001).
  15. Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 39, (5), 715-725 (2005).
  16. Ernst, O., Vayttaden, S. J., Fraser, I. D. C. Measurement of NF-kappaB Activation in TLR-Activated Macrophages. Methods in Molecular Biology. 1714, 67-78 (2018).
  17. Rodriguez, M. S., Thompson, J., Hay, R. T., Dargemont, C. Nuclear retention of IkappaBalpha protects it from signal-induced degradation and inhibits nuclear factor kappaB transcriptional activation. Journal of Biological Chemistry. 274, (13), 9108-9115 (1999).
  18. Mendez, J. M., Kolora, L. D., Lemon, J. S., Dupree, S. L., Keestra-Gounder, A. M. Activation of the endoplasmic reticulum stress response impacts the NOD1 signaling pathway. Infection and Immunity. (2019).
  19. Hoiseth, S. K., Stocker, B. A. D. Aromatic-Dependent Salmonella-Typhimurium Are Non-Virulent and Effective as Live Vaccines. Nature. 291, (5812), 238-239 (1981).
  20. Keestra, A. M., et al. Manipulation of small Rho GTPases is a pathogen-induced process detected by NOD1. Nature. 496, (7444), 233-237 (2013).
  21. Wong, D., et al. Extensive characterization of NF-kappaB binding uncovers non-canonical motifs and advances the interpretation of genetic functional traits. Genome Biology. 12, (7), R70 (2011).
  22. Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nature Methods. 8, (10), 879-884 (2011).
  23. Cogswell, J. P., et al. NF-kappa B regulates IL-1 beta transcription through a consensus NF-kappa B binding site and a nonconsensus CRE-like site. Journal of Immunology. 153, (2), 712-723 (1994).
  24. Thornberry, N. A., et al. A Novel Heterodimeric Cysteine Protease Is Required for Interleukin-1-Beta Processing in Monocytes. Nature. 356, (6372), 768-774 (1992).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics