NF-KB-avhengige luciferase aktivisering og kvantifisering av Gene Expression i Salmonella infiserte tissue kultur celler

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å raskt og enkelt måle kjernefysisk faktor Kappa-Light-Chain-Enhancer av aktiverte B-celler (NF-KB) aktivering i cellelinjer uttrykker NF-kB:: luciferase reporter konstruksjoner, via målinger av luminescence i cellen lysat. I tillegg er genuttrykk bestemmes via RT-qPCR isolert fra celler infisert med Salmonella tyfimurium.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Mendez, J. M., Keestra-Gounder, A. M. NF-κB-dependent Luciferase Activation and Quantification of Gene Expression in Salmonella Infected Tissue Culture Cells. J. Vis. Exp. (155), e60567, doi:10.3791/60567 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Den dimeric transkripsjon faktor NF-KB regulerer mange cellulære respons trasé, inkludert inflammatoriske trasé ved å indusere uttrykk for ulike cytokiner og chemokiner. NF-KB er constitutively uttrykt og er sequestered i stoffer av hemmende protein kjernefysiske faktor av Kappa lys polypeptid gen Enhancer i B-cellene inhibitor, Alpha (IκBα). Aktivering av NF-KB krever nedbrytning av IκBα, som deretter eksponerer en kjernefysisk lokalisering signal på NF-KB og fremmer sin smugling til kjernen. En gang i kjernen, NF-KB binder seg til Promotor regionen NF-KB mål gener som interleukin 6 (IL-6) og IL-23, for å fremme sine uttrykk.

Aktiveringen av NF-KB oppstår uavhengig av transkripsjon eller oversettelse. Derfor må aktiveringsstatusen for NF-KB måles enten ved kvantifisere NF-KB spesielt i kjernen, eller ved kvantifisere uttrykk for NF-KB mål gener. I denne protokollen, celler stabilt transfekterte med en NF-kB:: luciferase reporter konstruere er analyseres for NF-KB aktivering ved hjelp av in vitro vev kultur teknikker. Disse cellene er smittet med Salmonella tyfimurium å aktivere NF-KB, som traffics til kjernen og binder seg til KB områder i promoter regionen luciferase, inducing sitt uttrykk. Celler er lysert og analysert med luciferase analysen systemet. Mengden luciferase som produseres av cellene, samsvarer med intensiteten i luminescence signalet, som oppdages av en plate leser. Det luminescence signalet som genereres av denne fremgangsmåten, gir en rask og svært følsom metode for å vurdere aktivering av NF-KB under en rekke betingelser. Denne protokollen benytter også kvantitative omvendt transkripsjon PCR (RT-qPCR) for å oppdage relative mRNA nivåer som er tegn på genuttrykk.

Introduction

Den kjernefysiske faktor-KB (NF-KB) familie av proteiner er viktig transkripsjon aktivator som regulerer genuttrykk i ulike biologiske trasé. Aktivering av NF-KB induserer transkripsjon av målet gener, hvorav mange er viktige for immun-og inflammatoriske reaksjoner, celle spredning, stress svar og kreft progresjon1,2. NF-KB spiller en integrert rolle i formidling tidlige inflammatoriske utfall for patogen klarering. Gitt de mange biologiske prosesser formidlet av NF-KB aktivering, forstyrrelser i sine signalering kan få alvorlige konsekvenser for helse og sykdom. Tap av funksjon mutasjoner i NF-KB signalering er forbundet i flere uimottakelig mangel fenotyper, mens gevinsten av funksjonen mutasjoner er forbundet med flere typer kreft, inkludert B-celle lymfomer og brystkreft3. I tillegg har mange patogener vist å direkte modulere aktiverings tilstanden til NF-kb gjennom uttrykk for virulens faktorer4,5,6,7.

Aktivering av NF-KB er kjent for å være en konsekvens av mange variable stimuli inkludert bakterielle produkter som lipopolysaccharides (LPS), flagellin og peptidoglycans kjent som patogen-assosiert molekylær mønstre (PAMPs). Disse PAMPs oppdages av mønstergjenkjenning reseptorer (PRRs) som toll-lignende reseptorer (TLRs) og Nod-lignende reseptorer (NLRs) fører til aktivering av NF-KB og den påfølgende uttrykk for en rekke NF-KB-avhengige inflammatoriske gener8. I tillegg til PRR aktivering av PAMPs, kan andre bakterielle produkter, for eksempel bakterielle effektor proteiner, indusere aktiveringen av NF-kB. Interessant, bakterier også uttrykke effektor proteiner som aktivt dempe NF-KB veien og forbedre sine patogenitet, understreker viktigheten av NF-KB som en viktig formidler av immunitet9.

Det er fem forskjellige under enheter som danner NF-KB dimers; P50, p52, forholdet (P65), RelB og cRel. De to viktigste NF-KB-heterodimerer er P50: forholdet og p52: RelB dimers. Den aktiverte NF-KB dimers binder til DNA-områder, kjent som KB nettsteder, i promoter og Enhancer regioner av ulike mål gener. Under normale homøostatisk forhold, NF-KB samhandler med en familie av inhibitor proteiner kjent som IκB proteiner å være inaktiv. Ved stimulering, IκB er fosforylert av IκB kinase (IKK), som gjør det mulig å være målrettet for ubiqitinering, og senere degradering. Nedbrytning av IκB aktiverer NF-KB ved å avsløre et kjernefysisk lokaliserings signal. NF-KB deretter translocates til kjernen, der det binder KB områder i arrangøren regionen mål gener og fremme transkripsjon10. Dermed aktivering av NF-KB upregulates mRNA uttrykk for NF-KB mål gener, og denne endringen kan måles gjennom RNA kvantifisering analyser som RT-qPCR11.

Det finnes flere metoder og brukes vanligvis for måling av NF-KB aktivering, inkludert Elektroforetiske mobilitet Skift analyser (EMSA), kjernefysiske translokasjon og gen reporter analyser. EMSA brukes til å oppdage protein komplekser med nukleinsyre syrer. Stimulert celler er fraksjonert å isolere kjernefysiske proteiner, inkludert translocated NF-KB, som deretter inkubert med radiolabeled nukleotider inneholder NF-KB bindende domenet. Prøvene er kjørt på en gel og avbildet av autoradiografi av 32P-merket nukleinsyre syre. Hvis NF-KB er til stede i proteinet brøkdel, vil det binde nukleotider, som vil migrere tregere gjennom gel og presentere som diskrete band. Kjernefysiske fraksjoner av celler som mangler aktivert NF-KB (for eksempel unstimulated kontroll celler) vil produsere noen band som nukleotider migrere raskere til slutten av gelen. En stor ulempe med denne metoden er at det i stor grad er kvantitativ i binær forstand (dvs. på eller av) og ikke tilstrekkelig fange meningsfulle forskjeller i NF-KB bindende kapasitet. I tillegg denne metoden ikke anser kromatin strukturer som er funksjonelt viktig for NF-KB målet gener12,13.

I likhet med den forrige metoden, det er en "ikke-Shift"-analysen der multi-brønn platene er belagt med nukleotider inneholder NF-KB bindende sekvens. Etter behandling av celler med kjernefysiske fraksjoner av protein, NF-KB vil binde til nukleotider bundet til brønnen. Anti-NF-KB antistoffer blir deretter lagt til, som vil samhandle med den bundne NF-KB og produsere et fargemetrisk signal proporsjonal med mengden av NF-KB, som indikerer graden av NF-KB-aktivering. Denne metoden er fordelaktig over EMSA ved at den ikke krever radiolabeled nukleinsyre syrer og er kvantitativ, i sammenligning. Men en påminnelse om denne metoden er at det igjen ikke skiller mellom kromatin statene NF-KB målet gener14.

En annen metode som NF-KB aktivering kan oppdages er av kromatin immunutfelling (ChIP), hvorved DNA og samspill proteiner er kryss-knyttet til formaldehyd og immunoprecipitated med spesifikke anti-NF-KB antistoffer. De spesifikke nukleotid fragmentene blir deretter renset og identifisert gjennom PCR forsterkning eller direkte høy gjennomstrømming sekvensering. Resultater generert fra denne metoden gir semi-kvantitative resultater av NF-KB bindende aktivitet med mål gener. Imidlertid er resultatene svært avhengig av fiksering forhold og rensing prosesser på hvert trinn15.

I kjernefysiske translokasjon analyser, celler stimuleres til å indusere NF-KB aktivering og deretter fast. Anti-P65 antistoffer legges til faste celler. Alternativt kan P65 delenhet selv være merket med et fluorescerende peptid som grønn fluorescerende grønn (GFP). I begge tilfeller, immunofluorescence ville tillate tenkelig av lokaliseringen av P65 å avgjøre Cellular distribusjon. Ved å måle andelen av cytosolic og kjernefysiske lokaliserte protein, kan etterforskere bestemme relativ aktiveringstilstand NF-kB. En ulempe med denne metoden er at immunofluorescence er forholdsvis tidkrevende, krever kostbare antistoffer, og trenger relativt større teknisk ekspertise16.

Reporter gener er ofte brukt verktøy for å studere regelverket og uttrykk mønstre av et gen av interesse. Vanligvis er reporter gener konstruert fra arrangøren sekvensen av et gen av interesse smeltet til et gen koding for et lett synlig protein. Proteiner med enzymatisk aktivitet, fluorescens, eller luminescence egenskaper er ofte valgt for deres evne til å være analyseres og kvantifisert. Således, det lese-ut (e.g., luminescence, fluorescens) behandler som signal for oppdagelsen av det gen gjengivelsen. Disse reporter konstruksjoner kan deretter innføres i ulike celletyper, for eksempel epitelceller eller makrofager.

Beskrevet i protokollen er bruken av en klonet HeLa cellelinje (HeLa 57A) som er stabilt transfekterte med en luciferase reporter som inneholder tre eksemplarer av KB konsensus av immunglobulin ĸ-kjeden promoter region17. Uttrykk for luciferase er avhengig av aktiveringen av NF-KB, som oppstår etter celle stimulering. Stimulert celler er lett lysert ved hjelp av cellelyse Rings buffer gitt i luciferase analysen Kit. En del av celle lysat blandes deretter med luciferase analysebuffer som inneholder luciferin. Luciferin er underlaget av luciferase og er nødvendig for generering av lys i nærvær av luciferase. Etter å kombinere analysen buffer med lysat, vil løsningen avgir lys i en prosess kjent som luminescence. Mengden av lys produsert, gitt i lumen, er proporsjonal med mengden av luciferase tilstede i lysat og fungerer som et mål på NF-KB aktivering. Lumen målingene tolkes i forhold til en unstimulated standard å ta hensyn til Baseline NF-KB aktivitet og signalet i seg selv er stabil i flere minutter for å muliggjøre pålitelig måling. I tillegg er HeLa 57A cellelinjen stabilt transfekterte med en NF-KB-Independent β-galaktosidase reporter. Β-galaktosidase reporter er constitutively uttrykt, og β-galaktosidase aktivitet kan måles for å kontrollere for celle levedyktighet eller variasjon i celle tall17. De luciferase verdiene kan deretter justeres til β-galaktosidase verdier og rapporteres som fold økning over unstimulated kontroll celler.

Siden NF-KB er en transkripsjon faktor ansvarlig for økt uttrykk for NF-KB-avhengige mål gener, et oppfølgingseksperiment for å kontrollere for NF-KB-avhengige økt genuttrykk er kvantitativ omvendt transkripsjon polymerase kjedere reaksjon ( RT-qPCR). RT-qPCR er en svært følsom metode der endringer i genuttrykket kan kvantifisert over flere størrelsesordener. Stimulert og kontroll celler høstes for RNA via fenol-kloroform ekstraksjon. Etter fase separasjon trekkes RNA ut som hovedkomponenten i det vandige laget. RNA-en blir deretter utløst og vasket for å produsere en ren pellet. Denne pellet blir deretter rekonstituert og ytterligere rengjort av forurensende DNA via DNase behandling. Den rene RNA-en blir deretter omvendt for å skape utfyllende DNA (cDNA). Denne cDNA kan deretter analyseres gjennom kvantitative PCR-teknikker, der overflod av en bestemt mRNA-sekvens er kvantifisert for å avgjøre genuttrykk. Denne teknikken ikke belyse translational kontroll, post translational modifikasjon, protein overflod, eller protein aktivitet. Men mange gener, spesielt de som er involvert i Pro-inflammatoriske prosesser, er regulert via NF-KB og deres mRNA overflod er en indikasjon på deres uttrykk.

Metoden foreslo her utnytter en rask og enkel måte som NF-KB aktivering kan oppdages via luminescence analyser av mobilnettet lysat. RT-qPCR av NF-KB mål genuttrykk kan brukes til å kvantifisere uttrykk for bestemte gener, samt validere funksjonell aktivitet av NF-KB aktivering. De store fordelene med et slikt system er dens enkelhet og hastighet, noe som gjør det mulig for høy gjennomstrømming screening av en rekke forhold som modulere NF-KB aktivering. Denne protokollen er egnet for andre cellelinjer uttrykker en NF-kB:: luciferase reporter, og har blitt demonstrert i stabilt transfekterte RAW 264.7 celler18. Mengden tid som kreves for å håndtere prøver, fra cellelyse til å generere en luminescence signal, er minimal og tar span av omtrent en time. Måling av NF-KB krever bare grunnleggende laboratorieutstyr som ugjennomsiktige plater, en plate leser som kan måle luminescence, og enkel dataanalyse programvare, for eksempel et regnearkprogram.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cell Passaging og seeding

  1. Oppretthold HeLa 57A celler i en 75 cm2 kolbe som inneholder 10 ml av Dulbecco ' s modifiserte Eagle ' s Media (DMEM) supplert med 5% varme deaktivert fosterets storfe serum (FBS) ved 37 ° c i en 5% co2 inkubator.
  2. Aspirer cellekultur medier og vask med 1 mL 0,05% Trypsin-EDTA-løsning. Aspirer Trypsin og Skift ut med ytterligere 1 mL. Plasser flasken i et 37 ° c inkubator for 4-5 min slik at cellene kan løsne fra kolbe.
  3. Tilsett 9 mL cellekultur medier og vask forsiktig bunnen av flasken et par ganger for å løsne celler og danner en homogen suspensjon.
  4. Fortynne HeLa 57A celler 1:6 eller 1:8 i friske medier og frø i nye kanner. Passage celler når de er 90% confluent eller hver tre dager og vedlikeholde celler på minimum 25% confluency.
  5. En dag før celle stimulering, trypsinize HeLa 57A celler og suspendere i 10 mL av vekst medier. Telle celler i suspensjon ved hjelp av en hemocytometer og bruke vekst medier for å fortynne celler til en endelig konsentrasjon av 2,5 x 105 celler/ml i et 50 ml konisk rør.
  6. Overføring 250 μL av celle fjæring (~ 6,25 x 104 celler) til hver brønn av en 48-brønn plate. Med jevne mellomrom hetten og snu det koniske røret for å sikre en homogen celle suspensjon. Trykk på platen forsiktig på siden for å sikre at cellene fordele jevnt i brønnene.
  7. Overfør platen til 37 ° c i en 5% CO2 inkubator og la cellene feste og vokse over natten.

2. utarbeidelse av bakterier

  1. To dager før smitte, strek frosne bestander av Salmonella på lb agar plater for å produsere enkelt kolonier. Overfør platene til en inkubator satt til 37 ° c og tillater over natten vekst.
  2. En dag før infeksjon, tilsett 3 mL lysogeny buljong (LB) til steril bakteriell kultur rør, og legger til riktig antibiotika til Media.
  3. Ved hjelp av en steril inoculation sløyfe, plukke en enkelt koloni fra stripete bakterielle kulturer og berøre loopen til LB Media. Cap rørene etter vaksinere og kast sløyfen.
  4. Plasser rørene i en risting inkubator satt til 37 ° c, 180 RPM, og la det vokse over natten.
  5. På dagen for smitte, hente overnight bakterielle kulturer fra inkubator.
  6. Forbered rør for under kultur ved å legge til 3 mL fersk LB, som inneholder antibiotika når det er hensiktsmessig.
  7. Overfør 30 μL av den over natten bakterie kulturen (1 i 100 fortynning) til ferskt tilberedte medier. Plasser rørene i en risting inkubator satt ved 37 ° c for 3 t.
  8. Etter 3 h inkubasjons, overføre 1 mL av steril LB buljong i en plast Cuvette å tjene som blank. Overfør 900 μL av LB til de andre kyvetter som skal brukes til prøve analysen.
  9. Overfør 100 μL av bakteriell under kultur til en Cuvette inneholdende 900 μL av LB og pipette opp og ned flere ganger for å blande. Gjenta dette for hver bakteriell suspensjon.
  10. Slå på spektrofotometer for å måle den optiske tettheten (OD) av bakteriekulturer i en bølgelengde på 600 NM (OD600).
  11. Plasser det tomme i spektrofotometer. Legg merke til orientering, så det bør være et merke mot toppen indikerer slikt.
  12. Lukk lokket og trykk på den tomme knappen på spektrofotometer for å få bakgrunns absorbansen.
  13. Erstatt den tomme Cuvette med et eksempel Cuvette i samme retning, og trykk Les.
  14. Registrer OD600 verdier av disse prøvene. Multipliser verdien med 10 for å gjøre rede for den fortynningsfaktoren.
  15. Fortynne bakteriell under kultur med fersk LB for å oppnå en absorbansen verdi på ca 1,0, som grovt tilsvarer 1 x 109 CFU/ml. Fortynne denne suspensjonen 1:10 i en Cuvette og måle absorbansen-som skal gi en verdi på ~ 0,1.
  16. I et nytt rør, tilsett et passende volum av fortynnet under kultur til frisk LB for å oppnå en suspensjon på 1 x 108 CFU/ml som skal brukes som en inokulum.
  17. Forbered seriell fortynninger av inokulum ved å overføre 50 μL av bakteriell suspensjon til et rør som inneholder 450 μL av steril PBS (10-fold fortynning) til en endelig fortynning av ca 102 CFU/ml er gjort.
  18. Transfer 100 μL av de to laveste fortynninger (102 og 103 tilsvarende med 10 og 100 koloni forming enheter, HENHOLDSVIS) til en lb agar plate og spre suspensjonen med en celle spre å få enkelt kolonier. Overfør disse platene til en 37 ° c inkubator og ruge over natten.
  19. Dagen etter teller koloniene og beregne bakteriell konsentrasjon av den første inokulum å bestemme den faktiske inokulum konsentrasjon.

3. infeksjon av celler

Merk: på dette punktet, bør cellene være på ca 90% confluency. For HeLa 57A celler i en 48-brønn plate, er dette ca 1 x 105 celler per brønn. Celler vil bli smittet med mangfold av smitte (MOI) på 10, eller 106 CFU/well.

  1. Merk lokket på platen i henhold til infeksjons forholdene som skal brukes for hver brønn, med hver tilstand som gjøres i tre eksemplarer.
  2. Tilsett 10 μL av inokulum på egnede brønner. Tilsett 10 μL av sterile LB til ikke-infisert kontroll brønner.
  3. For å synkronisere tidspunktet for infeksjon, plasserer platen i en tabletop sentrifuge og spinne på 500 x g i 5 min, slik at platen er telleren balansert.
  4. Overfør infiserte celler til en 5% CO2 inkubator ved 37 ° c for 1 t.
  5. Plasser en alikvot av cellekultur medier i et vannbad på 37 ° c for bruk i neste trinn.
  6. En time etter smitte tid, fjerne cellekultur medier fra vannbad og tørk utvendig med 70% etanol. Overfør vevs kultur plate til biosafety skap.
  7. Ved hjelp av steril teknikk, aspirer medier fra brønner og Erstatt med 250 μL av ferske, varme cellekultur medier.
  8. Retur plater til 5% CO2 inkubator ved 37 ° c for ytterligere 4 h.
  9. Fjern platene fra CO2 inkubator og aspirer mediene fra brønnene. For luciferase analyse fortsetter du til trinn 4,1. For RNA-isolering går du videre til trinn 5,1.

4. luciferase analyse

  1. Tilsett 100 μL av 1x cellelyse Rings buffer til brønnene. Det kan hende at bufferen først må fortynnes til en arbeids konsentrasjon, avhengig av reagens.
  2. Overfør platen til en-80 ° c fryseboks og ruge i minst 30 minutter for å sikre effektiv cellelyse.
  3. Plasser platen som inneholder frosne celle lysat på en benk for å tine og fremstille luciferase substrat reagenser i henhold til produsentens anbefalinger.
  4. La luciferase substrat reagenser likevekt til romtemperatur.
  5. Slå på plate leseren og åpne tilsvarende leser programmet. Still inn maskinen til å måle luminescence.
  6. Overfør 10 μL av hver prøve til en brønn av en ugjennomsiktig 96-brønn plate.
  7. Tilsett 50 μL av luciferase analyse reagens ved hjelp av en flerkanals pipette til hver brønn på den ugjennomsiktige platen.
  8. Trykk forsiktig på platen på siden for å blande brønner og sikre at den nederste overflaten er dekket med væske. Plasser platen i en plate leser og starte lesing.
  9. Kopier de luminescence verdiene til et regnearkprogram og plott resultatene.

5. RNA-isolasjon

  1. Tilsett 500 μL av guanidium ammoniumthiocyanat til hver brønn og Pipetter opp og ned flere ganger for å sikre fullstendig lyse Rings.
  2. Overfør innholdet til en merket mikrosentrifugen tube. Oppretthold prøver på isen så mye som mulig for å opprettholde RNA-kvalitet.
  3. Sett en tabletop sentrifuge til 4 ° c og opprettholde sentrifuge ved denne temperaturen for resten av protokollen.
  4. Til hvert prøverør legger du til 100 μL av kloroform, lokk tett og rister i 15 s. ruge ved romtemperatur i 10 minutter.
  5. Sentrifuger ved 12 000 x g for 15 min ved 4 ° c. I løpet av denne tiden, forberede neste trinn av RNA rensing ved å merke nye rør.
  6. Overfør den øvre vandige fasen til det nye røret som inneholder 250 μL av isopropanol, og pass på å ikke forstyrre de midtre eller nedre lagene.
  7. Oppbevar ubrukt produkt i en-80 ° c fryser, som også kan brukes til proteinanalyse. Det gjenværende vandige laget kan også fungere som en backup hvis RNA er nødvendig senere.
  8. Vortex blandingen av vandig lag og isopropanol og la prøvene å sitte ved romtemperatur i 10 min.
  9. Sentrifuger prøvene ved 12 000 x g i 10 min ved 4 ° c.
  10. Fjern rørene fra sentrifuger. RNA-utfelling danner en hvit pellet på siden og bunnen av slangen. Åpne rørene og fjern forsiktig supernatanten ved å strømme ut i en avfallsbeholder.
  11. Vask RNA-pellet-en ved å tilsette 500 μL av 75% etanol og Vortex.
  12. Sentrifuger ved 8 000 x g for 5 min ved 4 ° c.
  13. Fjern supernatanten ved å helle ut og igjen vaske pellet med 75% etanol.
  14. Sentrifuger ved 8 000 x g for 5 min ved 4 ° c.
  15. Ved bruk av liten volum pipette (f.eks. 10-200 μL volum), aspirer så mye av supernatanten som mulig, og pass på at du ikke skyver noen væske tilbake i røret eller løsne pellet med pipette spissen. Hvis pellet blir forskyves, sentrifuger kort og igjen prøve å fjerne supernatanten.
    1. Luft-tørk RNA pellets. Hvis pellets er synlig for alle prøve, periodisk (enhver 5 minuttene) sjekk opp på seg å se hvis de endre fra hvit å helt, angir det de er tørr. Når pellets begynner å snu klar, tilsett 20 μL av ultrarent, RNase fritt vann for å oppløse RNA.
    2. Hvis pellets var ikke i starten synlig for alle eksemplar, bare sammenlegge ultrarent vann 5 min etter fjerner supernatanten.
  16. For å øke løselighet, pass løsningen et par ganger gjennom en pipette spissen og ruge i 10 min ved 55-60 ° c.

6. DNase behandling av RNA

  1. For å opprettholde RNA-integriteten, Oppbevar RNA-prøver på is med mindre annet er angitt. På denne tiden, kan 10x DNase buffer fjernes fra fryseren og lov til å tine på isen.
  2. Klargjør spektrofotometer for prøveanalyse ved å rense alle prøveanalyse overflater med en lofri klut.
  3. Ta en bakgrunns måling før analyse. Det gjør du ved å laste inn sensoren med 1,5 μL av samme ultrarent vann som brukes til å oppløse RNA-pellets. Trykk på Read blank -knappen for å generere en bakgrunns avlesning.
  4. Bruk den lofri kluten til å tørke av instrumentets prøve overflate. Gjenta dette trinnet etter hvert prøve lesing.
  5. Last 1,5 μL av resuspendert RNA til prøveholderen og velg Les eksempel. Gjenta til alle prøvene er lest.
  6. Forbered DNase Master Mix ved å kombinere 2,4 μL av 10x DNase buffer og 1 μL av DNase, per prøve, i et 1,5 mL mikrosentrifugen rør. Forbered Master mix for to ekstra volumer.
  7. Bland Master Mix ved å sveipe røret flere ganger. Sentrifuger kort på røret for å samle innholdet i bunnen av røret. Tilsett 3,4 μL av mastermix til 20 μL av RNA-prøve. Bland innholdet ved å bla og sentrifuger kort, som før.
  8. Overfør prøvene til en varme blokk innstilt på 37 ° c i 20 min. Fjern DNase inaktive reagens fra fryseren og Tin ved romtemperatur.
  9. 20 min etter å ha plassert prøver på varme blokken, Overfør prøvene til et rør stativ plassert på arbeidsbenken.
  10. Vortex innholdet i DNase inaktive reagens forsiktig. Overføring 2,6 μL av DNase inaktive reagens til rørene som inneholder RNA og deretter flick rørene for å skape en homogen blanding.
  11. Sentrifuger prøvene ved 12 000 x g i 1 min.
  12. Forsiktig Pipetter supernatanten til en ny, merket tube.

7. omvendt transkripsjon av mRNA til cDNA

  1. Forbered en Master Mix avhengig av mengden av prøver pluss to ekstra for å gjøre rede for tap gjennom pipettering (tabell 1). Bruk 1 mikrogram RNA og tilsett H2O til et volum på 50 μL totalt.
Reagens Volum (μL) Endelig konsentrasjon
MgCl2 (25mm) 3,5 1,75 mM
Omvendt transkripsjon buffer (10x) 5 1x
dNTP mix (10 μM, hver) 2,5 500 NM
tilfeldige heksamer (100 μM) 1,25 2,5 μM
Multiscribe revers transkriptase (50 U/μL) 1 1 U/μL
RNase-hemmer (20 U/μL) 1,25 1,25 U/μL
RNA (1 μg) 20 ng/uL
H2O Topp opp til 50

Tabell 1: komponenter og oppskrift for omvendt transkripsjon Master mix.

  1. Cap prøvene tett og merke PCR-rør på siden som etiketter på lokket kan fjernes fra det oppvarmede lokket på thermocycler senere. Bland med virvlingen.
  2. Sentrifuger kort på PCR-rørene for å samle prøver til bunnen av røret.
  3. Plasser PCR-rørene i en thermocycler og Kjør prøvene under følgende innstillinger:
    25 ° c i 10 min, 48 ° c i 30 min, 95 ° c i 5 min, og hold deretter ved 10 ° c.
  4. Overførings rør som inneholder nylig syntetisert cDNA til en-20 ° c fryser eller brukes umiddelbart i qPCR-analyse.

8. klargjøre og laste plate for RT-qPCR analyse

  1. Før du starter, planlegge oppsett av 384-brønn qPCR plate for prøveanalyse.
  2. Tin primere og cDNA på isen.
  3. Forbered en Master mix (se tabell 2), pluss ca 10% ekstra å gjøre rede for tap gjennom pipettering.
Reagens Volum (μL)
10 μM F primer 1
10 μM R primer 1
Ultrarent H2O 4
2x SYBR grønn 10

Tabell 2: komponenter og oppskrift på qPCR Master mix.

  1. Vortex Master mix og dispensere 8 μL i brønnene på 384-brønn plate ved hjelp av en repeater pipette. Prøvene vil bli analysert i duplikat for hver primer og cDNA sample kombinasjon.
  2. Ved hjelp av en P10 (eller mindre) pipette, overføring 2 μL av cDNA å duplisere brønner for hver primer satt til å bli analysert. Erstatt tips etter hver brønn for å unngå krysskontaminering.
  3. Forsegle platen ved forsiktig å påføre limet filmen til overflaten, slik at alle brønnene er dekket. Trykk på filmen ved hjelp av en forsegling padle eller rull å forsegle godt.
  4. Plasser platen i en sentrifuge, med en tom plate som en motvekt. Sentrifuger platen ved 500 x g i 5 min.

9. kjøre Thermocycler for qPCR Analysis

  1. Slå på datamaskinen og PCR-instrumentet i sanntid.
  2. Åpne RT-qPCR-programvaren og velg nytt eksperiment.
  3. Under kategorien Oppsett velger du eksperiment egenskaper, der parameterne for kjøringen kan angis.
  4. Definer eksperiment navnet, som vil angi filnavnet og innstillingene som brukes til å lagre resultater.
  5. For instrument valgvelger du det gjeldende tilkoblede instrumentet som skal kjøre analysen. Velg KOMPARATIV CT (ΔΔCt) Run metoden.
  6. Velg SYBR grønne reagenser som det fluorescerende DNA-Dye som skal brukes og standard som rampe hastighet.
  7. Kontroller at boksen ved siden av Inkluder Smelt kurve er avmerket.
  8. Under Definer -fanen tildeler du mål (dvs. gener som skal forsterkes) og prøver (for eksempel eksperimentelle forhold).
  9. Velg kategorien Tilordne . Merk brønnene med passende mål og prøver, ettersom de tilsvarer laste oppsettet til 384-brønn platen.
  10. Velg Kjør metode. Bruk parameterne for analysen som er oppført i (tabell 3).
Hold Stadium PCR-stadiet Smelte kurve Stage
Trinn 1 Trinn 2 Trinn 1 Trinn 2 Trinn 1 Trinn 2 Trinn 3
Temp 50 ° c 95 ° c 95 ° c 60 ° c 95 ° c 60 ° c 95 ° c
Tid 2:00 10:00 0:15 1:00 0:15 1:00 0:15
Data innsamling ja ja
Antall sykluser 1x 40x 1x

Tabell 3: syklus parametere for thermocycler.

  1. Plasser 384 brønn platen i thermocycler og start analysen.

10. analyse av qPCR resultater med delta-delta-CT-metoden (2-ΔΔCt)

  1. Analyser resultater generert fra qPCR-reaksjonen for feil som kan forstyrre nedstrøms analyse. Mange feil vil bli flagget automatisk av systemet.
  2. For riktig konstruert primere, bør smelte kurvene bare ha en topp. Ekskluder eventuelle brønner som inneholder en smelte kurve med mer enn én topp fra videre analyse.
  3. Eksporter CT-verdiene til et regnearkprogram for å analysere dataene ved hjelp av ΔΔCt-metoden. Et foreslått format er angitt (Tabell 4). Den siste kolonnen er flippen uttrykket endring av prøven, i forhold til kontroll prøvene.
Housekeeping genet (GAPDH) Gene av interesse (IL6)
Ct1 Ct2 Ave CT Ct1 Ct2 Ave CT ΔCt Ave ΔCt CTRLS ΔΔCt 2 ^-(ΔΔCt) Gjennomsnitt
Kontroll 1 15,33 15,37 15,35 26,81 26,91 26,86 11,51 10,51 1,00 0,50 1,00
Kontroll 2 16,83 16,77 16,80 26,89 26,92 26,91 10,11 10,51 -0,41 til en 1,33
Kontroll 3 17,56 17,53 17,54 27,38 27,56 27,47 9,93 10,51 -0,59 til en 1,50
Sl1344 1 15,50 15,41 15,45 22,15 22,13 22,14 6,69 10,51 -3,83 til en 14,21 13,23
SL1344 2 16,02 15,98 16,00 23,01 22,96 22,98 6,98 10,51 -3,53 til en 11,57
SL1344 3 17,27 17,30 17,28 23,99 23,98 23,98 6,70 10,51 -3,82 til en 14,09
SipA SopB sopE2 1 15,38 15,41 15,39 23,31 23,09 23,20 7,80 10,51 -2,71 til en 6,56 7,29
SipA SopB sopE2 2 16,01 16,05 16,03 23,89 23,92 23,91 7,88 10,51 -2,64 til en 6,23
SipA SopB sopE2 3 16,78 16,78 16,78 24,02 24,06 24,04 7,27 10,51 -3,25 til en 9,49
SipA SopB SopE2 sopE 1 15,52 15,60 15,56 27,04 27,03 27,03 11,47 10,51 0,96 0,51 0,79
SipA SopB SopE2 sopE 2 15,56 15,59 15,57 26,37 26,42 26,39 10,82 10,51 0,31 0,81
SipA SopB SopE2 sopE 3 15,91 15,92 15,91 26,24 26,12 26,18 10,27 10,51 -0,25 til en 1,19

Tabell 4: format for analysering av qPCR-data.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Analysen beskrevet her fokuserer på aktivering av transkripsjon faktoren NF-KB ved hjelp av en NF-KB-avhengige luciferase reporter som er stabilt transfekterte i en linje av HeLa celler. Aktivert NF-KB translocates til kjernen der det binder KB bindende områder av mål gener, inkludert Pro-inflammatorisk cytokiner IL6 og IL23. En generell oversikt over NF-KB-aktivering er avbildet i figur 1. Den gram-negative bakterien Salmonella enterica serovar tyfimurium ble brukt i denne studien som en AKTIVATOR av NF-KB og påfølgende uttrykk for IL6 (figur 2). En av de viktigste virulens faktorene som kreves for patogenesen er type III sekresjon system-1 (T3SS-1) som gjør S. Tyfimurium å infisere celler og indusere NF-KB aktivering. Funksjonen til T3SS-1 er å levere bakterielle proteiner, kalt effekt Orer, til verts celler. Her effektor proteiner mange mobil signalering veier for å megle invasjon av verts epitelceller. NF-KB-aktiveringen forårsaket av S. Tyfimurium er for det meste avhengig av T3SS-1-effektor proteiner SopE, SipA, SopB og SopE218. Her HeLa 57A celler ble smittet med vill type S. Tyfimurium stamme SL1344 og to mutant stammer mangler enten tre (SipA, SopB, SopE2) eller fire (SipA, SopB, SopE2, SopE) effektor proteiner. Figur 2 er et representativt eksperiment av NF-KB-avhengige luciferase aktivering (figur 2a) og IL6 genuttrykk (figur 2B) i jakten 57A celler infisert med S. Tyfimurium stammer. Infeksjon med den ville typen SL1344 belastning induserer en sterk luciferase signal som er redusert i celler infisert med SipA, SopB, SopE2 Triple mutant (SopE-avhengig respons), og redusert til kontrollnivåer med SipA, SopB, SopE2, SopE Quadruple mutant. De relative luminescence enhetene (RLU) samsvarer med IL6 uttrykks nivåene (figur 2). Figur 3 representerer resultatene generert fra RT-qPCR-analyse.

Figure 1
Figur 1: skjematisk av NF-KB aktivering og nedstrøms readouts. Som beskrevet ovenfor beholdes NF-KB i stoffer i inaktiv tilstand av det hemmende proteinet IκBα. Både interne og eksterne stimuli kan bidra til aktivering av IKK, som fosforylerer IκBα og forårsaker dens påfølgende proteosomal degradering. Nedbrytning av IκBα avslører kjernefysiske lokalisering signal av NF-KB, som fremmer translokasjon. I kjernen, aktivert NF-KB binder seg til KB bindende områder av målet gener, fremme deres transkripsjon og uttrykk. Mål gener, slik som cytokiner IL6 og IL23, UTTRYKKES og kvantifisert via RT-qPCR. I HeLa 57A celler luciferase uttrykkes følgende NF-KB aktivering, som kan kvantifisert via luminescence analyser. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: representative data for luminescence analysen og RT-qPCR analyse etter S. Tyfimurium infeksjon i HeLa 57A celler. 1 x 105 HeLa 57A celler ble infisert med 106 CFU (Moi = 10) av log fase S. Tyfimurium vill type SL1344, eller mutant stammer mangler SipA, SopB og SopE2, og SipA, SopB, SopE2 og SopE. Etter 1 time, Media ble erstattet, og inkubasjons fortsatte i ytterligere fire timer. (A) celler ble behandlet for uttrykk for luciferase via luminescence analyser. (B) celler ble HENTET av RNA, som ble brukt for RT-qPCR analyse. Relativ uttrykk for mål gener ved hjelp av Delta-deltaet CT-metoden (2-ΔΔCt) vises. Median og standardavvik for tre eksemplarer brønner vises. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: sammendrags resultater generert fra RT-qPCR-analyse. (A) en forsterkning tomten er vist for BRØNNENE forsterke GAPDH fra HeLa 57A celler infisert med S. Tyfimurium. (B) smelte kurve tomten av brønner som inneholder GAPDH-primere viser en enkelt smelte topp tilsvarende ca 84 ° c. (C) dupliserte brønner som inneholder PRIMERE for Il-6. En av brønnene viser en andre smelte peak, som betegnet av en svart pil, og bør utelukkes fra analysen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den store bidrag av protokollen som er beskrevet er at det gir en rask og enkel metode for å oppdage NF-KB aktivering i celler, som gjør det mulig for høy gjennomstrømming analyse av flere stimulerende forhold eller medikamenter som påvirker NF-KB aktivering. Her beskriver vi en protokoll for NF-KB aktivering i Salmonella-infiserte HeLa celler. Disse cellene kan brukes til infeksjon med andre patogener i tillegg til å studere virkningen av bakteriell infeksjon på NF-KB aktivering. I tillegg kan NF-KB-avhengige luciferase aktivering i HeLa 57A celler brukes til skjerm for aktivator eller hemmere av signalering trasé som fører til NF-KB aktivisering. Her, vi seedet HeLa 57A celler i 48-brønn plater, men disse eksperimentene kan skaleres opp til 96-og til og med 384-brønn plater for å tillate flere prøver per eksperiment. HeLa 57A celler constitutively uttrykke LacZ, som kan måles som en intern kontroll for celle nummer og levedyktighet ved hjelp av β-gal analyser. Protokollen som beskrives her, gjelder for bruk i cellelinjer enten stabilt eller midlertidig transfekterte med en NF-kB:: luciferase reporter-konstruksjon. Det ømt punkt 264.7 macrophage cellen Line har allerede blitt anvendt for slik en hensikt18. Viktigere, denne metoden skiller ikke mellom aktivering av ulike homo/heterodimerer av de fem distinkte NF-KB under enheter. De ulike NF-KB homo-heterodimer komplekser har ulike slektskap for promoter sekvenser, samt ulike transcriptional konsekvenser21. Det er mulig at aktivering av en bestemt NF-KB dimer er savnet ved hjelp av reporteren beskrevet her på grunn av lav affinitet binding til KB bindende områder fra immunglobulin ĸ-kjeden promoter regionen.

Det er viktig å merke seg at forholdene som passer for å stimulere en cellelinje ikke kan være direkte gjelder for en annen. Derfor er det sterkt anbefalt at analysen forholdene optimaliseres i hvert analysesystem. Infeksjons tidspunktet, MOI, varighet av behandling av narkotika, medikament dose, og seeding betingelser er alle viktige hensyn å ta hensyn til ved vurdering av NF-KB aktivering. For eksempel, rå 264.7 makrofager er mer følsomme for Salmonella infeksjon krever ulike forhold for å produsere en lignende luminescence signal sett med HeLa 57A celler18.

Under luminescence målinger er det ikke uvanlig at kant brønner har betydelig forskjellige verdier enn de andre brønnene som ble stimulert på samme måte. Dette skyldes vanligvis høyere fordampning av kant brønnene på tallerkenen som fører til økt legemiddelkonsentrasjon. Dette kan løses ved å legge serum frie medier til rommet mellom brønnene, for plater som tillater det, endre lokk/plate kombinasjoner for å redusere fordampning, eller utelate kant brønner helt Hvis problemene vedvarer.

Uttrykt i pattedyrceller, har Firefly luciferase en halveringstid på flere timer og er generelt betraktet som stabil i forbindelse med de fleste reporter analyser22. Lengre behandlings varigheter enn de som er beskrevet her, kan være pålitelig utført. Imidlertid gir luciferase analysen systemet brukes her et stabilt signal bare for første minutt og raskt forverres etter det. Derfor er det svært viktig at luminescence tiltaket gjøres raskt etter blanding celle lysat og substrat.

NF-KB er en transkripsjon faktor for et stort utvalg av gener, inkludert cytokiner og chemokiner (dvs. Il6 og Il23). Måling av NF-KB-avhengige luciferase aktivitet betyr ikke nødvendigvis at disse cytokiner og chemokiner uttrykkes. Denne metoden kan utfylle eksisterende molekylære kvantifisering teknikker ved å tjene som en potensiell første skjerm for karakterisering av tilstander som påvirker NF-KB aktivitet, som deretter kan funksjonelt validert gjennom RT-qPCR. Funksjonell validering av NF-KB-aktivering kan også utføres via Western Blot-analyse eller funksjonelle analyser som er spesifikke for et protein av interesse i tilfeller der mRNA-kvantifisering kanskje ikke er passende. Dette er tilfellet for interleukin-beta (Il1b), et gen som transkripsjon er indusert av NF-KB binding, men proteinet produktet krever post translational modifikasjon for å danne den eldre produktet23,24.

Den spesifikke RNA isolasjons protokollen som beskrives her, er ikke den eneste som kan brukes til bruk i RT-qPCR-analysen, og andre foretrukne metoder, for eksempel kommersielt tilgjengelige prosjektpakker, kan i stedet brukes. Det er viktig å merke seg at kvaliteten på RNA-en er svært viktig for prosessen, og at RNA-en bør holdes på isen så mye som mulig for å unngå nedbrytning. Det er viktig å kjøre dupliserte reaksjoner i RT-qPCR reaksjoner for å konstatere at PCR-reaksjonene er konsekvente, ettersom pipettering av slike små volumer ved lasting av 384-brønn platen ofte kan forårsake feil. CT-verdier av housekeeping genet bør være konsistent mellom prøvene, og avvik fra dette kan være en indikasjon på ineffektiv rengjøring trinn eller avvik i RNA konsentrasjoner under omvendt transkripsjon som kan påvirke de endelige resultatene. Det er også viktig å sjekke smelte kurven etter hver qPCR eksperimentet. Tilstedeværelsen av en topp antyder at qPCR primere er forsterke et enkelt gen. Flere kurver tyder på at det er off-Target gen forsterkning eller tilstedeværelsen av primer dimers. I begge tilfeller tyder flere topper til stede i smelte kurven at primere bør redesignet for å sikre spesifisitet. Med så mye rom for variasjon, mosjon og foredling av god teknikk på hvert trinn er avgjørende for å generere nøyaktige og reproduserbar resultater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forskning i Keestra-Gounder Lab er støttet av tilskudd fra NIAID av NIH under prisen nummer R21AI122092 og fra American Diabetes Association under Award nummer 1-18-JDF-035.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adhesive film VWR International 60941-070
Chloroform Fisher Bioreagents C298-500
DMEM Thermo Fisher 11665092
DNAse treatment kit Qiagen 79254
dNTPs Promega U1511
Ethanol Fisher Bioreagents BP2818100 molecular grade
FBS Sigma-Aldrich F0926
HeLa 57A cells Ref # 15
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems 4368814
Isopropanol Fisher Bioreagents BP26181
Kanamycin Fisher Bioreagents BP906-5
LB agar Fisher Bioreagents BP1425-500
Lysogeny broth Fisher Bioreagents BP1426-500
MgCl2 Fisher Chemical
NanoDrop ND-1000 Thermo Scientific spectrophotometer
Promega luciferase assay system Promega E1501 Cell lysis buffer & luciferin substrate
Random Hexamers Thermo Scientific SO142
Real-time GAPDH forward primer 5'-CCAGGAAATGAGCTTGAC
AAAGT-3'
Real-time GAPDH reverse primer 5-'CCCACTCCTCCACCT
TTGAC-3'
Real-time IL-23 forward primer 5-'GAGCCTTCTCTGCTCCC
TGAT-3'
Real-time IL-23 reverse primer 5'-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3'
Real-time IL-6 forward primer 5'-GTAGCCGCCCCACACAGA-3'
Real-time IL-6 reverse primer 5'-CATGTCTCCTTTCTCAGG
GCTG-3'
Reverse Transcriptase Applied Biosystems 4308228
RNAse inhibitor Thermo Scientific EO0381
RT buffer Promega A3561
SL1344 Ref # 17
SL1344 ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039 Ref # 18
SL1344 ΔsopE ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039 Ref # 18
SYBR green Applied Biosystems 4309155 2x mastermix
Tri-reagent Molecular Research Center TR 118 guanidine thiocyanate
Trypsin -EDTA Thermo Fisher 25300054 0.05% Trypsin-EDTA
Ultrapure water Fisher Bioreagents BP248450
Well plate for PCR VWR International 89218-294 384-well plate

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, T., Zhang, L., Joo, D., Sun, S. C. NF-kappaB signaling in inflammation. Signal Transduction and Targeted Therapy. 2, (2017).
  2. Piva, R., Belardo, G., Santoro, M. G. NF-kappaB: a stress-regulated switch for cell survival. Antioxidants & Redox Signaling. 8, (3-4), 478-486 (2006).
  3. Lawrence, T. The nuclear factor NF-kappaB pathway in inflammation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1, (6), a001651 (2009).
  4. Hargett, D., Rice, S., Bachenheimer, S. L. Herpes simplex virus type 1 ICP27-dependent activation of NF-kappaB. Journal of Virology. 80, (21), 10565-10578 (2006).
  5. Zaragoza, C., et al. Viral protease cleavage of inhibitor of kappaBalpha triggers host cell apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences United States of America. 103, (50), 19051-19056 (2006).
  6. Gao, X., et al. Bacterial effector binding to ribosomal protein s3 subverts NF-kappaB function. PLOS Pathogens. 5, (12), e1000708 (2009).
  7. Kravchenko, V. V., et al. Modulation of gene expression via disruption of NF-kappaB signaling by a bacterial small molecule. Science. 321, (5886), 259-263 (2008).
  8. Kawai, T., Akira, S. Signaling to NF-kappaB by Toll-like receptors. Trends in Molecular Medicine. 13, (11), 460-469 (2007).
  9. Pinaud, L., Sansonetti, P. J., Phalipon, A. Host Cell Targeting by Enteropathogenic Bacteria T3SS Effectors. Trends in Microbiology. 26, (4), 266-283 (2018).
  10. Karin, M. How NF-kappaB is activated: the role of the IkappaB kinase (IKK) complex. Oncogene. (1999).
  11. Berti, R., et al. Quantitative real-time RT-PCR analysis of inflammatory gene expression associated with ischemia-reperfusion brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 22, (9), 1068-1079 (2002).
  12. Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 9, (23), 6505-6525 (1981).
  13. Holden, N. S., Tacon, C. E. Principles and problems of the electrophoretic mobility shift assay. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 63, (1), 7-14 (2011).
  14. Renard, P., et al. Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB. Nucleic Acids Research. 29, (4), E21 (2001).
  15. Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 39, (5), 715-725 (2005).
  16. Ernst, O., Vayttaden, S. J., Fraser, I. D. C. Measurement of NF-kappaB Activation in TLR-Activated Macrophages. Methods in Molecular Biology. 1714, 67-78 (2018).
  17. Rodriguez, M. S., Thompson, J., Hay, R. T., Dargemont, C. Nuclear retention of IkappaBalpha protects it from signal-induced degradation and inhibits nuclear factor kappaB transcriptional activation. Journal of Biological Chemistry. 274, (13), 9108-9115 (1999).
  18. Mendez, J. M., Kolora, L. D., Lemon, J. S., Dupree, S. L., Keestra-Gounder, A. M. Activation of the endoplasmic reticulum stress response impacts the NOD1 signaling pathway. Infection and Immunity. (2019).
  19. Hoiseth, S. K., Stocker, B. A. D. Aromatic-Dependent Salmonella-Typhimurium Are Non-Virulent and Effective as Live Vaccines. Nature. 291, (5812), 238-239 (1981).
  20. Keestra, A. M., et al. Manipulation of small Rho GTPases is a pathogen-induced process detected by NOD1. Nature. 496, (7444), 233-237 (2013).
  21. Wong, D., et al. Extensive characterization of NF-kappaB binding uncovers non-canonical motifs and advances the interpretation of genetic functional traits. Genome Biology. 12, (7), R70 (2011).
  22. Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nature Methods. 8, (10), 879-884 (2011).
  23. Cogswell, J. P., et al. NF-kappa B regulates IL-1 beta transcription through a consensus NF-kappa B binding site and a nonconsensus CRE-like site. Journal of Immunology. 153, (2), 712-723 (1994).
  24. Thornberry, N. A., et al. A Novel Heterodimeric Cysteine Protease Is Required for Interleukin-1-Beta Processing in Monocytes. Nature. 356, (6372), 768-774 (1992).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics