तनाव उपचार के तहत बैक्टीरियल विकास का बहु-पैमाने पर विश्लेषण

Immunology and Infection
 

Summary

यह प्रोटोकॉल एकल कोशिका और सेल जनसंख्या के स्तर पर तनाव की स्थिति के तहत जीवाणु विकास के समय-समाधान विवरण की अनुमति देता है।

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Cayron, J., Lesterlin, C. Multi-scale Analysis of Bacterial Growth Under Stress Treatments. J. Vis. Exp. (153), e60576, doi:10.3791/60576 (2019).

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Abstract

तनाव की स्थिति में बढ़ने और जीवित रहने की बैक्टीरियल क्षमता का विश्लेषण माइक्रोबायोलॉजी अध्ययनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए आवश्यक है। एंटीबायोटिक दवाओं या अन्य रोगाणुरोधी यौगिकों, विकिरण, गैर-शारीरिक पीएच, तापमान या नमक एकाग्रता के संपर्क में तनाव-उत्प्रेरण उपचार के लिए बैक्टीरियल कोशिकाओं की प्रतिक्रिया की विशेषता के लिए प्रासंगिक है। विभिन्न तनाव उपचार सेल डिवीजन, डीएनए प्रतिकृति, प्रोटीन संश्लेषण, झिल्ली अखंडता, या सेल चक्र विनियमन सहित विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं को परेशान कर सकते हैं। ये प्रभाव आमतौर पर सेलुलर पैमाने पर विशिष्ट फेनोटाइप से जुड़े होते हैं। इसलिए, तनाव से प्रेरित विकास या व्यवहार्यता कमियों की सीमा और करणीयता को समझने के लिए एकल कोशिका और जनसंख्या के स्तर दोनों पर कई मापदंडों का सावधानीपूर्वक विश्लेषण करने की आवश्यकता है । यहां प्रस्तुत प्रायोगिक रणनीति पारंपरिक ऑप्टिकल घनत्व निगरानी और चढ़ाना परखों को एकल सेल विश्लेषण तकनीकों जैसे प्रवाह साइटोमेट्री और लाइव कोशिकाओं में वास्तविक समय माइक्रोस्कोपी इमेजिंग को जोड़ती है। यह मल्टीस्केल फ्रेमवर्क बैक्टीरियल आबादी के भाग्य पर तनाव की स्थिति के प्रभाव का समय-समाधान विवरण देता है।

Introduction

इस प्रोटोकॉल का समग्र उद्देश्य जनसंख्या पर और एकल-कोशिका स्तरों पर तनाव उपचार के संपर्क में आने वाले जीवाणु कोशिकाओं के व्यवहार का विश्लेषण करना है। बैक्टीरियल विकास और व्यवहार्यता पारंपरिक रूप से ऑप्टिकल घनत्व निगरानी (ओडी600एनएम)का उपयोग करके जनसंख्या स्तर पर संबोधित की जाती है, जो बैक्टीरियल सेल मास संश्लेषण का प्रॉक्सी है, या संस्कृति में व्यवहार्य कोशिकाओं की एकाग्रता निर्धारित करने के लिए परख चढ़ाना (कॉलोनी बनाने इकाई प्रति मिलीलीटर, सीएफयू/एमएल)। सामान्य (अतनावपूर्ण) बढ़ती स्थितियों के तहत, ओडी600एनएम और सीएफयू/एमएल माप कड़ाई से सहसंबद्ध हैं क्योंकि बैक्टीरियल दोहरीकरण समय सीधे सेल मास वृद्धि1,2पर निर्भर करता है । हालांकि, यह सहसंबंध अक्सर उन स्थितियों के तहत बाधित होता है जो कोशिका द्रव्यमान संश्लेषण3,सेल डिवीजन4या ट्रिगर सेल लिसिस को प्रभावित करते हैं। तनाव उपचार द्वारा एक सरल उदाहरण प्रदान किया जाता है जो कोशिका विभाजन को रोकता है, जिसके परिणामस्वरूप फिलामेंतुस बैक्टीरियल कोशिकाओं का गठन5,6होता है। फिलामेंतुश कोशिकाएं सामान्य रूप से एकत्र होती हैं क्योंकि सेल मास संश्लेषण अप्रभावित होता है, लेकिन वे व्यवहार्य कोशिकाओं में विभाजित करने में असमर्थ होते हैं। संस्कृति ऑप्टिकल घनत्व फलस्वरूप एक सामान्य दर पर समय के साथ वृद्धि होगी, लेकिन नहीं व्यवहार्य परख (CFU/mL) चढ़ाना द्वारा निर्धारित कोशिकाओं की एकाग्रता । इस मामले में, कई अन्य लोगों की तरह, ऑप्टिकल घनत्व और चढ़ाना माप जानकारीपूर्ण हैं, लेकिन मनाया तनाव प्रेरित प्रभाव की एक व्यापक समझ प्रदान करने में विफल । इन पहनावा परखों को एकल-सेल विश्लेषण तकनीकों के साथ संयुक्त करने की आवश्यकता है ताकि तनाव-प्रेरित विकास की कमी के गहन लक्षण वर्णन की अनुमति दी जा सके ।

यहां, चार पूरक प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों को जोड़ती एक प्रक्रिया का वर्णन किया गया है: (1) पारंपरिक चढ़ाना परख और बुनियादी ऑप्टिकल घनत्व निगरानी सेल व्यवहार्यता और सेल मास संश्लेषण की निगरानी के लिए क्रमशः; (2) कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या पर कोशिका आकार और डीएनए सामग्री मापदंडों का मूल्यांकन करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री; (3) सेल आकृति विज्ञान का विश्लेषण करने के लिए माइक्रोस्कोपी स्नैपशॉट इमेजिंग; और (4) सेल भाग्य की लौकिक गतिशीलता की जांच के लिए माइक्रोफ्लूइडिक कक्षों में समय-चूक एकल सेल इमेजिंग। यह बहु-पैमाने पर ढांचा व्यक्तिगत कोशिकाओं के व्यवहार के आलोक में सेल विकास और व्यवहार्यता पर वैश्विक प्रभावों की व्याख्या करने की अनुमति देता है। इस प्रक्रिया को विशेष परिस्थितियों में वृद्धि (यानी, विकास माध्यम, पीएच, तापमान, नमक एकाग्रता), या एंटीबायोटिक दवाओं या अन्य के संपर्क में ब्याज के लगभग किसी भी तनाव के लिए विविध जीवाणु प्रजातियों की प्रतिक्रिया को समझने के लिए लागू किया जा सकता है रोगाणुरोधी यौगिक।

Protocol

1. सेल संस्कृति, तनाव-प्रेरण, और नमूना प्रक्रिया

नोट: पृष्ठभूमि कणों से बचने के लिए बाँझ संस्कृति ग्लासवेयर, पिपेट टिप्स और विकास माध्यम का उपयोग 0.22 माइक्रोन पर फ़िल्टर किया जाता है। यहां, सेल संस्कृतियों को कम ऑटोफ्लोरेसेंस समृद्ध परिभाषित माध्यम (सामग्री की तालिकादेखें)7,8में उगाया जाता है।

  1. एक लुरिया-शोरबा (पौंड) अगारोज प्लेट (यदि आवश्यक हो तो चयनात्मक एंटीबायोटिक के साथ) पर एक जमे हुए ग्लाइसेरोल स्टॉक से ब्याज के बैक्टीरियल तनाव लकीर और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात (17 घंटे) इनक्यूबेट ।
    नोट: यहां प्रस्तुत उदाहरण प्रयोग एस्चेरिचिया कोलाई MG1655 hupA-mCherry का उपयोग करता है । यह तनाव एचएयू न्यूक्लियोड से जुड़े प्रोटीन के फ्लोरोसेंटी टैग किए गए सबयूनिट α का उत्पादन करता है, इस प्रकार लाइव कोशिकाओं9में गुणसूत्र की हल्की माइक्रोस्कोपी दृश्यकी अनुमति देता है।
  2. एक ही कॉलोनी के साथ मध्यम के 5 मिलील टीका और १४० रोटेशन प्रति मिनट (आरपीएम) रातोंरात (17 घंटे) पर मिलाते हुए के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर बढ़ते हैं । उत्तेजित संस्कृति के संतोषजनक वातारण को सुनिश्चित करने के लिए फ्लैक्स (‧50 मिलील) या बड़े व्यास (2 सेमी) परीक्षण ट्यूबका उपयोग किया जाना चाहिए।
  3. अगले सुबह 600 एनएम (ओडी600एनएम)पर ऑप्टिकल घनत्व को मापते हैं और संस्कृति को एक परीक्षण ट्यूब में पतला करते हैं जिसमें 0.01 के ओडी600एनएम के लिए ताजा माध्यम होता है। प्रयोग के दौरान विश्लेषण किए जाने वाले समय बिंदुओं की संख्या के आधार पर संस्कृति की कुल मात्रा को समायोजित करने की आवश्यकता है।
  4. संस्कृति का 200 माइक्रोन नमूना एक माइक्रोप्लेट (0.2 मिलीएल प्रति अच्छी तरह से एक स्पष्ट पारदर्शी नीचे के साथ काम करने की मात्रा के प्रति लोड) और यह एक स्वचालित प्लेट रीडर में जगह (सामग्री की मेजदेखें) ओडी600nm निगरानी के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के दौरान।
  5. 37 डिग्री सेल्सियस पर टीका वाला परीक्षण ट्यूब को मिलाते हुए (140 आरपीएम) से ओडी600एनएम = 0.2 तक, समृद्ध माध्यम में पूर्ण घातीय चरण के अनुरूप।
    नोट: उचित घातीय विकास प्राप्त करने से पहले कम से कम 4−5 पीढ़ियों के लिए कोशिकाओं को विकसित करना महत्वपूर्ण है। चरण 1.3 (ओडी600एनएम = 0.01) में उपयोग किए जाने वाले प्रारंभिक इनोकुलम को गरीब माध्यम (यानी, जहां घातीय चरण ओडी 0.2 से नीचे पहुंच गया है) में वृद्धि के मामले में अनुकूलित किए जाने की आवश्यकता है, या यदि अधिक पीढ़ियां चाहते हैं (उदाहरण के लिए, विशिष्ट शारीरिक अध्ययन के लिए या विस्तारित तनाव उपचार के लिए)।
  6. ओडी600एनएम = 0.2 पर, निम्नलिखित संस्कृति के नमूने टी0 समय बिंदु (तनाव प्रेरण से पहले तेजी से बढ़ती कोशिकाओं) के अनुरूप लें: (1) एक 150 माइक्रोन नमूना तुरंत समय चूक माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए माइक्रोफ्लूइडिक उपकरण में लोड किया जाएगा (अनुभाग 2 देखें); (2) कमजोर पड़ने और चढ़ाना परख के लिए एक २०० μL नमूना (धारा 3 देखें); (3) फ्लो साइटोमेट्री एनालिसिस (सेक्शन 4) के लिए बर्फ पर 250 माइक्रोन का नमूना डाला जाएगा। (4) माइक्रोस्कोपी स्नैपशॉट इमेजिंग के लिए अगारोज-माउंटेड स्लाइड पर तुरंत जमा किया जाने वाला 10 माइक्रोन का नमूना (सेक्शन 5 देखें)।
  7. परीक्षण ट्यूब में शेष कोशिका संस्कृति को विशिष्ट तनाव उपचार के लिए बेनकाब करें जिसे आप 37 डिग्री सेल्सियस पर जांच करना चाहते हैं और मिलाते हुए (140 आरपीएम) के साथ इनक्यूबेट करना चाहते हैं।
    नोट: ओडी600nm निगरानी के लिए स्वचालित प्लेट रीडर में बढ़ रही संस्कृति भी तनाव उपचार के अधीन किया जाना चाहिए ।
  8. तनाव उपचार (टी1,टी2,टी3,आदि) के बाद प्रासंगिक समय बिंदुओं पर, तनावग्रस्त संस्कृति से निम्नलिखित सेल नमूने लें: (1) कमजोर पड़ने और चढ़ाना परख के लिए 200 माइक्रोन नमूना (अनुभाग 2 देखें); (2) फ्लो साइटोमेट्री एनालिसिस (सेक्शन 3) के लिए बर्फ पर डालने के लिए २५० माइक्रोन का नमूना; (4) माइक्रोस्कोपी स्नैपशॉट इमेजिंग के लिए अगारोज-माउंटेड स्लाइड पर तुरंत जमा किया जाने वाला 10 माइक्रोन का नमूना (सेक्शन 4 देखें)।
    नोट: प्रत्येक तनाव-उत्प्रेरण उपचार में एक दक्षता होती है जो खुराक और समय-निर्भर होती है। इस प्रकार, इष्टतम परिणामों के लिए उपयोग किए जाने वाले उपचार की खुराक और अवधि निर्धारित करने के लिए प्रारंभिक परीक्षण चलाना आवश्यक हो सकता है। यह खुराक और एक्सपोजर समय की एक श्रृंखला के साथ इलाज एक सेल संस्कृति के एक स्वचालित प्लेट रीडर (संभावित चढ़ाना परख के साथ जुड़े) का उपयोग करके ओडी निगरानी प्रदर्शन करके किया जा सकता है। यहां प्रस्तुत प्रयोग में सेल कल्चर का इलाज सेल डिवीजन-डिवोंटिंग एंटीबायोटिक सेफेलेक्सिन (सीईपीएच) के साथ 60 मिन के लिए 5 μg/mL फाइनल कंसंट्रेशन पर किया गया। सेफेलेक्सिन को केंद्रीकरण (475 ग्राम, 5 मिन) का उपयोग करके 15 मिलीग्राम ट्यूब में कोशिकाओं को पैलेट करके धोया गया था, सुपरनेटेंट को हटाना, कोमल पाइपटिंग द्वारा ताजा माध्यम की बराबर मात्रा में सेल पेलेट को फिर से निलंबित करना, और एक साफ ट्यूब में स्थानांतरित करना। धोया कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए (140 आरपीएम) के साथ इनक्यूबेटेड किया गया ताकि रिकवरी की अनुमति दी जा सकी जा। नमूना टी60 (सेफेलेक्सिन के बाद 60 मिन' सेफेलेक्सिन-60min-इलाज' नमूना), टी120 (धोने के बाद 60 00 इंच), और टी180 (धोने के बाद 120 0 0) पर लिया गया था।

2. चढ़ाना परख

नोट: चढ़ाना परख संस्कृति के नमूनों में एक CFU उत्पन्न करने में सक्षम कोशिकाओं की एकाग्रता को मापने के लिए अनुमति देता है । इस प्रक्रिया की दर है जिस पर एक सेल दो व्यवहार्य कोशिकाओं में विभाजित है और सेल डिवीजन गिरफ्तारी का पता लगाने की अनुमति देता है पता चलता है (जैसे, सेल lysis के जीवाणु पीढ़ी के समय की वृद्धि) ।

  1. ताजा माध्यम में संस्कृति नमूना के 200 माइक्रोन के10-7 तक 10 गुना धारावाहिक कमजोरी तैयार करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर ऊष्मायन के बाद 3−300 कॉलोनियों के बीच प्राप्त करने के लिए गैर-चयनात्मक पौंड अगारोज प्लेटों पर उचित कमजोर पड़ने की प्लेट 100 माइक्रोन।
    नोट: बैक्टीरियल डिवीजनों को सीमित करने के लिए ताजा माध्यम में धारावाहिक कमजोर पड़ने को तेजी से किया जाना चाहिए। वैकल्पिक रूप से, शोधकर्ता कमजोर पड़ने की प्रक्रिया के दौरान सेल डिवीजनों को रोकने के लिए कार्बन स्रोत के बिना खारा समाधान का उपयोग करने पर विचार कर सकते हैं।
  2. अगले दिन, प्रत्येक संस्कृति नमूने में व्यवहार्य कोशिकाओं (CFU/mL) की एकाग्रता निर्धारित करने के लिए कालोनियों की संख्या की गणना करें । अनुपचारित और इलाज सेल संस्कृतियों के लिए समय के एक समारोह के रूप में CFU/mL प्लॉट ।

3. फ्लो साइटोमेट्री

नोट: निम्नलिखित अनुभाग प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए सेल नमूनों की तैयारी का वर्णन करता है। इस विश्लेषण तकनीक से बड़ी संख्या में कोशिकाओं के लिए कोशिका आकार और डीएनए सामग्री के वितरण का पता चलता है। जब संभव हो, तो प्रवाह साइटोमेट्री नमूनों को तुरंत संसाधित करने की सिफारिश की जाती है। वैकल्पिक रूप से, नमूनों को बर्फ पर रखा जा सकता है (6 घंटे तक) और दिन के अंत में एक साथ विश्लेषण किया जाता है, एक बार चढ़ाना और माइक्रोस्कोपी इमेजिंग किया गया है।

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर ताजा माध्यम में ~ 15,000 कोशिकाओं/μL (एक ओडी600nm ~ 0.06 के अनुरूप) की एकाग्रता पर 250 μL प्राप्त करने के लिए संस्कृति नमूना के 250 μL पतला करें।
    नोट: बर्फ पर ऊष्मायन कोशिकाओं के विकास और रूपात्मक संशोधन को सीमित करेगा। वैकल्पिक रूप से, उपयोगकर्ता 75% इथेनॉल में कोशिकाओं के निर्धारण को करने पर विचार कर सकता है, जैसा कि आमतौर पर प्रवाह साइटोमेट्री10के लिए अनुशंसित होता है।
  2. डीएनए धुंधला के लिए, डीएनए फ्लोरोसेंट डाया (अनुपात 1:1) के 10 μg/mL समाधान के साथ जीवाणु नमूना मिश्रण और नमूने का विश्लेषण करने से पहले 15 min के लिए अंधेरे में इनक्यूबेट ।
  3. नमूना को ~ 120,000 कोशिकाओं/मिन प्रवाह दर के साथ प्रवाह साइटोमीटर में पास करें। उचित सेटिंग्स के साथ आगे बिखरे हुए (एफएससी) और साइड-बिखरे हुए (एसएससी) प्रकाश के साथ-साथ डीएनए फ्लोरोसेंट डाये फ्लोरेसेंस सिग्नल (FL-1) प्राप्त करें।
  4. सेल आबादी में सेल आकार और डीएनए सामग्री के वितरण का प्रतिनिधित्व करने के लिए एफएससी और FL-1 सेल घनत्व हिस्टोग्राम प्लॉट करें।

4. स्नैपशॉट माइक्रोस्कोपी इमेजिंग

नोट: निम्नलिखित भाग जनसंख्या स्नैपशॉट विश्लेषण के लिए माइक्रोस्कोपी स्लाइड और छवि अधिग्रहण की तैयारी का वर्णन करता है। यह प्रक्रिया कोशिकाओं (कोशिका लंबाई, चौड़ाई, आकार) और न्यूक्लियोइड डीएनए के इंट्राकोशियलर संगठन की आकृति विज्ञान के बारे में जानकारी प्रदान करेगी।

  1. टिप्पणियों को शुरू करने से पहले तापमान को स्थिर करने के लिए थर्मोनेस माइक्रोस्कोप चैंबर को 37 डिग्री सेल्सियस पर पहले से गरम करें। यह कक्ष समय-चूक प्रयोगों के दौरान माइक्रोस्कोप प्रकाशिकी और नमूना चरण के तापमान मॉड्यूलेशन के लिए अनुमति देता है।
  2. लेस्टरलिन और डुबैरी7में वर्णित अगारोज-माउंटेड स्लाइड तैयार करें।
    1. नीले फ्रेम के नीचे से प्लास्टिक फिल्म निकालें (सामग्री की मेजदेखें), दूसरी तरफ खोखले प्लास्टिक फिल्म जा रहा है । एक माइक्रोस्कोप ग्लास स्लाइड पर नीले फ्रेम छड़ी।
    2. पिपेट ~ 150 माइक्रोन पिघला 1% अगारोज मध्यम समाधान और नीले फ्रेम डिब्बे के भीतर डालना। अतिरिक्त तरल को हटाने के लिए एक साफ कवरस्लिप के साथ तेजी से कवर करें और कमरे के तापमान पर जमना करने के लिए अगारोज पैड के लिए कुछ न्यूनतम इंतजार करें।
    3. सेल सैंपल तैयार होने पर ब्लू फ्रेम से कवरस्लिप और प्लास्टिक फिल्म को हटा दें। अगारोज पैड पर सेल सैंपल के 10 माइक्रोन डालें और बूंद को फैलाने के लिए ग्लास स्लाइड को धीरे से झुकाएं। जब सभी तरल को सोख लिया गया हो, तो नमूने को सील करने के लिए नीले फ्रेम पर एक साफ कवरस्लिप चिपका एंटोस्टिक करें। माइक्रोस्कोपी स्लाइड के लिए अब माइक्रोस्कोपी तैयार है।
  3. स्लाइड को माइक्रोस्कोप चरण पर रखें और प्रेषित प्रकाश (चरण विपरीत उद्देश्य के साथ) का उपयोग करके और उचित तरंगदैर्ध्य (एमचेरी के लिए 560 एनएम) पर प्रकाश स्रोत उत्तेजना के साथ छवि अधिग्रहण करें।
  4. छवि विश्लेषण के दौरान स्वचालित सेल का पता लगाने की सुविधा के लिए अलग कोशिकाओं को शामिल करने वाले दृश्य के क्षेत्रों का चयन करें। सुनिश्चित करें कि सेल आबादी के मजबूत सांख्यिकीय विश्लेषण की अनुमति देने के लिए कम से कम 300 कोशिकाओं को चित्रित किया गया है।

5. माइक्रोफ्लूइडिक्स टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी इमेजिंग

नोट: निम्नलिखित भाग माइक्रोफ्लूइडिक प्लेटों की तैयारी (सामग्री की तालिकादेखें), सेल लोडिंग, माइक्रोफ्लूइडिक्स कार्यक्रम और समय-चूक छवि अधिग्रहण बताता है। यह इमेजिंग प्रक्रिया वास्तविक समय में व्यक्तिगत कोशिकाओं के व्यवहार का पता चलता है।

  1. माइक्रोफ्लूइडिक प्लेट से संरक्षण समाधान निकालें और इसे ताजा माध्यम पूर्व गरम से 37 डिग्री सेल्सियस तक बदल दें, जैसा कि माइक्रोफ्लूइडिक सॉफ्टवेयर उपयोगकर्ता गाइड में वर्णित है।
  2. माइक्रोफ्लूइडिक प्लेट को कई गुना सिस्टम पर सील करें और प्राइमिंग बटन पर क्लिक करें।
  3. माइक्रोस्कोप स्टेज पर कई गुना सिस्टम के साथ माइक्रोफ्लूइडिक प्लेट रखें और माइक्रोस्कोपी अधिग्रहण शुरू करने से पहले ~ 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रीहीट करें।
    नोट: यह प्रीहीटिंग कदम माइक्रोफ्लूइडिक चैंबर के फैलाव से बचने के लिए महत्वपूर्ण है, जो समय-चूक प्रयोग और समझौता छवि अधिग्रहण के दौरान माइक्रोस्कोप के ध्यान को बदल देगा।
  4. माइक्रोफ्लूइडिक प्लेट को सील करें। अच्छी तरह से 8 से संस्कृति नमूना के १५० μL के साथ मध्यम की जगह और अच्छी तरह से 1 से 5 के लिए वांछित माध्यम के साथ या तनाव उत्प्रेरण अभिकर्ता के बिना माध्यम की जगह ।
  5. माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट को सील करें और माइक्रोस्कोप स्टेज पर रखें।
  6. माइक्रोफ्लूइडिक सॉफ्टवेयर पर (सामग्री की तालिकादेखें) सेल लोडिंग प्रक्रिया चलाते हैं। जांच लें कि संचारित प्रकाश में माइक्रोस्कोप के नीचे देखकर कोशिकाओं की लोडिंग संतोषजनक है। कक्ष में सेल घनत्व अपर्याप्त होने पर दूसरी बार सेल लोडिंग प्रक्रिया चलाएं।
  7. प्रेषित प्रकाश मोड में सावधानीपूर्वक ध्यान केंद्रित करें और अलग बैक्टीरिया दिखाने वाले दृश्य के कई क्षेत्रों का चयन करें। ऐसे क्षेत्रों का चयन करना महत्वपूर्ण है जो समय के साथ अलग कोशिकाओं के विकास की निगरानी करने में सक्षम होने के लिए भीड़ नहीं करते हैं (~ 100 माइक्रोन2 प्रति~ 10−20 कोशिकाओं की सिफारिश की जाती है)। इससे इमेज एनालिसिस के दौरान सेल डिटेक्शन की भी सुविधा मिलेगी।
  8. माइक्रोफ्लुइडिक सॉफ्टवेयर पर, एक प्रोटोकॉल बटन बनाएं पर क्लिक करें। कोशिकाओं को अनुकूलित करने के लिए अनुमति देने के लिए 1−2 पीढ़ी के समय समकक्ष के लिए विकास माध्यम के इंजेक्शन कार्यक्रम (वैकल्पिक) । फिर 2 साई में 10 मिनट के दौरान तनाव उत्प्रेरण माध्यम के इंजेक्शन कार्यक्रम, तनाव उपचार की वांछित अवधि के लिए 1 साई पर इंजेक्शन के बाद । यदि आप तनाव के बाद कोशिकाओं की वसूली का विश्लेषण करना चाहते हैं, तो वांछित अवधि के लिए ताजा विकास माध्यम के इंजेक्शन को प्रोग्राम करें।
    नोट: यहां प्रस्तुत प्रयोग में, 2 साई में 10 min के लिए सेफेलेक्सिन इंजेक्शन दिया गया था, इसके बाद 1 साई में 50 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 000 0000000000000. इसके बाद 10 मिन के लिए 2 साई पर फ्रेश ग्रोथ मीडियम का इंजेक्शन लगाया गया, इसके बाद 1 पीएसआई पर 3 घंटे का समय लगाया गया ।
  9. ट्रांसमिट लाइट में फेज कंट्रास्ट का उपयोग करके हर 10 मीटर में 1 फ्रेम के साथ टाइम-लैप्स मोड में माइक्रोस्कोपी इमेजिंग करें और जरूरत पड़ने पर एमचेरी सिग्नल के लिए 560 एनएम उत्तेजना प्रकाश स्रोत।
    नोट: माइक्रोफ्लूइडिक इंजेक्शन प्रोटोकॉल की शुरुआत के रूप में एक ही समय में सूक्ष्म छवि अधिग्रहण शुरू करना महत्वपूर्ण है।

6. छवि विश्लेषण

नोट: यह अनुभाग संक्षेप में स्नैपशॉट और समय-चूक माइक्रोस्कोपी छवियों को संसाधित करने और विश्लेषण करने के प्रमुख चरणों का वर्णन करता है। माइक्रोस्कोपी छवियों का उद्घाटन और दृश्य ओपन सोर्स इमेजजे/फिजी (https://fiji.sc/)11के साथ किया जाता है । मात्रात्मक छवि विश्लेषण मुक्त माइक्रोबेज प्लगइन12 (https://microbej.com) के साथ खुले स्रोत ImageJ/फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया जाता है। यह प्रोटोकॉल माइक्रोबेज 5.13I संस्करण का उपयोग करता है।

  1. फिजी सॉफ्टवेयर और माइक्रोबेज प्लगइन खोलें।
  2. स्नैपशॉट विश्लेषण के लिए, छवियों को संजोने और प्राप्त छवि ढेर फ़ाइल को बचाने के लिए माइक्रोबेज लोडिंग बार में एक माइक्रोस्कोप स्लाइड (एक नमूना) के अनुरूप सभी छवियों को छोड़ दें। समय-चूक डेटा के लिए, बस छवि ढेर को माइक्रोबेज़ के लोडिंग बार में छोड़ दें।
  3. चरण विपरीत छवि के विभाजन के आधार पर कोशिकाओं की रूपरेखा का स्वचालित पता चला एंटनी चलाएं और यदि प्रासंगिक हो, तो दाग डीएनए फ्लोरेसेंस सिग्नल के विभाजन के आधार पर नाभिकों का। नेत्रहीन सेल डिटेक्शन की सटीकता की जांच करें और यदि आवश्यक हो तो सुधार के लिए माइक्रोबेज संपादन उपकरण का उपयोग करें। प्राप्त परिणाम फ़ाइल को सहेजें।
    नोट: ई. कोलाई कोशिकाओं का पता लगाने के लिए उपयोग की जाने वाली सेटिंग्स सामग्री की तालिका में इंगित की जाती हैं (माइक्रोबेज के टिप्पणियां/विवरण कॉलम देखें)। अन्य जीवाणु प्रजातियों (विशेष रूप से गैर-रॉड-आकार बैक्टीरिया के लिए) के लिए, उपयोगकर्ता को पता लगाने से पहले सेटिंग्स को परिष्कृत करना चाहिए (माइक्रोबेज ट्यूटोरियल देखें)। समय-चूक छवियों के लिए, माइक्रोबेज संपादन उपकरण का उपयोग करके कोशिकाओं का अर्ध-स्वचालित पता लगाना पसंद किया जा सकता है ताकि व्यक्तिगत कोशिकाओं के भाग्य पर ध्यान केंद्रित करने की अनुमति दी जा सके (माइक्रोबेज ट्यूटोरियल देखें)।
  4. विश्लेषण को पूरा करने और ResultJ विंडो प्राप्त करने के लिए आइकन ResultJ पर क्लिक करें। उस बिंदु से कई अलग-अलग प्रकार के आउटपुट ग्राफ उत्पन्न किए जा सकते हैं। कोशिका आकार/लंबाई के सामान्यीकृत हिस्टोग्राम को प्लॉट करें और प्रति सेल न्यूक्लॉयड नंबर का मतलब है।

Representative Results

वर्णित प्रक्रिया का उपयोग सेफ्रेसिन के क्षणिक जोखिम के दौरान एस्चेरिचिया कोलाई K12 कोशिकाओं के व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए किया गया था, एक एंटीबायोटिक जो विशेष रूप से सेल डिवीजन(चित्रा 1ए)13को रोकता है। क्रोमोसोमल डीएनए से जुड़े फ्लोरोसेंटी लेबल वाले हू प्रोटीन का उत्पादन करने वाले हुपा-एमचेरी ई कोलाई तनाव का उपयोग इस उपचार8,9के दौरान गुणसूत्र की गतिशीलता की जांच करने के लिए किया गया था। तेजी से बढ़ती hupA-mCherry ई. कोलाई कोशिकाओं से पहले विश्लेषण किया गया (टी0)और ६० मिन सेफेक्सिन (टी६०)के साथ ऊष्मायन के बाद । फिर, एंटीबायोटिक बह गया था और 1 घंटे (टी१२०)और 2 एच (टी१८०)के बाद सेल आबादी की वसूली का विश्लेषण किया गया था(चित्रा 1बी)

Figure 1
चित्रा 1: तनाव उपचार के लिए बैक्टीरियल प्रतिक्रिया के विश्लेषण के लिए प्रक्रिया। (क)विधि की योजनाबद्ध। (ख)कार्टून अमीर माध्यम में सामान्य वृद्धि के दौरान और सेफेलेक्सिन (सीईपीएच) के क्षणिक संपर्क के दौरान, (टी0)पर अतिरिक्त और सेफेलेक्सिन धोने के बाद (टी60)से (टी180)तक कोशिका आकृति विज्ञान को दर्शाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

ओडी और सीएफयू/एमएल का समानांतर विकास एक पहला संकेतक है जो तनाव उपचार के प्रभाव को समझने में मदद करता है । ये दो पैरामीटर बेफिक्र विकास के दौरान कड़ाई से सहसंबद्ध हैं, लेकिन अक्सर असंबद्ध होते हैं और तनाव में स्वतंत्र रूप से विकसित होते हैं। सेफेक्सिन की उपस्थिति में बढ़ रही सेल संस्कृतियों ने अतनावग्रस्त संस्कृतियों(चित्रा 2ए)के रूप में समान ओडी600एनएम वृद्धि का प्रदर्शन किया, जिसमें यह दर्शाया गया है कि दवा सेल मास संश्लेषण को प्रभावित नहीं करती है। हालांकि, सेल डिवीजन(चित्रा 2बी)के सख्त अवरोध के कारण सेफ्रेक्सिन मौजूद होने पर व्यवहार्य कोशिकाओं की एकाग्रता में वृद्धि नहीं हुई। कोशिकाओं को फिर से विभाजित करना शुरू कर दिया जब सेफेलेक्सिन हटा दिया गया था और अंततः (टी180)पर अतनावग्रस्त संस्कृति के बराबर एकाग्रता तक पहुंच गया। ये परिणाम सेफेलेक्सिन के बैक्टीरियोस्टैटिक प्रभाव को दर्शाते हैं, जो कोशिका विभाजन के पूरी तरह से रिवर्सिबल अवरोध को प्रेरित करता है। विभिन्न तनावों के परिणामस्वरूप ओडी और सीएफयू/एमएल घटता का अलग-अलग अनयुग्मन होगा, जो प्रेरित प्रभाव के आधार पर (उदाहरण के लिए, कोशिका आकृति विज्ञान जैसे फिलामेंटेशन या उभड़ा हुआ, कोशिका मृत्यु के साथ या बिना लाइसिस के) का संशोधन होगा। विभिन्न तनाव-प्रेरित प्रभावों का संकेत देने वाले संभावित परिणाम परिणामों की एक गैर-संपूर्ण सूची चित्रा 2सीमें प्रस्तुत की जाती है।

Figure 2
चित्रा 2: जनसंख्या स्तर पर अनुपचारित और सेफलेसिन-उपचारित कोशिकाओं की जीवाणु विकास निगरानी। (A)ऑप्टिकल घनत्व निगरानी (ओडी600एनएम/mL)। (ख)अनुपचारित और सेफ्लेक्सिन-60मिनट-उपचारित संस्कृतियों के भीतर व्यवहार्य कोशिका (सीएफयू/एमएल) की एकाग्रता । त्रुटि सलाखों के एक प्रयोगात्मक ट्रिपलेट के लिए मानक विचलन का संकेत मिलता है । (ग)संभावित परिणामों और संबंधित तनाव प्रभावों की योजनाबद्ध । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

जनसंख्या स्तर पर देखी गई तनाव प्रतिक्रिया की सही व्याख्या करने के लिए एकल-सेल विश्लेषण आवश्यक है। फ्लो साइटोमेट्री कोशिका ओं के आकार और डीएनए सामग्री की जांच की अनुमति देता है14,15 (चित्रा 3)। सेफ्लेक्सिन के संपर्क में आने से कोशिका आकार और डीएनए सामग्री (टी60)की समानांतर वृद्धि हुई। जब सेफेक्सिन को हटा दिया गया था, तो जनसंख्या कोशिका का आकार और डीएनए सामग्री धीरे-धीरे टी180पर तनावग्रस्त आबादी के समान हो गई। इन परिणामों से पता चलता है कि सेफिलेक्सिन ने डीएनए प्रतिकृति को बाधित नहीं किया और तंतु कोशिकाओं के गठन को उकसाया जिसमें कई गुणसूत्र समकक्ष थे। ये तंतु सामान्य कोशिका आकार और डीएनए सामग्री के साथ कोशिकाओं में विभाजित जब दवा बह गई थी । प्रवाह साइटोमेट्री परिणाम तनाव के लिए बहुत अलग होगा जो डीएनए संश्लेषण को रोकते हैं, जो केवल एक गैर-नकल गुणसूत्र वाले तंतु कोशिकाओं के गठन का कारण बनते हैं। उस मामले में, सेल का आकार इसी तरह बढ़ेगा लेकिन डीएनए सामग्री में वृद्धि के साथ जुड़ा नहीं होगा ।

Figure 3
चित्रा 3: अनुपचारित और सेफेलेक्सिन-60min-इलाज कोशिकाओं का प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण। (A)सेल साइज डिस्ट्रीब्यूशन हिस्टोग्राम (एफएससी-एच) । (ख)डीएनए सामग्री हिस्टोग्राम (FL1-SYTO9) । n = 120,000 कोशिकाओं का विश्लेषण किया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

स्नैपशॉट माइक्रोस्कोपी इमेजिंग का उपयोग सेल आकृति विज्ञान और एचयू-एमचेरी स्थानीयकरण(चित्र4ए)द्वारा दिखाए गए डीएनए के इंट्रासेल्युलर संगठन की जांच करने के लिए किया गया था। सेफेलेक्सिन ने सामान्य कोशिका चौड़ाई और कोई विभाजन सेप्टा के साथ लंबी कोशिकाओं के गठन को उकसाया। इन चिकनी फिलामेंट्स में नियमित रूप से दूरी वाली डीएनए संरचनाएं होती हैं जिन्हें नाभिक कहा जाता है, जिससे यह पुष्टि होती है कि सेफेलेक्सिन गुणसूत्र प्रतिकृति और अलगाव को प्रभावित नहीं करता था। मात्रात्मक छवि विश्लेषण काफी हद तक सेल आकार और डीएनए सामग्री वृद्धि पहले प्रवाह साइटोमेट्री(चित्र4बी, सी)के साथ मनाया की पुष्टि की । परिणाम तनाव के लिए बहुत अलग होगा जो डीएनए-क्षति को प्रेरित करते हैं, जिससे तंतु कोशिकाओं का गठन होता है जिसमें प्रतिकृति जारी रहती है लेकिन अलगाव बिगड़ा हुआ है । उस मामले में, सेल आकार और डीएनए सामग्री इसी तरह वृद्धि होगी, लेकिन कोशिकाओं डीएनए के एक भी असंरचित द्रव्यमान बंदरगाह होगा । स्नैपशॉट छवियां अन्य प्रकार के अपथन कोशिका आकार या मिनी, अनुक्लीट या लाइसेड कोशिकाओं (भूत कोशिकाओं) की उपस्थिति को भी प्रकट कर सकती हैं।

Figure 4
चित्रा 4: अनुपचारित और सेफेक्सिन-60min-इलाज कोशिकाओं का माइक्रोस्कोपी स्नैपशॉट विश्लेषण। (ए)प्रतिनिधि माइक्रोस्कोपी छवियां चरण विपरीत (ग्रे) और हू-एमचेरी सिग्नल (लाल) दिखाती हैं। (ख)सेल लेंथ डिस्ट्रीब्यूशन हिस्टोग्राम । स्केल बार = 5 μm.(सी)प्रति कोशिका नाभिक की संख्या का हिस्टोग्राम। प्रत्येक नमूने के लिए 800 और 2,000 कोशिकाओं के बीच विश्लेषण किया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

माइक्रोफ्लूइडिक उपकरण16 से जुड़ी समय-चूक माइक्रोस्कोपी ने पहले देखे गए फेनोटाइप को निर्धारित करने में मदद की और विकास की कमी के विकास और करणीय संबंध के बारे में अतिरिक्त अंतर्दृष्टि प्रदान की। समय-चूक छवियां(चित्रा 5 और मूवी 1)ने पुष्टि की कि सेल विस्तार (सेल मास संश्लेषण), और गुणसूत्र प्रतिकृति और अलगाव सेफेलेक्सिन के संपर्क से बाधित नहीं थे। इसके अलावा सेफेक्टिन को हटाए जाने पर रिकवरी की प्रक्रिया का पता चला। फिलामेंतुकोशिका वंश के विश्लेषण से पता चला है कि सेल डिवीजन दवा को धोने के बाद ~ 20 मिन को फिर से शुरू करता है(चित्रा 5बी)। परिणामस्वरूप विभाजित कोशिकाएं व्यवहार्य थीं, क्योंकि वे बदले में विभाजित थीं, अंततः सामान्य आकार और डीएनए सामग्री का प्रदर्शन करने वाली 33 कोशिकाओं के गठन के लिए अग्रणी हैं। यह प्रयोग है, जो पीढ़ी CFU/mL माप (~ ३३ min) से तनावग्रस्त आबादी के लिए गणना समय के समान है की १८० मिन से अधिक ~ 31 मिन की एक समग्र पीढ़ी के समय की गणना की अनुमति दी ।

Figure 5
चित्रा 5: सेफेक्सिन-60min-इलाज कोशिकाओं का माइक्रोस्कोपी समय-चूक विश्लेषण। (ए)प्रतिनिधि माइक्रोस्कोपी छवियां चरण विपरीत (ग्रे) और हू-एमचेरी सिग्नल (लाल) दिखाती हैं। निगरानी फिलामेंटिनस सेल सफेद रूपरेखा द्वारा इंगित किया जाता है, और विभिन्न रंगों द्वारा विभाजित कोशिकाओं। स्केल बार = 5 μm.(B)फिलामेंतुस सेल वंश के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व पैनल(ए)और मूवी 1के लिए इसी । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Movie 1
मूवी 1: ई. कोलाई हू-mCherry की माइक्रोफ्लूइडिक फिल्म सेफिलेक्सिन के साथ इलाज किया । सेफ्लेक्सिन को 60 मिन के बाद इंजेक्ट किया गया था, इसके बाद 3 घंटे के लिए ताजा आरपीएम माध्यम का इंजेक्शन लगाया गया था। स्केल बार = 5 μm. कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

Discussion

प्रक्रिया के दौरान कोशिकाओं की विकास स्थिति पर ध्यान देना आवश्यक है। एक पूर्ण घातीय चरण तक पहुंचने से पहले कई पीढ़ियों से अधिक कोशिकाओं को बढ़ाएं। इस विधि की सफलता के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि सभी कोशिकाओं के नमूनों को एक साथ एकत्र किया जाता है, और एक ही समय में केवल एक इलाज और एक अनुपचारित संस्कृति का विश्लेषण करना सबसे अच्छा है। माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए सेल नमूनों को प्रक्रिया के दौरान प्रयोगात्मक तापमान पर बनाए रखा जाना चाहिए। इसके बाद प्रयोग की शुरुआत से पहले माइक्रोस्कोप चैंबर और माइक्रोफ्लूइडिक चैंबर को प्रीहीट करना जरूरी है । यदि प्रवाह साइटोमेट्री के लिए सेल नमूनों का आसानी से विश्लेषण नहीं किया जा सकता है, तो उन्हें बर्फ पर 6 घंटे तक रखा जा सकता है। बर्फ पर ऊष्मायन कोशिकाओं के विकास और रूपात्मक संशोधन को सीमित करेगा। वैकल्पिक रूप से, उपयोगकर्ता इथेनॉल 75% में कोशिकाओं के निर्धारण का उपयोग करने पर विचार कर सकता है, जिसे आमतौर पर प्रवाह साइटोमेट्री10के लिए अनुशंसित किया जाता है। यदि प्रोटोकॉल के लिए संभावित गुमराह कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए मध्यम, अपकेंद्रित्र और पिपेट कोशिकाओं से तनाव प्रेरक धोने की आवश्यकता होती है।

दोनों प्रवाह साइटोमेट्री और स्नैपशॉट विश्लेषण सेल आकार और डीएनए सामग्री मापदंडों तक पहुंच देते हैं, स्नैपशॉट के साथ सेल आकृति विज्ञान का अतिरिक्त अवलोकन प्रदान करते हैं। DAPI10 (4', 6-diamidino-2-phenylindole) या अन्य स्थिर डीएनए रंगों के साथ डीएनए धुंधला किया जा सकता है अगर कोई फ्लोरोसेंट संलयन ब्याज के जीव में नाभिक का पालन करने के लिए उपलब्ध है । यदि प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण नहीं किया जा सकता है, तो माइक्रोस्कोपी द्वारा बड़ी संख्या में कोशिकाओं की छवि और विश्लेषण करना महत्वपूर्ण है।

माइक्रोस्कोपी इमेजिंग भी ब्याज के विशिष्ट रास्ते में शामिल प्रोटीन के लिए फ्लोरोसेंट संलयन ले जाने उपभेदों का उपयोग कर किया जा सकता है । इससे विभिन्न प्रकार की सेलुलर प्रक्रियाओं जैसे प्रतिकृति, प्रतिलेखन, सेल वॉल संश्लेषण या सेल डिवीजन पर तनाव के प्रभाव को प्रकट करने में मदद मिलेगी। विधि को बैक्टीरियल प्रजातियों की एक श्रृंखला पर लागू किया जा सकता है, केवल आवश्यकता यह है कि माइक्रोफ्लूइडिक उपकरण कोशिकाओं की आकृति विज्ञान के साथ संगत होना चाहिए। मानक माइक्रोफ्लूइडिक प्लेटें रॉड-आकार बैक्टीरिया के लिए सुविधाजनक हैं, जिनकी सेल चौड़ाई 0.7 माइक्रोन और 4.5 माइक्रोन के बीच होती है। हालांकि, विशिष्ट आकृतियों के साथ cocci, ovococci, या अन्य जीवाणु उपभेदों का परीक्षण करने की आवश्यकता है। वैकल्पिक रूप से, यदि उपकरण या असंगत बैक्टीरियल उपभेदों की अनुपलब्धता के कारण माइक्रोफ्लूइडिक प्रयोग नहीं किए जा सकते हैं, तो 2h की अधिकतम अवधि के लिए अगारोज-माउंटेड स्लाइड पर समय-चूक इमेजिंग की जा सकती है।

इस बहु-पैमाने पर विश्लेषण का समग्र लाभ बैक्टीरियल विकास क्षमता (यानी, बड़े पैमाने पर संश्लेषण, सेल व्यवहार्यता, कोशिका आकृति विज्ञान, झिल्ली अखंडता, डीएनए सामग्री) और जिस तरह से तनाव में शामिल होने के प्रभाव की वैश्विक दृष्टि प्रदान करना है। ये तनाव की स्थिति में बढ़ रही जीवाणु आबादी में समय के साथ विकसित होते हैं। यह एकल-कोशिका स्तर और जनसंख्या स्तर पर सामान्य विकास की बहाली का विश्लेषण करने की भी अनुमति देता है। यह दृष्टिकोण जीवाणु प्रजातियों की एक विस्तृत श्रृंखला और लगभग किसी भी प्रकार के तनाव उपचार पर लागू होता है, जैसे एंटीबायोटिक या अन्य रोगाणुरोधी यौगिकों के संपर्क में, बहुप्रजातियों में अन्य जीवों के साथ बातचीत के प्रभाव का विश्लेषण आबादी, या आनुवंशिक उत्परिवर्तन का प्रभाव।

Disclosures

लेखकों ने कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं की ।

Acknowledgments

लेखक ों ने साइटोमेट्री के साथ तकनीकी सहायता के लिए हुपा-एमचेरी स्ट्रेन, ए डेडियू और माइक्रोबेज के साथ मदद के लिए ए ड्यूक्रेट प्रदान करने के लिए एफ कॉर्नेट को धन्यवाद दिया। वित्तपोषण: सी लेस्टरलिन इंसेर्म और सीएनआरएस संस्थानों के साथ-साथ एटिप-एवेनिर कार्यक्रम, श्लमबर्ग फाउंडेशन फॉर एजुकेशन एंड रिसर्च (एफएसईआर 2019), प्लाज्मेड रिसर्च प्रोग्राम (एएनआर-18-CE35-0008) के साथ-साथ जे कैरॉन को फंडिंग के लिए फिनोवी के लिए एएनआर फंडिंग को स्वीकार करते हैं; फ्लो साइटोमीटर उपकरणों के वित्तपोषण के लिए ला लिग कॉन्ट्रे ले कैंसर। लेखक योगदान: सीएल और जेसी प्रक्रिया डिजाइन और कागज लिखा था; जेसी ने प्रयोगों का प्रदर्शन किया और आंकड़ों का विश्लेषण किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose BioRad 1613100 Certified molecular biology agarose
Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer ThermoFisher scientific A24858 Cytometer
CellASIC ONIX Microfluidic System Merck Millipore CAX2-S0000 Microfluidic system
CellASIC ONIX2 FG Merck Millipore ONIX2 1.0.1 Microfluidic software
CellASIC ONIX2 Manifold Basic Merck Millipore CAX2-MBC20 Manifold system
CytoOne 96-well plate with lid Starlab CC7672-7596 Microplate with 0,2 mL well working volume and clear flat bottom, for automated plate reader
E. coli strain carrying a chromosomal insertion for a hupA-mCherry fusion Created by P1 transduction of hupA-mCherry in E. coli MG1655
Fiji ImageJ https://fiji.sc/ Image software. Cite Schindelin et al. if used in publication
Gene Frame Thermo Scientific AB-0578 Blue frame (125 μL, 1,7 x 2,8 cm)
Luria-Broth agarose medium MP Biomedicals 3002232 Growth medium for plating assay
MicrobeJ Imagej/Fiji plugin https://www.microbej.com/ Microscopy image analysis plugin. Cite Ducret et al. If used in publication; Detection settings: For bacteria : Area (μm2): 0,1-max; Length (μm): 0,5-max; Width (μm): 0,6-max; Range (μm): 0,5-max; Angularity (rad): 0-0,3; 0-max for all other parameters. For nucleoid: Tolerance: 500; Threshold: Local; 0-max for all other parameters
Microfluidic Plates CellASIC ONIX Merck Millipore B04A-03-5PK Plate for Microfluidic system
Microscope Nikon eclipse Ti Nikon Fluorescence microscope
MOPS EZ Rich Defined Medium (RDM) Teknova M2105 Growth rich medium, 10x MOPS Mixture, 0,132 M K2HPO4, 10x AGCU, 5x Supplement EZ, 20% Glucose. Filtered at 0,22 μm
SYTO9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain ThermoFisher scientific S34854 DNA fluorescent dye
TECAN Infinite M1000 TECAN 30034301 Automated plate reader

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References

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