Toepassing van selectieve fluorescerende kleurstoffen voor membraan-en celwand voor het beeldvorming van filamenteuze schimmels in levende cellen

Biology
 

Summary

Vitale fluorescerende kleurstoffen zijn essentiële hulpmiddelen voor Live-celbeeldvormings analyses in moderne schimmel celbiologie. Dit papier Details de toepassing van gevestigde en minder bekende fluorescerende kleurstoffen voor het volgen van plasma membraan dynamiek, Endo-/exocytose en celwand morfogenese in filamenteuze schimmels.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Lichius, A., Zeilinger, S. Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi. J. Vis. Exp. (153), e60613, doi:10.3791/60613 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

De toepassing van selectieve fluorescerende kleurstoffen voor membraan-en celwand voor Live-celbeeldanalysen van organel dynamiek in schimmelcellen begon twee decennia geleden en blijft sindsdien sterk bijdragen aan ons begrip van de filamenteuze schimmel Levensstijl. Dit papier biedt een praktische gids voor het gebruik van de twee membraan kleurstoffen FM 1-43 en FM 4-64 en de vier celwand vlekken Calcofluor wit M2R-, Solophenyl flavine 7GFE 500, Pontamine Fast Scarlet 48 en Congo rood. De focus ligt op hun lage-dosis toepassing om artefact vrije kleuring, hun co-beeldvormings eigenschappen en hun kwantitatieve evaluatie vast te stellen. De gepresenteerde methoden zijn van toepassing op alle filamenteuze schimmel monsters die op de beschreven manieren kunnen worden bereid. De fundamentele kleurings benaderingen kunnen dienen als uitgangspunt voor aanpassingen aan soorten die mogelijk verschillende teeltomstandigheden vereisen. Ten eerste worden biofysische en biochemische eigenschappen beoordeeld omdat hun begrip essentieel is voor het gebruik van deze kleurstoffen als echt vitale fluorescerende vlekken. Ten tweede worden stapsgewijze protocollen gepresenteerd die de voorbereiding van verschillende soorten schimmel monsters voor fluorescerende Live-celbeeldvorming gedetailleerd weergeven. Ten slotte illustreren voorbeeld experimenten verschillende benaderingen voor: (1) identificeren van gebreken in de spatio-temporele organisatie van endocytose in genetische mutanten, (2) relatief karakteriseren gedeelde en duidelijke co-lokalisatie van GFP-gelabelde doel eiwitten in het endocytische traject (3) identificeren morfogenetische celwand defecten in een genetische Mutant, en (4) monitor Cell Wall biogenese in real time.

Introduction

Twintig jaar geleden werd de manier waarop hyphal morfogenese en de onderliggende moleculaire celbiologie konden worden gevisualiseerd in filamenteeuze schimmels geregiseerd door de toepassing van het membraan selectieve fluorescerende Fei Mao Dye FM 4-641. Later, het voordeel van de chitin-bindende kleurstof Calcofluor wit als vitale fluorescerende marker van schimmel celwand dynamiek werd gerealiseerd2. Sindsdien zijn zowel kleurstoffen als varianten daarvan een inherent onderdeel geworden van Live-celbeeldvormings analyses van organel dynamiek in schimmels en blijven ze ongekende inzichten bieden in de filamenteuze schimmel levensstijl. Dit papier Details de toepassing van gevestigde en minder bekende fluorescerende kleurstoffen voor het volgen van plasma membraan dynamiek, Endo-en exocytose en celwand morfogenese in filamenteuze schimmels. Endocytose tracking assays kunnen verschillende cel biologische vragen met betrekking tot de algemene studie van endocytose worden aangepakt3. Hiervoor wordt de lokalisatie, snelheid en opeenvolging van bevlekte compartimenten bij toevoeging van FM-kleurstof opgenomen door tijdsverloop microscopie en kwantitatief vergeleken tussen de geteste schimmel stammen4. Celwand kleurstoffen afbakenen de buitenste grens van de cel en laten het volgen van morfogenetische gebeurtenissen toe, waaronder gepolariseerde hyphal Tip groei2, hyphal vertakkingen5, hyphal Fusion6,7 en septum formatie8. Bovendien vergemakkelijken ze de kwantificering van gelokaliseerde celwand depositie en de identificatie van defecten tijdens celwand biogenese9. Omdat gedetailleerde kennis van de biochemische en biofysische eigenschappen van een fluorescerende marker een fundamentele voorwaarde is voor de succesvolle in vivo toepassing, worden deze kenmerken voor het eerst samengevat voor de zes kleurstoffen die in dit artikel worden vermeld.

Membraan selectieve kleurstoffen
FM (Fei Mao) styryl kleurstoffen zijn kleine amfifiele moleculen die niet kunnen passeren maar omkeerbaar associëren met de buitenste bijsluiter van de lipide dubbellaagse van biologische membranen10. Ze zijn vrijwel niet-tl-licht in waterige oplossing, maar worden intens fluorescerend bij de integratie van plasma membraan, waardoor uitstekende signaal-ruis (S/N)-verhoudingen11worden gegenereerd. Deze eigenschappen maken ze bij uitstek geschikt voor het visualiseren van plasma membraan en intracellulaire organel dynamiek, inclusief het volgen van Endo-en exocytose12. De groen-fluorescerende FM 1-43 en de rood-fluorescerende FM 4-64 zijn voor deze doeleinden de twee meest gebruikte fluorescerende membraan markers. SynaptoGreen C4 en SynaptoRed C2 zijn generieke moleculen van alternatieve leveranciers die onderling verwisselbaar kunnen worden gebruikt in plaats van FM 1-43 en FM 4-64, respectievelijk.

Styryl kleurstoffen bestaan uit drie belangrijke structurele gebieden: (1) de lipofiele staart die het inbrengen van de kleurstof in de lipide dubbellaag vergemakkelijkt, (2) de de-kern die de spectrale eigenschappen van de kleurstof bepaalt en wordt gevormd door twee aromatische ringen die met één tot drie dubbele bindingen zijn verbonden, en (3) de positief geladen hydrofiele kop die volledige inbrenging en permeatie van de kleurstof door het membraan voorkomt (Figuur 1a).

Hoe langer de lipofiele staart, hoe hoger de hydrofobiciteit van de kleurstof en dus een bindende affiniteit met het membraan, maar hoe lager de oplosbaarheid in water en de membraan ontkleurings graad. Daardoor produceren verschillende FM-kleurstof varianten verschillende kleurings dynamiek en-patronen. De hogere hydrofobiciteit van de C4-tailed FM 1-43 zorgt voor een sterker en stabieler fluorescentie signaal bij plasma membranen en inwendige organellen sneller dan de kortere C2-tailed FM 4-64, wanneer toegepast bij equimolaire concentraties (Figuur 2).

Belangrijk is dat de constante en hoge associatie/dissociatie percentages van beide FM-kleurstoffen11 met gemiddelde retentietijden van 1 – 6 s per individuele kleurstof molecuul13 de kans op gelokaliseerde verstoring van de membraan functie verminderen, bijvoorbeeld door de modificatie van membraan vloeibaarheid of geforceerde permanente interactie van membraan eiwitten. Dit is waarschijnlijk de belangrijkste reden waarom deze moleculen kunnen worden gebruikt als vitale kleurstoffen. Niettemin, FM-kleurstof concentraties boven 50 μM zijn giftig voor de schimmel-en plantencellen2,14, en bewijs van de door-2 tabak protoplasten geeft aan dat meer dan 20 μM FM-kleurstof leidt tot verzadiging van het plasma membraan14. Daarom is het raadzaam om deze limiet niet te overschrijden, vooral gezien het feit dat uitstekende beeldvorming is bereikt met slechts 2 – 5 μM15,16.

Met name de spectrale eigenschappen van FM-kleurstoffen variëren sterk afhankelijk van de specifieke membraan-micro omgeving (beoordeeld14). Over het algemeen verschillen excitatie-en emissiespectra van FM-kleurstoffen in oplossingen van zuiver oplosmiddel (zoals gewoonlijk vermeld in de productinformatie) significant van die in cellulaire omgevingen en kunnen ze in de meeste gevallen niet direct worden geraadpleegd voor het selecteren van instellingen voor Live-celbeeldvorming. De excitatie/emissiemaxima van FM 1-43 en FM 4-64 worden bijvoorbeeld blauw-verschoven met respectievelijk 37/46 nm en 43/64 nm, wanneer gebonden aan schimmel membranen in vergelijking met hun oplossingen in methanol (tabel 1).

De baanbrekende Fundamentals voor het gebruik van FM 4-64 en FM 1-43 voor het volgen van plasma membraan, Endo-/exocytose en organel dynamiek, waaronder de spitzenkörper en mitochondriën, zijn al uitvoerig gedocumenteerd voor een breed scala aan filamenteuze schimmelsoorten eerder2,4,17,18,19. Aanbevolen beeldvormings instellingen voor beide FM-kleurstoffen die in verschillende filamenteuze schimmelsoorten werken, worden afgebeeld in Figuur 1b. Technische beperkingen van de beschikbare apparatuur of specifieke cellulaire en experimentele omstandigheden, zoals kweekmedium, pH of temperatuur, kunnen echter enkele aanpassingen vergen. Gelukkig werken FM-kleurstoffen over een breed spectrum bereik, en zeer goede beeldvormende resultaten worden bereikt door spannende FM 1-43 met 514 nm of FM 4-64 met 488 nm. Bijgevolg moeten de optimale beeldvormings instellingen voor elk type monster en de beoogde toepassing afzonderlijk worden bepaald.

De aanzienlijke verschuiving van het Stoke-over van meer dan 135 nm van FM 4-64 zorgt voor uitstekende gelijktijdige co-Imaging met fluoroforen die groen licht uitstralen; Dit wordt vaak benut om de intracellulaire lokalisatie dynamiek van groene fluorescerende eiwitten (GFP)-gelabelde fusie-eiwitten ten opzichte van het plasma membraan en de endocytische pathway9,20te evalueren.

Celwand-selectieve kleurstoffen
Calcofluor White M2R-(CFW), ook op de markt gebracht als fluorescerende Brightener 28, is waarschijnlijk de bekendste fluorescerende kleurstof die wordt gebruikt om de celwanden van bacteriën, schimmels, algen, hogere planten en insecten te vlekken. Aanvankelijk gebruikt als optische bleken agent in de papier-, textiel-en detergentenindustrie, de voordelen voor de klinische diagnose van schimmelinfecties werd vroeg gerealiseerd op21,22. Omdat CFW onherroepelijk in de ontluikende chitine-keten intercalates, verstoort het normale chitine microfibril assemblage tijdens celwand biogenese waardoor celwand stress23wordt gegenereerd. Dit activeert op zijn beurt een celwand schade herstelmechanisme dat leidt tot lokaal verhoogde celwand depositie als het resultaat van glucan en chitine synthase activatie24,25. Dit fenomeen kan voorkomen bij elke kleurstof die werkt door stabiel te binden aan celwand polymeren, is concentratie-afhankelijk en is het meest merkbaar bij hyphal-tips die de meest productieve groei en dus de meest gevoelige delen van het mycelium vertegenwoordigen (Figuur 3). Een uitgebreide samenvatting van de moleculaire machine die reageert op celwand schade is onlangs verstrekt26.

Overdosed Dye in combinatie met fototoxiciteit kan leiden tot snelle cellyse van hyphal compartimenten (film 1). Niettemin, verhoogde gevoeligheid voor kleurstof concentraties die "vitale" in het wild type zijn kunnen worden benut om gebreken in celwand biosynthese van gen verlies-van-functie mutanten9identificeren. Voor CFW en Congo rood (CR), een andere textiel kleurstof ook bekend als direct Red 28 en gebruikt als α-en β-chitine-specifieke celwand vlek voor schimmels eninsecten 27,28, drempelconcentraties die sterk induceren chitine synthases zijn vastgesteld met > 60 μm CFW en > 70 μM CR, terwijl concentraties <15 μm van beide kleurstof niet veranderen of schimmelgroei remmen29,30,31. Hickey et al. plaatste deze drempel concentratie voor CFW bij 25 μM2. Daarom is het raadzaam om kleurstof concentraties ≤ 5 μM te gebruiken om stressgerelateerde artefacten uit te sluiten en ervoor te zorgen dat deze moleculen als echt "vitale fluorescerende kleurstoffen"2,32worden gebruikt. Dit geldt evenzeer voor Solophenyl flavine 7GFE 500 (SPF) en Pontamine Fast Scarlet 4B (PFS), synoniem aan directe gele 86 en direct Red 23, respectievelijk twee andere nuttige celwand kleurstoffen waarvan de toepassing voor schimmels is gemeld voor de eerste keer meer dan een decennium geleden33. Maar ondanks hun opmerkelijke spectrale eigenschappen34,35, is het gebruik van beide kleurstoffen sindsdien zeer beperkt36,37. Zoals eerder getoond voor 1,5 μM CFW2, 2 μm SPF volstaan om de celwand dynamiek onder inheemse omstandigheden op te lossen met een zeer hoge temporele resolutie (film 2). Dezelfde resultaten kunnen worden verkregen met 2 μM CR of PFS.

Samen vormen deze vier kleurstoffen, CFW, SPF, PFS en CR, een set celwand-selectieve fluorescentie markers die bijna het volledige zichtbare emissie Lichtspectrum (400 – 700 nm) beslaan dat wordt gebruikt op moderne fluorescerende microscopen (Figuur 4). De significante toename van de intensiteit van de fluorescentie bij binding aan celwand polymeren is inherent aan alle vier en genereert uitstekende S/N-verhoudingen. Dit op zijn beurt toelaat om kleurstof concentraties en excitatie lichtintensiteit zeer laag te houden en maakt het mogelijk om celwand kleuring als "lage dosis" Live-Cell Imaging techniek2uit te voeren. Omdat deze celwand kleurstoffen plasma membraan ondoorbaar zijn, functioneren ze tegelijkertijd als levende/dode vlekken. Met name vanwege hun extreem brede emissie lichtspectra, moeten sommige beperkingen met betrekking tot de co-Imaging eigenschappen van CFW en SPF met andere fluor Foren zorgvuldig worden overwogen.

Protocol

1. bereiding van schimmel monsters

  1. Preculturen van schimmels
    1. Beënt de gewenste belasting op een geschikt vast agar-medium, zoals aardappel dextrose agar (PDA) voor Trichoderma atroviride of Vogel's minimal medium (VMM) voor Neurospora crassa. Voeg een geschikte selectiemarkering toe bij het werken met transformant stammen.
    2. Inbroed de pre-cultuur op de optimale temperatuur van het organisme. Bijvoorbeeld, T. atroviride bij 25 °C en N. crassa bij 30 °c, en 12 h/12 h licht/donker cycli totdat een sporulerend mycelium heeft ontwikkeld, maar nog niet bereikt de rand van de plaat. Op een standaard formaat Petri schaal (9,2 cm Ø), dit neemt de wild-type T. atroviride op 4 – 6 dagen gemiddelde, terwijl de N. crassa wild type bereikt dit stadium na 3 – 4 dagen gemiddeld.
  2. Teelt van schimmel kolonies
    1. Snijd met een steriel scalpel een klein agar-blok van 3 mm x 3 mm dat niet-sporulerend mycelium uit de kolonie rand van de pre-cultuur vervoert.
    2. Plaats het agar-blok in het midden van een verse vaste medium plaat om de experimentele cultuur te beënten.
    3. Inincuberen van de experimentele cultuur op basis van de ontwikkelingsfase bedoeld om te worden onderzocht. Bijvoorbeeld, de wild-type T. atroviride vereist 20 – 22 uur bij 25 °c in het donker om kolonies van ongeveer 2 cm diameter op PDA te ontwikkelen, terwijl de wild-type N. crassa kolonie diameters van ongeveer 4 cm bereikt na 14 – 16 h van incubatie bij 30 °c in het donker op VMM.
      Opmerking: incubatie in het donker voorkomt de vorming van pigmenten die een autofluorescentie kunnen introduceren. Om de gemiddelde achtergrond fluorescentie uit de experimentele cultuur te elimineren, vervangt u agar met 1,5% w/v van een transparante Stolp middel (Zie de tabel met materialen) en elk complex medium met een gedefinieerd minimaal medium.
  3. Teelt van massief germende culturen
    1. Gebruik 5 mL steriele fysiologische zoutoplossing (0,9% w/v NaCl) om naald sporen te oogsten uit de pre-cultuur plaat en verzamel de resulterende Spore suspensie in een 15 mL schroefdop buis.
    2. Meng de Spore suspensie goed door krachtige grondig en filtreer vervolgens over een strook van 1 cm x 5 cm steriele filter stof (Zie de tafel van de materialen) lichtjes gevuld in een 1 ml pipetpunt (zowel geassembleerd als vooraf geautoclaveerd) in een verse steriele buis.
    3. Bepaal de Spore dichtheid met een celtelkamer en bereid een 1 x 107 cellen/ml Spore suspensie met fysiologische zoutoplossing voor.
      Opmerking: de Spore suspensie kan gedurende maximaal twee weken bij 4 °C worden bewaard.
    4. Bereid een standaard formaat Petri schaal (9,2 cm Ø) met 20 mL vast medium en voeg 15 – 20 steriele glas parels (3 mm Ø) aan de bovenzijde toe.
    5. Pipetteer 200 μL van de Spore suspensie op de medium plaat en verdeel de cellen gelijkmatig over de hele plaat door zachtjes te schudden. Verzamel de glazen kralen in een bekerglas met 70% ethanol voor hergebruik.
    6. Inincuberen van de experimentele cultuur op basis van de ontwikkelingsfase bedoeld om te worden onderzocht. Het wild type T. atroviride vereist bijvoorbeeld 5 – 6 h bij 25 °c in het donker om naald GERMLINGS op PDA te ontwikkelen, terwijl de N. crassa wild type connaat van naaldhout ontwikkelt na 3 – 4 uur incubatie bij 30 °c in het donker op VMM.
      Opmerking: om een middellange achtergrond fluorescentie uit de experimentele cultuur te elimineren, moet u agar vervangen door 1,5% w/v van een transparant Stolp middel, en elk complex medium met een gedefinieerd minimaal medium.
  4. Teelt van vloeibare germling culturen
    1. Vul 190 μL vloeibaar kweekmedium in elke put van een 8-well Chambered micro-Slide.
    2. Voeg 10 μL van een 1 x 107 cellen/ml Spore oplossing (bereid in stappen 1.4.1 – 1.4.3) toe en meng door voorzichtig een paar keer omhoog en omlaag te pipetteren. Het resulterende totale aantal cellen is 1 x 105 per put.
    3. Inincuberen van de experimentele cultuur op basis van de ontwikkelingsfase bedoeld om te worden onderzocht. Het wild type T. atroviride vereist bijvoorbeeld 5 – 6 h bij 25 °c in het donker om coniferingen te ontwikkelen in aardappel dextrose-Bouillon (VOB), terwijl het wilde type N. crassa coniferingen ontwikkelt na 3 – 4 uur incubatie bij 30 °c in het donker in vloeibare VMM.

2. bereiding van kleurstof werkoplossingen

  1. Om de volledige oplosbaarheid van elke kleurstof te garanderen, dient u 2 mM stockoplossingen in Dimethylfumaraat sulfoxide (DMSO) te bereiden door de juiste hoeveelheid toe te voegen (Zie exacte gewichten in tabel 1) tot 1 ml 100% DMSO en meng goed door vortexing.
    Let op: Zorg ervoor dat u de DMSO nemen van een septum-verzegeld fles; het moet een duidelijke transparante vloeistof. Bij contact met de lucht wordt DMSO bruin-waarschijnlijk als gevolg van de oxidatie van sporen onzuiverheden-en kan het de celgroei of kleurstof kleuring negatief beïnvloeden.
  2. Filter steriliseren de stamoplossing door een 0,2 μm spuit membraanfilter in een verse steriele 1,5 mL reactie buis. Om kleurstof bleaching te minimaliseren, wikkel de buis in aluminiumfolie.
    Opmerking: de kleurstof voorraadoplossing kan worden uitgedrukt in kleinere volumes om te voorkomen dat ze ontdooien/vriezen en gedurende enkele maanden bij 4 °C worden bewaard.
  3. Bereid een werkoplossing met een waterige kleurstof van 20 μM door 2 μL kleurstof voorraadoplossing op te lossen in 198 μL steriel gedestilleerd water in een verse steriele 1,5 mL-reactie buis. Om kleurstof bleaching te minimaliseren, wikkel de buis in aluminiumfolie.
    Opmerking: de kleurstof werkoplossing moet vers worden bereid op de dag van het experiment.
  4. Tijdens de montage van het monster (zie rubriek 3) zal de kleurstof werkoplossing standaard worden verdund 1:10, resulterend in een uiteindelijke kleurstof concentratie van 2 μM en 0,1% w/v uiteindelijke DMSO-concentratie.
    Opmerking: het kiezen van verschillende verdunningsfactoren door simpelweg de volume verhouding tussen de kleurstof werkoplossing en de bevestigings vloeistof te veranderen, maakt het mogelijk om de gewenste eind kleurstof concentratie eenvoudig aan te passen.
    Let op: om ongewenste effecten te voorkomen als gevolg van kleurstof of DMSO-toxiciteit, mag de verdunningsfactor niet onder 1:4 vallen tot een resultaat maximale eindconcentratie van 5 μM kleurstof en 0,4% w/v DMSO. Hogere kleurstof concentraties zullen het systeem snel verzaaien en een betrouwbare signaal kwantificering voorkomen, terwijl meer dan 0,5% w/v (≥ 62,5 mM) DMSO de celontwikkeling38kan aantasten.

3. monstervoorbereiding voor microscopie

  1. Monteer monsters van schimmel kolonies (stap 1,2) of massieve germling culturen (stap 1,3) door de omgekeerde agar-blok methode.
    1. Houd een schone glazen afdekplaat van 24 mm x 60 mm (#1 = 0,13 – 0.16 mm dikte) klaar en voeg 18 μL vloeibare minimale medium (VMM of M9) of fysiologische zoutoplossing toe aan het midden.
    2. Voeg 2 μL van de 20 μM kleurstof werkoplossing toe aan de 18 μL vloeistof en meng goed door meerdere malen op en neer te pipetteren, terwijl de productie van luchtbellen wordt vermeden.
      Opmerking: bij het werken met verschillende monsters, is het raadzaam om een Master mix van vloeistof-Dye oplossing voor iedereen te bereiden om ervoor te zorgen gelijke kleurstof concentratie gedurende het experiment.
    3. Knip met een schoon scalpel een monster van 15 mm x 15 mm uit de omtrek van de kolonie of een stevige germling-cultuur en plaats deze verticaal naast de gemiddelde druppel op de Afdekstrook.
    4. Gebruik de scalpel om de bovenrand van het blok en een vinger te ondersteunen om de achterzijde van het blok op zijn plaats te houden, en verlaag langzaam de zijkant die het mycelium of de germlings op de vloeistof draagt. Het monster is nu klaar voor overdracht naar de Microscoop.
      Let op: het is essentieel om dit langzaam en zeer zorgvuldig te doen om de mechanische belasting op de cellen te minimaliseren en om te voorkomen dat er luchtbellen tussen monster en cover slip worden gevangen.
  2. Monteer de vloeibare germling culturen van stap 1,4.
    Opmerking: de meest handige, vloeibare germling culturen in Chambered micro-well slides kunnen direct worden overgebracht en verder gemanipuleerd op de Microscoop fase.
    1. Voeg 22 μL kleurstof werkoplossing toe aan 200 μL vloeibaar medium, wat resulteert in een standaard eindconcentratie van 2 μM kleurstof en 0,1% w/v DMSO.
      Opmerking: vloeibare germling culturen hebben het grote voordeel dat fluorescerende kleurstoffen (of andere chemicaliën, zoals remmers) kunnen worden toegevoegd op elk gewenst tijdstip van het experiment, ook tijdens het opnemen. In dat geval moet er speciale aandacht worden besteed aan het zeer langzaam toedienen van de vloeistof druppels om de cellen niet te storen. Systeem trillingen en de Brownse beweging introduceren mogelijk al een celbeweging.

4. live-cel microscopie

  1. Pas de basisinstellingen voorbeeld verwerving aan. Met de volgende instellingen voorbeeld verwerving u de kleurings dynamiek in afzonderlijke schimmeldraden vastleggen en van toepassing zijn op beide volgende assays
    1. Breng 5 – 10% laser vermogen van 20% van het volledige uitgangsvermogen van het apparaat.
    2. Gebruik een plan APO 60x – 63x glycerol of water onderdompeling doel met een hoge numerieke diafragma ≥ 1,2.
    3. Beperk het afbeeldings verzamelings gebied tot de omtrek van de schimmeldraden door een afbeeldingsgrootte van 1024 x 256 pixels in te stellen en door een optische zoomfactor van 2 – 3 te gebruiken.
    4. Gebruik bidirectionele scanning met 400 Hz. Stel de pinhole grootte in op 1 luchtige eenheid.
    5. Stel de versterking van de gevoeligste detector in op 100%.
    6. Voor tijd ronden opnemen, Start Image Acquisition met één frame om de 15 s om redelijke temporele resolutie mogelijk te maken zonder kleurstof bleken of foto stress te produceren.
    7. Voor 3D-opnames stelt u de bovenste en onderste ruimtelijke grens in op de grens van de schimmeldraden en de ruimte optische secties 1 μm uit elkaar om een redelijke ruimtelijke resolutie mogelijk te maken.
      Opmerking: vanwege de snelle groei van hyphae is een hoge ruimtelijke resolutie in de Z-as vaak geofferd voor een hoge temporele resolutie in de X/Y-as of andersom. Alleen zeer moderne confocale laser scanning microscopen zijn snel genoeg om aan beide eisen te voldoen.
  2. Endocytose opname-assays
    1. Raadpleeg Figuur 1 en tabel 1 om de beste excitatie/emissie-instellingen voor FM 1-43 en/of FM 4-64 beschikbaar te stellen op het microscopie systeem en dienovereenkomstig aan te passen.
      Opmerking: met de aanbevolen concentratie van 2 μM is de opname van FM-kleurstof in het plasma membraan direct in normale gezonde cellen. Het hele proces van aanvankelijke plasmamembraan kleuring tot kleurstof verschijning in buisvormige vacuolen wordt meestal binnen 30 – 45 minuten bij kamertemperatuur voltooid. Het verhogen van de FM-kleurstof concentratie verhoogt de S/N-ratio en produceert zo sneller hogere contrast beelden. Echter, het versnelt ook het etiketteringsproces waardoor het moeilijker is om de chronologische opeenvolging van organel kleuring te differentiëren.
    2. Start Image Recording met de bovenstaande aanbevolen basisinstellingen voorbeeld verwerving en evalueer de resultaten.
    3. Optimaliseer instellingen voorbeeld verwerving in de ruimtelijke en temporele resolutie die nodig is om het aspect van het plasma membraan of endocytose dynamiek vast te leggen waar het experiment op gericht is.
    4. Om bijvoorbeeld zeer snelle dynamiek in X/Y vast te leggen, verlaagt u de totale Afbeeldingsgrootte, slechts één brandvlak en verhoogt u de scansnelheid tot 1 fps. Voor een hogere resolutie in de Z-as verlaagt u de resolutie in X/Y, verkleint u de beeldgrootte en verkleint u de afstand tussen optische secties tot 0,5 μm.
  3. Celwand dynamica
    1. Raadpleeg Figuur 4 en tabel 1 voor het identificeren van de beste excitatie/emissie-instellingen voor de toegepaste celwand kleurstof die beschikbaar is op het microscopie systeem en pas dienovereenkomstig aan.
      Opmerking: vanwege hun brede emissiespectra zijn CFW en SPF niet goed geschikt voor gelijktijdige co-Imaging met andere fluor Foren, overwegend GFP. Sommige beperkingen zijn zelfs van toepassing voor sequentiële beeldvormings benaderingen met deze kleurstoffen, en moeten dus individueel worden geoptimaliseerd.
    2. Start Image Recording met de bovenstaande aanbevolen basisinstellingen voorbeeld verwerving en evalueer de resultaten.
      Opmerking: bij de aanbevolen concentratie van 2 μM is de opname van de kleurstof in de celwand niet noodzakelijkerwijs direct maar redelijk snel. Het hele proces van septum vorming, bijvoorbeeld, duurt gemiddeld ongeveer 5 – 7 min bij kamertemperatuur20. Het verhogen van de celwand kleurstof concentratie verhoogt de S/N-ratio en produceert zo sneller hogere contrast beelden. Echter, het introduceert ook snel artefacten als gevolg van geïnduceerde celwand schade reparatie.
    3. Optimaliseer instellingen voorbeeld verwerving in de ruimtelijke en temporele resolutie die nodig is om het aspect van celwand morfogenese vast te leggen het experiment is gericht op, zoals uiteengezet in punt 4.2.3.

Representative Results

Kwantitatieve beeldanalyse
Naast "Just" visualisering van cellulaire processen, maakt Live-Cell Imaging het mogelijk om kwantitatieve informatie uit de vastgelegde gegevens te halen. In het algemeen is kwantitatieve beeldanalyse een complex onderwerp waarvan de juiste bespreking veel verder reikt dan het toepassingsgebied van dit artikel, vandaar dat de lezer wordt verwezen naar speciale studieboeken en artikelen39,40,41. Niettemin, enkele fundamentele richtlijnen die zijn gekoppeld aan de volgende voorbeeldgegevens worden verstrekt. Er moet aan een aantal cruciale voorwaarden worden voldaan om beeld kwantificering mogelijk te maken, waaronder: (1) er moeten op alle monsters gedefinieerde Molten van fluorescerende kleurstoffen worden aangebracht om een nauwkeurige vergelijking mogelijk te maken; (2) de instellingen voorbeeld verwerving moeten zodanig worden afgesteld dat de detectoren voor emissie licht nooit verzadigd zijn, anders worden de maximale intensiteiten afgesneden; (3) de instellingen voorbeeld verwerving moeten in de loop van een samenhangende experimentele verzameling blijven staan, anders worden veranderingen in de kunstmatige intensiteit geïntroduceerd; (4) beeldgegevens moeten worden opgeslagen in een informatie-verliesloos bestandsformaat, samen met de meta-informatie die alle instrumentinstellingen bevat; en (5) beeldanalyse moet worden beperkt tot het minimale aantal nabewerkings stappen dat nodig is om de gewenste kwantitatieve informatie te extraheren.

Meestal zijn gedefinieerde normen die het mogelijk maken dat de geregistreerde signalen absoluut kwantificeren, niet beschikbaar in de levende cel. Zo is de kwantitatieve beeldanalyse in zijn eenvoudigste vorm gebaseerd op de relatieve vergelijking van pixel intensiteiten binnen dezelfde afbeelding of tussen verschillende beelden die met identieke instellingen zijn opgenomen. De Microscoop-besturingssoftware van de fabrikant bevat normaalgesproken basishulpmiddelen voor het nabewerken van afbeeldingen en kwantitatieve analyse, of kan worden geüpgraded met extra functies voorbeeld segmentatie, drempel, ratio Imaging, enz. Verschillende open source beeldverwerkings platformen, verschillend geschikt voor verschillende soorten beeldvormende gegevens, zijn beschikbaar, waaronder ImageJ (https://imagej.net; https://imagej.nih.gov/ij/), Icy (http://icy.bioimageanalysis.org/), CMEIAS Bioimage Informatics (http://cme.msu.edu/cmeias/) en Wimasis (https://www.wimasis.com/en/).

De gepresenteerde voorbeeldgegevens zijn verwerkt en geanalyseerd met behulp van het ImageJ-platform. In het kort zijn specifieke gebieden in de cel, zoals de hyphal Tip Apex of septa, gemarkeerd met een omvangrijke gebiedsselectie gereedschappen en de intensiteit van alle ingesloten pixels wordt uitgelezen met de software die is geïmplementeerd "meetinstrument". De intensiteitsgegevens van besturingselementen en experimentele samples worden overgebracht naar een spreadsheetbestand, wiskundig geanalyseerd en voorbereid als grafiek. Nadere bijzonderheden kunnen worden gevonden in de geciteerde originele publicaties.

Voorbeeld van gegevens 1: FM 4-64 opname-assays
Schimmel monsters werden gekweekt als kolonies (stap 1,2) en gemonteerd door de omgekeerde agar-blok methode (stap 3,1). De uiteindelijke concentratie van FM 4-64 was 1,67 μM. Imaging-instellingen: HCX PL APO 63x/1.3 NA glycerol onderdompeling doel op een omgekeerde confocale laser scanning microscoop (Zie de tabel van de materialen); FM 4-64 excitatie bij 488 nm en emissie bij 600 – 700 nm; Eén frame elke minuut voor maximaal 150 min. FM 4-64 opname assays geïdentificeerde gebreken in de spatio-temporele organisatie van endocytose in gendeletie en gen overexpressie mutanten van de schimmel-specifieke Sur7-familie eiwit 2 (Sfp2) van T. atroviride9 (Figuur 5).

Voorbeeld gegevens 2: FM 4-64 co-kleuring van fluorescerende fusie proteïnen gericht op endocytische compartimenten
Schimmel monsters werden gekweekt als kolonies (stap 1,2) en gemonteerd door de omgekeerde agar-blok methode (stap 3,1). De uiteindelijke concentratie van FM 4-64 was 2 μM. Imaging-instellingen: CFI-plan APO VC 60x/1.2 NA XC water onderdompeling op een omgekeerde confocale laser scanning-microscoop (Zie de tabel met materialen); GFP excitatie bij 488 nm en emissie bij 500 – 530 nm, FM 4-64 excitatie bij 488 nm en emissie bij 600 – 700 nm, en helder-veld met uitgezonden licht detector, allemaal tegelijk; Eén frame elke 15 s voor maximaal 15 min. FM4-64 co-kleuring werd gebruikt om de subcellulaire verdeling van de twee versterkte groene fluorescerende eiwit (EGFP)-gelabelde transmembraan proteïnen te relateren Sfp2 en Gpr1 aan het endocytische traject in T. atroviride (Figuur 6, film 3, film 4).

Voorbeeld gegevens 3: FM 4-64 co-kleuring voor de identificatie van morfogenetische verschillen
Schimmel monsters werden gekweekt als kolonies (stap 1,2) en gemonteerd door de omgekeerde agar-blok methode (stap 3,1). De uiteindelijke concentratie van FM 4-64 was 2 μM. beeldvormings instellingen: plan Apochromat 63x/1.4 NA olie onderdompeling op een omgekeerde confocale laser scanning microscoop (Zie de tabel met materialen); GFP excitatie bij 488 nm en emissie bij 505-550 nm, FM 4-62 excitatie bij 488 nm en emissie bij 574 – 691 nm, en helder-veld met uitgezonden licht detector, allemaal tegelijk; Eén frame elke 8,5 s voor maximaal 15 min. FM4-64 co-kleuring toegestaan om de subcellulaire lokalisatie dynamiek van fluorescently gelabelde BUD-6 polarisome complex eiwit te relateren aan endosome handel-afhankelijke processen, zoals de vorming van septa en gepolariseerde hyphal Tip groei, en gekenmerkt verschillen in de subcellulaire organisatie en hyphal architectuur tussen wild type en Mutant stammen van N. crassa (Figuur 7, film 5).

Voorbeeld gegevens 4: celwand kleuring onthult morfogenetische verschillen
Schimmel monsters werden gekweekt als kolonies (stap 1,2) en gemonteerd door de omgekeerde agar-blok methode (stap 3,1). De eindconcentraties van 2 μM CFW, 20 μM SPF en 100 μM CR werden gebruikt. Imaging-instellingen: CFI-plan APO VC 60x/1.2 NA XC water immersie doelstelling op een omgekeerde confocale laser scanning-microscoop (Zie de tabel met materialen); CFW en SPF excitatie bij 405 nm en emissie bij 430 – 470 nm, CR excitatie bij 543 nm en emissie bij 580 – 620 nm. De verschillende interactie-eigenschappen van CFW, SPF en CR met celwand polymeren accentueren morfogenetische verschillen tussen de Δsfp2 Mutant en de wild type stam van T. atroviride9. Toenemende stress van de celwand toegebracht door verhoogde kleurstof concentraties treedt sneller en meer uitgesproken op in de mutant in vergelijking met het wild type. Bovendien maken dezelfde beelden het mogelijk om morfogenetische verschillen met betrekking tot de diameter van de hyphal en de septale afstand tussen beide stammen te kwantificeren (Figuur 8).

Voorbeeld gegevens 5: real-time monitoring van celwand biosynthese
Germlings werden gekweekt als vloeibare cultuur (stap 1,4) in 8-well Chambered micro-slides (stap 3,2). De uiteindelijke CFW-concentratie was 0,12 μM. Imaging-instellingen: CFI-plan APO VC 60x/1.2 NA XC water immersie doelstelling op een omgekeerde confocale laser scanning-microscoop; CFW excitatie bij 405 nm en emissie bij 420 – 470 nm; Eén frame elke 20 s voor maximaal 35 min. De zeer lage CFW-concentratie voorkomt verzadiging van de celwand met kleurstof moleculen en maakt kwantitatieve real-time monitoring van celwand biosynthese mogelijk. Hieruit blijkt dat de afzetting van nieuw celwand materiaal niet uniform is, maar zeer snel reageert op gelokaliseerde fysieke spanningen als gevolg van de relatieve verplaatsing van één cel op celcelbevestiging voorafgaand aan germling fusie in N. crassa (Figuur 9, film 6).

Figure 1
Figuur 1: biochemische en biopfysische eigenschappen van FM-kleurstoffen. A) chemische structuren van FM 1-43/SynaptoGreen C4 en FM 4-64/SynaptoRed C2. B) absorptie-en emissiespectra van beide FM-kleurstoffen, met de optimale beeldvormings instellingen voor aan het membraan gebonden kleurstoffen in filamenteuze schimmels: 445 – 495 Nm blauw licht zal de FM 1-43 wekken met 100 – 80% efficiëntie, terwijl 488 nm van een argon laser de kleurstof zal prikkelen met 91% efficiëntie. Door de blauwe verschuiving bij membraan binding (*) ligt het optimale detectiebereik van de FM 1-43-emissie tussen 520 – 590 nm. Evenzo zijn de optimale beeldvormings instellingen voor FM 4-64 bij schimmels 471 – 541 nm (100 – 80% efficiëntie) bij gebruik van een polychromatische excitatie lichtbron of 514 nm (99% efficiëntie) bij gebruik van een argon laser en 650 – 750 nm voor detectie van emissie licht. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: gelijktijdige co-Imaging van fm 1-43 en fm 4-64. Een equimolaire mengeling van beide kleurstoffen werd toegevoegd aan een vloeibare germling-cultuur van N. crassa die een uiteindelijke concentratie van 10 μM oplevert. Na 25 minuten na toevoeging van de kleurstof heeft FM 1-43 het plasma membraan bevlekt en al geaccumuleerd in interne membranen, met inbegrip van sterk bevlekt mitochondriën (m) maar grotendeels met uitzondering van vacuole membranen (v), en is meer dan acht keer sterker in vergelijking met FM 4-64 (gemiddelde fluorescentie intensiteiten 176 tot 21, respectievelijk), waarvan de lagere hydrofobiciteit/hogere hydrofiele graad vertraagt de internalisatie snelheid leidt tot een langdurige woning tijd op het plasma membraan. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: celwand stress-geïnduceerde afzetting van celwand polymeren bij de top Apex houdt vaak cel autolyse. Hyphae van T. atroviride uitdrukken cytoplasmatische GFP werden bevlekt met 10 μM solophenyl flavine 7gfe 500 (SPF) en onmiddellijk na de montage afbeelding gemaakt. Niet-beklemtoonde schimmeldraden (a), beklemtoonde schimmeldraden met licht verhoogde glucan/chitin depositie bij de Apex en progressie van autolyse (b), en sterk gestreste schimmeldraden met uitgesproken apicale glucan/chitin dop (sterretje) en terminale autolyse (c) duidelijk door het totale verlies van GFP fluorescentie en uitgebreide Vacu Schaalbalk = 10 μm. Zie film 1 voor voltijdse cursus volgorde. Merk op dat de drie schimmeldraden zich inderdaad naast elkaar bevonden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: biochemische en biopfysische eigenschappen van selectieve kleurstoffen voor celwanden. Chemische kenmerken die worden gegeven zijn die van de natriumzouten van elke kleurstof. Absorptie-en emissiespectra komen overeen met die in cellulaire omgevingen. Aangegeven monochromatische Laser excitatie lijnen (geschreven in kleur), polychromatische excitatie reeksen die van toepassing zijn op epifluorescentie microscopen, en emissie lichtdetectie bereiken zijn die aanbevolen voorbeeld vorming in filamenteuze schimmels. Twee Laser excitatie lijnen worden aangegeven wanneer beide even goed werken. (*) Het emissiespectrum van de cel aan de muur gebonden PFS is aanzienlijk meer verschoven dan eerder genoteerd33, echter, resulterend in zeer goede S/N-verhoudingen met lagere kleurstof concentraties dan eerder gebruikt. Het volledige spectrum van CR is momenteel niet beschikbaar, vandaar dat van Nijl rood (CAS-nr.: 7385-67-3) wordt weergegeven als de dichtstbijzijnde overeenkomst. Gedetailleerde informatie over de spectrale eigenschappen van CR kan elders worden gevonden42. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: invloed van Sfp2 op de endocytische opname van FM4-64. Drie opeenvolgende belangrijke stadia van de opname van de FM-kleurstof zijn gemakkelijk te onderscheiden in het wild type (WT). Stadium I: exclusieve kleuring van plasma membraan, fase II: eerste verschijning van FM-kleurstof in endocytische blaasjes, en fase III: exclusieve kleuring van endocytische blaasjes en endomembranen. Equivalente kleurings patronen worden op het vroegste tijdstip van hun verschijning weergegeven. In vergelijking met de T. atroviride wild type, endocytose is iets versneld in de sfp2 over-uitdrukken Mutant (OEsfp2), terwijl de kleurstof opname is dramatisch vertraagd in de sfp2 deletie Mutant (Δsfp2). Bijvoorbeeld, kleurstof opname in het plasma membraan treedt direct op in OEsfp2 maar neemt 2 min in het wild type; en volledige internalisatie van de FM-kleurstof uit het plasma membraan komt 10x sneller voor in OEsfp2 vergeleken met Δsfp2. Schaal staven = 5 μm. Figuur is overgenomen uit Atanasova et al.9 in overeenstemming met de Creative Commons-licentie (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Co-kleuring van EGFP-gelabelde membraan eiwitten met FM 4-64 vergemakkelijkt differentiatie van verschillende subcellulaire lokalisatie dynamiek in T. atrovirideA) het vier-transmembraan domein proteïne Sfp2 co-LOKALISEERT met FM4-64 gelabelde organellen, met inbegrip van het plasma membraan en septa, de Spitzenkörper (SPK; pijl) en vermoedelijke buisvormige vacuolen. B) de GPCR-achtige zeven-transmembraan proteïne Gpr1 co-LOKALISEERT met FM4-64 tot dezelfde organellen als Sfp2, met uitzondering van de SPK. schaal staven van 10 μm. Zie film 3 en film 4 voor voltijdse cursus reeksen. Het cijfer is gewijzigd van Atanasova et al.9 in overeenstemming met de Creative Commons-licentie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 7
Afbeelding 7: FM 4-64 kleuring onderscheidt ΔBud-6 Mutant van wild type, en LOKALISEERT Bud-6 bij de septale ring. A) FM 4-64 kleuring van de schimmeldraden van de N. crassa wild type (pijlen geven septa; pijlpunten geven de SPK aan). B) septa en SPK ontbreken in ∆Bud-6. Schaal staven, 50 μm. (c en D) Close-up van de hyphal Apex en subapex van wild type (c) en ∆Bud-6 (d). SPK (pijlpunt) onderscheidt in het wild type, maar niet ∆Bud-6. Vierkante haken geven de nucleaire uitsluitingszone aan die niet is vastgesteld in ∆Bud-6. Schaal staven = 5 μm. (E) Bud-6-GFP rekrutering naar de beginnende septation site voorafgaand aan de invaginatie van het plasma membraan (pijlpunten) en begeleidende septale vernauwing. Schaal staven = 5 μm. Zie film 5a en film 5b voor volledige tijdcursus reeksen. Figuur is gereproduceerd met wijzigingen van Lichius et al.16 in overeenstemming met de Creative Commons-licentie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 8
Figuur 8: verwijdering van sfp2 verandert het Afzettings patroon van celwand materiaal en beïnvloedt hyphal morfogenese van T. atroviride. A) de CFW-en SPF-kleuring onthult verhoogde celwand depositie in Δsfp2 (pijlen) in vergelijking met het wild type (WT). CR kleuring induceert uitgebreide Tip zwelling alleen in Δsfp2 (pijlpunten). Schaal staven = 10 μm.B) morfogenetische defecten in Δsfp2 omvatten significant gereduceerde Septale afstanden (Δsfp2 = 26,0 μm, wild type = 85 μm; n = 60; ANOVA PR < 2 − 16) en kleinere hyphal diameters (∆sfp2 = 5,6 μm, wild type = 12,6 μm; n = 100; ANOVA PR < 2 − 16). C) verhoogde kleurstof fluorescentie in de punt Apex in vergelijking met de subapex. Schaalbalk = 5 μm. (D) intensiteits codering 3D-oppervlakte-plot van (C). E) kwantificering van relatieve fluorescentie intensiteiten bij Δsfp2 en wild type (n = 55). De afbeelding is gereproduceerd uit Atanasova et al.9 in overeenstemming met de Creative Commons-licentie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 9
Figuur 9: real-time monitoring van de biosynthese van celwand. A) fusie van conidiale anastomose buis (cat) tussen germlings van N. crassa. Fysiek contact wordt zichtbaar door de reactie van germling Torque (21 – 28 min). Intensiteit kleurcodering CFW fluorescentie geeft gebieden met weinig (donkerblauw) en intense (gele) celwand depositie. De aanvankelijk Onbevlekte homing tip (pijlpunt), stort nieuwe celwand materiaal bij tipcontact en in het gebied ervaren van de grootste fysieke stress (Arrow). Schaalbalk = 5 μm. Zie film 6 voor voltijdse cursus volgorde. Afbeelding gereproduceerd van38 met toestemming. B) projectie van a) die vier cirkelvormige gebieden aangeeft waarin de fluorescentie intensiteiten werden gemeten. Schaalbalk = 5 μm. C) plot van de aangegeven gebieden met de snelle toename van de gelokaliseerde celwand biosynthese in reactie op fysieke stress (Cat 1, pijl). In de kiem buis (GT) en het Spore lichaam (Conidium) neemt de biosynthese van de celwand gestaag toe. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Movie 1
Movie 1: kleurstof-geïnduceerde celwand spanning. 10 μM SPF (cyaan) werden toegevoegd aan T. atroviride schimmeldraden uitdrukken cytoplasmatische GFP (magenta). Uitgebreide Tip kleuring treedt onmiddellijk op, gevolgd door de snelle Lysis van hyphal compartimenten binnen 2 min; duidelijk door de verdwijning van GFP fluorescentie. Klik hier om deze film te downloaden.

Movie 2
Film 2: vitale SPF-kleuring. 2 μM SPF (cyaan) maken het mogelijk om de punt groei van T. atroviride -schimmeldraden te volgen met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie zonder dat de stress artefacten van de celwand op de top van het uiteinde worden inducerende. Klik hier om deze film te downloaden.

Movie 3
Film 3: FM 4-64 co-kleuring van Sfp2-GFP. Co-kleuring van T. atroviride uitdrukken Sfp2-megfp (groen) met 1,67 μM FM 4-64 (rood) onthullen de overlappende en duidelijke lokalisatie van het membraan eiwit met het endocytische traject. Klik hier om deze film te downloaden.

Movie 4
Film 4: FM 4-64 co-kleuring van Gpr1-GFP. Co-kleuring van T. atroviride uitdrukken Gpr1-megfp (groen) met 1,67 μM FM 4-64 (rood) onthullen de overlappende en duidelijke lokalisatie van het membraan eiwit met het endocytische traject. Klik hier om deze film te downloaden.

Movie 5
Film 5: FM 4-64 co-kleuring van Bud-6-GFP. (5a) Co-kleuring van N. CRASSA uitdrukken Bud-6-GFP (groen) met 2 μM FM 4-64 (rood) toestaan tracking van Bud-6 dynamiek tijdens septum vorming ten opzichte van de bijbehorende plasma membraan invaginatie. (5b) bijgesneden en samenvoegen afbeelding van (5a). Klik hier om film 5a te downloaden
Klik hier om Movie 5b te downloaden.

Movie 6
Film 6: real-time monitoring van celwand biosynthese. N. crassa germlings met de uitdrukking MAK-1-GFP (groen) werden mede-gekleurd met 0,12 ΜM CFW (blauw) om gelokaliseerde celwand biogenese te onthullen tijdens door Cat gemedieerde germling fusie. Merk op dat er enige afloop door het CFW-signaal in de GFP-kanalen is, waarin wordt illustrerend dat SPF of CR betere keuzes zijn als sequentiële en gelijktijdige co-Imaging kleurstoffen voor GFP, respectievelijk. Klik hier om deze film te downloaden.

Tabel 1: eigenschappen van selectieve fluorescerende kleurstoffen voor membraan-en celwand. * = mg/mL waarden gecorrigeerd voor het gereduceerde gehalte aan zuiverheid/kleurstof tot resultaat equimolarity in alle oplossingen; n.i.a. = geen informatie beschikbaar. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussion

Dit artikel gaat verder met het baanbrekende werk dat het gebruik van verschillende fluorescerende kleurstoffen als vitale organel markers voor filamenteuze schimmels in de vroege jaren 20002,4,43, en pogingen om de photophysical en cel biologische eigenschappen van FM-kleurstoffen en geselecteerde celwand kleurstoffen in meer detail dan voorheen te bespreken. Vooral met betrekking tot ongewenste cellulaire effecten, zoals membraan verzadiging of celwand schade, die boven bepaalde kleurstof concentraties optreden. Wat eerder is beschouwd als niet-toxisch op cellulair niveau wordt nu beschouwd als giftig op moleculair niveau. Hoewel deze effecten zeer subtiel kunnen zijn en niet direct zichtbaar zijn door duidelijke veranderingen in organel-of Celgedrag, moet elke mogelijke interferentie van de kleurstof toepassing dan visualisatie worden geminimaliseerd voor het onderzoek naar de inheemse moleculaire functie. Gelukkig vergemakkelijkt een verbeterde gevoeligheid en kwantum efficiëntie van moderne detectoren, zoals silicium lawine fotodiode detectoren (si-Apd's)44 of de Airyscan area detector45, het gebruik van nog lagere kleurstof bedragen dan voorheen. Een ander belangrijk doel van het artikel is het illustreren van de co-Imaging eigenschappen van deze kleurstoffen met andere fluor Foren, vooral, die van GFP als de meest gebruikte fluorescerende eiwitten in de biologie. Dit moet helpen bij het ontwerp van Imaging experimenten die gericht zijn op het correleren van de subcellulaire lokalisatie dynamiek van fluorescerende fusie eiwitten aan die van de schimmel celwand, het plasma membraan of de Endo-en exocytose pathway enz.

Beeldvorming onder natuurlijke en stressvrije omstandigheden is essentieel voor het verwerven van betrouwbare gegevens. Enkele praktische overwegingen met betrekking tot kweekmedium en monstervoorbereiding zijn gericht op het bieden van een uitgangspunt voor het vinden van de optimale omstandigheden die een artefact vrije, lange tijd observatie van gezonde, onbeklemtoonde cellen mogelijk maken met de hoogst mogelijke S/N-ratio voor elk gegeven monster. Er is geen universele manier om betrouwbare en zinvolle beeldvormende resultaten te behalen. Het is inherent aan de benadering dat biologische variatie van het monster, subjectiviteit en verwachtingen van de microscopist, evenals beeld nabewerking een aanzienlijke invloed hebben op de gegevensverwerving en-interpretatie, respectievelijk. Vandaar, de praktische ervaring van de microscopist, haar/zijn intieme kennis over de celbiologie van de schimmel onderzochte, evenals bekwame monstervoorbereiding om condities te creëren als ' natuurlijke ' en ongestoord mogelijk in een Lab setting, zijn van essentieel belang voor het verwerven en evalueren van Imaging data die waarheidsgetrouw weerspiegelt de bestudeerde cellulaire verschijnselen. Als vuistregel geldt dat het optreden van ongewenste neveneffecten van fluorescerende kleurstoffen, variërend van de subtiele en dus niet duidelijk zichtbare activering van een plasma membraan of celwand, het opnieuw modelleren van stressrespons trajecten op de rechtlijnige cytotoxische inductie van celautolyse, alleen veilig kan worden voorkomen door lage kleurstof concentraties ≤ 2 μM toe te passen.

De toepassing van fluorescerende kleurstoffen is eenvoudig, maar hun specifieke kenmerken zijn slecht gekarakteriseerd. Een belangrijke sterkte van het gebruik van fluorescerende kleurstoffen is de preparatieve eenvoud van de experimentele protocollen. Teelt en bemonstering van de schimmel, toevoeging van de kleurstof (fen), en montage op de Microscoop fase zijn (met de praktijk) ongecompliceerd. Aanpassing van de basis beeldvormings instellingen, inclusief excitatie en emissie golflengten, belichtingstijden, tijdsverloop instellingen enz., volgen eenvoudige biofysische regels van de Microscoop en biologische regels van de gebruikte fluorescerende kleurstoffen in de cellen. Tabel 1 beoogt de identificatie van de meest geschikte combinatie van kleurstof of kleurstof voor experimenten te ondersteunen. Bovendien zijn fluorescerende kleurstoffen redelijk geprijsd, gemakkelijk beschikbaar met betrouwbare hoge kwaliteit en dus zorgen voor een zeer reproduceerbare toepassing.

Twee belangrijke beperkingen van het gebruik van selectieve fluorescerende kleurstoffen van membraan of celwand zijn de (vaak) beperkte kennis van hun precieze kleurings eigenschappen, die in de meeste gevallen niet-specifiek zijn op het organel-en moleculair niveau, en hun concentratieafhankelijke ongewenste neveneffecten. FM-kleurstoffen zijn specifiek voor lipide-bilayers die deelnemen aan Endo-en exocytose. Echter, precies welke subcellulaire organellen worden achtereenvolgens gelabeld onder de geteste omstandigheden is niet onmiddellijk duidelijk en vereist vergelijking van verschillende FM kleurstof varianten, en co-labeling met aanvullende organelle-specifieke markers. De voorkeur van FM 1-43 voor mitochondriale membranen, in vergelijking met FM 4-64, is een voorbeeld. Cell Wall selectieve kleurstoffen vertonen een variërende specificiteit voor de drie belangrijkste polymeren van de schimmel celwand. CFW wordt beschouwd als een niet-specifieke vlek voor β-glucanen en chitine, SPF wordt verondersteld het meest selectief te zijn voor β-1, 4-glucanen, en CR wordt verondersteld zeer selectief te zijn voor α-en β-chitinen. Informatie over de bindende specificiteit van PFS aan schimmel celwand polysacchariden is momenteel niet beschikbaar. Welke verhouding welke schimmel celwand polymeer het meest effectief wordt geëtiketteerd bij een bepaalde kleurstof concentratie bij de onderzochte schimmelsoorten is niet gemakkelijk te beantwoorden, en de toepassing van gedetailleerde metingen die in vitro of in vivo in andere organismen of andere schimmelsoorten zijn verworven, moeten zeer zorgvuldig worden overwogen. Helaas, deze informatie is schaars en sterk verspreid in de literatuur35,42,46. Meer recente records die zouden volgen op eerdere studies33 om nieuwe inzichten te bieden in de precieze kleurings eigenschappen van de aanbevolen kleurstoffen specifiek in schimmels zijn momenteel niet beschikbaar.

Imaging-besturingselementen zijn essentieel om kleurings patronen en mobiele reacties nauwkeurig te evalueren. Waarschijnlijk de meest uitdagende deel, echter, is om te weten de celbiologie van de schimmel zo goed dat de opgenomen veranderingen in de subcellulaire lokalisatie van membraan en celwand selectieve fluorescerende kleurstoffen, veranderingen in cellulaire architectuur of hyphal groeipatroon kan uitsluitend en vol vertrouwen worden gerelateerd aan de beoogde effecten van de experimentele behandeling. Hiervoor is het cruciaal om goede controles te hebben naast een nieuw Live-celbeeldvormings experiment. Deze omvatten het onbehandelde wild type als negatieve beeldvormings regeling om achtergrond autofluorescentie en detector ruis uit het verworven beeld uit te sluiten, en om een morfologische comparator te hebben bij het werken met mutanten. Bovendien is een positieve beeldvormings controle, bijvoorbeeld een stam die GFP of RFP in het cytoplasma of een ander bekend fluorescerende marker eiwit uitdrukt, essentieel om de excitatie lichtintensiteit in te stellen op het vereiste minimum en een Cell Vitality Control te hebben. Zodra deze controles zijn ingesteld, is het gebruik van fluorescerende kleurstoffen niet beperkt tot visualisatie taken alleen, maar hun concentratie-afhankelijke kleuring dynamiek, evenals concentratie-afhankelijke bijwerkingen kunnen analytisch worden uitgebuit; bijvoorbeeld, voor het kwantitatief controleren van de celwand biosynthese in real time of voor de identificatie van mutant-specifieke fenotypes in gevoeligheidstesten47.

Verbeterde toekomstige toepassingen zijn afhankelijk van een gedetailleerde functionele analyse van kleurstof kleurings eigenschappen. Een belangrijke voortdurende uitdaging is het verder verbeteren en automatiseren van kwantitatieve beeld analyses om de functionele evaluatie van de subcellulaire dynamiek van selectieve fluorescerende kleurstoffen van membraan-en celwand in filamenteuze schimmels te voorkomen. Hiervoor zijn uitgebreide, kwantitatieve co-lokalisatie studies van deze kleurstoffen met bekende organel-en celwand polymeer markers in combinatie met Mutante stammen met een tekort aan specifieke transporttrajecten of die geen specifieke structurele componenten hebben, eerst vereist. Verschillende endocytose markers voor vergelijkende analyses met FM kleurstoffen zijn beschikbaar48,49, en met betrekking tot de nog slecht gekenmerkte bindende specificiteiten van celwand kleurstoffen in schimmels, kan de toepassing van fluorescently-gelabelde glucan-specifieke antilichamen50 een mogelijkheid bieden om dit probleem aan te pakken.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben en niets te onthullen.

Acknowledgments

Dank gaat uit naar het Tiroler wetenschaps Fonds (TWF) voor het verstrekken van subsidie #256524 aan AL, aan het Vienna Science and Technology Fund (WWTF) voor het verstrekken van subsidie #LS13-086 aan SZ, en aan het publicatie Fonds van de Universiteit van Innsbruck voor de ondersteuning van publicatie van Open Access. De auteurs bedanken ook de faculteit zoölogie van de Universiteit van Innsbruck voor het leveren van de Leica TCS SP5 II confocale laser scanning microscoop.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BRAND cell counting chamber Merck BR718005 Thoma format
Calcofluor White M2R Merck/Sigma-Aldrich F3543 cell wall dye
CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI Nikon MRD07602 water immersion objective
CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI Nikon MRD07602 water immersion objective
Congo Red Merck/Sigma-Aldrich C6277 cell wall dye
Dimethyl sulfoxide VWR 8,36,73,230 organic solvent
Eclipse TE2000-E with C1 scanning unit Nikon custom configuration inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 2 and 4
Eclipse TE2000-U with Bio-Rad Radiance 2100 scannig unit Nikon custom configuration inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 5
FM 1-43 Merck/Sigma-Aldrich S6814 membrane dye
FM 4-64 Merck/Sigma-Aldrich S6689 membrane dye
Glass beads Rettberg 1340691030 3 mm glass beads
Glass cover slips Thermo Fisher Scientific BB02400600A113MNT0 24 x 60 # 1 glass cover slips
HCX PL APO 63x/1.3 NA Glyc Leica 15506353 glycerol immersion objective
LSM 510 Meta Zeiss custom configuration inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 3
M9 Minimal Medium Merck/Sigma-Aldrich M6030 generic fungal growth medium
Micro-slide 8-well ibidi 80826 ibiTreat #1.5 polymer coverslip
Miracloth Merck/Millipore 475855-1R polyester filtration material
Petri dish Sarstedt 8,21,472 92 x 16 mm culture dish w/o cams
Phytagel Merck/Sigma-Aldrich P8169 transparent gelling agent
Plan Apochromat 63x/1.4 NA Oil DIC Zeiss 440762-9904-000 oil immersion objective
Pontamine Fast Scarlet 4B Merck/Sigma-Aldrich 212490 cell wall dye
Potato Dextrose Agar (PDA) BD Difco 213400 fungal growth medium for T. atroviride
Potato Dextrose Broth (PDB) BD Difco 254920 fungal growth medium for T. atroviride
Reaction tube Sarstedt 72,706 1.5 mL SafeSeal tube
Scalpel B.Braun 5518016 Cutfix sterile scalpel #23
Screw cap tube Sarstedt 6,25,54,502 15 mL polypropylene tube
Solophenyl Flavine 7GFE 500 CIBA 1485385V6 cell wall dye
SynaptoGreen C4 Biotum 70020 membrane dye
SynaptoRed C2 Biotum 70021 membrane dye
Syringe membrane filter Thermo Fisher Scientific 723-9945 0.45 µm SFCA syringe filter
TCS SP5 II Leica custom configuration inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 1
Vogel's Minimal Medium (VMM) FGSC Fungal Genetics Stock Centre fungal growth medium for N. crassa

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Read, N. D., Fischer, S., Parton, R. M. Imaging Spitzenkörper, pH and calcium dynamics in growing fungal hyphae. Pesticide Science. 54, (2), 179-181 (1998).
  2. Hickey, P. C., Swift, S. R., Roca, M. G., Read, N. D. Live-cell imaging of filamentous fungi using vital fluorescent dyes and confocal microscopy. Microbial Imaging. Elsevier. 63-87 (2004).
  3. Jelínková, A., et al. Probing plant membranes with FM dyes: tracking, dragging or blocking. The Plant Journal. 61, (5), 883-892 (2010).
  4. Fischer-Parton, S., et al. Confocal microscopy of FM4-64 as a tool for analysing endocytosis and vesicle trafficking in living fungal hyphae. Journal of Microscopy. 198, (3), 246-259 (2000).
  5. Harris, S. D. Branching of fungal hyphae: regulation, mechanisms and comparison with other branching systems. Mycologia. 100, (6), 823-832 (2008).
  6. Roca, M. G., Arlt, J., Jeffree, C. E., Read, N. D. Cell biology of conidial anastomosis tubes in Neurospora crassa. Eukaryotic Cell. 4, (5), 911-919 (2005).
  7. Becker, Y., et al. The fungal cell-wall integrity MAPK cascade is crucial for hyphal network formation and maintenance of restrictive growth of Epichloë festucae in symbiosis with Lolium perenne. Molecular Plant-Microbe Interactions. 28, (1), 69-85 (2015).
  8. Justa-Schuch, D., Heilig, Y., Richthammer, C., Seiler, S. Septum formation is regulated by the RHO4-specific exchange factors BUD3 and RGF3 and by the landmark protein BUD4 in Neurospora crassa. Molecular Microbiology. 76, (1), 220-235 (2010).
  9. Atanasova, L., et al. The Gpr1-regulated Sur7 family protein Sfp2 is required for hyphal growth and cell wall stability in the mycoparasite Trichoderma atroviride. Scientific Reports. 8, (1), 12064 (2018).
  10. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 12, (2), 363-375 (1992).
  11. Wu, Y., Yeh, F. L., Mao, F., Chapman, E. R. Biophysical characterization of styryl dye-membrane interactions. Biophysical Journal. 97, (1), 101-109 (2009).
  12. Betz, W. J., Mao, F., B, S. C. Imaging exocytosis and endocytosis. Current Opinion in Neurobiology. 6, 365-371 (1996).
  13. Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle recycling by staining and destaining vesicles with FM dyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2012, (1), 77-83 (2012).
  14. Bolte, S., et al. FM-dyes as experimental probes for dissecting vesicle trafficking in living plant cells. Journal of Microscopy. 214, Pt 2 159-173 (2004).
  15. Riquelme, M., et al. Spitzenkorper localization and intracellular traffic of green fluorescent protein-labeled CHS-3 and CHS-6 chitin synthases in living hyphae of Neurospora crassa. Eukayotic Cell. 6, (10), 1853-1864 (2007).
  16. Lichius, A., Yáñez-Gutiérrez, M. E., Read, N. D., Castro-Longoria, E. Comparative live-cell imaging analyses of SPA-2, BUD-6 and BNI-1 in Neurospora crassa reveal novel features of the filamentous fungal polarisome. PloS one. 7, (1), 30372 (2012).
  17. Peñalva, M. A. Tracing the endocytic pathway of Aspergillus nidulans with FM4-64. Fungal Genetics and Biology. 42, (12), 963-975 (2005).
  18. Dijksterhuis, J., Molenaar, D. Vesicle trafficking via the Spitzenkörper during hyphal tip growth in Rhizoctonia solani. Antonie van Leeuwenhoek. 103, (4), 921-931 (2013).
  19. Hickey, P. C., Read, N. D. Imaging living cells of Aspergillus in vitro. Medical Mycology. 47, 110-119 (2009).
  20. Delgado-Álvarez, D. L., Bartnicki-García, S., Seiler, S., Mouriño-Pérez, R. R. Septum development in Neurospora crassa: the septal actomyosin tangle. PLoS One. 9, (5), 96744 (2014).
  21. Hageage, G. J., Harrington, B. J. Use of Calcofluor White in clinical mycology. Laboratory Medicine. 15, (2), 109-112 (1984).
  22. Monheit, J. E., Cowan, D. F., Moore, D. G. Rapid detection of fungi in tissues using Calcofluor White and fluorescence microscopy. Archives of Pathology and Laboratory. 108, (8), 616-618 (1984).
  23. Herth, W., Schnepf, E. The fluorochrome Calcofluor White binds oriented to structural polysaccharide fibrils. Protoplasma. 105, (1-2), 129-133 (1980).
  24. Elorza, M. V., Rico, H., Sentandreu, R. Calcofluor White alters the assembly of chitin fibrils in Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans cells. Journal of General Microbiology. 129, (5), 1577-1582 (1983).
  25. Lagorce, A., et al. Genome-wide analysis of the response to cell wall mutations in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Journal of Biological Chemistry. 278, (22), 20345-20357 (2003).
  26. Sanz, A. B., García, R., Rodríguez-Peña, J. M., Arroyo, J. The CWI Pathway: regulation of the transcriptional adaptive response to cell wall stress in yeast. Journal of Fungi. 4, (1), (2017).
  27. Slifkin, M., Cumbie, R. Congo Red as a fluorochrome for the rapid detection of fungi. Journal of Clinical Microbiology. 26, (5), 827-830 (1988).
  28. Michels, J., Büntzow, M. Assessment of Congo Red as a fluorescence marker for the exoskeleton of small crustaceans and the cuticle of polychaetes. Journal of Microscopy. 238, (2), 95-101 (2010).
  29. Pancaldi, S., Poli, F., Dall'Olio, G., Vannini, G. L. Morphological anomalies induced by Congo Red in Aspergillus niger. Archives of Microbiology. 137, (3), 185-187 (1984).
  30. Roncero, C., Durán, A. Effect of Calcofluor White and Congo Red on fungal cell wall morphogenesis: in vivo activation of chitin polymerization. Journal of Bacteriology. 163, (3), 1180-1185 (1985).
  31. Kopeck, M., Gabriel, M. The influence of Congo Red on the cell wall and (1,3)- β-d-glucan microfibril biogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Archives of Microbiology. 158, (2), 115-126 (1992).
  32. Heilmann, C. J., et al. Surface stress induces a conserved cell wall stress response in the pathogenic fungus Candida albicans. Eukayotic Cell. 12, (2), 254-264 (2013).
  33. Hoch, H. C., Galvani, C. D., Szarowski, D. H., Turner, J. N. Two new fluorescent dyes applicable for visualization of fungal cell walls. Mycologia. 97, (3), 580-588 (2005).
  34. Liesche, J., Ziomkiewicz, I., Schulz, A. Super-resolution imaging with Pontamine Fast Scarlet 4BS enables direct visualization of cellulose orientation and cell connection architecture in onion epidermis cells. BMC Plant Biology. 13, 226 (2013).
  35. Ursache, R., Andersen, T. G., Marhavý, P., Geldner, N. A protocol for combining fluorescent proteins with histological stains for diverse cell wall components. The Plant Journal. 93, (2), 399-412 (2018).
  36. Knight, N. L., Sutherland, M. W. A rapid differential staining technique for Fusarium pseudograminearum in cereal tissues during crown rot infections. Plant Pathology. 60, (6), 1140-1143 (2011).
  37. Fajardo-Somera, R. A., et al. Dissecting the function of the different chitin synthases in vegetative growth and sexual development in Neurospora crassa. Fungal Genetics and Biology. 75, 30-45 (2015).
  38. Lichius, A. Cell Fusion in Neurospora crassa. The University of Edinburgh. Edinburgh (UK). Doctor of Philosophy (Ph.D.) (2010).
  39. Chen, W., Li, W., Dong, X., Pei, J. A Review of Biological Image Analysis. Current Bioinformatisc. 13, (4), 337-343 (2018).
  40. Live cell imaging: A laboratory manual. Goldman, R. D., Swedlow, J., Spector, D. L. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2010).
  41. Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nature methods. 9, (7), 697-710 (2012).
  42. Zemanek, G., Jagusiak, A., Chłopaś, K., Piekarska, B., Stopa, B. Congo Red fluorescence upon binding to macromolecules - a possible explanation for the enhanced intensity. Bio-Algorithms and Med-Systems. 13, (2), 1187 (2017).
  43. Hickey, P. C., Jacobson, D. J., Read, N. D., Louise Glass, N. Live-cell imaging of vegetative hyphal fusion in Neurospora crassa. Fungal Genetics and Biology. 37, (1), 109-119 (2002).
  44. Hamamatsu Si APD - high sensitivity photodiodes having an internal gain mechanism: Avalanche photodiode selection guide 2019. Available from: https://www.hamamatsu.com/resources/pdf/ssd/si_apd_kapd0001e.pdf (2019).
  45. Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12, 1205 (2015).
  46. Thomas, J., Idris, N. A., Collings, D. A. Pontamine Fast Scarlet 4B bifluorescence and measurements of cellulose microfibril angles. Journal of Microscopy. 268, (1), 13-27 (2017).
  47. Ram, A. F. J., Klis, F. M. Identification of fungal cell wall mutants using susceptibility assays based on Calcofluor White and Congo Red. Nature Protocols. 1, (5), 2253-2256 (2006).
  48. Toshima, J. Y., et al. Spatial dynamics of receptor-mediated endocytic trafficking in budding yeast revealed by using fluorescent alpha-factor derivatives. Proceedings of the National Academy of Science of the USA. 103, (15), 5793-5798 (2006).
  49. Kilaru, S., Schuster, M., Latz, M., Guo, M., Steinberg, G. Fluorescent markers of the endocytic pathway in Zymoseptoria tritici. Fungal Genetics and Biology. 79, 150-157 (2015).
  50. Fu, C., Tanaka, A., Free, S. J. Neurospora crassa 1,3-α-glucan synthase, AGS-1, is required for cell wall biosynthesis during macroconidia development. Microbiology. 160, Pt 8 1618-1627 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics