Biology
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Anvendelse af membran og cellevæg selektive fluorescerende farvestoffer til levende celle billeder af filamentøse svampe
Chapters
Summary November 28th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vitale fluorescerende farvestoffer er essentielle værktøjer til analyser af levende celler i moderne svampe cellebiologi. Dette papir beskriver anvendelsen af etablerede og mindre kendte fluorescerende farvestoffer til sporing af plasma membran dynamik, endo-/exocytose og cellevæg morfogenesis i filamentøse svampe.
Transcript
Membran og celle væg selektive fluorescerende farvestoffer er vigtige værktøjer til analyse af organelle dynamik og levende svampeceller. Vores protokoller giver væsentlige teoretiske baggrund og praktiske retningslinjer for anvendelsen af et udvalg af disse farvestoffer som virkelig vitale pletter. Det centrale punkt for dette er at bruge meget lave farvestof koncentrationer, der ikke forårsager cellulære artefakter relateret til mætning eller farvestof toksicitet og samtidig give gode signal til støj forhold til høj kvalitet, langsigtet levende celle billeddannelse.
Med kolleger fra Institut for NuklearMedicin af det medicinske universitet, vi for nylig brugt disse farvning teknikker til at udvikle en ny tilgang til billed-guidet diagnose af aapergillosis. Evnen til at overvåge membran og cellevæg strukturer i realtid var afgørende for bestemmelse af optagelse dynamik af den eksperimentelle stofforbindelse. For at begynde denne procedure, først få en forberedt preculture.
Brug en steril skalpel til at skære en lille agar blok, der bærer ikke-sporulerende mycelium fra kolonien kanten af preculture. Placer agarblokken i midten af en frisk, solid medium plade for at vaccinere den eksperimentelle kultur. Inkuber forsøgskulturen i henhold til den udviklingsfase, der skal inkuberes.
Prøve forberedelse er noget delikat og optimering af billedet erhvervelse indstillinger er temmelig kompleks. Visuel demonstration af begge procedurer ledsaget af verbal forklaring i høj grad letter replicability. For at montere prøverne, holde en ren 24 af 60 millimeter glas dække slip klar og tilsæt 18 mikroliter af flydende minimal medium eller fysiologisk salt opløsning på midten.
Tilføj to mikroliter af den forberedte 20 mikromolar farvestof arbejdsopløsning til væsken i midten af dækslet slip og bland godt ved pipettering op og ned flere gange og samtidig undgå produktion af luftbobler. Ved hjælp af en ren skalpel, skåret en 15 med 15 millimeter prøve fra periferien af kolonien og placere den lodret ved siden af medium dråbe på dækslet slip. Brug skalpel til at støtte den øverste kant af blokken og en finger til at holde bagsiden af blokken på plads.
Sænk derefter langsomt den side, der bærer myceliet på væsken. Monter den forberedte prøve på mikroskopstadiet. Juster først de grundlæggende indstillinger for billederhvervelse for at registrere stående dynamik i individuelle hyfae som beskrevet i tekstprotokollen.
For endocytose optagelse analyser, konsultere figur et og tabel en af tekstprotokollen til at identificere de bedste excitation og emission indstillinger for FM 143 eller FM 464, der er tilgængelige på mikroskopisystemet og justere disse indstillinger i systemet i overensstemmelse hermed. Start billedoptagelse ved hjælp af de tidligere justerede indstillinger, og vurder resultaterne. Derefter optimere billedet erhvervelse indstillinger til den rumlige og tidsmæssige opløsning, der kræves for at fange det aspekt af plasma membran eller endocytose dynamik eksperimentet er fokuseret på.
For cellevægdynamik skal du se figur fire og tabel et af tekstprotokollen for at identificere de bedste excitations- og emissionsindstillinger for det anvendte cellevægfarvestof og justere indstillingerne på mikroskopisystemet i overensstemmelse hermed. Start billedoptagelse ved hjælp af de tidligere justerede indstillinger, og vurder resultaterne. Optimer derefter indstillingerne for billederhvervelse til den rumlige og tidsmæssige opløsning, der kræves for at fange det aspekt af cellevægsfedse, som eksperimentet fokuserer på.
Ud over blot at visualisere cellulære processer, levende celle billeddannelse tillader udvinding af kvantitative oplysninger fra de registrerede data. I et eksempel på FM 464 optagelse analyser, svampeprøver dyrkes som kolonier og monteret ved den omvendte agar blok metode. Analyserne identificerede defekter i spatio-tidsmæssig organisering af endocytose i gensletning og genoverpresende mutanter af svampespecifikt protein SFP 2 af trichoderma atrovirid.
Eksempler på FM 464 co-farvning af fluorescerende fusion proteiner målrettet til endocytiske rum er vist her. Denne co-farvning er ansat til at relatere den subcellulære fordeling af de to forbedrede grønne fluorescerende protein mærkede transmembrane proteiner, SFP 2 og GPR 1, til den endocytiske vej i trichoderma atroviride. Et eksempel på FM 464 co-farvning til identifikation af morfogenetiske forskelle viser, at denne co-farvning giver mulighed for yderligere relation af den subcellulære lokalisering dynamik flourescently mærket BUD-6 polarisme kompleks protein til at afslutte nogle menneskehandel-afhængige processer såsom dannelsen af septa og polariseret hyphal tip vækst.
Det kendetegner også forskelle i den subcellulære organisation og hyphal arkitektur mellem vilde type og mutant stammer af neurospora crassa. Repræsentativ cellevægfarvning viser, at de forskellige interaktionsegenskaber af kalcofluorhvid, solophenyl flavine og congorød med cellevægpolymerer fremhæver morfogenetiske forskelle mellem deltaet SFP 2 mutant og den vilde typestamme af trichoderma atrovirid. Forøgelse af cellevæggen stress påført af forhøjede farvestof koncentrationer sker hurtigere og er mere udtalt i mutant i forhold til den vilde type.
Desuden giver de samme billeder mulighed for kvantificering af morfogenetiske forskelle med hensyn til hyphaldiameter og septalafstand mellem begge stammer. Repræsentativ realtime overvågning af cellevæg biosyntese indikerer, at den meget lave calcofluor hvid koncentration forhindrer mætning af cellevæggen med farvestof molekyler og giver kvantitativ realtime overvågning af cellevæg biosyntese. Dette afslører, at aflejringen af nye cellevæg materiale ikke er ensartet, men reagerer meget hurtigt på lokaliserede fysiske belastninger som følge af den relative forskydning af en celle på celle-til-celle vedhæftet fil før dermalinfusion i neurospora crassa.
Mindre er mere. Brug så lidt farvestof som muligt for at forhindre interferens af lysstofrørmarkøren med cellulære processer. Efter denne procedure, flourescence opsving efter foto-blegning eksperimenter kunne udføres for at kvantificere transport og biogenesekinetik.
Den banebrydende indførelse af membran og cellevæg farvning i filamentøse svampe i begyndelsen af årtusindet gjorde bogstaveligt talt revolutionere den måde, vi ser på svampe. Calcofluor hvid kan forårsage øjenirritationer og er en klassificeret cancerigen. Congo rød er cancerigenic og teratogenic, så vær venlig at bære øjen-og hudbeskyttelse, når håndtering af disse farvestoffer.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
