Évaluation de la guérison aigue des plaies à l’aide de l’implantation d’éponge d’alcool polyvinyl subcutanée et des modèles excisionaux de blessure de peau de queue.

Immunology and Infection

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Summary

Ici, deux modèles murins de guérison de blessure sont décrits, l’un conçu pour évaluer les réponses cellulaires et de guérison de blessure de cytokine et l’autre pour quantifier le taux de fermeture de blessure. Ces méthodes peuvent être utilisées avec des modèles complexes de maladies telles que le diabète pour déterminer les mécanismes de divers aspects de la mauvaise cicatrisation des plaies.

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Crane, M. J., Henry Jr, W. L., Tran, H. L., Albina, J. E., Jamieson, A. M. Assessment of Acute Wound Healing using the Dorsal Subcutaneous Polyvinyl Alcohol Sponge Implantation and Excisional Tail Skin Wound Models.. J. Vis. Exp. (157), e60653, doi:10.3791/60653 (2020).

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Abstract

La cicatrisation des plaies est un processus complexe qui exige la progression ordonnée de l’inflammation, la formation des tissus de granulation, la fibrose et la résolution. Les modèles murins fournissent un aperçu mécaniste précieux de ces processus; cependant, aucun modèle unique ne traite entièrement de tous les aspects de la réponse de guérison des plaies. Au lieu de cela, il est idéal d’utiliser plusieurs modèles pour aborder les différents aspects de la cicatrisation des plaies. Ici, deux méthodes différentes qui traitent de divers aspects de la réponse de guérison de blessure sont décrites. Dans le premier modèle, les éponges d’alcool polyvinyles sont sous-cutanées implantées le long du dorsum de souris. Après la récupération de l’éponge, les cellules peuvent être isolées par perturbation mécanique, et les fluides peuvent être extraits par centrifugation, permettant ainsi une caractérisation détaillée des réponses cellulaires et cytokine dans l’environnement aigu de blessure. Une limitation de ce modèle est l’incapacité d’évaluer le taux de fermeture des plaies. Pour cela, un modèle d’excision de la peau de la queue est utilisé. Dans ce modèle, un morceau rectangulaire de 10 mm x 3 mm de la peau de la queue est excisé le long de la surface dorsale, près de la base de la queue. Ce modèle peut être facilement photographié pour l’analyse planimétrique pour déterminer les taux de guérison et peut être excisé pour l’analyse histologique. Les deux méthodes décrites peuvent être utilisées dans les souches de souris génétiquement altérées, ou en conjonction avec des modèles de conditions comorbides, telles que le diabète, le vieillissement, ou l’infection secondaire, afin d’élucider les mécanismes de cicatrisation des plaies.

Introduction

Il existe de nombreux systèmes de modèles murins disponibles pour examiner les processus de cicatrisation des plaies, chacun possédant des avantages spécifiques et des limitations1,2. Les méthodes suivantes présentent deux modèles de plaies murines, chacun abordant un aspect particulier de la réponse de guérison de blessure, et qui peuvent être employés pour identifier la cause et l’effet des perturbations dans la réponse aux dommages. Le processus de cicatrisation des plaies se produit dans des phases distinctes. La première phase est inflammatoire, caractérisée par l’afflux rapide de plaquettes, de neutrophiles et de monocytes/macrophages, ainsi que par la production de cytokines et de chimiocontres proinflammatoires. Après la résolution de l’inflammation, l’environnement passe à un état plus réparateur avec l’induction des cytokines profibrotiques et proangiogéniques et des facteurs de croissance. Le tissu de granulation est déposé et les néovessels se forment avec la migration des myofibroblastes, des fibroblastes, des cellules épithéliales, et des cellules endothéliales. Dans les phases finales, la matrice extracellulaire provisoire est remodelée, et la formation de cicatrices et la fermeture de blessure procède2,3,4,5,6,7,8.

Aucun modèle murin unique ne fournit un système pour étudier toutes les étapes de la cicatrisation desplaies 2. Ici, deux modèles chirurgicaux de blessure sont décrits : l’un élucide les réponses cellulaires aigues et de guérison de blessure de cytokine, et l’autre permet l’évaluation de la fermeture de blessure aussi bien que des analyses histologiques. Ces deux méthodes peuvent être utilisées de façon complémentaire pour évaluer les effets d’une perturbation ou d’une comorbidité sur différents aspects de la réponse de guérison des plaies. L’implantation sous-cutanée dorsale des éponges d’alcool polyvinyle (PVA) est un système qui a été utilisé dans les modèles de rongeurs pendant des décennies pour élucider de nombreux aspects des réponses cellulaires et de tissu de granulation9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 ,21,22,23,24. Cette approche permet la récupération de liquides de plaie riches en cytokine et d’infiltrations cellulaires. Dans ce modèle, 1 cm x 1 cm x 0,5 cm de morceaux d’éponge PVA sont placés dans des poches sous-cutanées par une incision de 2 cm faite à la ligne médiane dorsale postérieure. L’incision est fermée avec des clips chirurgicaux, et les éponges peuvent être récupérées à des points plus tard pour l’isolement cellulaire et fluide. Le milieu cellulaire et cytokine des éponges isolées reflète les étapes normales de la guérison aigue de blessure jusqu’à environ 14 jours postimplantation. À des points de temps ultérieurs le modèle est plus avantageux pour étudier la formation de tissu de granulation et la réponse du corps étranger1. Avec ce système, il est possible d’isoler les cellules de6, ce qui offre un avantage distinct pour les tests phénotypiques et fonctionnels et l’isolement de l’ARN, sur l’isolement des cellules d’autres méthodes à base de biopsie1,22,23,25,26.

Le taux de fermeture de la plaie est déterminé à l’aide du modèle d’excision de la peau de la queue. Dans ce modèle, comme initialement décrit par Falanga et al. et rapporté par d’autres27,28,29,30, une section de 1 cm x 0,3 cm pleine épaisseur de la peau de queue est enlevée près de la base de la queue. La zone de la plaie est facilement visualisée et peut être mesurée au fil du temps. Alternativement, le tissu de queue peut être isolé pour l’analyse histologique. Cette approche peut être utilisée comme alternative ou en conjonction avec la méthode bien établie de biopsie de poinçon dorsale. Les principales distinctions entre ces deux modèles sont le taux de fermeture des plaies, la présence ou l’absence de fourrure, et la structure de la peau2,31,32. Les plaies de peau de queue offrent un délai plus long pour évaluer la fermeture des plaies, car il faut environ 21 jours pour que la fermeture complète se produise. Ceci s’oppose aux biopsies non attelles de poinçon dorsale, qui guérissent beaucoup plus rapidement (7-10 jours), principalement par contraction due à l’action du carnosus panniculus. Les biopsies de poinçon dorsale attelle guérissent plus lentement et diminuent les effets de la guérison contractile, mais comptent sur la présence d’un corps étranger pour restreindre les mécanismescontractuels-basés 1,2,27,30,31,33.

Les modèles décrits de blessure sont informatifs pour comprendre les processus normaux de guérison de blessure en l’absence de perturbation. Tandis que la guérison de la peau de rongeur diffère de manière très significative de la peau humaine, y compris la structure lâche, la dépendance à la guérison contractile, et d’autres différences anatomiques, le système murin offre certains avantages pour des études mécanistes et de criblage. La disponibilité de souches consanguines et de mutants génétiques, la tractabilité génétique et le coût inférieur sont au premier plan. La perspicacité mécaniste acquise à partir d’études murines peut être traduite en modèles animaux complexes qui imitent plus étroitement la guérison de la peau humaine, comme le système porcin2,31.

En plus d’examiner les réponses de guérison de blessure dans l’état régulier, ces modèles peuvent être combinés avec des conditions comorbides pour comprendre la base des défauts de guérison de blessure au niveau cellulaire, de cytokine, et brut de tissu. C’est dans ce cadre particulier que les deux modèles peuvent être utilisés de concert pour évaluer les effets d’une affection comorbide particulière, comme la pneumonie postopératoire, à la fois sur la réponse de guérison des plaies cellulaires aigues et sur le taux de fermeture desplaies 30.

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Protocol

Toutes les études sur les animaux décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université Brown et menées conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux des National Institutes of Health.  REMARQUE : dans la vidéo, le drapé chirurgical a été omis à des fins de démonstration.

1. Implantation sous-cutanée des éponges PVA

  1. Utilisez des ciseaux pour couper des feuilles d’éponge PVA en morceaux de 8 mm x 8 mm x 4 mm. Réhydratez les morceaux d’éponge PVA en les submergeant en sterile 1x PBS dans un bécher.
  2. Autoclavez les éponges dans 1x PBS pour stériliser, et refroidir complètement. Rangez les éponges autoclavées dans le PBS stérile 1x à 4 oC.
  3. Avant d’effectuer l’implantation chirurgicale, aco-pas le nombre nécessaire d’éponges dans un plat de culture stérile dans des conditions stériles dans un capot de flux laminar. Conservez les éponges supplémentaires dans le PBS stérile 1x à 4 oC pour une utilisation future. Assurez-vous que les éponges gonflent à 1 cm x 1 cm x 0,5 cm après la réhydratation. Une image d’éponges PVA déshydratées est montrée dans la figure 1A.
    REMARQUE : Pour maintenir la stérilité du site chirurgical, la procédure d’implantation d’éponge de PVA exige qu’une personne manipule la souris et prépare le site chirurgical, et une deuxième personne pour effectuer l’implantation.
  4. Anesthésiez une souris mâle de 8 à 12 semaines C57BL/6J par injection intraperitonéale de 80 mg/kg de kétamine. Administrer 40 mg/kg de xylazine intraperitoneally pour l’analgésie.  Confirmez la profondeur de l’anesthésie par la perte d’un réflexe de pédale. Préparer le site chirurgical en enlevant les cheveux le long du dorsum avec des tondeuses. À l’aide de gaze stérile, appliquer la solution povidone-iode à la zone de rasage 2x, suivie de 70% d’éthanol.
  5. Placez la souris sur des rideaux chirurgicaux stériles. Placez un tampon chauffé sous les rideaux chirurgicaux pour maintenir la température de base de la souris.
  6. Portez des gants chirurgicaux stériles pour effectuer la chirurgie. Éloignez la peau dorsale du tissu sous-jacent avec des forceps, et à l’aide de ciseaux chirurgicaux stériles, faites une incision de 2 cm le long de la ligne médiane dorsale d’environ 2 cm antérieur à la base de la queue. Tout en maintenant l’incision ouverte avec des forceps stériles, utilisez des ciseaux chirurgicaux stériles à pointe émoussée pour former une poche sous-cutanée le long du dorsum dans l’une des positions indiquées dans la figure 1B.
  7. Continuez à utiliser des forceps pour soulever la peau loin du tissu sous-jacent. À l’aide de ciseaux chirurgicaux stériles, presser délicatement une éponge PVA dans le plat de culture pour enlever l’excès de PBS. Ramassez l’éponge PVA par un coin à l’aide de ciseaux chirurgicaux stériles et, en menant avec le coin tenu par les ciseaux, placez l’éponge dans la poche sous-cutanée formée à l’étape 1.4.
  8. Répétez ce processus 5x, en plaçant un total de six éponges dans des poches sous-cutanées comme le montre la figure 1B.
  9. Pincer la peau dorsale incisée avec des forceps stériles et fermer l’incision avec deux pincements en acier inoxydable.
  10. Utilisez un nouvel ensemble d’instruments chirurgicaux stériles pour chaque souris. Vous pouvez également utiliser un stérilisateur perlé pour stériliser les instruments entre souris.

2. Isolement des fluides des éponges PVA

  1. Pour évaluer le milieu aigu de cytokine de blessure, isolez les éponges entre 1-14 jours postimplantation.
  2. Préparer un tube de collecte de fluides en niant le baril d’une seringue de 5 ml dans un tube de culture de 16 ml.
  3. Euthanasiez une souris avec des éponges PVA implantées par asphyxie de CO2 suivie d’une dislocation cervicale.
  4. Retirez les agrafes chirurgicales et ouvrez l’incision avec des forceps dentés. Utilisez des ciseaux pour prolonger l’incision le long de la ligne médiane dorsale.
  5. À l’aide de forceps, extraire une éponge de sa poche sous-cutanée et la transférer au canon de seringue préparé, en prenant soin de minimiser la pression sur l’éponge. Dissociez tout tissu conjonctif qui reste adhéré à la surface de l’éponge. Utilisez des ciseaux pour disséquer l’éponge du tissu environnant si nécessaire. Répétez le processus d’enlèvement de l’éponge avec les éponges restantes. Placer le tube contenant les éponges sur la glace.
  6. Pour isoler le liquide de la plaie, centrifugez le tube de culture contenant la seringue de 5 ml avec les éponges à 700 x g pendant 10 min.
  7. Après la centrifugation, jetez la seringue et les éponges. Le liquide de la plaie aura recueilli dans le tube de culture de 16 ml. Une image représentative du liquide recueilli à partir d’une blessure du jour 7 est montrée dans la figure 1D. Transférer le liquide de la plaie dans un tube propre pour un stockage à long terme à -80 oC.

3. Isolement des cellules des éponges PVA

  1. Pour évaluer le milieu cellulaire de guérison aigue de blessure, recueillez des éponges entre 1-14 jours d’implantation post-éponge. Les éponges obtenues à partir d’une blessure 7 jours après l’implantation sont indiquées dans la figure 1E.
  2. Préparer le milieu de collecte contenant 1x HBSS (calcium/-magnésium/-phénol rouge) complété par 1% de FBS, 1% HEPES et 1% de pénicilline-streptomycine.
  3. Aliquot 5 mL de collecte HBSS milieu dans un tube conique de 15 mL.
  4. Extraire les éponges PVA des souris euthanasiées telles que décrites dans 2.2-2.4. Placer les éponges dans le tube conique contenant 5 ml de milieu de collecte HBSS.
  5. Transférer les éponges et le milieu de la collection HBSS dans un sac de mélangeur de 80 ml en versant. Accrochez le sac de mélangeur de l’écoutille du mélangeur à pagaie, positionné de sorte que les pagaies frappent les éponges et les supports. Ajuster les réglages du mélangeur à pagaie pour fonctionner à hauteur de 60 s. Appuyez sur le démarrage.
  6. Transférer le support du sac de mélangeur vers le tube conique de 15 ml avec une pipette, en laissant les éponges dans le sac. Pressez les éponges pour libérer complètement les médias. Ajuster les réglages du mélangeur à pagaie pour fonctionner pendant 30 s en hauteur. Ajouter 5 ml de support au sac de mélangeur et répéter le processus d’estomac 2x pour un total de trois lavages d’éponge.
  7. Centrifuge le tube conique à 250 x g pendant 5 min. Une boulette rouge de cellules et de globules rouges sera visible au fond du tube conique après centrifugation.
  8. Jetez le supernatant et effectuez une lyse des globules rouges : ajouter 900 L de dH2O à la pastille et à la pipette cellulaire pour mélanger. Neutraliser avec 100 L de 10x PBS. Ajouter 4 ml de PBS 1x au tube pour neutraliser complètement la lyse, puis la centrifugeuse à 250 x g pendant 5 min.
    REMARQUE : L’étape de lyse doit être brève ; laisser l’eau en contact avec les cellules pour plus de 3-5 s pourrait entraîner une lyse des globules non rouges.
  9. Après centrifugation, une boulette de cellules blanches contenant des cellules de plaie dépourvues de globules rouges sera présente au fond du tube conique. Jeter le supernatant et réutiliser la pastille cellulaire dans le milieu désiré pour les analyses en aval.

4. Analyse facultative de cytométrie de débit des leucocytes innés isolés des plaies d’éponge de PVA

  1. Résuspendez 0,5 à 1 x10 6 cellules de plaie dans 25 'L d’une solution de blocage d’anticorps contenant 10 'g/mL anti-CD16/CD32 FcR-II/III anticorps dilués dans 1x PBS - 1% BSA.
    REMARQUE : Tous les anticorps doivent être titrés pour déterminer les concentrations optimales pour l’analyse de cytométrie d’écoulement.
  2. Incuber les cellules avec anticorps bloquant pendant 10 min sur la glace.
  3. Faire un mélange de maître 2x d’anticorps contenant 2,5 mg/mL de PerCP-eFluor710-Ly6G, 5 mg/mL de FITC-Ly6C, APC-Fire750-CD45.2, APC-R700-Siglec-F, et 10 mg/mL d’eFluor660-F4-80 dilués dans 1x PBS - 1% BSA. Ajoutez directement 25 L du cocktail d’anticorps aux cellules incubant dans le blocage des anticorps.
  4. Incuber les cellules pendant 20 min sur la glace, à l’abri de la lumière.
  5. Laver les cellules 2x avec 1x PBS.
  6. Faire un mélange principal de amine-réactive réparable viabilité dye-eFluor506 dilué 1:1,000 dans 1x PBS. Réutilisez la pastille de cellules dans 50 L de la solution de teinture de viabilité.
    REMARQUE : Le sérum doit être exclu de l’étape de viabilité fixable, car il empêchera la liaison du colorant aux protéines endogènes. Incuber les cellules pendant 20 min sur la glace, à l’abri de la lumière.
  7. Laver les cellules 2x avec 1x PBS. Réutilisez la pastille de cellules dans 50 L de 1% de paraformaldéhyde.
  8. Incuber les cellules avec 1% de paraformaldéhyde pendant 15 minutes sur la glace, à l’abri de la lumière.
  9. Laver les cellules 1x avec 1x PBS et ressinpendre la granule en 1x PBS pour l’analyse cytométrique de débit.

5. Excision de peau de queue

  1. Anesthésiez une souris mâle de 8 à 12 semaines C57BL/6J par injection intraperitoneal de 80 mg/kg de kétamine. Administrer 40 mg/kg de xylazine intraperitoneally pour l’analgésie. Confirmez la profondeur de l’anesthésie par la perte d’un réflexe de pédale.
  2. Préparer le site chirurgical sur la queue de la souris anesthésié en utilisant de la gaze stérile pour appliquer la solution povidone-iode 2x, suivie d’une application d’éthanol à 70%.
  3. Définir une section de 10 mm x 3 mm sur la surface dorsale de la queue, à 10 mm de la base de la queue(figure 1C) à l’aide d’un marqueur permanent pour tracer à partir d’un modèle préfabriqué.
  4. Placez la souris anesthésiée sur des rideaux chirurgicaux stériles.
  5. Portez des gants chirurgicaux stériles pour effectuer les interventions chirurgicales. Avec une lame stérile de scalpel, faites une incision pleine épaisseur le long des bords droit, inférieur, et gauche de la zone de blessure.
  6. À l’aide de forceps stériles, pelez la peau excisée de la queue et utilisez des ciseaux chirurgicaux stériles pour couper le bord supérieur de la zone de la plaie.
  7. Appliquer une pression avec de la gaze stérile pour arrêter de saigner.
  8. Appliquer un film de barrière de pulvérisation sur le lit de la plaie.
  9. Photographiez les blessures à distance fixe à intervalles réguliers. Analyser les photographies par analyse planimétrique pour déterminer les mesures de la zone de la plaie. Vous pouvez également utiliser des étriers pour obtenir des mesures de longueur et de largeur des plaies.

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Representative Results

Réponse inflammatoire systémique après l’implantation d’éponge de PVA
La chirurgie d’implantation d’éponge de PVA a généré une réponse inflammatoire systémique, comme démontré par l’induction de l’IL-6 dans le plasma 1 jour après la blessure(figure 2A). D’autres cytokines proinflammatoires, y compris TNF-MD et IL-1, ainsi qu’un tableau de chimiothèques, y compris CCL2 et CXCL1 ont été induits systématiquement dans les 7 premiers jours après l’implantation éponge PVA, et ont été décrits ailleurs26,30.

Isolement des cellules et des fluides des plaies éponge pVA
Le principal avantage du modèle de blessure d’éponge de PVA est la capacité de récupérer suffisamment de cellules pour des analyses phénotypiques et fonctionnelles de la réponse de guérison cellulaire aigue de blessure. Le nombre de cellules qui peuvent être récupérées à partir de plaies éponge PVA augmente au fil du temps, d’environ 2 x 106 cellules par six éponges le jour de la plaie 1 x 106 à 8 x 106 cellules le jour de la plaie 7(figure 2B). Le nombre de cellules continue d’augmenter au-delà du jour 7. Il n’est pas recommandé de poursuivre ce modèle au-delà de 14 jours parce que les éponges deviennent pleinement encapsulées par le collagène et le système passe de la modélisation d’une réponse de guérison des plaies aigues à la modélisation d’un granulome du corps étranger1,22,23,25,26. Les neutrophiles, les monocytes et les macrophages étaient les principaux infiltrés cellulaires dans les plaies d’éponge de PVA. Les neutrophiles ont prédominé le milieu cellulaire de la plaie un jour après la blessure, tel qu’évalué par analyse cytométrique de débit(figure 2C). Les monocytes et les macrophages dérivés du monocyte se sont accumulés dans les 3 jours d’implantation post-éponge, et les trois populations cellulaires ont augmenté en nombre au fil du temps(figure 2C). Une stratégie représentative de gating de cytométrie de flux pour identifier les populations de neutrophiles, de monocytes et de macrophage est indiquée dans la figure 2D. Après avoir exclu les doublets cellulaires utilisant des paramètres FSC-H et SSC-H(figure 2D, i et ii), les cellules non viables ont été exclues à l’aide d’un colorant réparable amine-réactif (indiqué ici) ou d’un colorant d’acide nucléique (p. ex., sytox ou propidium iodide)(figure 2D, iii). Les débris cellulaires résiduels non enlevés par les étapes de gating antérieures ont ensuite été exclus à l’aide des paramètres FSC-A et SSC-A(figure 2D, iv). Les cellules hématopoïétiques comprenaient la majorité des cellules de plaie d’éponge de PVA et ont été identifiées par l’expression CD45 (figure 2D, v). Les neutrophiles ont été identifiés comme Ly6G-Siglec-F ( Figure2D, vi). Lescellules siglec-F étaient principalement des éosinophiles(figure 2D, vii). Gating sur Ly6G-Siglec-F- cellules, monocytes/macrophages ont été identifiés comme F4/80cellules (figure 2D, viii). Les cellules F4/80pourraient être fractionnées par l’expression Ly6C pour distinguer les monocytes inflammatoires Ly6Csalut (figure 2D, ix) et les macrophagesdérivés de monocytes bas de Ly6C(figure 2D, x)26.

La capacité de mesurer les cytokines et d’autres facteurs solubles de blessure est un autre avantage au modèle de blessure d’éponge de PVA. Il est possible d’extraire jusqu’à 100 l de liquide par éponge. Les fluides extraits conviennent à une variété d’essais en aval. La détection des cytokines et des chimiothérapeuines dans les fluides de blessure tôt et tardif par ELISA ou immunoassays multiplex à base de perles ont été rapportés ailleurs26,30. Il est possible d’obtenir à la fois des cellules et des fluides à partir de la même blessure. Pour ce faire, il est recommandé d’isoler trois éponges d’un côté de la ligne médiane dorsale pour l’isolement cellulaire et 3 éponges de l’autre côté de la ligne médiane dorsale pour l’extraction du liquide.

Évaluation de la fermeture de la plaie à l’aide du modèle d’excision de la peau de la queue
Le modèle excisional de peau de queue fournit une alternative à la méthode dorsale de la biopsie de poinçon de peau pour étudier la fermeture lente de blessure dans la peau ferme manquant de fourrure dense. Des exemples d’images de blessures de peau de queue à 1, 7 et 15 jours après l’excision sont montrées dans la figure 3A. La fermeture des plaies pourrait être quantifiée en mesurant la zone du lit de la plaie au fil du temps. Le jour 7 et le jour 15 des zones de lit de blessure étaient approximativement 70% et 35%, respectivement, de la zone de blessure de jour 1(figure 3B). La fermeture complète des plaies a nécessité environ 28 jours. La blessure de peau de queue pourrait également être observée dans la section transversale par l’analyse histologique. La figure 3C et la figure 3D montrent des images représentatives des sections transversales tachées de trichrome de H et E et de Masson, respectivement. Les marges latérales de la peau excisée sont indiquées par des pointes de flèche sur la surface dorsale de la queue.

Figure 1
Figure 1 : Schéma des modèles murins de guérison des plaies. (A) Côté (gauche) et vue supérieure (droite) des éponges PVA déshydratées mesurant 8 mm x 8 mm x 0,4 mm. (B) Illustration d’une souris démontrant le placement de l’incision dorsale de mi-ligne (ligne rouge centrale) et de six éponges PVA de 1 cm x 1 cm x 0,5 cm dans des poches sous-cutanées. (C) Schéma démontrant la taille et le placement d’une plaie excisionale (10 mm x rectangle rouge de 3 mm) sur la surface dorsale de la queue. (D) Liquide de blessure isolé de trois éponges qui ont été récupérées de l’espace sous-cutané 7 jours après l’implantation. (E) L’apparition d’éponges récupérées de la plaie 7 jours après l’implantation. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : La réponse systémique et cellulaire à l’implantation d’éponge de PVA. (A) Un cours de temps des niveaux d’IL-6 dans le plasma démontre que l’implantation d’éponge de PVA a induit une réponse inflammatoire systémique. La concentration d’IL-6 a été mesurée à l’aide d’une immunoassay à base de perles multiplexe. (B) Le nombre de cellules isolées de la plaie d’éponges PVA a augmenté au fil du temps. (C) Un cours de temps démontre l’accumulation de neutrophiles, de monocytes et de macrophages dérivés de monocytes dans les plaies d’éponge PVA au fil du temps. (D) Une stratégie représentative de gating des cellules isolées des plaies d’éponge de PVA démontre comment identifier des sous-ensembles de leucocyte par analyse cytométrique de flux. Les portes sont définies comme suit: (i et ii) doublet exclusion, (iii) exclusion de cellules mortes à l’aide d’un colorant réparable amine-réactif, (iv) exclusion des débris par FSC-A et SSC-A, (v) CD45- cellules hématopoïétiques, (vi) Ly6G- neutrophiles, (vii) Siglec-F- eosinophiles, (viii) Ly6G-Siglec-F- F4/80- monocytes/macrophages, (ix) F4/80+ Ly6Csalut monocytes, et (x) F4/80-Ly6C macrophagesbas. Des portes ont été placées selon les contrôles de fluorescence-moins un (FMO). Les données présentées dans A-C sont la moyenne ' SEM, n '6-10 souris par groupe dans (A), n ' 8-9 souris dans (B), et n ' 6-8 souris dans (C). Toutes les données sont combinées à partir d’expériences indépendantes de 2 à 3. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Évaluation de la cicatrisation excisionale de la peau de la queue. (A) Photographies représentatives des plaies excisionales de peau de queue prises 1, 7, et 15 jours après la blessure. (B) Le taux de fermeture des plaies excisionales de peau de queue. Des blessures ont été photographiées tous les deux jours. Un logiciel de traitement d’image a été utilisé pour retracer les marges du lit de la plaie et calculer la zone de la plaie aux points de temps indiqués. La zone de la plaie est présentée comme une fraction de la zone de la plaie mesurée le jour 1. Images représentatives des sections transversales de queue qui étaient encastrées par la paraffine, sectionnées et tachées avec (C) H et E ou (D) Trichrome de Masson. La blessure était située sur la surface dorsale de la section transversale de la queue; les marges latérales de blessure sont indiquées par des pointes de flèche. Les données indiquées dans (B) sont la moyenne - SEM, n 8 souris par groupe. Les données sont combinées à partir de deux expériences indépendantes. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Cet article décrit deux modèles de plaies murines tractables qui permettent l’évaluation de la réponse aigue de guérison de blessure. La première méthode implique l’implantation chirurgicale des éponges de PVA dans l’espace sous-cutané dorsal. Cette approche offre un avantage distinct sur les modèles de plaies à base de biopsie pour étudier la réponse de guérison cellulaire de blessure due au grand nombre de cellules et à la quantité de fluides de blessure obtenus des éponges isolées. Pour l’exécution réussie de cette procédure, le maintien d’un champ chirurgical stérile en nettoyant soigneusement la peau autour de l’incision est impératif, car la translocation des bactéries dans la plaie modifiera considérablement le cours de la guérison. En utilisant la méthode d’isolement cellulaire décrite ici, il est possible d’isoler au moins 1-10 x 106 cellules des éponges PVA, selon le temps de l’extraction de l’éponge. La majorité des cellules isolées des plaies d’éponge PVA sont viables(figure 2D). Cependant, parce qu’il est possible pour les cellules mortes de constituer jusqu’à 20% des cellules de plaie isolées après une perturbation mécanique, il est fortement recommandé d’utiliser une tache de viabilité lors de la procédure avec des analyses basées sur la cytométrie du débit. Les cellules isolées des plaies d’éponge de PVA sont principalement d’origine hématopoïétique déterminée par la positivité DE CD45(figure 2D). L’accumulation rapide de neutrophiles suivis de monocytes et de macrophages est compatible avec les stades aigus de réparation des plaies3,4,34,35,36,37,38. Les cellules isolées conviennent aux analyses en aval, y compris l’immunophénotypage, le tri cellulaire, la culture, l’extraction de l’ARN et une variété d’essais fonctionnels.

Le modèle de plaie éponge PVA permet également l’isolement des fluides, ce qui est idéal pour évaluer la cytokine et les réponses des facteurs de croissance dans l’environnement aigu des plaies. Les fluides éponges PVA conviennent aux tests effectués par ELISA, l’immunoassay multiplexe à base de perles et la quantitation des protéines, entre autres. Des études antérieures ont démontré par la mesure de cytokine et de facteur de croissance que l’environnement tôt de blessure est inflammatoire dans la nature, avec l’induction rapide de l’IL-6, TNF--, et IL-1 ' des jours 1-3. L’environnement de blessure passe alors à un état réparateur avec l’induction ultérieure des facteurs de croissance pro-angiogéniques et pro-fibrotiques, y compris VEGF et TGF-2222,23,25,26,30.

Tandis que le modèle d’implantation d’éponge de PVA est avantageux pour étudier des réponses cellulaires et cytokine de blessure aigues, une de ses limites est l’incapacité de mesurer le taux ou le degré de guérison. La mesure de cet aspect de la cicatrisation des plaies peut être nécessaire lors de l’évaluation des effets d’une condition comorbide sur divers aspects de la réponse de guérison de blessure30. Pour cette mesure, les méthodes basées sur la biopsie sont préférées. Ici, le modèle d’excision de peau de queue est présenté. Dans ce modèle, une section pleine épaisseur de la peau de la queue est excisée à partir de la surface dorsale de la queue. Encore une fois, le maintien d’un champ chirurgical stérile est important pour éviter d’inoculer le lit de la plaie. L’utilisation d’un film de barrière de pulvérisation ou d’un autre revêtement de plaie est également recommandée pour éviter l’infection ultérieure de blessure. Les souris mâles plus âgées ou les souches agressives nécessitent un logement en solo pour éviter toute perturbation de la plaie. Un avantage particulier de la queue comme un site pour étudier la cicatrisation des plaies est qu’il repose davantage sur la rééthélialisation pour la fermeture, comme décrit par d’autres27,32,33. En plus de mesurer la zone du lit de plaie et d’effectuer des analyses histologiques, d’autres ont signalé son utilisation dans l’évaluation de l’efficacité des interventions topiques dans la modulation des processus de guérison33.

Chacun des modèles de plaie décrits dans ces méthodes offrent des avantages distincts pour comprendre les processus de réparation des plaies dans un état stable et en présence de comorbidités. En raison de la grande disponibilité de souches génétiquement modifiées de souris consanguines, il est également possible de manipuler les réponses de guérison des plaies pour répondre à des questions mécanistes sur le processus. En outre, ces systèmes peuvent être mis en œuvre dans les modèles murins de conditions associées à une mauvaise cicatrisation des plaies, y compris le diabète, le vieillissement, l’infection secondaire, et d’autres30,36,39,40. Les connaissances mécanistes acquises à partir d’études murines peuvent alors fournir la base pour étudier la cicatrisation des plaies dans des modèles animaux de plus haut ordre. Ensemble, l’implantation d’éponge de PVA et les modèles excisionaux de peau de queue fournissent des systèmes tractables et polyvalents pour élucider des processus de guérison de blessure dans des conditions régulières d’état et pathologiques.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs souhaitent remercier Kevin Carlson, de l’Installation de cytométrie et de tri des flux de l’Université Brown, pour consultation et aide aux expériences de cytométrie des débits. Des images de la figure 1B et de C ont été créées avec BioRender. Kayla Lee et Gregory Serpa sont remerciés pour leur aide photographique. Ce travail a été soutenu par des subventions de ce qui suit: Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) YFAA15 D15AP00100, Dean’s Areas of Emerging New Science Award (Brown University), National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) 1R01HL126887-01A1, National Institute of Environmental Science (NIES) T32-ES7272 (Training in Environmental Pathology) et Brown University Research Seed Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific BP3991
15 mL centrifuge tubes, Olympus Genesee 28-103
1x HBSS (+Calcium, +Magnesium, –Phenol Red) ThermoFisher Scientific 14025076
5ml Syringe BD 309646
Anti-mouse CD45.2-APC Fire750 BioLegend 109852 Clone 104
Anti-mouse F4/80-eFluor660 ThermoFisher Scientific 50-4801-82 Clone BM8
Anti-mouse Ly6C-FITC BD Biosciences 553104 Clone AL-21
Anti-mouse Ly6G-PerCP-eFluor710 ThermoFisher Scientific 46-9668-82 Clone 1A8-Ly6g
Anti-mouse Siglec-F-APC-R700 BD Biosciences 565183 Clone E50-2440
Autoclip Stainless Steel Wound Clip Applier Braintree Scientific NC9021392
Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9mm Braintree Scientific NC9334081
Blender Bag, 80mL Fisher Scientific 14258201
Culture Tube, 16mL, 17x100 Genesee Scientific 21-130
Fetal Bovine Serum - Standard ThermoFisher Scientific 10437028
Fixable Viability Dye eFluor506 ThermoFisher Scientific 65-0866-14
Hepes Solution, 1M Genesee Scientific 25-534
ImageJ Software NIH
Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15070-063
Polyvinyl alcohol sponge - large pore size Ivalon/PVA Unlimited www.sponge-pva.com
Povidone-iodine solution, 10% Fisher Scientific 3955-16
Spray barrier film, Cavilon 3M 3346E
Stomacher 80 Biomaster, 110V Seward 0080/000/AJ

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References

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