Induzione dell'eriptosi nei globuli rossi utilizzando un ionoforo di calcio

Biochemistry

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Summary

Viene fornito un protocollo per l'induzione dell'eriptosi, la morte cellulare programmata negli eritrociti, utilizzando l'ionoforo di calcio, la ionomycina. L'eryptosi di successo viene valutata monitorando la fosfatidilaserina di localizzazione nel foglietto illustrativo esterno della membrana. Sono stati esaminati i fattori che influiscono sul successo del protocollo e sono state fornite condizioni ottimali.

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Bigdelou, P., Farnoud, A. M. Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore. J. Vis. Exp. (155), e60659, doi:10.3791/60659 (2020).

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Abstract

L'eriptosi, l'eritrocito morto cellulare programmato, si verifica in una serie di malattie ematologiche e durante la lesione agli eritrociti. Un segno distintivo delle cellule eriptotiche è la perdita di asimmetria compositiva della membrana cellulare, che porta alla traslocazione della fosfatidilanella nel volantino esterno della membrana. Questo processo è innescato da una maggiore concentrazione intracellulare di Ca2 ,che attiva la scramblase, un enzima che facilita il movimento bidirezionale dei fosfolipidi tra volantini a membrana. Data l'importanza dell'eriptosi in varie condizioni malate, ci sono stati sforzi per indurre l'eriptosi in vitro. Tali sforzi si sono generalmente affidati all'ionoforo di calcio, la ionomycina, per migliorare la concentrazione intracellulare di Ca2 e indurre l'eriptosi. Tuttavia, molte discrepanze sono state segnalate nella letteratura per quanto riguarda la procedura per indurre l'eryptosi utilizzando ionomycina. Qui, riportiamo un protocollo passo-passo per l'eriptosi indotta da ionomicina negli eritrociti umani. Ci concentriamo su importanti passi nella procedura, tra cui la concentrazione di ionoforo, il tempo di incubazione e l'esaurimento del glucosio e forniamo risultati rappresentativi. Questo protocollo può essere utilizzato per indurre riproducibilmente l'eryptosi in laboratorio.

Introduction

La morte cellulare programmata negli eritrociti, nota anche come eriptosi, è comune in molte condizioni cliniche e disturbi ematologici. L'eryptosi è associata al restringimento cellulare e alla perdita di asimmetria fosfolipidide nella membrana plasmatica cellulare1,2. La perdita di asimmetria provoca la traslocazione della fosfatidiladila (PS), un lipido normalmente localizzato nell'opuscolo interno3,4, nel volantino esterno della cellula, che segnala ai macrofagi di fagocitosi e rimuove gli eritrociti difettosi5,6,7,8. Alla fine della normale durata della vita degli eritrociti, la rimozione delle cellule eriftotiche dai macrofagi garantisce l'equilibrio degli eritrociti in circolazione. Tuttavia, in condizioni di malattia, come la malattia delle cellule falciformi e talassemia9,10,11, una maggiore eryptosi può provocare anemia grave2. A causa della sua importanza nelle malattie ematologiche, c'è un interesse significativo nell'esaminare i fattori che inducono o inibiscono l'eryptosi e i meccanismi molecolari alla base di questo processo.

La membrana plasmatica di eritrociti sani è asimmetrica, con diversi fosfolipidi che si localizzano nei volantini esterni e interni. L'asimmetria della membrana è regolata principalmente dall'azione degli enzimi della membrana. La translocasi aminofosofilidi consente il trasporto di aminoofosbantidi, PS e fosfatidylethanolamina (PE), indirizzando questi lipidi al foglietto interno della cellula. D'altra parte, il floppase trasporta la colina contenente fosfolipidi, fosfatidilcolina (PC) e sphingomyelin (SM), dal volantino interno a quello esterno della membrana cellulare12. Tuttavia, a differenza delle cellule sane, la membrana degli eritrociti erittoticiti è strapazzata. Ciò è dovuto all'azione di un terzo enzima, la scramblase, che interrompe l'asimmetria fosfolipidi facilitando il trasporto bidirezionale degli aminoofolipidi13,14,15,16. La Scramblase viene attivata da livelli intracellulari elevati di Ca2. Pertanto, gli ionofori di calcio, che facilitano il trasporto di Ca2 o attraverso la membrana cellulare12, sono efficienti induttori di eriptosi.

Ionomycin, un ionoforo di calcio, è stato ampiamente utilizzato per indurre eryptosi in eritrocites12,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. L'ionomicina ha sia gruppi idrofili che idrofobici, che sono necessari per legare e catturare gli ioni Ca2 e trasportarlo nello spazio citosolico27,28,29. Questo porta all'attivazione della scramblase e alla traslocazione di PS al volantino esterno, che può essere facilmente rilevato utilizzando l'allegato-V, una proteina cellulare ad alta affinità con PS12. Sebbene sia comunemente riportata l'eriptosi mediante ionomycina, vi è una notevole discrepanza di metodi nella letteratura (Tabella 1). La popolazione di eritrociti sottoposti a eriptosi dipende da diversi fattori come la concentrazione di ionoforo, il tempo di trattamento con l'ionoforo e il contenuto di zucchero dell'ambiente extracellulare (l'esaurimento del glucosio attiva i canali di cation e facilita l'ingresso di Ca2, nello spazio citoco)30,31. Tuttavia, c'è poca coerenza in questi fattori nella letteratura, rendendo difficile eseguire l'eryptosi riproducibilmente in vitro.

In questo protocollo, presentiamo una procedura passo-passo per indurre l'eriptosi negli eritrociti umani. Vengono esaminati i fattori che influiscono sul successo dell'eryptosi, tra cui la concentrazione di Ca2o, la concentrazione di ionoforo, il tempo di trattamento e la pre-incubazione nel buffer impoverito di glucosio e vengono riportati valori ottimali. Questa procedura dimostra che la pre-incubazione degli eritrociti in un buffer privo di glucosio aumenta significativamente la percentuale di eryptosi rispetto al buffer contenente glucosio. Questo protocollo può essere utilizzato in laboratorio per produrre eritrociti eritotici per varie applicazioni.

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Protocol

Tutti i campioni di sangue umano utilizzati nel protocollo descritto di seguito sono stati acquistati come campioni de-identificati. Nessun soggetto umano è stato direttamente coinvolto o reclutato per questo studio. Le linee guida della Dichiarazione di Helsinki dovrebbero essere utilizzate quando la ricerca coinvolge soggetti umani.

1. Isolamento degli eritrociti dal sangue intero

  1. Aggiungere 500 l di sangue intero nel citrato acido dextrose (ACD) (conservato a 4 gradi centigradi) in un tubo di microcentrifuga.
    NOTA: Il sangue intero è stato acquistato in ACD. Secondo la società, 1,5 mL di ACD viene aggiunto a 7 mL di sangue intero (8,5 mL di volume totale).
  2. Centrifugare l'intero sangue a 700 x g per 5 min a temperatura ambiente (RT) e rimuovere il plasma chiaro e il sottile cappotto di buffy utilizzando una pipetta per lasciare lo strato di eritrociti rosso.
  3. Preparare 1 L di Ringer soluzione contenente 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO4, 32 mM HEPES, 5 mM di glucosio, e 1 mM CaCl2. Regolare il pH a 7,4 aggiungendo 2 gocce di 1,0 M NaOH. Per preparare la soluzione Ringer senza glucosio, seguire lo stesso protocollo, ma non includere il glucosio nella soluzione.
  4. Lavare gli eritrociti 2x nella soluzione Ringer sospendendo il pellet cellulare in 1,5 mL di soluzione Ringer, centrifugeno a 700 x g per 5 min a RT e rimuovendo il supernatante.
  5. Fare un ematocrito dello 0,4% risuspendendo 40 ll l del pellet eritrocito in 9.960 l di soluzione Ringer senza glucosio per raggiungere un volume finale di 10 mL.
    NOTA: L'ematocrite è un termine usato per riferirsi alla frazione di volume degli eritrociti in sospensione. Un ematocrite dello 0,4% è una sospensione contenente lo 0,4% di eritrociti.
  6. Incubare la sospensione cellulare a 37 gradi centigradi per 7 giorni.

2. Trattamento degli eritrociti con ionomycina e misurazione dell'emolisi

  1. Sciogliere 1 mg di sale di calcio ionomycina in 630 l di zolfo dimetilo (DMSO) per raggiungere una concentrazione finale di 2 mM. Aliquota e conservare a -20 gradi centigradi.
  2. Prendere 1 mL dell'ematoctolo dello 0,4% dal punto 1,5 e aggiungere 0,5 luna di 2 mM ionomycin per raggiungere una concentrazione finale di 1 M. Incubazione per 2 h a 37 .
    1. Utilizzare 1 mL dell'ematocrito senza trattamento con ionomycina come controllo negativo.
  3. Centrifugare gli ematocriti trattati con ionomycina e non trattati a 700 x g per 5 min a RT, e rimuovere i loro supernatanti per lasciare i pellet cellulari nella parte inferiore dei tubi.
  4. Lavare le cellule 3x con la soluzione Ringer sospendendo i pellet cellulari in 1,5 mL di soluzione Ringer, centrifugeno a 700 x g per 5 min a RT e scartando i supernatanti.
  5. Per misurare l'emolisi, aggiungere 1 mL dell'ematocrito dello 0,4% non trattato dal punto 1,5 a un tubo di microcentrifuga e incubare per 2 h a 37 gradi centigradi come controllo negativo per l'emolisi (0%).
  6. Aggiungere 1 mL dell'ematocrito dello 0,4% non trattato dal punto 1,5 a un tubo di microcentrifuga e centrifugare a 700 x g per 5 min a RT. Rimuovere il supernatante e aggiungere 1 mL di acqua distillata al pellet cellulare e incubare per 2 h a 37 gradi centigradi come controllo positivo per l'emolisi (100%).
  7. Aggiungere 1 mL dell'ematocra trattato con ionomicina 0,4% dal punto 2.2 a un tubo di microcentrifuga.
  8. Centrifugare le cellule non trattate, le cellule trattate e le cellule in acqua distillata a 700 x g per 5 min a RT.
  9. Prendere 200 l dei supernatanti e aggiungere a una piastra di 96 pozze.
  10. Misurare l'assorbimento a 541 nm utilizzando un lettore di microplacche.
  11. Calcolare l'emolisi utilizzando l'equazione 132:

    %Emolisi (AT - A0)/(A100 - A0)

    dove A0 è l'assorbimento degli eritrociti nella soluzione Ringer, A100 è l'assorbimento degli eritrociti nell'acqua, e AT è l'assorbimento degli eritrociti trattati dalla ionomicina.

3. Saggio vincolante allegato-V

  1. Diluire 2 mL del buffer di associazione V allegato 5x in 8 mL di salina con buffer fosfato (PBS) per ottenere un buffer di rilegatura 1x.
  2. Risospendere i pellet cellulari trattati con ionomycina e non trattati dal passaggio 2.4 in 1 mL del buffer di rilegatura 1x.
  3. Prendere 235 l delle sospensioni cellulari nel cuscinetto di rilegatura e aggiungere 15 L di annessina V-Alexa Flour 488 coniugato.
  4. Incubare le cellule a RT per 20 min in un luogo buio. Centrifuga a 700 x g per 5 min a RT e rimuovere il supernatante.
  5. Lavare le celle 2x con buffer di rilegatura 1x, sospendendo il pellet cellulare in 1,5 mL del buffer di legame, centrifugeno a 700 x g per 5 min a RT e rimuovendo il supernatante.
  6. Risospendere i pellet cellulari in un buffer di rilegatura di 1x pari a 250 gradi per le misurazioni della citometria di flusso.

4. Citometria di flusso

  1. Trasferire 200 l degli eritrociti macchiati di annessa-V a 1 mL di tubi in polistirolo inferiore rotondi compatibili con la citometria di flusso.
  2. Accedi al software di citometria del flusso e fai clic sul pulsante del nuovo esperimento. Fare clic sul nuovo pulsante del tubo. Selezionare il foglio globale e scegliere l'analisi di applicazione per misurare l'intensità di fluorescenza con una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 530 nm.
  3. Impostare il numero di celle su 20.000 da raccogliere per l'analisi FACS (Fluorescenza-attivata dall'ordinamento delle cellule).
  4. Selezionare il tubo desiderato e fare clic sul pulsante di carico. Fare clic sul pulsante registra per le misurazioni a dispersione in avanti e laterale. Ripetere l'operazione per tutti i campioni.
  5. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul pulsante del campione e fare clic su Applica analisi batch per generare il file dei risultati.
  6. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul pulsante campione e fare clic su Genera file FSC.
  7. Aggiungere i dati di citometria di flusso (file FSC) nell'area di lavoro del software di citometria di flusso.
  8. Analizzare i dati di controllo selezionando la popolazione cellulare di interesse e aggiungendo statistiche per il valore dell'eryptosis.
    1. Fare doppio clic sul controllo e selezionare l'istogramma rispetto all'intensità della fluorescenza.
    2. Fare clic sul pulsante del cancello per disegnare un cancello sull'istogramma che indica la percentuale di eryptosi.
  9. Applicare le stesse statistiche per tutti gli altri tubi sperimentali per ottenere i valori di eryptosis. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul controllo e selezionare Copia analisi in gruppo.
  10. Dopo aver inserito correttamente tutti i campioni, trasferire i dati analizzati trascinandoli e rilasciandoli nell'editor di layout.
    1. Sovrapporre i dati analizzati con il controllo nell'editor di layout.
    2. Impostare gli istogrammi e le intensità desiderati modificando l'asse x e y dei grafici sovrapposti.
    3. Esportare i file di immagine facendo clic sul pulsante Esporta e salvare i grafici nella posizione desiderata.

5. Microscopia confocale

  1. Trasferire 5 - L di cellule macchiate di annessione-V su un vetrino al microscopio e coprirlo con uno slittamento di copertura. Conservare in un luogo buio per evitare il fotosbiancamento.
  2. Utilizzare il laser Argon del microscopio a fluorescenza confocale per osservare le cellule eccitate a 488 nm con gli ingrandimenti desiderati.
    NOTA: Un microscopio confocale non è necessariamente necessario e qualsiasi microscopio con capacità di fluorescenza può essere utilizzato per ottenere immagini a fluorescenza che dimostrino un legame annesso-V.
  3. Ottenere immagini a fluorescenza del controllo (cellule non trattate) e cellule trattate.
    NOTA: Si prevede che le cellule non trattate mostrino segnali di fluorescenza molto deboli, mentre si prevede che le cellule trattate mostrino fluorescenza verde brillante sulle loro membrane.

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Representative Results

Ottimizzazione della concentrazione di ionomycina

Mentre l'iononomicina è necessaria per indurre l'eriptosi, l'aumento delle concentrazioni di ionomycina può portare all'emolisi (cioè la lisi degli eritrociti e il rilascio di emoglobina), che deve essere evitata. Il trattamento degli erittrociti con 1 .M ionomycin soluzione per 2 h è sufficiente per indurre l'eryptosi, come dimostra l'etichettatura di successo con annessione-V Alexa farina 488 coniugato e quantificazione da FACS analisi (Figura 1A). Un aumento delle concentrazioni di ionomycina (5 e 10 M) comporta un leggero aumento dell'eriptosi (Figura 1A-D). Tuttavia, tali concentrazioni migliorano anche l'emolisi (Figura 1E), che non è desiderata. Per rimanere al di sotto del 5% di emolisi, è necessario utilizzare 1 ionomycina M.

Tempo di trattamento con ionomycina

L'incubazione di eritrociti con ionomicina in soluzione Ringer per appena 30 min è sufficiente per indurre l'eryptosi (Figura 2A). L'aumento del tempo di incubazione aumenta il livello di eriptosi, misurato dal saggio legante V di annessa, fino a 2 h(Figura 2B,C). Tuttavia, ulteriori tempi di incubazione si trae una leggera diminuzione del livello di eryptosis (Figura 2D). L'eryptosi massima è stata ottenuta dopo 2 h di trattamento con 1 ionomycina, e per tutti gli altri tempi di trattamento, è stata ottenuta un'eryptosi inferiore (Figura 2E). Gli istogrammi di citometria a flusso rappresentativo sono presentati nella figura 2A-D. Inoltre, la percentuale media di eryptosi ed emolisi, per vari periodi di trattamento con 1 ionomycina, sono presentati rispettivamente nella Figura 2E e nella Figura 2F. Il più alto valore di emolisi dopo 180 min spiega la riduzione dell'eryptosi dopo la stessa quantità di incubazione (Figura 2E) in quanto esistono cellule meno vitali su 180 min di trattamento con iononomina.

Inoltre, le cellule sono state trattate con basse concentrazioni di ionomycina tra cui 0, 0,25, 0,5 e 1 M per tempi di trattamento più lunghi, tra cui 6 e 12 h, ed è stata misurata l'eriptosi (Figura 3). Le cellule trattate con concentrazioni di ionomycina inferiori a 1 M per 6 e 12 h mostrano un'eriptosi inferiore rispetto alle cellule trattate con 1 ionomycina (Figura 3). Poiché la riduzione della concentrazione e l'aumento del tempo di esposizione non hanno migliorato l'eryptosi, è stato utilizzato 1 M per scatenare l'eriptosi.

L'eriptosi dipende dal tempo di incubazione e dalla concentrazione di glucosio extracellulare

La concentrazione di glucosio extracellulare influisce sull'esito del processo. I valori più elevati di eriptosi si osservano quando gli eritrociti sono pre-incubati nella soluzione Ringer senza glucosio rispetto alla soluzione Ringer contenente glucosio prima dell'incubazione con 1 ionomicina M per 2 h. I valori più alti di eryptosi si ottengono dopo 7 giorni di pre-incubazione in entrambe le soluzioni. Tuttavia, l'eryptosis è più alta dopo l'incubazione pre-incubazione nella soluzione Ringer senza glucosio rispetto alla normale soluzione Ringer, che contiene 5 mM di glucosio (vedere Figura 4A per grafici rappresentativi e Figura 4B per il confronto dei mezzi globali). Inoltre, gli istogrammi a dispersione in avanti indicano l'effetto dell'esaurimento del glucosio sul restringimento degli eritrociti (Figura 5A-D). La dispersione in avanti è una misura per le dimensioni delle cellule in base alla rifrazione della luce e il livello di luce sparpagliata è direttamente proporzionale alle dimensioni delle celle33. Le cellule incubate in una soluzione Ringer priva di glucosio mostrano una dispersione meno in avanti rispetto alle cellule incubate nel buffer contenente glucosio (Figura 5E), che indica un restringimento delle cellule nell'ambiente privo di glucosio.

Oltre alle misurazioni della citometria di flusso, le cellule sono state osservate al microscopio a fluorescenza confocale per confermare l'eriptosi. Gli eritrociti senza trattamento (Figura 6A) e con trattamento con ionomycina (Figura 6B) sono stati etichettati con annessa-V Alexa Flour 488 coniugati e osservati al microscopio. Le cellule trattate hanno mostrato un segnale di fluorescenza luminosa (Figura 6B) a causa del legame di annessione-V a PS nel volantino esterno. Al contrario, le cellule senza trattamento hanno mostrato un segnale di fluorescenza molto debole (Figura 6A) che indica un'eriptosi molto bassa. Ulteriori immagini di esempio di eritrociti eriptoticiti etichettati con allegato-V con segnale ad alta fluorescenza sono mostrati nella Figura 6C.

Figure 1
Figura 1: Grafici rappresentativi dell'effetto delle varie concentrazioni di ionomicina sull'eryptosi e sull'emolisi. Gli istometri di flusso degli erittrociti trattati con (A) 1 M, (B) 5 M e (C) 10 ionomycin (grigio) a 37 gradi centigradi allo 0,4% di ematocriti nella soluzione Ringer per 2 h. Linea nera indica cellule non trattate. La percentuale di eryptosi è indicata in ogni cifra. L'esposizione alla fossconcellina è stata misurata utilizzando l'associazione annessione-V. (D) Mezzi aritmetici - SD (n ) della percentuale di eryptosi di cellule trattate con diverse concentrazioni di ionomycina dopo 2 h di trattamento, e (E) aritmetica significa aritmetica (n ) di emolisi di eritrociti con diverse concentrazioni di ionomycina nelle stesse condizioni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Cifre rappresentative sull'effetto dei vari tempi di trattamento dell'ionomicina sull'eryptosi. Gli istometri di flusso degli erittrociti trattati con 1 ionomycina (grigio) a 37 gradi centigradi per (A) 30 min, (B) 60 min, (C) 120 min e (D) 180 min allo 0,4% di ematocrita nella soluzione Ringer. La linea nera indica le cellule non trattate. La percentuale di eryptosi è indicata in ogni cifra. L'esposizione alla fosfatidilaserina è stata misurata attraverso l'associazione annessione-V. (E) Mezzi aritmetici - SD (n - 3) di eriptosi percentuale di cellule trattate con 1 ionomycina M per tempi diversi. La più alta eryptosi è stata ottenuta dopo 120 min trattamento. (F) Mezzi aritmetici - SD (n - 3) di emolisi percentuale di cellule trattate con 1 iononomina M per tempi diversi. Per l'analisi statistica, è stato eseguito ANOVA unidirezionale non parametrico con test Kruskal-Wallis, e l'eryptosi dopo 120 min trattamento è stato significativamente superiore al controllo come indicato nel pannello E. - è per p < 0.05. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Effetto di varie concentrazioni di ionomycina e tempi di trattamento sull'eryptosi. Mezzi aritmetici - SD (n - 3) della percentuale di eryptosi delle cellule trattate con diverse concentrazioni di ionomycina è mostrato dopo vari tempi di trattamento. Le cellule sono state trattate con basse concentrazioni di ionomycin, tra cui 0, 0,25, 0,5 e 1 M per un'esposizione più lunga (6 h e 12 h). Concentrazioni più elevate e trattamenti più lunghi hanno portato a valori di eryptosis più elevati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Effetto dell'esaurimento di energia sull'eryptosi. (A) Istogramma della citometria di flusso per gli eritrociti trattati con 1 ionomycina (grigio) a 37 gradi centigradi per 2 ore allo 0,4% di ematocrita, dopo la pre-incubazione nella soluzione Ringer senza glucosio (figure principali) e la soluzione Ringer (figure inferiori) da 1 a 7 giorni, rivela che l'esaurimento dell'energia facilita l'eriptosi. La linea nera indica le cellule non trattate. Percentuali di eryptosi sono indicate nei grafici per ogni giorno. (B) Mezzi aritmetici - SD (n - 3) della percentuale di eriptosi di erittri trattati con 1 ionomycin a 37 gradi centigradi per 2 h allo 0,4% di ematocrito, dopo la pre-incubazione nella soluzione Ringer (barre nere) e la soluzione Ringer senza glucosio (barre bianche) da 1 a 7 giorni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Effetto dell'esaurimento di energia sulle dimensioni delle cellule. Istogramma a dispersione in avanti per gli eritrociti trattati con 1 ionomycina a 37 gradi centigradi per 2 h allo 0,4% di ematocrit, dopo la pre-incubazione nella soluzione Suoneria senza glucosio (grigio) e la soluzione Suoneria (linea nera) per (A) 1 giorno, (B) 3 giorni, (C) 5 giorni e (D) 7 giorni. L'istogramma a dispersione in avanti nel tempo indica il restringimento dell'eritrocito nel buffer privo di glucosio. (E) Mezzi aritmetici - SD (n - 3) di intensità di dispersione in avanti di eritrociti trattati con 1 ionomycin M a 37 gradi centigradi per 2 h allo 0,4% di ematocrite, dopo la pre-incubazione nella soluzione Ringer (barre nere) e la soluzione Ringer senza glucosio (barre bianche) da 1 a 7 giorni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Immagini microscopiche a fluorescenza confocale di erittrociti trattate con (A) 0 - M, (B) e (C) ionomycin a 37 gradi centigradi per 2 h allo 0,4% di ematocriti. L'ingrandimento degli obiettivi 40x è stato utilizzato per le immagini nei pannelli A e B, e l'ingrandimento degli obiettivi 100x è stato utilizzato per scattare immagini per il pannello C. PS in eritrociti sani si trova sul volantino interno della membrana cellulare, quindi non c'è segnale di fluorescenza nel pannello A. Nei pannelli B e C gli eritrociti sono stati indotti per l'eriptosi e c'è un segnale di fluorescenza luminoso derivante dal legame di annessione-V a PS traslocato al volantino esterno della membrana cellulare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Densità cellulare /hematocit Concentrazione di ionomycina Buffer Pre-incubazione Tempo di trattamento con ionomycina Metodo di rilevamento Riferimento
1,65 x 108 celle / mL 0,3 mM Buffer A 36 h nel buffer A 1 ora Allegato V 12
0.40% 1 mM Soluzione Ringer 48 h in Ringer 1 ora Allegato V 17
50% 10 mM Buffer B - 3 h Merocyanina 540 18
0.40% 1 mM Soluzione Ringer 48 h in Ringer 1 ora Allegato V 19
0.40% 1 mM Soluzione Ringer 48 h in Ringer 1 ora Allegato V 20
2% 1 mM Soluzione Ringer - 4 ore Allegato V 21
0.40% 1 mM Soluzione Ringer - 0,5 h Allegato V 22
10% 1 mM Soluzione Ringer - 3 h Allegato V 23
0.40% 10 mM Soluzione Ringer - 0,5 h Allegato V 24
0.40% 1 mM Soluzione Ringer 48 h in Ringer 0,5 h Allegato V 25
2 x 106 celle/mL 1 mM Salina con buffer HEPES (HBS) - 0,5 h Allegato V 26
Buffer A: 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2- 6H2O, 10 mM di glucosio e 1,8 mM CaCl22H2O
Buffer B: 5 mM Tris, 100 mM KC1, 60 mM NaCl e 10 mM di glucosio

Tabella 1: Vari protocolli utilizzati in letteratura per indurre l'eryptosi utilizzando la iononomina.

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Discussion

L'obiettivo di questa procedura è quello di fornire valori ottimali per la concentrazione di ionoforo, il tempo di trattamento e la concentrazione di glucosio extracellulare, che sono fattori importanti per garantire una corretta induzione di eriptosi. Un passo critico nel protocollo è l'esaurimento del glucosio extracellulare, che, nonostante la sua importanza, non è stato sufficientemente sottolineato nella letteratura. Il contenuto di zucchero nella normale soluzione Ringer (5 mM) ha un effetto inibitorio sull'eryptosi. L'esaurimento del glucosio nell'ambiente extracellulare induce stress cellulare e attiva la chinasi C (PKC) proteica, con conseguente attivazione dei canali di calcio e potassio. Ciò si traduce in un aumento dell'ingresso di Ca2 nello spazio citosolico30,31,34 e alla fine attiva lo scramblase16, che aumenta l'eriptosi. L'attivazione del canale di potassio provoca anche una fuoriuscita di cloruro di potassio fuori dalla cellula, che porta al restringimento dell'eritrocito35.

La procedura descritta in precedenza deve essere eseguita con particolare attenzione all'emolisi. È importante utilizzare una concentrazione ottimizzata di ionofori, che è abbastanza alta da indurre eryptosi, e abbastanza bassa da prevenire l'emolisi. Allo stesso modo, l'incubazione di eritrociti con ionomycina per un breve periodo di tempo si traduce in bassa erorfasi, mentre l'incubazione molto lunga può portare a interruzioni della membrana cellulare e emolisi. Va anche notato che mentre il protocollo presentato è altamente affidabile quando eseguito sullo stesso campione di eritrociti, cellule provenienti da individui diversi rispondono in modo diverso alla ionomycina e ci potrebbe essere variabilità inter-soggetto tra diversi campioni.

Particolare attenzione dovrebbe essere prestata all'analisi dei dati dalla citometria di flusso. La percentuale di eryptosi ottenuta dal citometro di flusso indica la percentuale di popolazione cellulare con PS sul loro volantino esterno. Tuttavia, le celle con intensità diverse di legame allegato-V non possono essere distinte in base a questo numero. L'allegato-V si lega alla PS esposta sulla superficie cellulare, con un'affinità molto elevata e un'elevata specificità a PS36,37,38. Tuttavia, come mostrato nelle immagini di microscopia in questo rapporto, diverse cellule mostrano differenze nell'intensità di legame allegato-V. Le cellule con PS bassa sulle loro membrane hanno basse intensità di fluorescenza, mentre una maggiore occupazione di PS sulla membrana cellulare si traduce in intensità di fluorescenza più elevate.

Il protocollo presentato in questo documento può essere modificato aumentando la concentrazione extracellulare di Ca2. In questo protocollo, la iononomina è stata utilizzata per indurre l'eryptosi in presenza di 1 mM CaCl2; concentrazioni più elevate di Ca2 o più potrebbero portare a livelli di calcio intracellulare migliorati e possono indurre più eryptosi. Inoltre, diversi ionofori di calcio, come il selectoforo e la calcimicina, potrebbero avere una diversa capacità di migliorare la concentrazione intracellulare di Ca2,rispetto alla ionomicina, e potrebbero portare a diversi valori di eriptosi. Tuttavia, l'eryptosi coerente degli eritrociti può essere ottenuta utilizzando la ionomycina con il protocollo delineato e può essere utilizzata in laboratorio per esaminare i meccanismi molecolari dell'eriptosi, imitare le condizioni malate39,40in vitroe le terapie potenziali dello screening che inibiscono l'eryptosi, tra le altre applicazioni.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione NIH R15ES030140 e dalla concessione NSF CBET1903568. È stato riconosciuto anche il sostegno finanziario del Russ College of Engineering and Technology e del Department of Chemical and Biomolecular Engineering dell'Università dell'Ohio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plate Fisher Scientific 12-565-331
Annexin V Alexa Fluor 488 - apoptosis kit Fisher Scientific A10788 Store at 4 °C
BD FACSAria II flow cytometer BD Biosciences 643177
CaCl2 Fisher Scientific C79-500
Centrifuge Millipore Sigma M7157 Model Eppendorf 5415C
Confocal fluorescence microscopy Zeiss, LSM Tek Thornwood Model LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images
Cover glasses circles Fisher Scientific 12-545-100
Disposable round bottom flow cytometry tube VWR VWRU47729-566
DMSO Sigma-Aldrich 472301-100ML
DPBS VWR Life Science SH30028.02
Glucose monohydrate Sigma-Aldrich Y0001745
HEPES Buffer (1 M) Fisher Scientific 50-751-7290 Store at 4 °C
Ionomycin calcium salt EMD Milipore Corp. 407952-1MG Dissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 °C
KCl Fisher Scientific P330-500
MgSO4 Fisher Scientific M65-500
Microcentrifuge tube Fisher Scientific 02-681-5
NaCl Fisher Scientific S271-500
Plain glass microscope slides Fisher Scientific 12-544-4
Synergy HFM microplate reader BioTek
Whole blood in ACD Zen-Bio Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use

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References

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