Kombinerad användning av Stjärtvenmetastaser-analyser och real tids in vivo-avbildning för att kvantifiera bröst cancer metastaserande kolonisering och börda i lungorna

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Den beskrivna metoden kombinerar experimentella svans vener metastaser analyser med in vivo levande djur avbildning för att möjliggöra realtidsövervakning av bröstcancer metastaser bildning och tillväxt utöver kvantifiering av metastaser antal och storlek i lungorna.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Warren, J. S. A., Feustel, P. J., Lamar, J. M. Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs. J. Vis. Exp. (154), e60687, doi:10.3791/60687 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Metastaser är den främsta orsaken till cancerrelaterade dödsfall och det finns begränsade terapeutiska alternativ för patienter med metastaserad sjukdom. Identifiering och testning av nya terapeutiska mål som underlättar utvecklingen av bättre behandlingar för metastaserande sjukdom kräver prekliniska in vivo-modeller. Demonstreras här är en uterustransplantat musmodell för testmetoder bröstcancer metastaserande kolonisering och efterföljande tillväxt. Metastaserande cancerceller är stabilt omvandlas med virala vektorer kodning Firefly luciferas och zsgreen proteiner. Kandidatgener är då stabilt manipulerade i luciferase/ZsGreen-uttrycker cancerceller och sedan cellerna injiceras i möss via laterala svans ven till assay metastaserande kolonisering och tillväxt. En in vivo bild anordning används sedan för att mäta bioluminescens eller fluorescens av tumörcellerna i de levande djuren för att kvantifiera förändringar i metastatisk börda över tiden. Uttrycket av fluorescerande protein gör att antalet och storleken av metastaser i lungorna som skall kvantifieras i slutet av experimentet utan behov av snittning eller histologisk färgning. Detta tillvägagångssätt erbjuder ett relativt snabbt och enkelt sätt att testa rollen av kandidaten gener i metastaserad kolonisering och tillväxt, och ger en hel del mer information än traditionella svans venen metastaser analyser. Med hjälp av denna metod, visar vi att samtidig knockdown av Ja associerade protein (YAP) och transkriptionella Co-aktivator med en PDZ-bindande motiv (TAZ) i bröstcancerceller leder till minskad metastaserande börda i lungorna och att denna minskade börda är resultatet av signifikant försämrad metastaserad kolonisering och minskad tillväxt av metastaser.

Introduction

Cancer är fortfarande den näst vanligaste dödsorsaken i världen1 och metastaser är ansvarig för majoriteten av dessa dödsfall2,3. Men en begränsad förståelse av de molekylära mekanismerna som styr metastaserad kolonisering och efterföljande tillväxt har hindrat utvecklingen av effektiva behandlingar för metastaserande sjukdom. Identifiering av nya terapeutiska mål kräver ett test för att testa hur oroad uttryck eller funktion av en kandidat gen påverkar metastaser bildas och tillväxt. Även inhemska musmodeller har sina fördelar, de är tidskrävande och dyrt att generera, vilket gör dem mer lämpade för mål validering snarare än mål identifiering. Transplantation modellsystem där kandidaten genen är oroad i cancerceller in vitro-och sedan effekter på metastatisk potential bedöms in vivo, är billigare och högre genomströmning än autoktona modeller. Dessutom, viral vektorer för stabil leverans av RNAi, CRISPR/CAS9, och transgener är allmänt tillgängliga, vilket gör det relativt lätt att stör praktiskt taget någon gen eller gener av intresse i en cancer cellinjer. Denna metod kan också användas för att assay rollen av kandidaten gener i metastaserad kolonisering och tillväxt i mänskliga cancer cellinjer genom transplantation cellerna till immunkomprometterade eller humaniserade möss.

De två typer av analyser som används för att testa metastaser bildas genom transplanterade cancerceller in vivo är spontana metastaser-analyser och experimentella metastaser-analyser. I spontana metastaser analyser4,5, cancerceller injiceras i möss, tillåtet att bilda en primär tumör, och sedan spontan metastaser bildas och efterföljande tillväxt är analyseras. Styrkan i denna modell är att cellerna måste slutföra alla steg i den metastaserande processen för att bilda metastaserande tumörer. Emellertid, många cancer cellinjer inte metastasera effektivt i spontana metastaser modeller, och någon manipulation av de celler som påverkar primär tumörtillväxt kan blanda ihop resultaten av metastaser analysen. Experimentella metastaser analyser, där cancerceller injiceras direkt i cirkulationen, används för att undvika dessa fallgropar. Vanliga experimentella metastaser analyser inkluderar svansen ven injektion6,7,8 (och visas här), intrakardiell injektion9, och Portal Vein injektion10.

Syftet med det protokoll som presenteras här är att ge en in vivo experimentell metastaser analys som gör det möjligt för en forskare att övervaka metastaser bildas och tillväxt i realtid, samt att kvantifiera slutpunkt metastaser antal och storlek i lungorna av samma mus. För att åstadkomma detta, traditionella experimentella svans venen metastaser analyser6,7,8 kombineras med levande djur avbildning, med hjälp av en in vivo Imaging Device9,11,12,13,14. Tumörceller som stabilt uttrycker både luciferas och ett fluorescerande protein injiceras i möss via den laterala svans venen och därefter används in vivo-avbildningsapparaten för att mäta förändringar av metastatisk börda i lungorna över tid (figur 1). In vivo-enheten för levande djur kan dock inte särskilja eller mäta storleken på enskilda metastaser. Således, i slutet av experimentet, en fluorescerande stereomikroskop används för att räkna antalet och mäta storleken på fluorescerande metastaser i lungorna utan behov av snittning och histologi eller immunohistokemi (figur 1). Detta protokoll kan användas för att testa hur ändring av uttryck eller funktion av en kandidat gen påverkar metastaser bildas och tillväxt. Potentiella terapeutiska föreningar såsom små molekyler eller funktion blockerar antikroppar kan också testas.

För att demonstrera detta tillvägagångssätt utförde vi först ett proof of Concept-experiment där den viktiga replikeringsfaktorn, replikeringproteinet a3 (RPA3) slås ned i metastaserande mus bröstcancerceller. Vi visar att möss injiceras med RPA3 knockdown celler har signifikant mindre metastaserande börda vid varje tidpunkt jämfört med möss injiceras med kontrollceller. Analys av de metastaser som innehåller lungorna visar att denna minskade metastatisk börda är resultatet av signifikant minskad metastaserad kolonisering och försämrad tillväxt av de metastaser som bildas. För att ytterligare demonstrera denna teknik, vi testade om samtidig knock down av Ja tillhörande protein (YAP) och transkriptionella Co-aktivator med en PDZ-bindande motiv (TAZ) försämrar metastaserad kolonisering eller efterföljande tillväxt. YAP och Taz är två relaterade transkriptionella Co-aktivatorer som är de kritiska nedströms manipulatorer av Hippo vägen. Vi15,16 och andra har inblandad YAP och Taz i metastaser (ses över i17,18,19), vilket tyder på att dessa proteiner är bra terapeutiska mål. Konsekvent, vi fann att möss injiceras med YAP/TAZ knockdown celler hade signifikant minskad metastaserande börda. Analys av lungorna visade att YAP/TAZ knockdown celler bildade många färre metastaser och att de metastaser som gjorde formen var mindre. Dessa experiment visar hur experimentella metastaser gör det möjligt för en forskare att snabbt och billigt testa rollen av en kandidat gen i metastaser bildas och tillväxt. De visar vidare hur den kombinerade användningen av levande djur avbildning och fluorescerande kvantifiering av metastaser i hela lungorna gör det möjligt för forskaren att bättre förstå stegen vid metastaserad kolonisation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Detta protokoll inbegriper användning av möss och biologiskt farliga material och kräver godkännande från lämpliga institutionella säkerhets kommittéer. Alla de beskrivna in vivo arbete här är godkänt av Albany Medical College institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC).

Anmärkning: för en protokoll översikt, se schematiskt i figur 1.

1. paketera alla nödvändiga retrovirus och upphov

Anmärkning: det beskrivna protokollet använder lentivirala eller retrovirala vektorer för att stabilt uttrycka ett luciferas enzym och fluorescerande protein samt att manipulera uttrycket av en kandidat gen. Dessa virus är förpackade i HEK-293FT-celler enligt beskrivningen nedan.

  1. Dag 1: platta hek-293ft celler på 6-well plattor i 2 ml komplett tillväxt media (10% FBS i DMEM med 1% penicillin/streptomycin och 2 mm L-glutamin) så att de är 40-60% konfluenta på dag 2. Inkubera vid 37 ° c, 5% CO2 över natten.
  2. Dag 2: för varje viral vektor som skall förpackas, transfect en 40-60% konfluenta väl hek-293ft celler med retrovirala eller lentiviral vektor och lämpliga vektorer kodning av viral Coat och förpackningar proteiner.
    Anmärkning: detta protokoll använder VSVG som Coat protein, psPAX2 för lentiviral förpackning, och gag-pol för antiretrovirala förpackning (se kompletterande tabell 1 för vektor lista).
  3. Gör en co-transfektion blandning för varje brunn som följer:
    1. Kombinera 4 μL lipidlösning för transfektioner (se tabell över material) och 96 μl transfektionbuffert och inkubera i 5 minuter.
    2. Tillsätt 1 μg viral Vector, 0,5 μg av Coat protein Vector (VSVG) och 0,5 μg förpacknings protein vektor (psPAX2 eller gag-pol) och inkubera i 20 minuter.
    3. Tillsätt försiktigt Co-transfektionblandningen från steg 1.3.2 till HEK-293FT-cellerna som pläteras i steg 1,1 och inkubera vid 37 ° c, 5% CO2 över natten.
  4. Dag 3: ta bort de transfektionhaltiga medierna från varje brunn och tillsätt försiktigt 2 mL komplett tillväxtmedia till varje brunn. Inkubera vid 37 ° c, 5% CO2 i cirka 24 timmar.
  5. Dag 4: samla in den virala supernatanten från varje brunn med hjälp av en 3 mL spruta och filtrera genom ett 0,45 μm-filter till ett 2 mL microcentrifugerör.
  6. Valfritt: om insamling av en andra omgång virus önskas, tillsätt försiktigt 2 mL komplett tillväxtmedium till varje brunn och inkubera vid 37 ° c, 5% CO2 i cirka 24 timmar.
  7. Dag 5 (frivilligt): samla en andra omgång av viral supernatanten som i steg 1,5.
    Anmärkning: protokollet kan pausas genom att frysa den virala supernatanten.

2. generering av cancerceller som stabilt uttrycker luciferas och ett fluorescerande protein

Anmärkning: följande protokoll beskriver hur man först till stabilt etikett 4T1 celler med Firefly luciferas och ett fluorescerande protein (zsgreen) med hjälp av två vektorer med unika val gener. Sedan en 3RD viral vektor används för att manipulera uttrycket av en kandidat gen. Men virusvektorer som samtidigt levererar ett fluorescerande protein och en genetisk manipulation kan också användas som ett alternativ (som i de representativa experimenten nedan). Andra cancerceller kan användas, men cellnumren bör optimeras för steg 2,1 och 2.7.1.

  1. Tallrik 4T1 celler vid 1,5 x 105 celler/brunn i en 12-brunn tallrik i komplett tillväxtmedia (10% FBS i DMEM med 1% penicillin/streptomycin och 2 mm L-glutamin) och inkubera vid 37 ° c, 5% Co2 över natten.
  2. Infektera 4T1 celler med viral supernatanten genereras i steg 1 enligt följande.
    1. Aspirera tillväxten media från cellerna och tillsätt 500 μl av luciferas viral supernatanten och 500 μl av fluorescerande protein viral supernatanten att samtidigt infektera cellerna med både luciferas och fluorescerande protein virala supernatants.
    2. Tillsätt 1 μL 8 mg/mL hexadimethrine (se tabell över material).
    3. Inkubera cellerna vid 37 ° c, 5% tills 75-90% konfluenta (typiskt 24-48 timmar).
  3. Trypsinize den 4T1 celler med 500 μL av trypsin för 2-5 minuter (celler bör fritt skölja bort botten av brunnen). Överför alla celler till en 6 cm skålen i 4 mL av urvals mediet (komplett tillväxt medier som innehåller lämpliga antibiotika) och därmed släcka trypsin. Platta en 6 cm maträtt av icke-infekterade kontrollceller i samma urvalsmaterial.
    Anmärkning: lämplig antibiotika koncentration bör bestämmas i förväg genom att testa flera doser. Dessutom kan fluorescensaktiverad cell sortering också användas för att välja de fluorescerande celler som är märkta i stället för val av läkemedel.
  4. Inkubera cellerna vid 37 ° c, 5% CO2 i urvals mediet och dela cellerna vid behov tills alla icke-infekterade kontrollceller är döda (beroende på urvals gen och cellinjer).
  5. Bekräfta att de infekterade 4T1 celler uttrycker ZsGreen fluorescerande protein med en grön excitation (450-490 nm)/emission (500-550 Nm) filter inställt på en inverterad fluorescerande Mikroskop vid 50-100x förstoring.
  6. Bekräfta att de infekterade 4T1-cellerna uttrycker luciferas med hjälp av en kommersiellt tillgänglig luciferas Activity kit enligt följande.
    1. Använd en minimal volym 1x passiv lysis buffert för att lyse luciferase-uttrycker 4T1 celler och kontroll 4T1 celler som inte uttrycker luciferase, försiktigt skaka i 30 minuter.
    2. Tillsätt 20 μl celllysat till en vit botten 96-brunn plattan och sedan 50 μl av luciferas assay reagens från luciferas Activity kit.
    3. Använd en Plattläsare för att mäta Luminescens från cellerna vid alla våglängder i spektrumet med hjälp av luminiscens-inställningen.
      Obs: protokollet kan pausas genom att frysa ner de stabilt-transduced cellerna.
  7. Manipulera uttrycket av kandidat genen enligt följande:
    1. Platta 6 x 105 märkt 4T1 celler från steg 2,6 på en 60 mm maträtt i 4 ml av kompletta tillväxt medier och inkubera vid 37 ° c, 5% Co2 över natten.
    2. Aspirera tillväxt medierna från varje brunn och tillsätt 2 mL komplett tillväxtmedia innehållande 4 μL 8 mg/mL hexadimethrine bromid.
    3. Tillsätt 2 mL viral supernatanten från steg 1 till cellerna pläterade från steg 2.7.2 och inkubera vid 37 ° c, 5% CO2 över natten.
    4. Trypsinize den 4T1 celler med 500 μL av trypsin för 2-5 minuter (celler bör fritt skölja bort botten av brunnen). Överför alla celler till en 10 cm skålen i 10 mL av urvals mediet (komplett tillväxt medier som innehåller lämpliga antibiotika) och därmed släcka trypsin. Platta någon icke-infekterad kontroll märkt 4T1 celler i samma urval media.
    5. Inkubera cellerna vid 37 ° c, 5% CO2 i urvals mediet och dela cellerna vid behov tills alla icke-infekterade celler är döda.
    6. Bekräfta att uttrycket av den sökande genen ändras med hjälp av en standardmetod som Western blot20 eller qPCR21.
    7. Assay luminiscens och fluorescens som i steg 2.5-2.6 för att avgöra hur liknande de är i kontroll och knockdown celler, eftersom detta kan ändras (se diskussion).
      Obs: protokollet kan pausas genom att frysa ner de stabilt-transduced cellerna.

3. optimering av in vivo experimentell design

  1. Optimera lämpligt cell nummer och experimentets varaktighet för den önskade metastatiska bördan enligt följande.
    1. Utöka fluorescerande och bioluminescerande 4T1-celler från steg 2,6 i kompletta tillväxtmedia så att överflödiga celler finns tillgängliga på önskad injektionsdag.
    2. Bered cellerna för injektion av svans ven enligt beskrivningen i steg 4,2. För att bestämma det optimala cellnumret för injektioner, Omsuspendera cellerna vid flera olika koncentrationer i 100 μL 1x PBS.
      Anmärkningar: Vi rekommenderar att du testar ett antal cell nummer/mus från 25 000 till 500 000.
    3. Håll cellsuspensioner på is tills injektionen.
    4. Injicera varje spädning av 4T1-celler från steg 3.1.2 till 3-4 möss via den laterala svans venen som beskrivs i steg 4,3 (se nedan).
    5. Returnera musen till sin bur och övervaka i 15 minuter för att säkerställa en fullständig återhämtning. Möss ska kontrolleras för tecken på smärta eller ångest 3x varje vecka.
    6. Övervaka möss för bildning av metastaser och tillväxt under 3-6 veckor (stamberoende cellinjer och möss) med en in vivo levande djur avbildnings enhet (se steg 5 och 6).
      1. Euthanize möss 3-6 veckor efter svans venen injektion enligt standard institutionella riktlinjer.
      2. Förbered lungorna och Bedöm metastaser storlek och antal som beskrivs i steg 7.
      3. Välj lämplig tidslängd för metastaser att växa för den önskade metastaserande bördan (se diskussion).

4. svans venen injektion av märkta cancerceller

Anmärkning: steg 4.2.4 har optimerats för 4T1-celler som växer i uterustransplantat Balb/c-möss. Om andra cancer cellinjer och mus stammar används, antalet injicerade celler, och längden på analysen bör först optimeras.

  1. Expandera 4T1 cellinjer som genereras i steg 2 på 2 15 cm rätter i kompletta tillväxtmedia så att överskott celler finns tillgängliga på dagen för injektion.
  2. Förbered cellerna för svans venen injektion enligt följande:
    1. Sug upp media och skölj cell plattorna med 1x PBS.
    2. Trypsinize cellerna med 5 mL trypsin per 15 cm platta för 2-5 minuter (celler bör fritt skölja bort botten av brunnen). Överför alla celler till ett koniskt rör. Tvätta kvarvarande celler från vävnads odlings skålen med tillräckligt med kompletta Odlingsmedier för att släcka trypsin och tillsätt tvätten till samma koniska rör.
    3. Räkna cellerna med hjälp av en automatiserad cell räknare för att bestämma det totala cellnumret.
    4. Centrifugera cellerna vid 122 x g i 3 minuter, aspirera på supernatanten och Omsuspendera cellerna i 1x PBS vid önskad koncentration. Här, 2,5 x 104 celler injiceras i varje mus i 100 μl av PBS, så Omsuspendera cellerna vid 2,5 x 105 celler/ml. Håll cellsuspensioner på is tills injektionen.
      Anmärkning: det är viktigt att begränsa den tid mellan trypsinization av cellerna och svansen ven injektion till ungefär 1 timme.
  3. Injicera 4T1-celler från steg 4.2.5 till möss via den laterala svans venen enligt följande:
    1. Arbeta i en huva på djuranläggningen, försiktigt men grundligt blanda cellerna genom att invertera röret eller med hjälp av en 1 mL spruta för att säkerställa att de är jämnt återsuspenderade. Se alltid till att cellerna återsuspenderas innan du laddar sprutan.
    2. Ladda en 1 mL luer-lock spruta med cellsuspension och utvisa överskott luftbubblor. Placera en 1/2 tum, 30-gauge nål på sprutan med avfasning upp och utvisa luftbubblor.
    3. Placera försiktigt musen i en gnagare-hämmaren.
    4. De laterala svans venerna bör vara synlig och vidgad. Om inte, nypa försiktigt basen av svansen och doppa svansen i varmt kranvatten för att vidga venerna.
      Obs: dilatation av venerna kan också uppnås genom att placera musen buren under en värmelampa och/eller ovanpå en värmedyna.
    5. Använd en alkoholservett för att rengöra svansen. Stick in nålen i svans venen, avfasnings sidan uppåt och injicera 100 μL cellsuspension.
      Anmärkning: om nålen sätts in ordentligt i venen, bör det lätt glida något framåt och bakåt, och det bör inte vara motstånd när kolven trycks. Lyckade injektioner bör också resultera i en "flush" där den blå färgen på venen blir vit i några sekunder efter injektionen.
  4. Ta långsamt bort nålen och Använd en steril gasväv, tryck på injektionsstället för att stoppa blödning.
  5. Returnera musen till sin bur och övervaka i 15 minuter för att säkerställa full återhämtning. Möss ska kontrolleras för tecken på smärta eller ångest 3x varje vecka.
  6. Övervaka möss för bildning av metastaser och tillväxt under 3-6 veckor (stamberoende cellinjer och möss) med en in vivo levande djur avbildnings enhet (se steg 5 och 6).

5. övervakning av metastaserad belastning med fluorescens med en in vivo levande djur avbildning enhet

Notera: Använd inte bild djur för fluorescens med aktiv självlysande signal.

  1. Om bara Imaging bioluminescence, gå till steg 6.
  2. Sätt på den in vivo Live Animal Imaging-enheten.
  3. Ställ in vivo Live Animal Imaging anestesisystem enligt tillverkarens riktlinjer för att leverera mellan 1,5% och 2% isofluran till anestesi kammaren och bild kammaren.
  4. Anesthetize möss med överföras märkta metastaser från steg 4 genom att placera dem i en anestesi kammare och leverera 1,5-2,5% isofluran.
  5. Öppna bildprogram varan (se tabell över material) och logga in.
  6. Klicka på knappen initiera och vänta på att datorn initieras.
  7. Ändra Vyfältet till D.
    Anmärkning: synfält C kan också användas om en närmare syn på en mus krävs, men detta begränsar antalet möss som kan avbildas samtidigt.
  8. När programvaran har indikerat att kameran har uppnått rätt temperatur klickar du på knappen Imaging Wizard , väljer Fluorescence och väljer sedan lämpligt filterpar i rullgardinsmenyn.
    Anmärkning: om fluorophore används inte är ett alternativ, Välj input ex/EM och skriv excitation och utsläpp som krävs.
  9. Placera musen i kammaren enligt beskrivningen i steg 3.2.4.
  10. Klicka på Hämta sekvens.
  11. Efter avbildning, returnera musen till sin bur och övervaka i 15 minuter för att säkerställa full återhämtning.
  12. Upprepa steg 5,2 och steg 5.7-5.9 med minst en mus som inte innehåller metastaser. Obs: denna mus kommer att användas för att kvantifiera och subtrahera bakgrunds signalen under analysen (steg 8).
  13. Bild 2-3 gånger i veckan under experimentets varaktighet.

6. övervakning av metastaserad börda genom bioluminescens med en in vivo levande djur avbildning anordning

  1. Slå på in vivo Live Animal Imaging-enheten och Ställ in programmet enligt följande.
    1. Öppna bildprogram varan (se tabell över material) och logga in. Klicka på knappen initiera och vänta på att datorn initieras. Ändra Vyfältet till D.
      Anmärkning: synfält C kan användas för en närmare bild för att bilden hela mus kroppen; Detta begränsar dock antalet möss som kan avbildas på en gång.
    2. För första gången kan du redigera exponeringsinställningarna enligt följande: Klicka på Redigera | Preferenser | Förvärv | Automatisk exponering och ändra den maximala exponeringstiden från standardvärdet 60 sekunder till 300 sekunder och klicka på OK.
      Obs: Ändra inte några andra parametrar på fliken Automatisk exponering.
  2. Ställ in anestesisystemet enligt tillverkarens riktlinjer för att leverera mellan 1,5% och 2% isofluran till anestesi kammaren och bild kammaren.
  3. Se till att kameran har uppnått rätt temperatur innan du fortsätter till steg 6,4.
  4. Anesthetize metastaser som innehåller möss från steg 4 genom att placera dem i en anestesi kammare och leverera 1,5-2,5% isofluran.
  5. Förbered möss för Mareld-avbildning enligt följande.
    1. Ladda en 1 mL spruta med D-Luciferin (30 mg/mL i D-PBS) och tillsätt sedan en 1/2-tums 30-gauge nål till sprutan och utvisa luftbubblor.
    2. Mät och anteckna massan av den sövda musen.
    3. Hindra musen genom att nypa skruffen av halsen med hjälp av tummen och pekfingret och greppa svansen mellan Pinkie finger och basen av handen. Vänd musen på en 45-graders vinkel, med huvudet pekade nedåt.
    4. Sätt in nålen, kant sidan uppåt, i musens vänstra sida intraperitoneal (IP) utrymme. Bekräfta inträde i IP-utrymmet genom att dra tillbaka en liten volym. Det bör inte finnas färg vid basen av nålen när du ritar tillbaka i IP-utrymmet.
    5. Injicera lämplig volym av D-Luciferin för en dos på 150 mg/kg.
    6. Omedelbart efter D-Luciferin administration, starta en timer och Placera musen platt på ryggen i bildenheten med näsan i näsan konen och se till att 1,5-2,5% isofluran administreras. Placera avdelare mellan varje mus om du avbildar flera möss. Se till att möss placeras så plant som möjligt (dvs. inte lutar åt ena sidan).
    7. Klicka på rutorna självlysande och fotografi och klicka sedan på Hämta i Kontrollpanelen för förvärv.
  6. Kontinuerligt förvärva bioluminescerande bilder tills topp signalen uppnås och använda bilden med Peak bioluminescerande signal för analys.
  7. Efter avbildning, returnera musen till sin bur och övervaka i 15 minuter för att säkerställa full återhämtning.
  8. Bild 2-3 gånger i veckan under experimentets varaktighet.

7. kvantifiering av antalet metastaser och deras storlek

Obs: den tid som metastaser tillåts växa bör bestämmas för varje cell linje och mus stam, och kommer att påverkas av antalet injicerade celler.

  1. Euthanize möss enligt standard institutionella riktlinjer.
  2. Isolera och ta bort lungorna från varje mus och skölj i 1x PBS för att avlägsna överflödigt blod.
  3. Försiktigt separera lungorna i lober.
  4. Hämta bilder av ZsGreen-metastaser i loberna vid 10X i ljust fält och fluorescens med ett fluorescerande stereoskop med ett GFP Wideband-filter (excitation 470/40x).
    Observera: Behåll samma förstoring och ljusstyrka för alla samplingar. Den förstoring som används kan variera beroende på storlek, antal och ljusstyrka för metastaser samt synfält för det Mikroskop som används.
  5. Använd bildanalysprogram vara för att kvantifiera storleken och antalet metastaser från bilderna.
    Obs: protokollet för bildanalys är programvara beroende och kan optimeras med tumörer från steg 3. Alternativt kan du räkna antalet metastaser i varje lunga manuellt med hjälp av fluorescerande stereoskop. Protokoll kan pausas här och steg 8 kan göras när som helst efter alla in vivo bilder har samlats in.

8. behandling och analys av data från de bilder som erhållits med in vivo levande djur avbildning enhet

  1. Öppna alla bildfiler för varje mus i bildprogram varan.
    Obs: Använd bilden med den högsta bioluminescerande signalen för analys
  2. Se till att enheterna är i strålglans för bioluminescerande data och effektivitet för fluorescerande data genom att klicka på pilen längst upp till vänster i bildfönstret och ändra den till lämplig enhet.
  3. Använd bilden från den senaste tidpunkten för att skapa en intresse region (ROI) enligt följande.
    1. Klicka på ROI-verktyg i fönstret verktygspalett . Infoga en ROI genom att klicka på pilen och välja 1.
    2. Klicka på gränsen för ROI och flytta den över musens bröstkorg. Justera storleken på ROI så att den täcker musens bröstkorg och utesluter inte signal.
  4. Klicka på Mät ROIs och kopiera eller Skriv in RAW-numret i ett Excel-blad.
    Anmärkning: för bioluminescerande data väljer du det totala flödet (fotoner/sekund), vilket är summan av all lyster i ROI. Eftersom metastaser inte nödvändigtvis växer enhetligt, är det totala flödet att föredra framför genomsnittlig lyster eftersom det mäter summan av den metastatiska bördan. På liknande sätt, för fluorescerande data, den totala verkningsgraden% (utsläpp ljus (fotoner/sekund)/excitation ljus (fotoner/sekund)) bör användas i stället för genomsnittlig effektivitet.
  5. Högerklicka i bildfilen för att kopiera ROI som används i steg 8,3 och klistra in den i varje bildfil.
    Anmärkning: vid kvantifiering av fluorescerande bilder, kvantifiera samma region på en mus som var avbildad utan metastaser. Använd denna signal som bakgrunds signal och subtrahera den från varje fluorescerande metastaser-innehållande mus bild som erhållits.
  6. Flytta inklistrade ROIs över samma region som valts i steg 8.3.4 för varje bild och upprepa steg 8,4.
  7. Rita och analysera rådata enligt följande (se kompletterande tabell 2).
    1. Gör en logg10 omvandling av rådata för varje mus med hjälp av den angivna formeln(kompletterande tabell 2) och Plot som i figur 2D och figur 4F. Log10 Transformation linjärisera tillväxtkurvan som tenderar att vara geometriska och minimerar heteroscedasticitet.
    2. Med linjär regression beräknar du lutningen på den monterade linjen till log10 omvandlade data för varje mus plottas i steg 8.7.1 (kompletterande tabell 2). Referera till formeln i kompletterande tabell 2 för att passa linjen och beräkna lutningen i ett steg.
    3. Plotta de numeriska värdena i backarna som i figur 2E och figur 4G. Använd en students t-test eller enkelriktad ANOVA (för mer än 2 grupper) på sluttningarna för att avgöra statistisk signifikans.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att demonstrera ovanstående tillvägagångssätt utförde vi ett proof of Concept-experiment där en kritisk replikeringsfaktor, RPA3 slogs ned i en metastaserad mus bröstcancer cellinjer (4T122). Medan protokollet beskriver märkning cellerna med både luciferas och fluorescerande proteiner före genetisk manipulation, vi använde en modifierad metod eftersom RNAi vektorer också leverera zsgreen (figur 2a). Först, 4T1 celler var stabilt sensorik med en lentiviral konstruera kodning Firefly luciferas och hygromycin resistens (phage-luciferas-IRES-hygro). Efter hygromycin urval, en luciferas assay utfördes för att bekräfta stabilt uttryck för Firefly luciferas (figur 2a). Därefter var 4T1-luciferase celler stabilt sensorik med retrovirala vektorer som uttrycker zsgreen och antingen en kontroll miR30-baserade shRNA, eller en miR30-baserade shRNA tidigare visat sig effektivt rikta mus RPA316,23,24. Cellerna injicerades sedan i möss via laterala svans ven och in vivo bioluminescerande signal mättes två gånger i veckan för att övervaka den metastaserande bördan (figur 2B, C). Log10 omvandlas signalen för varje mus plottas som metastatisk börda över tiden (figur 2D) och sluttningarna av varje tomt fastställdes (figur 2E). Dessa data visar förändringstakten i metastaserad börda reduceras signifikant med RPA3 knockdown jämfört med kontrollceller. Även om skillnaderna är slående, dessa uppgifter enbart inte tillåter oss att avgöra om den minskade metastaserande bördan är resultatet av mindre metastaser eller på grund av långsammare tillväxt av metastaser. Därför, den ZsGreen-märkta metastaser i lungorna analyserades också i slutet av experimentet. Möss som injicerades med RPA3-knockdown-celler hade nästan inga metastaser i lungorna, medan kontroll möss hade många stora metastaser (figur 3). Dessutom var de metastaser som formades från RPA3-knockdown-celler klart mindre än kontroll 4T1-metastaser (figur 3A). I enlighet med våra manuella inventeringar (figur 3B) räknade bildanalysprogram betydligt mindre metastaser i RPA3 knockdown-möss (figur 3C). Dessutom var den totala metastatiska bördan i lungorna (summan av områdena för varje metastaser i millimeter) också drastiskt minskat med RPA3 knockdown (figur 3D). Slutligen var storleken på de enskilda metastaser som bildas i RPA3 knockdown möss i allmänhet mycket mindre än de i kontroll möss (figur 3E). Förutom de stora metastaser i kontroll möss, vi observerar många små metastaser också, men kan inte avgöra om dessa är tumörceller som seedade lungan och inte växa eller om de är tumörceller skjul från en av de större metastaser som re-seedade lungan på en ny plats (figur 3E). Kollektivt dessa data visar att RPA3 krävs för metastaser bildas av 4T1 celler. Dessa fynd förväntades eftersom vårt tidigare arbete visade att RPA3 knock down-celler signifikant reducerade förmågan att bilda metastaser i lungorna efter svans venen injektion16. Emellertid, detta experiment visar hur användningen levande djur avbildning och fluorescerande kvantifiering av metastaser antal och storlek kan användas för att avgöra om förändringar i metastatisk börda beror på skillnader i metastaserad kolonisering eller tillväxt.

För att visa hur denna metod kan användas för att besvara en mer biologiskt relevant fråga, frågade vi om YAP och Taz krävs för metastaserande kolonisering och efterföljande tillväxt i denna uterustransplantat modell av bröstcancer. Uttrycket och aktiviteten av YAP eller Taz ökar i många cancerformer jämfört med normal vävnad och detta är prediktivt för dålig patientresultat25,26,27,28,29. Dessutom har flera studier inblandade YAP, Taz, eller teads, den kritiska YAP/Taz-bindande partners, i metastaser15,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42, 43,44,45,46,47,48,49,50,51,52. Med tanke på dessa uppgifter vi använt vår metod för att testa om YAP och TAZ krävs för metastaser bildning och tillväxt. För detta använder vi en antiretrovirala vektor uttrycker tandem miR30-baserade shRNAs inriktning både YAP och TAZ. Som visad, detta tandem shRNA effektivt minskar YAP och TAZ proteinuttryck och transkriptionell aktivitet i 4T1 celler (figur 4a, B). 4T1-luciferase celler var stabilt sensorik med en zsgreen-uttrycker version av denna tandem YAP/Taz shRNA vektor eller en kontroll miR30-baserade shRNA (figur 4C) och sedan analyseras med svans ven injektioner i uterustransplantat Balb/c möss. Som framgår av figur 4var den hastighet med vilken metastatisk börda ökade signifikant snabbare hos de möss som injicerades med kontrollceller jämfört med de möss som injicerades med YAP/Taz knockdown-celler (figur 4D-F). Signifikant färre metastaser bildas i möss injiceras med YAP/TAZ knockdown celler jämfört med möss med kontrollceller oavsett om de räknas manuellt (figur 5A, B) eller använda bildanalysprogram varan (figur 5C). Inte bara gjorde många fler metastaser form i kontroll möss, men de var i allmänhet större (figur 5E). Konsekvent, den metastaserande bördan i lungorna (totalt metastaser område i mm) minskade också drastiskt med YAP/TAZ knockdown (figur 5D). Det är viktigt att notera att när metastaser är stora och nära varandra, programvaran kan inte skilja distinkta metastaser. Detta var fallet för några metastaser i kontroll möss (mus 3 och mus 7). Sålunda, det är viktigt att kontrollera produktionen av bildanalysprogram vara för att säkerställa att det är korrekt mätning av området av enstaka tumörer. Det är också därför det är viktigt att optimera antalet celler som injiceras och längden på experimentet. Kollektivt, dessa data visar att YAP och Taz krävs för att upprätthålla den hastighet med vilken metastatisk börda ökar i en uterustransplantat murin modell av metastaserad bröstcancer och att detta beror på oförmåga metastaser att bilda och minskad tillväxt av de få metastaser som gjorde form.

Figure 1
Figur 1: schematiskt protokoll. Alla nödvändiga virus förpackas först i HEK-293FT-celler. De önskade cellerna för studien är då samtidigt infekterade med luciferas och fluorescerande virus som varje uttrycker en unik däggdjurs substans val av läkemedel. Infekterade celler sedan utvidgas i lämpliga medier som innehåller båda läkemedlen att välja för stabilt sensorik celler uttrycker både luciferas och fluorescerande protein. Uttryck för båda etiketterna bekräftas enligt beskrivningen i protokollet. De märkta cellerna är sedan omvandlas med ett tredje virus a som innehåller genetisk manipulation (miR30 shRNA) och en tredje unika drogen val Gene. Efter val med den tredje drogen, cellerna injiceras i möss via laterala svans ven. Metastaserad börda övervakas i möss under hela experimentet med ett in vivo levande djur avbildningssystem. I slutet av experimentet, möss är euthanized, och bilder av hela lungorna tas med hjälp av en fluorescerande dissekera Mikroskop, och sedan används för att mäta antalet och storleken på metastaser. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Luciferase-baserade in vivo levande djur Imaging visar att RPA3 knockdown minskar bröstcancer metastaserande börda. (A) schematiskt visar hur cellerna genererades för denna in vivo-studie. 4T1 celler var stabilt sensorik med en lentivirus kodning luciferas och hygromycin resistens. Infekterade celler valdes med 600 μg/ml hygromycin B i en vecka och sedan mättes luciferas aktivitet i föräldrarnas eller 4T1-luciferas celler med hjälp av en luciferas reporter kit och plattan läsare (n = 1 experiment med replikat brunnar i genomsnitt). 4T1-Luciferase celler var sedan infekterade med retrovirus som levererar ZsGreen och miR30 shRNAs inriktning antingen mCherry (kontroll) eller mRPA3. Puromycin Selection (2,5 μg/mL) i 3 dagar användes för att välja för stabil integration av viruset. (B-E) 4T1-luciferase celler stabilt uttrycker ZsGreen och kontroll (SH-mcherry) eller mRPA3 (SH-mRPA3-431) shrnas injicerades i möss och avbildas för bioluminescens på de angivna dagarna som beskrivs i protokollet. (B &Amp; C) Bioluminescerande bilder för en representativ mus i varje grupp på den angivna dagen efter injektion (D) Plot av log10 omvandlas luciferas signal mätt för varje mus över loppet av experimentet. E) spridningsdiagram med medelvärde (heldragen linje) för varje mus lutning i D (n = 6 för sh-Control och 8 för sh-mRPA3-431). Statistisk signifikans testades med en students t -test; * p ≤ 0,05. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: kvantifiering av fluorescerande metastaser avslöjar att RPA3 knockdown förebygger metastaserande kolonisering och efterföljande tillväxt av bröstcancerceller. (A) fluorescerande (vänster) och brightfield (höger) bilder av representativa lober från varje mus injiceras i figur 2 21 dagar efter injektion. Asterisker (*) indikerade gröna autofluorescent bronkerna. (C-E) Bildanalysprogram (se tabell över material) användes för att identifiera och mäta objekt med hjälp av en intensitetströskel på 25 till 100 och en storleks tröskel på 0,01 mm2 till oändlighet. (B &Amp; C) Punktdiagram med medelvärdet (solid stapel) av det totala antalet metastaser i lungorna av varje mus när de räknas (B) med bildanalysprogram (C). Dden totala areal (mm) av lunga som mättes med bildanalysprogram ritas som metastaserande börda med medelvärdet som indikeras av en solid stapel. (E) storleken på varje metastaser är plottas för varje mus. Kontrollera möss indikeras av de blåa prickarna och mRPA3 knockdown möss av de röda prickarna. Observera att skalstapeln är separerad vid 1 mm för att göra det lättare att visualisera storlek och antal små metastaser (n = 6 sh-Control, 8 sh-mRPA3-431). Statistisk signifikans testades med en students t -test; p = 0,06; * * p ≤ 0,01. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: YAP/Taz knockdown minskar bröstcancer metastaserande börda. (A & B) 4T1 celler som stabilt uttrycker miR30-baserad kontroll (mcherry) eller tandem YAP/Taz shrnas (SH-mYAP1/mTAZ6) analyserades av Western blot-analys(a) eller transfekterade med en YAP/Taz-tead luciferas reporter konstruera och analyseras för YAP/Taz-tead transkriptionell aktivitet som beskrivitstidigare 15,16 (B) (n = 5 för kontroll och 4 för YAP1/TAZ6). (C) schematiskt visar hur cellerna genererades för in vivo-studien. 4T1-Luciferase celler var infekterade med retrovirus som levererar ZsGreen och antingen en miR30 shRNA inriktning mCherry (kontroll) eller tandem miR30 shRNAs inriktning både mYAP och mTAZ. Infekterade celler valdes i Puromycin (2,5 μg/mL) i 3 dagar. 4T1-luciferase celler stabilt uttrycker ZsGreen och kontroll (SH-mCherry) eller YAP/TAZ (SH-mYAP1/mTAZ1) shRNAs sedan injiceras i möss och avbildas för bioluminescens av den injicerade dagar. (D &Amp; E) Bioluminescerande bilder för en representativ mus i varje grupp på den angivna dagen efter injektionen. (F) Plot av log10 transformerade luciferas signal mäts för varje mus under loppet av experimentet. G) spridningsdiagram med medelvärde (fast stapel) för varje mus lutning i F (n = 7 för sh-Control och 8 för sh-mRPA3-431). Medelvärdet indikeras av en heldragen linje. Statistisk signifikans testades med en students t -test; p = 0,06; #, p ≤ 0,01; ***. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: YAP och Taz krävs för metastaserande bröstcancerceller att kolonisera lungorna. (A) fluorescerande (vänster) och brightfield (höger) bilder av representativa lober från varje mus injiceras i figur 4 21 dagar efter injektion. (C-E) Bilder bearbetades med bildanalysprogram som beskrivs i figur 3. (B &Amp; C) Punktdiagram med medelvärdet (solid stapel) av det totala antalet metastaser i lungorna av varje mus när de räknas manuellt (B) eller genom bildanalysprogram (C). D) den totala arealen av alla metastaser (mm) mättes med bildanalysprogram vara och plottas som metastaserande börda med medelvärdet (solid bar). (E) storleken på varje metastaser är plottas för varje mus. Kontrollera möss indikeras av de blå prickarna och sh-mYAP1/mTAZ6 knockdown möss av de röda prickarna. Observera att skalstapeln är separerad vid 1 mm för att bättre visualisera storlek och antal små metastaser (n = 7 sh-Control, 8 sh-mYA1/mTAZ6). Medelvärdet indikeras av en heldragen linje. Statistisk signifikans testades med en students t -test; * p ≤ 0,05, * *, p ≤ 0,01; **. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande tabell 1: tabell över vektorer. Alla vektorer som används listas och nya vektorer beskrivs. Standard molekylärbiologiska tekniker användes för att klona nya vektorer och sekvenser för nyligen beskrivna 97-mer shRNA ingår. Citeringar hänvisar till: [1]53, [2]16, [3]54vänligen klicka här för att ladda ner denna tabell.

Kompletterande tabell 2: exempel på databehandling och analys av in vivo-levande djur. Kalkylblad som visar hur rådata från in vivo levande djur bilder konverteras för analys som beskrivs i steg 6,7 och 6,8. Rådata som erhållits från in vivo levande djur avbildning omvandlas med hjälp av en log10 omvandling. Förändringstakten i metastatisk börda beräknas för varje mus genom att beräkna lutningen som genereras av log10 transformerade data. Exempel på detta är luciferas-analys från figur 2. Kolumnerna är färgkodade för att indikera vilka data som användes för att generera varje lutnings värde och formlerna bäddas in i kalkylarket. Att dubbelklicka på brunnen kommer att avslöja den formel som används för att bearbeta data. Vänligen klicka här för att ladda ner denna tabell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritiska steg i metoden
Det är viktigt att optimera antalet injicerade celler (steg 3) för en given cell linje och mus stam eftersom detta kan i hög grad påverka antalet metastaser som bildar och längden på experimentet. Om alltför många celler injiceras eller metastaser växa för länge, metastaser kan vara svårt att räkna att göra effekterna av genetisk manipulation svårt att bedöma. Men, om alltför få celler injiceras, få eller inga metastaser kan bildas. Därför bör ett preliminärt experiment göras med hjälp av olika antal celler för att bestämma det optimala antalet och hur lång tid som metastaser växer. För att säkerställa ett konsekvent antal metastaser inom en grupp är det viktigt att injicera lika många livskraftiga celler i varje mus. Eftersom celler kan bosätta sig i både röret och sprutan, bör cellerna försiktigt återsuspenderas innan du laddar sprutan, och cellsuspensioner bör inte lämnas i sprutan för länge (steg 4.3.2). Cellernas viabilitet minskar ju längre cellerna är i suspensionen, så tiden mellan trypsinization och injektion av cellerna bör inte vara mer än en timme (steg 4.2.5). Luftbubblor och stora klumpar av celler bör inte injiceras eftersom dessa kan orsaka embolier som dödar musen. Dessutom kan dra celler upp genom nålen skjuvning dem, så sprutan bör laddas utan nålen. För att bekräfta att ett relativt lika antal celler injicerades, kan in vivo levande djur bilder tas strax efter injektionen (figur 2B, figur 4D).

Noggrann och konsekvent kvantifiering av den bioluminescerande signalen är viktig och beroende av att cellerna tar upp och metaboliserar D-Luciferin. Detta kan påverkas av många variabler, inklusive, dosen av D-Luciferin, tidpunkten för injektion, mus kroppstemperatur, hur sövda musen är när injiceras, och hur en mus är placerad i anestesi kammaren före avbildning. Därför är det viktigt att hålla dessa steg konsekventa för alla möss och bildsessioner. Vi använde en värmedyna för att bibehålla konsistent mus kroppstemperatur i anestesi kammaren. Eftersom signalen måste tränga igenom vävnaden för både bioluminescerande och fluorescerande detektion, är det också viktigt att hålla muspositionen konsekvent för varje bild (platt på ryggen fungerar bäst för avbildning av lungorna). Kvantifiering av fluorescerande bilder från in vivo levande djur avbildning bör alltid göras med hjälp av effektivitet% enheter eftersom detta möjliggör lämplig jämförelse mellan bilder. Likaså bör total Flux (fotoner/sekund) alltid användas vid kvantifiering av bioluminescerande bilder. För analys av metastatisk börda omvandlar log10 -transformationen tillväxtkurvan (innan maximal signal uppnåtts) till en linjär komplott som var nödvändig för lutnings analysen.

Ändringar och felsökning av metoden
I det framlade protokollet en befolkning av celler är först stabilt sensorik med ett fluorescerande protein och luciferase, därefter som befolkningen är sensorik med endera en kontrollera vektorn eller en vektor som riktar genen av intresserar. Detta säkerställer att båda cellpopulationer har liknande fluorescerande protein och luciferas uttryck. Men som ett alternativ, viral vektorer som samtidigt levererar två av dessa komponenter kan utnyttjas. Faktum är att i de representativa experiment som vi använde ZsGreen uttrycker retrovirala vektorer för att uttrycka Helgeen i 4T1-luciferase celler. Det rekommenderas att uttrycket av luciferas och fluorescerande protein analyseras i alla cellgrupper efter genen av intresse ändras. Olika uttrycks nivåer mellan grupper kan försvåra tolkningen av data, så det är bäst om de olika grupperna har liknande uttryck för både fluorescerande protein och luciferase. Dessutom, röda blodkroppar kan vara autofluorescent och kan göra det svårt att visualisera fluorescerande metastaser i lungorna. Om så är fallet, röda blodkroppar kan rensas från lungorna av PBS perfusion under eutanasi att minska autofluorescent bakgrund (lämplig eutanasi tekniker och riktlinjer bör följas). Även om skillnaderna mellan kontroll-och knockdown grupper i våra representativa experiment är dramatiska, är den inneboende variationen mellan mus och mus som ofta finns i in vivo-metastaser-analyser uppenbar i kontroll möss (figur 3b och figur 5b). När denna variation är hög, kan det göra det svårt att avgöra omfattningen av knockdown effekt. En alternativ metod som kan användas för att minska denna variation är att märka kontrollceller och knockdown celler med distinkta fluorescerande proteiner och distinkta luciferas enzymer och sedan blanda de två populationerna i lika antal och injicera blandningen. Till exempel, kontrollceller stabilt uttrycker tomat och Renilla luciferas kan blandas med knockdown celler uttrycker zsgreen och Firefly luciferas. In vivo levande djur avbildning enheter kan skilja Renilla luciferas från Firefly luciferas, och tomat från zsgreen, så antingen fluorescens eller luminiscens kan användas för att självständigt kvantifiera varje cellpopulation. I själva verket har Dual luciferas avbildning av 4T1 celler som växer som primär tumörer i levande djur visats med hjälp av en in vivo levande djur avbildning enhet4. Det är dock viktigt att notera att det kan finnas överlappningar i fluorescerande signal, alltså ett spektral unmixing steg (se tillverkarens riktlinjer) bör ingå i detta tillvägagångssätt. Dessutom bör Renilla luciferas och Firefly luciferas avbildas separat med en tillräcklig tidsfördröjning som gör det möjligt för den första luciferas signalen inte längre kan upptäckas före avbildning den andra. Användning av distinkta fluoroforer gör fortfarande att antalet och storleken på metastaser i lungorna kan kvantifieras16. Att testa metastaserad kolonisering och tillväxt i andra organ förutom lungorna detta protokoll kan ändras och användas för intrakardiell och Portal venen injektioner9,10.

Metodens begränsningar
Använda en in vivo levande djur avbildning enhet för att förvärva realtid metastaserande börda i samband med fluorescerande märkta cancerceller ger en kraftfull metod för att assay metastaserande kolonisering och efterföljande tillväxt; Det finns dock begränsningar i denna strategi. Vissa gener kan krävas för medfödda cellproliferation snarare än specifika roller i metastaser. In vitro cell proliferation analyser kan göras före in vivo experiment för att avgöra om genen stör in vitro-tillväxt. Vid avbildning ett levande djur, den bioluminescerande eller fluorescerande signalen från metastaser måste vara stark nog att passera genom vävnaden. Dessutom, de optiska egenskaperna (dvs. absorption och spridning) av vävnaden påverkar också detektion55. Magnetiseringen ljuskälla måste kunna passera genom vävnad för att excitera fluorescerande märkta cancerceller och bioluminescens har ett större dynamiskt omfång än fluorescens. Således, även om fluorescens kan användas för levande djur avbildning, Mareld är att föredra för att upptäcka signalen i inre organ. Dessutom kan vissa immunkompetenta mus stammar avvisa celler som uttrycker fluorescerande proteiner. Faktum är att vi fann att celler som uttrycker tomat, GFP eller mCherry förkastades eller ner regleras fluorophore när de växer i BALB/c möss (data visas inte och15). Emellertid, som visats här (figur 3 och figur 5) och tidigare15,16, zsgreen-märkta celler är detekterbara i dessa möss. I fall där fluorescerande protein uttrycket blir omöjlig att upptäcka, ett annat sätt att kvantifiera den relativa metastaserande koloniseringen är att använda qPCR för att kvantifiera antingen fluorescerande genen eller en annan gen i den integrerade viral Vector15. Även om en in vivo levande djur avbildning enhet kan du upptäcka förändringar i metastatisk börda, det tillåter inte en att avgöra om dessa förändringar beror på förändrad storlek eller antal metastaser. Det ger inte heller rumslig information om placeringen av metastaser. Dessutom kan styrkan i signalen påverkas av hur djupt i vävnaden det är.

Metodens betydelse och eventuella framtida tillämpningar
Det finns många sätt på vilka den här metoden kan ändras för att få mer eller annan information. En mängd olika cancer cellinjer inklusive humana cancer cell linjer eller patient härrör xenograft kan användas i denna analys. Andra musmodeller kan också användas, inklusive transgena eller knockout möss som utformats för att testa hur inriktning proteiner tillverkade av stromaceller påverkar metastaserande kolonisering och tillväxt av de injicerade cancercellerna. Om det finns flera kandidat gener som ska testas, kan denna metod multiplexeras eftersom in vivo levande djur bildenheter kan upptäcka och särskilja ett brett spektrum av fluorofotar. Detta skulle minska antalet möss som krävs och öka antalet mål som kan testas. In vivo levande djur avbildning kan också kombineras med röntgen eller CT9 Imaging för att ge en mycket mer rumslig information om placeringen av metastaser. Slutligen, detta tillvägagångssätt kan ändras till assay mer specifika steg inom den metastaserande koloniseringen kaskad. Till exempel, de steg som är involverade i tumör cell seedning (intravaskulär överlevnad, extravasering, och post extravasering överlevnad) kan särskiljas genom att kvantifiera antalet tumörceller i lungorna vid flera tidpunkter inom de första 3 dagarna efter injektion (t. ex. gjort här16). I detta fall kan lungorna också färgas med vaskulära markörer och avbildas ex vivo att bestämma andelen cancerceller som har förhindra vid varje tidpunkt punkt56,57.

Sammanfattnings, användning av realtid in vivo levande djur avbildning av fluorescerande och självlysande cancerceller efter svans venen injektion möjliggör en mer detaljerad analys av hur en kandidat gen eller gener påverkar metastaserande kolonisering och efterföljande tillväxt. Detta tillvägagångssätt är snabbare och billigare än autoktona musmodeller och undviker några av de förbehåll för spontana metastaser modeller. Användningen av både fluorescens och luminiscens som ett sätt att upptäcka och kvantifiera metastaser ger forskarna oberoende avläsning som förbättrar förtroendet för resultaten och möjliggör flexibilitet i experimentell design. Användning av fluorescens för att kvantifiera metastaser storlek och antal undviker behovet av tidskrävande och potentiellt kostsamma histologisk bearbetning och analys, och möjliggör ytterligare användning av hela vävnader. Protokollet kan användas med ett antal olika tekniker för att manipulera uttrycket eller funktionen av kandidat genen, såsom RNAi, transgenens Expression, eller CRISPR/CAS-medierad redigering, och kan också användas för att testa små molekyler, funktion blockerar antikroppar, eller andra potentiella terapeutiska föreningar. Som nämnts ovan, flera enkla ändringar kan göras för att förbättra analysen och ge ytterligare information. Detta tillvägagångssätt är ett idealiskt sätt att identifiera och testa Pro-metastatiska gener som har terapeutisk potential för behandling av cancer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Emily Norton för att ha hjälpt till med virusinfektioner och kritisk läsning av manuskriptet. Vi tackar också Ryan Kanai för hjälp med att förvärva bilder av lungorna och Kate E. Tubbesing för hjälp med bildanalys av de gröna metastaser i lungorna. Vi tackar djur forskningsanläggningen personal för deras stöd och för hjälp vid utarbetandet av denna video. Detta arbete stöddes av en Susan G. Komen karriär katalysator Grant som tilldelas J.M.L. (#CCR17477184).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% SDS-PAGE Gel For western blot
2.5% Trypsin Gibco 15090-046 Trypsin for tissue culture
96 well flat bottom white assay plate Corning 3922 For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Alcohol wipes For sterolizing the injection site before tail vein injecitons
BALB/C mice (female, 6 weeks) Taconic BALB-F For tail vein metastatic colonization and burden assays
BSA regular VWR Ameresco 97061-416 For western blot
Cell lysis buffer Cell Signaling For collecting protien samples
Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 μm Celltreat 40-229749-CS For filtering viral supernatant
CO2 and euthanasia chamber For euthanasing the mice
Dual-luciferase reporter assay kit Promega E1960 For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Dulbecco&39;s phosphate buffered saline Himedia TS1006 For PBS
EDTA VWR 97061-406 Used to dilute trypsin for tissue culture
FBS 100% US origin VWR 97068-085 Component of complete growth media
Fujifilm LAS-3000 gel imager Fujifilm For western blot
GAPDH(14C10) Rabibit mAb Cell Signaling 2118 For western blot
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugate Thermo Scientific 31460 For western blot
Human embryonic kidney cells, HEK-293FT Invitrogen R70007 Cell line used for packging virus
HyClone DMEM/High clucose GE Healthcare life sciences SH30243.01 Component of complete growth media
Hygromycin B, Ultra Pure Grade VWR Ameresco 97064-810 For antibiotic selection of infected cells
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA Molecular devices For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Imagej Used for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 & 100
Immuno-Blot PVDF Membrane Biorad 1620177 For western blot
Isoflurane For mouse anesthesia
IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device) PerkinElmer CLS136340 For in vivo imaging of metastatic burden
Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters) Leica Microsystems Microscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain
L-Glutamine Gibco 25030-081 Component of complete growth media
Lipofectamine 3000 Life technologies L3000008 For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection
Living Image 3.2 (image software program) PerkinElmer Software for IVIS
Mouse breast cancer cells, 4T1 Karmanos Cancer Institute Aslakson, CJ et al.,1992 Mouse metastatic breast cance cell line
Multi-Gauge version 3.0 Fujifilm Software for quantifying western blot band intensity
Opti-MEM (transfection buffer) Gibco 31985-062 For packaging virus and transfection
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122 Component of complete growth media
Pierce BCA protein assay kit Thermo Scientific 23225 For quantifying protein concentration
Pierce Phosphatase Inhibitor Mini Tablets Thermo Scientific A32957 Added to cell lysis buffer
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets Thermo Scientific A32953 Added to cell lysis buffer
Polybrene (hexadimethrine bromide) Sigma-Aldrich 45-H9268 For infection
Puromycin Sigma-Aldrich 45-P7255 For antibiotic selection of infected cells
Rodent restrainer For restraining mice during tail vein injeciton
SDS-PAGE running buffer For western blot
TAZ (V3886) Antibody Cell Signaling 4883 For western blot
TBST buffer For western blot
TC20 automated cell counter Bio-Rad For counting cells
Vectors See Table 1 for complete list of vectors
VWR Inverted Fluorescence Microscope VWR 89404-464 For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells
Western transfer buffer For western blot
XenoLight D-Luciferin K+ Salt PerkinElmer 122799 Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection) Roche 6365787001 For packaging virus
YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb Cell Signaling 14074 For western blot

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ferlay, J. S. I., et al. GLOBOCAN 2012 v1.0, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC CancerBase No. 11. Available from: http://globocan.iarc.fr (2013).
  2. Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127, (4), 679-695 (2006).
  3. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331, (6024), 1559-1564 (2011).
  4. Wendt, M. K., Molter, J., Flask, C. A., Schiemann, W. P. In vivo dual substrate bioluminescent imaging. Journal of Visualized Experiments. (56), (2011).
  5. Moret, R., et al. Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis. Journal of Visualized Experiments. (147), (2019).
  6. Lizardo, M. M., Sorensen, P. H. Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay. Journal of Visualized Experiments. (133), (2018).
  7. Mohanty, S., Xu, L. Experimental metastasis assay. Journal of Visualized Experiments. (42), (2010).
  8. Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clinical and Experimental Metastasis. 15, (3), 272-306 (1997).
  9. Lim, E., et al. Monitoring tumor metastases and osteolytic lesions with bioluminescence and micro CT imaging. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
  10. Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
  11. Cordero, A. B., Kwon, Y., Hua, X., Godwin, A. K. In vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer. Journal of Visualized Experiments. (42), (2010).
  12. Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
  13. Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. Journal of Visualized Experiments. (26), (2009).
  14. Oshima, G., et al. Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
  15. Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. Journal of Biological Chemistry. 294, (7), 2302-2317 (2019).
  16. Lamar, J. M., et al. The Hippo pathway target, YAP, promotes metastasis through its TEAD-interaction domain. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109, (37), 2441-2450 (2012).
  17. Warren, J. S. A., Xiao, Y., Lamar, J. M. YAP/TAZ Activation as a Target for Treating Metastatic Cancer. Cancers (Basel). 10, (4), (2018).
  18. Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cell Signal. 28, (11), 1761-1772 (2016).
  19. Harvey, K. F., Pfleger, C. M., Hariharan, I. K. The Drosophila Mst ortholog, hippo, restricts growth and cell proliferation and promotes apoptosis. Cell. 114, (4), 457-467 (2003).
  20. Journal of Visualized Experiments Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. (2019).
  21. Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
  22. Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Ressearch. 52, (6), 1399-1405 (1992).
  23. Fellmann, C., et al. Functional identification of optimized RNAi triggers using a massively parallel sensor assay. Molecular Cell. 41, (6), 733-746 (2011).
  24. Reticker-Flynn, N. E., et al. A combinatorial extracellular matrix platform identifies cell-extracellular matrix interactions that correlate with metastasis. Nature Communications. 3, 1122 (2012).
  25. Sun, Z., et al. Prognostic Value of Yes-Associated Protein 1 (YAP1) in Various Cancers: A Meta-Analysis. Public Library of Science One. 10, (8), 0135119 (2015).
  26. Feng, J., Ren, P., Gou, J., Li, Z. Prognostic significance of TAZ expression in various cancers: a meta-analysis. Onco Targets and Therapy. 9, 5235-5244 (2016).
  27. Ge, L., et al. Yes-associated protein expression in head and neck squamous cell carcinoma nodal metastasis. Public Library of Science One. 6, (11), 27529 (2011).
  28. Zhang, X., et al. The Hippo pathway transcriptional co-activator, YAP, is an ovarian cancer oncogene. Oncogene. 30, (25), 2810-2822 (2011).
  29. Vlug, E. J., et al. Nuclear localization of the transcriptional coactivator YAP is associated with invasive lobular breast cancer. Cellular Oncology (Dordrecht). 36, (5), 375-384 (2013).
  30. Kim, T., et al. MRTF potentiates TEAD-YAP transcriptional activity causing metastasis. European Molecular Biology Organization Journal. 36, (4), 520-535 (2017).
  31. Nallet-Staub, F., et al. Pro-invasive activity of the Hippo pathway effectors YAP and TAZ in cutaneous melanoma. Journal of Investigative Dermatology. 134, (1), 123-132 (2014).
  32. Hsu, Y. L., et al. Angiomotin decreases lung cancer progression by sequestering oncogenic YAP/TAZ and decreasing Cyr61 expression. Oncogene. 34, (31), 4056-4068 (2015).
  33. Lau, A. N., et al. Tumor-propagating cells and Yap/Taz activity contribute to lung tumor progression and metastasis. European Molecular Biology Organization Journal. 33, (5), 468-481 (2014).
  34. Gu, J. J., et al. Inactivation of ABL kinases suppresses non-small cell lung cancer metastasis. Journal of Clinical Investigation Insight. 1, (21), 89647 (2016).
  35. Diepenbruck, M., et al. Tead2 expression levels control the subcellular distribution of Yap and Taz, zyxin expression and epithelial-mesenchymal transition. Journal of Cell Science. 127, Pt 7 1523-1536 (2014).
  36. Han, S., et al. Suppression of miR-16 promotes tumor growth and metastasis through reversely regulating YAP1 in human cholangiocarcinoma. Oncotarget. 8, (34), 56635-56650 (2017).
  37. Yin, K., et al. Netrin-1 promotes metastasis of gastric cancer by regulating YAP activity. Biochemical Biophysical Research Communications. 496, (1), 76-82 (2018).
  38. Guo, L., et al. Knockdown of TAZ modifies triple-negative breast cancer cell sensitivity to EGFR inhibitors by regulating YAP expression. Oncology Reports. 36, (2), 729-736 (2016).
  39. Liu, Y. N., et al. Loss of Androgen-Regulated MicroRNA 1 Activates SRC and Promotes Prostate Cancer Bone Metastasis. Molecular and Cellular Biology. 35, (11), 1940-1951 (2015).
  40. Bartucci, M., et al. TAZ is required for metastatic activity and chemoresistance of breast cancer stem cells. Oncogene. 34, (6), 681-690 (2015).
  41. Wang, T., et al. YAP promotes breast cancer metastasis by repressing growth differentiation factor-15. Biochimica et Biophysica Acta Molecular Basis of Disease. 1864, 5 Pt A 1744-1753 (2018).
  42. Wang, J., Rouse, C., Jasper, J. S., Pendergast, A. M. ABL kinases promote breast cancer osteolytic metastasis by modulating tumor-bone interactions through TAZ and STAT5 signaling. Science Signaling. 9, (413), (2016).
  43. Sun, S., Irvine, K. D. Cellular Organization and Cytoskeletal Regulation of the Hippo Signaling Network. Trends in Cell Biology. 26, (9), 694-704 (2016).
  44. Sharif, G. M., et al. Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling. Oncogene. 34, (48), 5879-5889 (2015).
  45. Li, C., et al. A ROR1-HER3-lncRNA signalling axis modulates the Hippo-YAP pathway to regulate bone metastasis. Nature Cell Biology. 19, (2), 106-119 (2017).
  46. Pei, T., et al. YAP is a critical oncogene in human cholangiocarcinoma. Oncotarget. 6, (19), 17206-17220 (2015).
  47. Qiao, Y., et al. YAP Regulates Actin Dynamics through ARHGAP29 and Promotes Metastasis. Cell Reports. 19, (8), 1495-1502 (2017).
  48. Zhou, W., Li, X., Premont, R. T. Expanding functions of GIT Arf GTPase-activating proteins, PIX Rho guanine nucleotide exchange factors and GIT-PIX complexes. Journal of Cell Science. 129, (10), 1963-1974 (2016).
  49. Haemmerle, M., et al. Platelets reduce anoikis and promote metastasis by activating YAP1 signaling. Nature Communcations. 8, (1), 310 (2017).
  50. Liu, Y., et al. Increased TEAD4 expression and nuclear localization in colorectal cancer promote epithelial-mesenchymal transition and metastasis in a YAP-independent manner. Oncogene. 35, (21), 2789-2800 (2016).
  51. Hiemer, S. E., et al. A YAP/TAZ-Regulated Molecular Signature Is Associated with Oral Squamous Cell Carcinoma. Molecular Cancer Research. 13, (6), 957-968 (2015).
  52. Lee, H. J., et al. Fluid shear stress activates YAP1 to promote cancer cell motility. Nature Communications. 8, 14122 (2017).
  53. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology. 70, (8), 5701-5705 (1996).
  54. Mahoney, W. M., Hong, J. H., Yaffe, M. B., Farrance, I. K. The transcriptional co-activator TAZ interacts differentially with transcriptional enhancer factor-1 (TEF-1) family members. Biochemical Journal. 388, Pt 1 217-225 (2005).
  55. Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. Journal of Biomedical Optics. 10, (4), 41210 (2005).
  56. Chen, M. B., Lamar, J. M., Li, R., Hynes, R. O., Kamm, R. D. Elucidation of the Roles of Tumor Integrin beta1 in the Extravasation Stage of the Metastasis Cascade. Cancer Resesearch. 76, (9), 2513-2524 (2016).
  57. Labelle, M., Begum, S., Hynes, R. O. Direct signaling between platelets and cancer cells induces an epithelial-mesenchymal-like transition and promotes metastasis. Cancer Cell. 20, (5), 576-590 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics