Den beskrivna metoden kombinerar experimentella svans vener metastaser analyser med in vivo levande djur avbildning för att möjliggöra realtidsövervakning av bröstcancer metastaser bildning och tillväxt utöver kvantifiering av metastaser antal och storlek i lungorna.
Metastaser är den främsta orsaken till cancerrelaterade dödsfall och det finns begränsade terapeutiska alternativ för patienter med metastaserad sjukdom. Identifiering och testning av nya terapeutiska mål som underlättar utvecklingen av bättre behandlingar för metastaserande sjukdom kräver prekliniska in vivo-modeller. Demonstreras här är en uterustransplantat musmodell för testmetoder bröstcancer metastaserande kolonisering och efterföljande tillväxt. Metastaserande cancerceller är stabilt omvandlas med virala vektorer kodning Firefly luciferas och zsgreen proteiner. Kandidatgener är då stabilt manipulerade i luciferase/ZsGreen-uttrycker cancerceller och sedan cellerna injiceras i möss via laterala svans ven till assay metastaserande kolonisering och tillväxt. En in vivo bild anordning används sedan för att mäta bioluminescens eller fluorescens av tumörcellerna i de levande djuren för att kvantifiera förändringar i metastatisk börda över tiden. Uttrycket av fluorescerande protein gör att antalet och storleken av metastaser i lungorna som skall kvantifieras i slutet av experimentet utan behov av snittning eller histologisk färgning. Detta tillvägagångssätt erbjuder ett relativt snabbt och enkelt sätt att testa rollen av kandidaten gener i metastaserad kolonisering och tillväxt, och ger en hel del mer information än traditionella svans venen metastaser analyser. Med hjälp av denna metod, visar vi att samtidig knockdown av Ja associerade protein (YAP) och transkriptionella Co-aktivator med en PDZ-bindande motiv (TAZ) i bröstcancerceller leder till minskad metastaserande börda i lungorna och att denna minskade börda är resultatet av signifikant försämrad metastaserad kolonisering och minskad tillväxt av metastaser.
Cancer är fortfarande den näst vanligaste dödsorsaken i världen1 och metastaser är ansvarig för majoriteten av dessa dödsfall2,3. Men en begränsad förståelse av de molekylära mekanismerna som styr metastaserad kolonisering och efterföljande tillväxt har hindrat utvecklingen av effektiva behandlingar för metastaserande sjukdom. Identifiering av nya terapeutiska mål kräver ett test för att testa hur oroad uttryck eller funktion av en kandidat gen påverkar metastaser bildas och tillväxt. Även inhemska musmodeller har sina fördelar, de är tidskrävande och dyrt att generera, vilket gör dem mer lämpade för mål validering snarare än mål identifiering. Transplantation modellsystem där kandidaten genen är oroad i cancerceller in vitro-och sedan effekter på metastatisk potential bedöms in vivo, är billigare och högre genomströmning än autoktona modeller. Dessutom, viral vektorer för stabil leverans av RNAi, CRISPR/CAS9, och transgener är allmänt tillgängliga, vilket gör det relativt lätt att stör praktiskt taget någon gen eller gener av intresse i en cancer cellinjer. Denna metod kan också användas för att assay rollen av kandidaten gener i metastaserad kolonisering och tillväxt i mänskliga cancer cellinjer genom transplantation cellerna till immunkomprometterade eller humaniserade möss.
De två typer av analyser som används för att testa metastaser bildas genom transplanterade cancerceller in vivo är spontana metastaser-analyser och experimentella metastaser-analyser. I spontana metastaser analyser4,5, cancerceller injiceras i möss, tillåtet att bilda en primär tumör, och sedan spontan metastaser bildas och efterföljande tillväxt är analyseras. Styrkan i denna modell är att cellerna måste slutföra alla steg i den metastaserande processen för att bilda metastaserande tumörer. Emellertid, många cancer cellinjer inte metastasera effektivt i spontana metastaser modeller, och någon manipulation av de celler som påverkar primär tumörtillväxt kan blanda ihop resultaten av metastaser analysen. Experimentella metastaser analyser, där cancerceller injiceras direkt i cirkulationen, används för att undvika dessa fallgropar. Vanliga experimentella metastaser analyser inkluderar svansen ven injektion6,7,8 (och visas här), intrakardiell injektion9, och Portal Vein injektion10.
Syftet med det protokoll som presenteras här är att ge en in vivo experimentell metastaser analys som gör det möjligt för en forskare att övervaka metastaser bildas och tillväxt i realtid, samt att kvantifiera slutpunkt metastaser antal och storlek i lungorna av samma mus. För att åstadkomma detta, traditionella experimentella svans venen metastaser analyser6,7,8 kombineras med levande djur avbildning, med hjälp av en in vivo Imaging Device9,11,12,13,14. Tumörceller som stabilt uttrycker både luciferas och ett fluorescerande protein injiceras i möss via den laterala svans venen och därefter används in vivo-avbildningsapparaten för att mäta förändringar av metastatisk börda i lungorna över tid (figur 1). In vivo-enheten för levande djur kan dock inte särskilja eller mäta storleken på enskilda metastaser. Således, i slutet av experimentet, en fluorescerande stereomikroskop används för att räkna antalet och mäta storleken på fluorescerande metastaser i lungorna utan behov av snittning och histologi eller immunohistokemi (figur 1). Detta protokoll kan användas för att testa hur ändring av uttryck eller funktion av en kandidat gen påverkar metastaser bildas och tillväxt. Potentiella terapeutiska föreningar såsom små molekyler eller funktion blockerar antikroppar kan också testas.
För att demonstrera detta tillvägagångssätt utförde vi först ett proof of Concept-experiment där den viktiga replikeringsfaktorn, replikeringproteinet a3 (RPA3) slås ned i metastaserande mus bröstcancerceller. Vi visar att möss injiceras med RPA3 knockdown celler har signifikant mindre metastaserande börda vid varje tidpunkt jämfört med möss injiceras med kontrollceller. Analys av de metastaser som innehåller lungorna visar att denna minskade metastatisk börda är resultatet av signifikant minskad metastaserad kolonisering och försämrad tillväxt av de metastaser som bildas. För att ytterligare demonstrera denna teknik, vi testade om samtidig knock down av Ja tillhörande protein (YAP) och transkriptionella Co-aktivator med en PDZ-bindande motiv (TAZ) försämrar metastaserad kolonisering eller efterföljande tillväxt. YAP och Taz är två relaterade transkriptionella Co-aktivatorer som är de kritiska nedströms manipulatorer av Hippo vägen. Vi15,16 och andra har inblandad YAP och Taz i metastaser (ses över i17,18,19), vilket tyder på att dessa proteiner är bra terapeutiska mål. Konsekvent, vi fann att möss injiceras med YAP/TAZ knockdown celler hade signifikant minskad metastaserande börda. Analys av lungorna visade att YAP/TAZ knockdown celler bildade många färre metastaser och att de metastaser som gjorde formen var mindre. Dessa experiment visar hur experimentella metastaser gör det möjligt för en forskare att snabbt och billigt testa rollen av en kandidat gen i metastaser bildas och tillväxt. De visar vidare hur den kombinerade användningen av levande djur avbildning och fluorescerande kvantifiering av metastaser i hela lungorna gör det möjligt för forskaren att bättre förstå stegen vid metastaserad kolonisation.
Kritiska steg i metoden
Det är viktigt att optimera antalet injicerade celler (steg 3) för en given cell linje och mus stam eftersom detta kan i hög grad påverka antalet metastaser som bildar och längden på experimentet. Om alltför många celler injiceras eller metastaser växa för länge, metastaser kan vara svårt att räkna att göra effekterna av genetisk manipulation svårt att bedöma. Men, om alltför få celler injiceras, få eller inga metastaser kan bildas. Därför bör ett prelimin…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Emily Norton för att ha hjälpt till med virusinfektioner och kritisk läsning av manuskriptet. Vi tackar också Ryan Kanai för hjälp med att förvärva bilder av lungorna och Kate E. Tubbesing för hjälp med bildanalys av de gröna metastaser i lungorna. Vi tackar djur forskningsanläggningen personal för deras stöd och för hjälp vid utarbetandet av denna video. Detta arbete stöddes av en Susan G. Komen karriär katalysator Grant som tilldelas J.M.L. (#CCR17477184).
10% SDS-PAGE Gel | For western blot | ||
2.5% Trypsin | Gibco | 15090-046 | Trypsin for tissue culture |
96 well flat bottom white assay plate | Corning | 3922 | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells |
Alcohol wipes | For sterolizing the injection site before tail vein injecitons | ||
BALB/C mice (female, 6 weeks) | Taconic | BALB-F | For tail vein metastatic colonization and burden assays |
BSA regular | VWR Ameresco | 97061-416 | For western blot |
Cell lysis buffer | Cell Signaling | For collecting protien samples | |
Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 μm | Celltreat | 40-229749-CS | For filtering viral supernatant |
CO2 and euthanasia chamber | For euthanasing the mice | ||
Dual-luciferase reporter assay kit | Promega | E1960 | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells |
Dulbecco&39;s phosphate buffered saline | Himedia | TS1006 | For PBS |
EDTA | VWR | 97061-406 | Used to dilute trypsin for tissue culture |
FBS 100% US origin | VWR | 97068-085 | Component of complete growth media |
Fujifilm LAS-3000 gel imager | Fujifilm | For western blot | |
GAPDH(14C10) Rabibit mAb | Cell Signaling | 2118 | For western blot |
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugate | Thermo Scientific | 31460 | For western blot |
Human embryonic kidney cells, HEK-293FT | Invitrogen | R70007 | Cell line used for packging virus |
HyClone DMEM/High clucose | GE Healthcare life sciences | SH30243.01 | Component of complete growth media |
Hygromycin B, Ultra Pure Grade | VWR Ameresco | 97064-810 | For antibiotic selection of infected cells |
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA | Molecular devices | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells | |
Imagej | Used for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 & 100 | ||
Immuno-Blot PVDF Membrane | Biorad | 1620177 | For western blot |
Isoflurane | For mouse anesthesia | ||
IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device) | PerkinElmer | CLS136340 | For in vivo imaging of metastatic burden |
Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters) | Leica Microsystems | Microscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain | |
L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | Component of complete growth media |
Lipofectamine 3000 | Life technologies | L3000008 | For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection |
Living Image 3.2 (image software program) | PerkinElmer | Software for IVIS | |
Mouse breast cancer cells, 4T1 | Karmanos Cancer Institute | Aslakson, CJ et al.,1992 | Mouse metastatic breast cance cell line |
Multi-Gauge version 3.0 | Fujifilm | Software for quantifying western blot band intensity | |
Opti-MEM (transfection buffer) | Gibco | 31985-062 | For packaging virus and transfection |
Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Component of complete growth media |
Pierce BCA protein assay kit | Thermo Scientific | 23225 | For quantifying protein concentration |
Pierce Phosphatase Inhibitor Mini Tablets | Thermo Scientific | A32957 | Added to cell lysis buffer |
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets | Thermo Scientific | A32953 | Added to cell lysis buffer |
Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 45-H9268 | For infection |
Puromycin | Sigma-Aldrich | 45-P7255 | For antibiotic selection of infected cells |
Rodent restrainer | For restraining mice during tail vein injeciton | ||
SDS-PAGE running buffer | For western blot | ||
TAZ (V3886) Antibody | Cell Signaling | 4883 | For western blot |
TBST buffer | For western blot | ||
TC20 automated cell counter | Bio-Rad | For counting cells | |
Vectors | See Table 1 for complete list of vectors | ||
VWR Inverted Fluorescence Microscope | VWR | 89404-464 | For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells |
Western transfer buffer | For western blot | ||
XenoLight D-Luciferin K+ Salt | PerkinElmer | 122799 | Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images |
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection) | Roche | 6365787001 | For packaging virus |
YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb | Cell Signaling | 14074 | For western blot |