Enrichissement des tissus mammifères et des oocytes Xenopus avec du cholestérol

Biochemistry

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Summary

Deux méthodes d’enrichissement du cholestérol sont présentées : l’application de cyclodextrine saturée de cholestérol pour enrichir les tissus et les cellules des mammifères, et l’utilisation de dispersions à base de phospholipides enrichies de cholestérol (liposomes) pour enrichir les oocytes Xenopus. Ces méthodes sont instrumentales pour déterminer l’impact des niveaux élevés de cholestérol dans la fonction moléculaire, cellulaire, et d’organe.

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Slayden, A., North, K., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A. Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol. J. Vis. Exp. (157), e60734, doi:10.3791/60734 (2020).

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Abstract

L’enrichissement du cholestérol des tissus et des cellules des mammifères, y compris les oocytes Xenopus utilisés pour étudier la fonction cellulaire, peut être accompli en utilisant une variété de méthodes. Ici, nous décrivons deux approches importantes utilisées à cette fin. Tout d’abord, nous décrivons comment enrichir les tissus et les cellules avec du cholestérol à l’aide de cyclodextrine saturée de cholestérol à l’aide d’artères cérébrales (tissus) et de neurones hippocampiques (cellules) à titre d’exemples. Cette approche peut être utilisée pour n’importe quel type de tissu, cellules ou lignées cellulaires. Une approche alternative pour l’enrichissement du cholestérol implique l’utilisation de lipoprotéines de faible densité (LDL). L’avantage de cette approche est qu’elle utilise une partie de la machinerie naturelle d’homéostasie de cholestérol de la cellule. Cependant, alors que l’approche de la cyclodextrine peut être appliquée pour enrichir n’importe quel type d’intérêt cellulaire avec le cholestérol, l’approche LDL est limitée aux cellules qui expriment les récepteurs LDL (par exemple, les cellules hépatiques, les cellules dérivées de la moelle osseuse telles que les leucocytes sanguins et les macrophages tissulaires), et le niveau d’enrichissement dépend de la concentration et de la mobilité du récepteur LDL. En outre, les particules de LDL incluent d’autres lipides, ainsi l’accouchement de cholestérol est non spécifique. Deuxièmement, nous décrivons comment enrichir les oocytes Xenopus avec du cholestérol à l’aide d’une dispersion à base de phospholipid (c.-à-d. liposomes) qui comprend le cholestérol. Les ocytes Xenopus constituent un système d’expression hétérologue populaire utilisé pour étudier la fonction cellulaire et protéique. Pour l’approche d’enrichissement du cholestérol à base de cyclodextrine du tissu mammifère (artères cérébrales) et pour l’approche d’enrichissement du cholestérol à base de phospholipid des oocytes Xenopus, nous démontrons que les niveaux de cholestérol atteignent un maximum après 5 min d’incubation. Ce taux de cholestérol demeure constant pendant les périodes prolongées d’incubation (p. ex., 60 min). Ensemble, ces données fournissent la base pour des conditions temporelles optimisées pour l’enrichissement de cholestérol des tissus, des cellules, et des oocytes de Xénoopus pour des études fonctionnelles visant à interroger l’impact de l’enrichissement de cholestérol.

Introduction

Le cholestérol, un lipide cellulaire majeur, joue de nombreux rôles fonctionnels et structurels critiques1,2,3,4,5,6,7,8,9. De la régulation des propriétés physiques de la membrane plasmatique à assurer la viabilité cellulaire, la croissance, la prolifération, et servant de molécule de signalisation et de précurseur dans une pléthore de voies biochimiques, le cholestérol est un composant impératif nécessaire pour la fonction normale de cellules et d’organes. En conséquence, l’insuffisance de cholestérol a comme conséquence des malformations physiques graves et une série de désordres. D’autre part, même une petite augmentation du cholestérol au-dessus des niveaux physiologiques (2-3x) est cytotoxique1,2,10 et a été associée au développement de troubles, y compris cardio-vasculaire11,12,13 et les maladies neurodégénératives14,15,16,17. Ainsi, pour interroger les fonctions critiques du cholestérol et pour déterminer l’effet des changements dans les niveaux de cholestérol, différentes approches qui modifient la teneur en cholestérol dans les tissus, les cellules et les oocytes Xénoopeus ont été développées.

Modification des taux de cholestérol dans les tissus et les cellules des mammifères
Plusieurs approches peuvent être exploitées pour diminuer les niveaux de cholestérol dans les tissus et les cellules18. Une approche implique leur exposition aux statines dissoutes dans le sérum lipoprotéine-déficiente pour inhiber la réductase de HMG-CoA, qui contrôle le taux de synthèse de cholestérol19,20. Cependant, ces médicaments abaissant le cholestérol inhibent également la formation des produits non-sterol le long de la voie de mévalonate. Par conséquent, une petite quantité de mévalonate est ajoutée pour permettre la formation de ces produits21 et d’améliorer la spécificité de cette approche. Une autre approche pour réduire le taux de cholestérol implique l’utilisation de 'cyclodextrines. Ces monomers de glucopyranose possèdent une cavité hydrophobe interne avec un diamètre qui correspond à la taille des stérols22, ce qui facilite l’extraction du cholestérol des cellules, les appauvrissant ainsi de leur teneur en cholestérol indigène23. Un exemple est 2-hydroxypropyl-----cyclodextrine (HP-CD), un médicament préclinique actuellement testé pour le traitement de la maladie de type C Niemann-Pick, un trouble métabolique mortel héréditaire génétiquement héréditaire caractérisé par le stockage lysosomal de cholestérol24. Le niveau d’épuisement du cholestérol dépend du dérivé spécifique utilisé. Par exemple, HP-CD extrait le cholestérol avec une capacité inférieure au dérivé méthylé, méthyle--cyclodextrine (M-CD)24,25,26,27,28,29,30. Notamment, cependant, les cyclodextrines peuvent également extraire d’autres molécules hydrophobes en plus du cholestérol, ce qui peut alors entraîner des effets non spécifiques31. Contrairement à l’épuisement, les cellules et les tissus peuvent être spécifiquement enrichis avec le cholestérol par le traitement avec la cyclodextrine qui a été présaturée avec le cholestérol23. Cette approche peut également être utilisée comme un contrôle de la spécificité des cyclodextrines utilisées pour l’épuisement du cholestérol31. L’épuisement du cholestérol des tissus et des cellules est simple et peut être réalisé en exposant les cellules de 30 à 60 min à 5 mM M-CD dissous dans le milieu utilisé pour stocker les cellules. Cette approche peut entraîner une diminution de 50% de la teneur en cholestérol (par exemple, dans les neurones hippocampal32, les artères cérébrales rat33). D’autre part, la préparation du complexe de l’enrichissement du cholestérol et du cholestérol est plus complexe et sera décrite dans la section du protocole.

Une approche alternative à l’enrichissement des tissus et des cellules à l’aide de la cyclodextrine saturée de cholestérol implique l’utilisation de LDL, qui repose sur les récepteurs LDL exprimés dans les tissus / cellules18. Bien que cette approche offre l’avantage d’utiliser la machinerie naturelle d’homéostasie de cholestérol de la cellule, elle a plusieurs limites. Tout d’abord, les tissus et les cellules qui n’expriment pas le récepteur LDL ne peuvent pas être enrichis en utilisant cette approche. Deuxièmement, les particules LDL contiennent d’autres lipides en plus du cholestérol. Plus précisément, LDL est composé de la protéine ApoB100 (25%) et les lipides suivants (75 %) : 6 à 8 % de cholestérol, 45 à 50 % d’ester de cholestéle, 18 à 24 % de phospholipides et 4 à 8 % de triacylglycerols34. Ainsi, l’administration du cholestérol via les particules LDL n’est pas spécifique. Troisièmement, le pourcentage d’augmentation de la teneur en cholestérol par LDL dans les tissus et les cellules qui expriment le récepteur LDL peut être significativement inférieur à l’augmentation observée à l’aide de cyclodextrine saturée de cholestérol. Par exemple, dans une étude précédente, l’enrichissement des artères cérébrales rongeurs avec le cholestérol par l’intermédiaire de LDL a eu comme conséquence seulement une augmentation de 10-15% des niveaux de cholestérol35. En revanche, l’enrichissement de ces artères avec la cyclodextrine saturée de cholestérol tel que décrit dans la section du protocole a entraîné une augmentation de la teneur en cholestérol de 50 % (Voir la section des résultats représentatifs, figure 1).

Modification des taux de cholestérol chez les oocytes Xenopus
Les ocytes Xénoopeus constituent un système d’expression hétérologue couramment utilisé pour étudier la fonction cellulaire et protéique. Des études antérieures ont montré que le taux de cholestérol à la molaire phospholipide chez les oocytes Xenopus est de 0,5 à 0,136. En raison de ce niveau intrinsèque élevé de cholestérol, l’augmentation de la teneur en cholestérol dans ce système est difficile, mais peut être atteint en utilisant des dispersions faites à partir de phospholipides membranaires et le cholestérol. Les phospholipides que nous avons choisis à cette fin sont similaires à ceux utilisés pour former des bilayers de lipides planaires artificiels et comprennent L-phosphatidylethanolamine (POPE) et 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine (POPS), tel que décrit dans la section du protocole. Cette approche peut entraîner une augmentation de la teneur en cholestérol de 50 % (voir la section des résultats représentatifs, figure 2).

Une approche alternative à l’enrichissement des oocytes Xenopus avec des dispersions à base de phospholipid implique l’utilisation de cyclodextrine saturée de cholestérol, qui est similaire à la façon dont les tissus et les cellules sont enrichis. Cependant, nous avons constaté que cette approche était de faible reproductibilité et d’efficacité, avec une augmentation moyenne de 25 % de la teneur en cholestérol. Cela est peut-être dû à la capacité de chargement différente de ces deux approches (voir la section des résultats représentatifs, figure 3). En revanche, il a été démontré que l’utilisation de cyclodextrine pour épuiser le cholestérol des oocytes Xenopus peut entraîner une diminution de 40% de la teneur en cholestérol36.

Ici, nous nous concentrons sur l’enrichissement du cholestérol des tissus et des cellules de mammifères par l’application de cyclodextrine saturée de cholestérol, et des oocytes Xenopus utilisant des liposomes. Les deux approches peuvent être exploitées pour délimiter l’effet de l’augmentation des niveaux de cholestérol sur la fonction protéique. Les mécanismes de modulation de cholestérol de la fonction protéique peuvent impliquer des interactions directes8 et/ou des effets indirects9. Lorsque le cholestérol affecte la fonction protéique par le biais d’interactions directes, l’effet d’une augmentation du taux de cholestérol sur l’activité protéique est probablement indépendant du type cellulaire, du système d’expression ou de l’approche d’enrichissement. Par exemple, nous avons utilisé ces deux approches pour déterminer l’effet du cholestérol sur les canaux de potassium rectifiant intérieurement (GIRK) de G-protéine (GIRK) exprimés dans les myocytes auriculaires37, neurones hippocampiques32,38, HEK29339 cellules, et Oocytes Xenopus 32,37. Les résultats obtenus dans ces études étaient cohérents : dans les trois types de cellules de mammifères et dans les oocytes amphibiens, le cholestérol a augmenté la fonction du canal GIRK (voir la section des résultats représentatifs, figure 4, pour les neurones hippocampiques et les expériences correspondantes dans les oocytes Xenopus). En outre, les observations faites dans ces études étaient également compatibles avec les résultats des études menées dans les myocytes auriculaires37,40 et neurones hippocampiques32,38 fraîchement isolés des animaux soumis à un régime à taux de cholestérol élevé40. Notamment, l’enrichissement du cholestérol des neurones hippocampal à l’aide de M -CD a inversé l’effet de la thérapie d’atorvastatine utilisée pour répondre à l’impact de l’alimentation à taux élevé de cholestérol à la fois sur les niveaux de cholestérol et la fonction GIRK38. Dans d’autres études, nous avons étudié l’effet des mutations sur la sensibilité au cholestérol du canal de potassium rectifiant intérieurement Kir2.1 utilisant les ocytes Xenopus et les cellules HEK29341. Encore une fois, l’effet des mutations sur la sensibilité du canal était similaire dans les deux systèmes.

Les applications des deux méthodes d’enrichissement pour déterminer l’impact des niveaux élevés de cholestérol sur la fonction moléculaire, cellulaire et d’organe sont nombreuses. En particulier, l’utilisation de complexes cyclodextrine-cholestérol pour enrichir les cellules et les tissus est très fréquente en grande partie en raison de sa spécificité. Des exemples récents de cette approche incluent la détermination de l’impact du cholestérol sur l’activation du canal HERG et les mécanismes sous-jacents42, la découverte que le cholestérol active le récepteur couplé à la protéine G Smoothened pour promouvoir la signalisation hérisson43, et l’identification du rôle du cholestérol dans la biomécanique des cellules souches et l’adipogenèse par les protéines linker associées à la membrane44. Dans nos propres travaux, nous avons utilisé l’enrichissement des tissus mammifères avec le complexe de cholestérol M-CD: pour étudier l’effet de l’enrichissement du cholestérol sur la fonction de base et le profil pharmacologique des canaux de grande conductance de calcium et de tension (BK, MaxiK) dans le muscle lisse vasculaire35,45,46. Dans d’autres études, nous avons utilisé l’approche de dispersion à base de phospholipid pour enrichir les oocytes Xenopus avec du cholestérol pour déterminer les rôles des différentes régions dans les canaux Kir2.1 et GIRK dans la sensibilité au cholestérol41,47,48,49, ainsi que pour déterminer les sites de liaison de cholestérol putatif dans ces canaux32,50,51.

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Protocol

Toutes les procédures expérimentales avec des animaux ont été effectuées à l’Université du Tennessee Health Science Center (UTHSC). Les soins aux animaux et les protocoles expérimentaux ont été examinés et approuvés par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’UTHSC, qui est une institution accréditée par l’Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International.

1. Enrichissement des tissus et des cellules à l’aide de méthyle-cyclodextrine saturée de cholestérol

REMARQUE : Le protocole d’enrichissement du cholestérol ci-dessous convient aux tissus, aux cellules et aux lignées cellulaires. À titre d’exemple, nous décrivons les étapes réalisées pour enrichir les artères cérébrales des mammifères. Des résultats représentatifs sont fournis pour les artères cérébrales(figure 1) et les neurones(figure 4).

  1. Préparation de la M-CD saturée de cholestérol
    1. Pesez 0,064 g de M-CD et dissolvez-le dans un flacon contenant 10 ml de solution saline tamponnée par le phosphate (PBS) pour obtenir une concentration finale de 5 mM M-CD. Remuer la solution avec une barre de remuer pour s’assurer que le M-CD est entièrement dissous.
    2. Pesez 0,0024 g de poudre de cholestérol et ajoutez-la au même flacon pour obtenir une concentration de 0,63 mM de cholestérol. Ensuite, remuer la solution vigoureusement. Utilisez une spatule pour briser autant de morceaux de cholestérol que possible (certains morceaux resteront jusqu’à l’incubation).
    3. Couvrir le flacon d’au moins deux couches de film de paraffine et secouer lentement (30 oscillations/min) dans un bain d’eau de 37 oC pendant la nuit. Cette étape est essentielle.
    4. Après 8-16 h, refroidir la solution à température ambiante (RT), puis filtrer à travers un filtre de seringue en polyethersulfone de 0,22 m dans une bouteille en verre.
      REMARQUE : Pour atteindre différentes concentrations de cholestérol en solution, ajustez les quantités de cholestérol et de M-CD par proportion simple. Il est important de maintenir le rapport molaire de M-CD: cholestérol à 8:1 pour obtenir la saturation du porteur de méthyle-cyclodextrine avec le cholestérol. La solution d’enrichissement du cholestérol peut être utilisée immédiatement ou pendant plusieurs jours si elle est stockée à 4 oC. Cependant, la capacité d’enrichissement du cholestérol diminue avec le temps à mesure que les agrégats de cholestérol apparaissent, et la solution devient trouble.
  2. Traitement des artères cérébrales avec M-CD saturé de cholestérol
    1. Euthanifiez un rat Sprague Dawley (250-300 g) en le plaçant dans une chambre avec 2% d’isoflurane. Ensuite, décapiter le rat anesthésié à l’aide d’une guillotine forte ou d’une grande paire de ciseaux pointus.
      REMARQUE : Si l’exécution de ces procédures régulièrement, il est utile d’élaborer un calendrier pour l’affûtage de guillotine. En outre, une paire séparée de ciseaux devrait être dédiée à la décapitation des rongeurs. La décapitation des rongeurs est une procédure terminale; par conséquent, les instruments n’ont pas besoin d’être stériles. Le nettoyage avec de l’eau savonneuse après chaque utilisation est suffisant.
    2. Placez la tête du rat vers l’avant, loin du chercheur. Placez la partie pointue d’une paire de ciseaux de taille moyenne entre le crâne et le tronc cérébral, et coupez latéralement des deux côtés.
    3. Utilisez des forceps pour ouvrir le crâne supérieur en tirant vers le haut sur la base du crâne où les coupures latérales ont été faites et enlevez soigneusement le cerveau. Assurez-vous de couper les nerfs optiques qui tiennent le cerveau dans le crâne.
    4. Mettez le cerveau dans un bécher avec PBS sur la glace après l’enlèvement.
      REMARQUE : Le cerveau peut être stocké sur la glace pendant 4-6 h à 4 oC.
    5. Dans un environnement non stérile transférer le cerveau de rat dans un bol de dissection ciré avec assez de PBS pour le submerger. Épinglez le cerveau vers le bas pour l’empêcher de bouger.
      REMARQUE : L’étape 1.2.5 peut être effectuée à RT si elle est exécutée rapidement. Sinon, il faut le faire sur la glace.
    6. Utilisez des forceps pointus et de petits ciseaux chirurgicaux pour disséquer les artères cérébrales et leurs branches qui forment le Cercle de Willis à la base du cerveau sous le microscope dans PBS à RT. Soyez doux lors de la dissection pour s’assurer que le tissu d’artère n’est pas étiré ou coupé. Cette étape est essentielle.
    7. Rincer brièvement les segments d’artère (jusqu’à 1 cm de long) dans PBS soit dans une assiette de 96 puits ou dans un plat de 35 mm pour enlever les restes de sang, puis les placer pendant 10 min dans la solution suffisamment enrichie de cholestérol (préparée à l’étape 1.1) pour couvrir les segments entiers de l’artère. Utilisez un plat de 35 mm s’il existe une quantité suffisante de solution enrichissante du cholestérol et une assiette de puits de 96 si les artères sont petites ou s’il y a une pénurie de solution enrichissante du cholestérol.
      REMARQUE : La même approche peut être utilisée pour enrichir d’autres tissus et cellules avec le cholestérol en utilisant un temps d’incubation de 60 min. Par exemple, cette approche a été précédemment utilisée pour l’enrichissement du cholestérol des artères cérébrales de souris35,45, neurones hippocampal32, myocytes auriculaires37, et HEK 293 cellules39. Le temps minimal d’incubation doit être déterminé pour chaque tissu ou type cellulaire basé sur la validation de l’enrichissement du cholestérol à différents moments avec un essai sensible au cholestérol (par exemple, la détermination biochimique de la quantité de cholestérol dans le tissu en tachant avec le cholestérol sensible à la fluorescence dye filipin).
  3. Tacher le tissu d’artère avec le filipin de colorant de fluorescence stéroïde-sensible pour déterminer n’importe quelles altérations dans les niveaux de cholestérol.
    REMARQUE : Dans la section résultats représentatifs, nous démontrons les résultats de deux approches pour évaluer les changements dans les niveaux de cholestérol : un essai biochimique effectué par l’application d’un kit à base d’oxidase de cholestérol disponible dans le commerce (voir tableau des matériaux) et la coloration avec le colorant de fluorescence sensible aux stéroïdes. La première approche peut être effectuée en suivant les instructions du fabricant. Le protocole de cette dernière approche est fourni ci-dessous.
    1. À l’aide d’une bouteille de poudre de filipin fraîche, préparez une solution de stock de 10 mg/mL dans du sulfoxide de diméthyle (DMSO). Cette étape est essentielle.
      REMARQUE : La solution qui en résulte est sensible à la lumière. Si elle est préparée correctement, la solution de stock filipin est jaunâtre. Une certaine poudre de filipin peut coller au bouchon de bouteille. Par conséquent, il est important de rincer la bouteille et le bouchon avec du solvant DMSO pour conserver la totalité de la quantité de filipin. Une fois préparé, le stock de filipin doit être utilisé dans les quelques jours. Filipin perd complètement sa capacité de fluorescence après 5 jours, même lorsqu’il est stocké dans l’obscurité à -20 oC.
    2. Retirez les segments d’artère de la solution enrichissante du cholestérol et lavez-les 3x avec PBS pendant 5 min.
    3. Fixer les segments d’artère dans 4% de paraformaldéhyde pendant 15 minutes sur la glace.
      CAUTION : Le paraformaldéhyde est sensible à la lumière. Par conséquent, le travail doit être effectué dans l’obscurité.
    4. Placez les segments d’artère dans 0.5% Triton dans PBS à RT pendant 10 min pour perméabiliser le tissu et faciliter la pénétration de teinture.
    5. Laver les segments d’artère 3x avec PBS pendant 5 minutes sur un shaker. Cette étape est essentielle.
      REMARQUE: Lorsque le Triton a été complètement lavé, il ne devrait pas y avoir de bulles à la surface de la solution PBS.
    6. Diluer la solution de stock filipin dans PBS à une concentration finale de 25 g/mL. Retirez les artères forment la solution PBS et placez-les dans la solution filipin diluée pendant 1 h dans l’obscurité. Cette étape est essentielle.
    7. Laver le filipin en rinçant les segments d’artère 3x avec PBS pendant 5 min sur un shaker. Cette étape est essentielle.
    8. Rincer brièvement les segments d’artère avec de l’eau distillée, absorber le liquide excessif avec une serviette en papier, et monter les artères sur une diapositive à l’aide de supports de montage disponibles dans le commerce (voir Tableau des matériaux).
    9. Couvrez l’artère d’un coverlip évitant le roulement ou la torsion de l’artère et placez les toboggans à sécher dans une zone sombre à RT pendant 24 h.
    10. Après que le milieu de montage sèche, scellez les bords de housse avec du vernis à ongles clair, et laissez le vernis à ongles sécher pendant 10-15 min. Conserver les toboggans dans l’obscurité à -20 oC.
    11. Équilibrez les diapositives à RT avant l’imagerie.
    12. Imagez le tissu avec un microscope à fluorescence ou un lecteur de fluorescence avec l’excitation réglée à 340-380 nm et émission à 385-470 nm.
      CAUTION: Filipin photobleaches rapidement; ainsi, les échantillons doivent être photographiés rapidement.

2. Enrichissement des oocytes Xenopus à l’aide de dispersions à base de phospholipid enrichies de cholestérol (liposomes)

  1. Préparation des solutions
    1. Pour préparer une solution de bouillon de cholestérol, dissoudre 10 mg de poudre de cholestérol dans 1 ml de chloroforme dans un bécher ou une bouteille de verre de 10 ml. Transférer la solution dans une bouteille en verre plafonnée de 1,5 ml.
      CAUTION : Compte tenu de la toxicité et de l’évaporation rapide du chloroforme, travaillez dans le capot et gardez les réactifs sur la glace.
    2. Préparer un KCl de 150 mM, 10 mM Tris-HEPES, pH et 7,4 tampons pour les phospholipides enrichis de cholestérol. Pour ce faire, dissoudre dans un flacon Erlenmeyer 5,5905 g de KCl et 0,6057 g de Tris dans de l’eau à double distillation à un volume total de 0,5 L. Dans un autre flacon, dissoudre 5,5905 g de KCl et 1,19155 g de HEPES dans de l’eau à double distillation à un volume total de 0,5 L. Mélanger les deux solutions dans un flacon 1 L Erlenmeyer, et ajuster le pH à 7,4 avec HCl.
      REMARQUE : Conservez la solution KCl de 150 mM, 10 mM Tris-HEPES à 4 oC.
    3. Pour préparer le culte de l’oocyte pré-moyen ND96 (faible K,faible Ca2 ') tampon, combiner 1 mL de 2 M KCl, 1 mL de 1 M MgCl2, 45,5 mL de 2 M NaCl, et 5 mL de 1/1 M NaOH-HEPES dans un flacon 1 L Erlenmeyer. Ajouter 900 ml d’eau à double distillation et ajuster le pH à 7,4 avec HCl. Transférer la solution à un cylindre de 1 L et porter le volume à 1 L avec de l’eau à double distillation. Ajouter ensuite 1,8 mL de 1 M CaCl2 et filtrer la solution.
      REMARQUE : De légères variations des ratios entre les composants utilisés pour fabriquer une solution ND96 ne semblent pas être essentielles pour l’enrichissement du cholestérol, peut-être parce que la solution ND96 n’est pas utilisée pendant l’étape d’enrichissement elle-même, mais pour le stockage. Un exemple est une solution de 1 L qui a une concentration légèrement plus faible d’ions de sodium et de chlorure, et est fait en combinant 2 mL de 1 M KCl, 1 mL de 1 M MgCl2, 82,5 ml de 1 M NaCl, 5 mL de 1 M HEPES, et 1,8 mL de 1 M CaCl2 (Ca2 est omis d’obtenir une solution libre Ca2). Ajuster le pH de la solution à 7,4 avec NaOH. Conservez la solution de culturation d’oocyte ND96 qui en résulte à 4 oC pour un mois.
  2. Préparation de la dispersion à base de phospholipides avec des liposomes de cholestérol
    1. Dans un tube en verre de 12 ml, combiner 200 lils de chacune des solutions lipidiques dissoutes par chloroforme de 10 mg/mL suivantes : L-phosphatidylethanolamine, 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine, et le cholestérol.
    2. Évaporer le chloroforme du capot pour sécher lentement sous un flux d’azote. Cette étape est essentielle.
    3. Suspendre les lipides dans 800 l de solution tampon composée de 150 mM KCl et 10 mM Tris-HEPES à pH 7,4, et couvrir avec le film de paraffine.
    4. Sonicate doucement à 80 kHz pendant 10 min jusqu’à ce qu’un mélange laiteux soit formé. Cette étape est essentielle.
      AVERTISSEMENT : Lorsque vous sonicez, la dispersion dans le tube de verre doit vibrer doucement, formant de petites vagues. Les gouttes de dispersion ne doivent pas sauter dans le tube.
  3. Enrichir les ocytes Xenopus avec du cholestérol
    REMARQUE : Les ovaires oocytes de grenouille peuvent être obtenus à partir de deux sources : premièrement, les grenouilles femelles Xenopus laevis peuvent être logées dans le but de la chirurgie interne. Cette procédure doit être approuvée par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux. Deuxièmement, des ovaires entiers peuvent être achetés auprès de fournisseurs commerciaux. Comme alternative à l’achat ou l’isolement des ovaires entiers, puis les digérer comme décrit dans les étapes 2.3.1-2.3.4, oïts individuels sont disponibles dans le commerce à l’achat. Si ces derniers sont utilisés, les étapes 2.3.1-2.3.4 peuvent être ignorées.
    1. Gardez les ovaires fraîchement obtenus à 14 oC dans une solution ND96. Dans ces conditions, les ovaires peuvent être stockés jusqu’à 1 semaine.
    2. Pour obtenir des ocytes individuels, perturbez le sac ovare à plusieurs endroits à l’aide de forceps pointus. Placer les morceaux d’ovaire dans une plaque de 60 mm, avec 5 ml de ND96 sans Ca2MDcomplété par un collagenase de 0,5 mg/mL. Secouez sur un shaker orbital à 60 oscillations/min pendant 15 min à RT.
      REMARQUE : Cette étape assurera la digestion du sac ovare. Pour préserver l’activité enzymatique, évitez de stocker le collagène contenant ND96 pendant de longues périodes de temps ( 1 h). Même un stockage bref doit être effectué à des températures fraîches inférieures à 15 oC.
    3. À l’aide d’une pipette de transfert avec une large pointe, pipette vigoureusement la solution contenant de l’oocyte de haut en bas d’environ 5-10x pour séparer les oocytes individuels. À cette étape, la solution deviendra sombre.
    4. Rincer rapidement les ocytes avec ca2ND96 gratuit jusqu’à ce que la solution devienne transparente.
    5. Transférer les ocytes individuels verslasolution ND-96 contenant la solution ND-96, complétée par une gentamicine de 2 mg/ml à l’aide d’une pipette de transfert avec une pointe étroite.
      REMARQUE : Cette étape est essentielle lorsqu’il est nécessaire de stocker les oocytes. Les oocytes individuels peuvent être stockés dans un incubateur pendant plusieurs jours à 14-17 oC. Cependant, les ocytes morts qui sont blanchâtres doivent être enlevés au moins une fois par jour pour éviter la contamination de la solution avec des produits chimiques toxiques.
    6. Transférer 90 l’un des phospholipides enrichis en cholestérol en un puits d’une plaque de puits de 96.
    7. Transférer jusqu’à six ocytes du milieu ND96 au puits avec le moins de médium possible. Cette étape est essentielle.
      AVERTISSEMENT: Ne pas exposer les ocytes à l’air pendant le transfert pour garder les oocytes intacts.
    8. Placez la plaque de puits 96 sur un rotateur de plate-forme tridimensionnel pour fournir un petit mouvement orbital aux ocytes dans la cellule pendant 5-10 min.
    9. Ajoutez une goutte de ND96 dans le puits, et transférez les oocytes enrichis de cholestérol de la plaque de puits 96 à une plaque de 35 mm avec ND96 pour une utilisation immédiate. Cette étape est essentielle.
    10. Utilisez un kit à base d’oxidase de cholestérol disponible dans le commerce (voir tableau des matériaux)pour évaluer les changements dans les niveaux de cholestérol en suivant les instructions du fabricant.

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Representative Results

L’utilisation de cyclodextrine saturée de cholestérol comme moyen d’enrichir les tissus et les cellules avec le cholestérol est bien établie. Ici, nous démontrons d’abord l’application de cette approche largement utilisée pour enrichir les artères cérébrales de rat avec le cholestérol utilisant M-CD saturé de cholestérol. La figure 1A montre un exemple d’une couche musculaire lisse de l’artère cérébrale image et démontre l’augmentation dépendante de la concentration de la fluorescence associée à la philippine obtenue lors de l’enrichissement des tissus avec des concentrations croissantes de cholestérol allant de 6,25 M-6,25 mM pour 1 h. La quantification correspondante des données d’imagerie est représentée à la figure 1B. Notamment, l’augmentation des niveaux de cholestérol 2 h après la période d’incubation de 1 h était de 50 % de l’augmentation observée immédiatement après le traitement avec le complexe de cholestérol de M-CD. Comme la figure 1C le démontre pour l’échantillon traité avec 0,625 mM de cholestérol pour 1 h, des études fonctionnelles utilisant les tissus traités doivent être effectuées dès que possible après l’enrichissement du cholestérol est terminée. En outre, alors qu’un temps d’incubation de 1 h est couramment utilisé pour enrichir les tissus et les cellules avec du cholestérol en utilisant cette approche, 5 min d’incubation est généralement suffisante pour atteindre une augmentation statistiquement significative de la teneur en cholestérol de l’artère cérébrale tel que déterminé par un test biochimique à base d’oxydée de cholestérol, tel que décrit dans la figure 1D. L’augmentation de la teneur en cholestérol est demeurée au même niveau lorsque le temps d’incubation a été porté à 60 min(figure 1D).

L’efficacité des liposomes enrichis de cholestérol comme moyen d’enrichir les oocytes Xenopus avec le cholestérol est démontrée dans la figure 2A-C. Bien qu’aucun changement significatif n’ait été observé dans les niveaux de cholestérol dans les dispersions à base de phospholipid témoins manquant de cholestérol(figure 2A), les niveaux de cholestérol ont augmenté de manière significative après seulement 5 min de traitement avec les dispersions à base de phospholipid qui incluaient le cholestérol, et sont restés au même niveau lorsque le temps d’incubation a été augmenté à 60 min(figure 2B). Un effet similaire a été observé dans deux lots différents d’oocytes qui ont été obtenus de deux grenouilles. Notamment, cependant, les niveaux initiaux de cholestérol et le changement de teneur en cholestérol variaient entre les deux lots: dans le lot 1, la concentration initiale de cholestérol était de 64 g de cholestérol par mg de protéines, tandis que la concentration initiale dans le lot 2 était de 45 g de cholestérol par mg de protéines, ce qui est de 70% des niveaux initiaux de cholestérol dans le lot 1. Après un traitement de 60 minutes, la concentration de cholestérol dans le lot 1 était de 124 g de cholestérol par mg de protéines, alors qu’au lot 2 il était de 67 g de cholestérol par mg de protéines. Ainsi, alors que la concentration de cholestérol a augmenté de plus de 90 % dans le lot 1, elle a augmenté de 50 % dans le lot 2. Néanmoins, l’augmentation substantielle des niveaux de cholestérol dans les deux lots fournit les moyens d’étudier l’effet d’une augmentation des niveaux de cholestérol sur la fonction des protéines exprimées dans ce système d’expression hétérologue. En outre, l’approche de dispersion à base de phospholipid pour enrichir les oocytes Xenopus avec le cholestérol semble être plus efficace que l’application de cyclodextrine saturée de cholestérol comme le fait dans les tissus et les cellules. Comme le montre la figure 3, l’application de complexes cyclodextrine-cholestérol pour enrichir les oocytes à l’aide de cyclodextrines de 5 mM a entraîné une augmentation moyenne de seulement 25 % des taux de cholestérol.

L’efficacité de l’approche à base de cyclodextrine pour enrichir les cellules est également démontrée dans les neurones fraîchement isolés de la région CA1 de l’hippocampe(figure 4A). Comme le montre la figure 4B, l’incubation des neurones dans le M-CD saturé de cholestérol pendant 60 min a entraîné une augmentation de plus de 2x des niveaux de cholestérol tel que déterminé par la fluorescence filipin-associée. En utilisant cette approche, nous avons testé l’effet de l’augmentation du cholestérol sur les canaux GIRK exprimés dans les neurones hippocampiques. Comme le montre la figure 4C, ce changement des taux de cholestérol a entraîné une augmentation significative des courants GIRK. De même, nous avons testé l’effet de l’enrichissement du cholestérol sur le sous-unité GIRK primaire exprimé dans le cerveau, GIRK2, en utilisant le système d’expression hétérologue Xenopus oocytes. À cette fin, nous avons surexprimé GIRK2MD (GIRK2_E152D), un mutant pore de GIRK2 qui augmente son expression membranaire et son activité52 chez les oocytes Xenopus, et enrichi les oocytes avec du cholestérol pendant 60 minutes en utilisant l’approche de dispersion à base de phospholipid. Comme les chiffres 4D-F le démontrent, l’augmentation des niveaux de cholestérol a entraîné une augmentation significative des courants semblable à l’effet de l’augmentation des niveaux de cholestérol dans les neurones sur la fonction du canal GIRK. Ces données démontrent en outre l’efficacité, la cohérence et l’utilité des deux approches décrites ci-dessus pour déterminer l’impact de l’augmentation des niveaux de cholestérol sur l’activité protéique et la fonction cellulaire.

Figure 1
Figure 1 : Enrichissement représentatif des artères cérébrales de rat avec cholestérol utilisant le méthyl----cyclodextrine saturé de cholestérol. (A) Un exemple d’une couche musculaire lisse de l’artère cérébrale image montrant l’augmentation dépendante de la concentration de la fluorescence associée à la philippine obtenue lors de l’enrichissement des tissus avec des concentrations croissantes de cholestérol allant de 6,25 M-6,25 mM pour 1 h. (B) Quantification des données d’imagerie dans (A). La mesure de l’intensité de fluorescence de l’image entière a été effectuée à l’aide de la fonction intégrée « Mesure » dans les logiciels commerciaux. À chaque concentration de cholestérol, 3 images ont été recueillies dans des artères récoltées auprès de donneurs d’animaux distincts. Pour chaque concentration de cholestérol, les données sont présentées comme la moyenne d’erreur standard. (C) Niveaux de cholestérol dans les segments de couche de muscle lisses d’artère cérébrale immédiatement après une période d’incubation de 1 h avec 0.625 mM cholestérol, et 3 h après le début du traitement (c.-à-d., 1 h d’incubation suivie de 2 h dans PBS). (D) Dépendance des niveaux de cholestérol sur le temps d’incubation tel que déterminé par un essai biochimique à base d’oxidase de cholestérol. Une différence significative est indiquée par un astérisque (p 0,05). Les panneaux (A) (concentrations de cholestérol 0 mM-0.625 mM), (B), et (C) ont été modifiés à partir du Nord et al.45. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Enrichissement représentatif des oocytes Xenopus avec cholestérol utilisant des liposomes. (A) Changement de cholestérol des oocytes Xenopus de contrôle incubés dans les liposomes sans cholestérol pendant 5-60 min. (B) Changement de pli des niveaux de cholestérol des oocytes Xenopus incubés dans les liposomes cholestérol-enrichis pendant 5-60 min. La barre de contrôle représentée se réfère à l’incubation dans les liposomes sans cholestérol pendant 5 min et est montré comme une comparaison. (C) Comparaison de l’effet de l’enrichissement du cholestérol de deux lots différents d’oocytes Xenopus utilisant des liposomes enrichis de cholestérol pendant 5 et 60 min. Une différence significative est indiquée par un astérisque (p 0,05). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Enrichissement représentatif des oocytes Xenopus avec cholestérol utilisant le méthyl---cyclodextrin saturé de cholestérol. (A) Changement de cholestérol des oocytes Xenopus de contrôle incubés dans le support ND96 de contrôle pendant 5-60 min. (B) Changement de pli des niveaux de cholestérol des oocytes Xenopus incubés dans le M -CD saturé de cholestérol pendant 5-60 min. La barre de contrôle représentée fait référence à l’incubation dans les supports de contrôle pendant 5 minutes et est montrée comme comparaison. Une différence significative est indiquée par un astérisque (p 0,05). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Exemples représentatifs d’études sur l’enrichissement du cholestérol sur la fonction protéique dans les cellules et les oocytes Xénoopeus : l’impact du cholestérol sur les canaux de potassium rectifiant intérieurement les protéines G. (A) Signal de fluorescence associé à Filipin du neurone pyramidal DE CA1 hippocampal des rats sur commande (gauche) contre cholestérol-enrichi (droite). (B) Données sommaires des signaux de fluorescence associés à la philippine obtenus à partir de neurones pyramidaux d’hippocampe CA1 fraîchement isolés et enrichis de cholestérol. L’enrichissement du cholestérol a été réalisé en incuber les neurones dans le M -CD saturé de cholestérol pendant 1 h (n - 12-14). (C) courbe de courant ionique (I)-voltage(V) illustrant l’effet de l’enrichissement du cholestérol tel que décrit dans (B) sur les courants GIRK dans les neurones hippocampiques de la région DE CA1. (D) Traces représentatives montrant l’effet de l’enrichissement du cholestérol à l’aide de liposomes à base de phospholipid enrichis de cholestérol sur GIRK2 (GIRK2_E152D) exprimés dans les oocytes Xenopus à -80 mV et 80 mV. (E) Données sommaires de (D) à -80 mV (n - 6-9). Une différence significative est indiquée par un astérisque (p 0,05). Les sous-figures (B-E) ont été modifiées à partir de Bukiya et coll.32. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Les méthodes d’enrichissement des tissus et des cellules des mammifères et des oocytes Xenopus avec le cholestérol constituent un outil puissant pour étudier l’effet des taux élevés de cholestérol sur les espèces moléculaires individuelles, sur les systèmes macromoléculaires complexes (p. ex. protéines) et sur la fonction cellulaire et des organes. Dans cet article, nous avons décrit deux approches complémentaires qui facilitent de telles études. Tout d’abord, nous avons décrit comment enrichir les tissus et les cellules avec du cholestérol à l’aide de M-CD saturé de cholestérol. Nous avons démontré que dans les segments de l’artère cérébrale, cette approche a entraîné une augmentation de 50 % des niveaux de cholestérol. En outre, dans une étude récente, nous avons montré que la même approche conduit à une augmentation de plus de 2x de la teneur en cholestérol dans les neurones hippocampes de la région DE CA1. En revanche, cependant, l’utilisation de cette approche comme un moyen d’enrichir les oocytes Xenopus a entraîné une augmentation de seulement 25% de la teneur en cholestérol chez les oocytes Xenopus. Ainsi, pour enrichir les oocytes Xenopus, nous avons développé une approche de dispersion à base de phospholipid qui se traduit systématiquement par une augmentation d’au moins 50% des niveaux de cholestérol. Il est possible que l’avantage de cette approche pour enrichir les oocytes Xenopus provient d’une capacité de chargement accrue par rapport à la capacité de chargement de l’approche complexe de cholestérol de la M-CD: cholestérol. Il est également possible que, bien que l’approche complexe du cholestérol M-CD: soit optimisée pour enrichir les tissus et les cellules, une optimisation supplémentaire du protocole est nécessaire pour améliorer son application pour enrichir les oocytes Xenopus.

La dispersion à base de phospholipides utilisée pour enrichir les oocytes Xenopus avec le cholestérol comprend deux lipides qui sont largement utilisés pour créer des bilayers lipides planaires (c.-à-d., L-phosphatidylethanolamine et 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine). Cependant, dans une étude antérieure, il a été montré que les oocytes Xenopus pourraient également être enrichis en utilisant le cholestérol des liposomes qui comprenait la phosphatidylcholine et la cholat36. Cette méthode a entraîné une augmentation du taux de cholestérol/phospholipide de molaire dans la membrane plasmatique de 0,5 à 0,1 à 0,9 à 0,1 avec un pourcentage moyen d’enrichissement de 71 %. Ce pourcentage moyen d’enrichissement est très similaire au niveau moyen d’augmentation de la teneur en cholestérol que nous avons observé (70,5 %), ce qui suggère que le choix des phospholipides utilisés pour former la dispersion n’est pas essentiel pour enrichir les oocytes Xenopus avec le cholestérol en utilisant cette approche.

Chaque protocole décrit comporte plusieurs étapes critiques. Après avoir préparé un mélange de cholestérol À un rapport molaire de 8:1 pour assurer la saturation de la M-CD avec du cholestérol, il est essentiel de couvrir le flacon avec au moins deux couches de film de paraffine et de le mettre dans un bain d’eau secouant lentement 37 oC pendant la nuit. Lors de la dissection des tissus pour le traitement du cholestérol, il est important d’être doux pour s’assurer que le tissu n’est pas étiré ou coupé. Après avoir permébilisé le tissu pour faciliter la pénétration du colorant, il est essentiel de laver complètement les segments de tissu dans PBS. La coloration des tissus dans le fillipin doit être effectuée dans l’obscurité, et le fillipin doit être méticuleusement lavé une fois la coloration terminée. Lors de la préparation des dispersions à base de phospholipid enrichies de cholestérol, il est essentiel de s’assurer que la dispersion dans le tube de verre vibre doucement, formant de petites vagues, pour éviter la séparation du cholestérol de la dispersion. Pour le traitement du cholestérol des oocytes Xenopus, il est important de transférer les oocytes du milieu ND96 au puits avec la dispersion à base de phospholipid enrichie de cholestérol avec le moins de médium possible tout en n’exposant pas les oocytes à l’air pour garder les oocytes intacts. Il est important de noter qu’en raison de la machinerie intrinsèque dans les tissus, les cellules et les oocytes Xénoopeus, les niveaux de cholestérol peuvent équilibrer, puis revenir à leurs niveaux d’origine au fil du temps. Par conséquent, des études fonctionnelles doivent être réalisées immédiatement après le temps d’incubation. Ici, nous avons démontré cette notion dans les artères cérébrales enrichies avec le cholestérol, montrant que l’augmentation des niveaux de cholestérol 2 h après une période d’incubation de 1 h était environ la moitié de l’augmentation observée immédiatement après la période d’incubation.

Bien qu’il ait suivi les étapes critiques décrites ci-dessus, plusieurs défis peuvent survenir. Par exemple, une augmentation des niveaux de cholestérol peut ne pas être observée après le traitement enrichissant le cholestérol. Si c’est le cas, il peut être nécessaire d’augmenter la concentration de cholestérol dans les médias enrichis de cholestérol. Il en va de même pour l’enrichissement du cholestérol des tissus, des cellules et des oocytes Xenopus. Cependant, dans la préparation des traitements à l’aide de l’approche complexe de la M-CD : cholestérol, la quantité de M-CD devrait être augmentée avec l’augmentation de la concentration de cholestérol pour maintenir un rapport molaire de 8:1 avec le cholestérol. En outre, il peut être nécessaire de préparer une solution fraîche d’enrichissement du cholestérol, parce que le cholestérol a tendance à précipiter hors de la solution, et la solution perd son efficacité cholestérol-enrichissante. Après l’enrichissement du cholestérol, il est possible qu’un signal de filipin ne soit pas observé. Si c’est le cas, il peut être nécessaire d’utiliser une poudre de filipin frais pour préparer un nouveau stock et répéter l’expérience. La fluorescence de Filipin diminue rapidement, et la solution de stock ne peut pas être stockée pendant plus de plusieurs jours. Une limitation de la coloration filipin est qu’il semble reconnaître les stéroïdes autres que le cholestérol. Par exemple, nous avons récemment démontré une augmentation du signal de fluorescence associé à la filipin dans les artères cérébrales du rat suivant l’enrichissement avec le coprostanol45. Ainsi, les résultats de la coloration des philippines doivent être interprétés avec prudence, et en cas de doute, des approches alternatives devraient être utilisées pour corroborer les résultats. Une possibilité serait d’effectuer un essai biochimique par l’application d’un kit à base d’oxidase de cholestérol disponible dans le commerce.

En résumé, les approches présentées sont très efficaces pour réaliser l’enrichissement du cholestérol de près de 50 %. En effet, l’approche complexe de la M-CD : cholestérol qui se traduit par des taux de cholestérol de 50 % dans les artères cérébrales est beaucoup plus efficace que l’utilisation de LDL pour enrichir ces tissus, ce qui se traduit par une simple augmentation de 10 % du cholestérol35. Il en va de même pour l’application de dispersions à base de phospholipides enrichies en cholestérol (liposomes) pour enrichir les oocytes Xenopus. Comme décrit ci-dessus, cette approche se traduit systématiquement par une augmentation d’au moins 50% des niveaux de cholestérol. Fait important, ces deux approches pour l’enrichissement du cholestérol résultats in vitro rendement qui sont comparables à l’augmentation du cholestérol obtenu en soumettant les animaux à un régime à taux de cholestérol élevé32,37,40,53,54. En outre, contrairement aux régimes élevés de cholestérol de plusieurs semaines, les approches in vitro exigent juste quelques minutes de temps d’incubation pour atteindre une augmentation statistiquement significative et stable du taux de cholestérol.

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Disclosures

Le Dr A. M. Dopico est un employé fédéral spécial à temps partiel et membre actuel du Conseil consultatif national sur l’abus et l’alcoolisme.

Acknowledgments

Ces travaux ont été soutenus par une subvention pour le développement scientifique (11SDG5190025) de l’American Heart Association (à A.R.-D.), et par les subventions AA-023764 (à A.N.B.), et HL-104631 et R37 AA-11560 (à A.M.D.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplex Red Cholesterol Assay Kit Invitrogen A12216
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA set Thermo Scientific 23208
Brain PE 25Mg in Chloroform Avanti Lipids 840022C
16:0-18:1 PS 25Mg Chloroform Avanti Lipids 840034C
Cholesterol 100Mg Powder Sigma C8667
KCl Fisher P217
Trizma base Sigma T6066
HEPES Corning 61-034-RO
MgCl2 Fisher M33
NaCl Fisher S271
KH2PO4 Fisher P285
MgSO4 EMD Chemicals MX0070-1
EDTA VWR E177
Dextrose Anhydrous Fisher BP350
NaHCO3 Sigma S6014
CaCl2 Sigma C3881
Blood Gas Tank nexAir
NaOH Fisher S318
1.5mL tubes Fisher S35818
Gastight Syringe 100uL Hamilton 1710
Microliter Syringe 25uL Hamilton 702
12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tube Pyrex 8120-12
Chloroform Fisher C298
Support Stand Homescience Tools CE-STAN5X8
Universal Clamp, 3-Prong Homescience Tools CE-CLPUNIV
Sonicator Laboratory Supplies G112SP1G
3D rotator mixer Benchmark Scientific B3D 1308
96 well plate Sigma BR781602
N2 gas nexAir
Glass beakers 40ml-1L Fisher 02-540
Ice Machine Scotsman CU1526MA-1
Ice bucket Fisher 50-136-7764
1X PBS Corning 21-031-CM
TritonX Fisher BP151-100
Sonic Dismembrator Fisher Model 100
Eppendorf microcentrifuge Eppendorf Model 5417R
Amber bottles Fisher 03-251-420
Corning™ Disposable Glass Pasteur Pipets FIsher 13-678-4A
Parafilm FIsher 50-998-944
Isotemp™ BOD Refrigerated Incubator FIsher 97-990E
Oocytes Xenoocyte™ 10005
Rat Envigo Sprague Dawley weight 250g
Methyl-β-cyclodextrin Sigma C4555
Water bath incubator with shaker Precision 51221080 Lowest shaker setting O/N 37 °C
Filipin Sigma SAE0088-1ML
DMSO Fisher BP231
Paraformaldehyde 4% Mallinckrodt 2621
DI H2O University DI source
ProLong Gold antifade reagnet Invitrogen P10144
Microslides 75x25mm Frosted Diagger G15978A
Forceps Fine Science Tools 11255-20
Microscope Coverslip Diagger G15972B
Clear nail polish Revlon 771 Clear
Labeling Tape Fisher 15-901-20F
Securline Lab Marker II Sigma Z648205-5EA
BD 10mL Syringe Fisher 14-823-16E
1.2 μm syringe filter VWR 28150-958
KimWipes Fisher 06-666A
pH probe Sartorus py-p112s
pH meter Denver instrument Model 225
70% ETOH Pharmco 211USP/NF
Timer Fisher 02-261-840
Steno book Staples 163485

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References

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