Att skapa mycket specifika kemiskt inducerad Proteindimeriseringssystem genom stegvis val av ett kombinatoriskt Endomänsantikroppsbibliotek

* These authors contributed equally
Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Skapa kemiskt inducerad proteindimerization system med önskad tillhörighet och specificitet för en given liten molekyl ligand skulle ha många biologiska avkänning och aktiverings applikationer. Här beskriver vi en effektiv, generaliserbar metod för de Novo Engineering av kemiskt inducerade dimeriseringssystem via det stegvisa urvalet av ett fag-visat kombinatoriskt endomänsantikroppsbibliotek.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Gomez-Castillo, L., Watanabe, K., Jiang, H., Kang, S., Gu, L. Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library. J. Vis. Exp. (155), e60738, doi:10.3791/60738 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protein Dimerization händelser som förekommer endast i närvaro av en liten molekyl ligand möjliggöra utveckling av små molekyler biosensorer för dissektion och manipulation av biologiska vägar. För närvarande finns endast ett begränsat antal kemiskt inducerade Dimerization (CID) system och tekniska nya med önskad känslighet och selektivitet för specifika små-molekyl ligander fortfarande en utmaning inom området för proteinteknik. Vi beskriver här en hög genomströmning screeningmetod, combinatorial binders-eNABLED sval av Cid (kombinerar-CID), för de Novo Engineering av CID-system som gäller för en stor variation av ligander. Den här metoden använder två-stegs val av en FAGE-visas kombinatoriska nanobody bibliotek för att få 1) "Anchor bindemedel" som först binder till en ligand av intresse och sedan 2) "Dimerization bindemedel" som bara binder till ankare bindemedel-ligand komplex. För att välja ankare bindemedel, ett kombinatoriskt bibliotek med över 109 komplementaritetskontrollerande region (CdR)-randomiserade nanoorgan screenas med en en ligand och träffar valideras med omärkta ligand av bio-Layer interferometri (bli). För att erhålla dimeriseringsbindemedel screenas nanobodys bibliotek med ankare-ligand-komplex som mål för positiv screening och obundna förankrings bindemedel för negativ screening. Kombinerar-Cid är i stort sett tillämplig på utvalda CID bindemedel med andra immunglobulin, icke-immunglobulin, eller beräkningsmässigt utformade ställningar för att skapa biosensorer för in vitro-och in vivo detektion av läkemedel, metaboliter, signalmolekyler, etc.

Introduction

CID system, där två proteiner dimerize endast i närvaro av en liten molekyl ligand (figur 1), erbjuder mångsidiga verktyg för dissekera och manipulera metaboliska, signalering, och andra biologiska vägar1. De har visat potentialen i biologisk aktivering, såsom drogkontrollerad t-cell aktivering2 och apoptos3,4, för att förbättra säkerheten och effekten av adoptiv T cellterapi. Dessutom, de ger en ny metod för in vivo eller in vitro-detektion av små molekyler mål. Till exempel kan CID proteiner vara genetiskt smält med fluorescensreporter system (t. ex. fluorescens resonans energiöverföring (FRET)5 och cirkulärt perdämpad fluorescerande proteiner)6 för realtid in vivo mätningar, eller fungera som affinitetsreagens för Sandwich enzymkopplad immunosorbent assay (Elisa)-liknande analyser.

Trots sina breda tillämpningar, skapa nya CID-system som kan styras av en viss liten molekyl ligand har stora utmaningar. Etablerade protein bindemedel Engineering metoder inklusive Animal immunisering7, in vitro-val8,9, och Computational protein design10 kan generera ligand bindande proteiner som fungerar via binära protein-ligand interaktioner. Emellertid, dessa metoder har svårt att skapa en ligand-inducerad ternära CID Complex. Vissa metoder skapar CID genom att kemiskt länka två ligander som självständigt binder till samma eller olika proteiner11,12,13,14,15,16 eller förlita sig på att välja bindemedel proteiner som antikroppar riktar befintliga små molekyl-proteinkomplex17,18, och därmed har ett begränsat urval av ligander.

Vi har nyligen utvecklat en combinatorial binders-enabled sval av Cid (kombinerar-CID) metod för de Novo Engineering av CID system19. Denna metod kan erhålla den höga specificiteten av ligand-inducerad Dimerization (t. ex. en ankare-Dimerization binder dissociation konstant, Kd (utan ligand)/Kd (med ligand) > 1 000). Den Dimerization specificitet uppnås med hjälp av ankare bindemedel med flexibla bindningsställen som kan införa kon Formations förändringar på ligand bindning, vilket ger en grund för valet av överensstämningsmässigt selektiva bindemedel endast erkänna ligand-bundna ankare bindemedel. Vi demonstrerade ett proof-of-princip genom att skapa Cannabidiol (CBD)-inducerad heterodimerer av nanoorgan, en 12-15 kDa funktionella antikroppar fragment från camelid bestående av en universell ställningen och tre flexibla CDR slingor (figur 2)20, som kan bilda en bindande ficka med anpassningsbara storlekar för liten molekyl epitoper21,22. Framför allt bör in vitro-urvalet av ett kombinatoriskt protein bibliotek vara kostnadseffektivt och generaliserbart för CID-teknik eftersom samma högkvalitativa bibliotek kan appliceras på olika ligander.

I detta protokoll och video, fokuserar vi på att beskriva två steg in vitro-val och validering av ankare (figur 3A) och Dimerization bindemedel (figur 3B) genom att avskärma det kombinatoriska nanobody biblioteket med en mångfald som är högre än 109 med hjälp av CBD som mål, men protokollet bör tillämpas på andra protein bibliotek eller små molekyl mål. Screening av CID bindemedel tar vanligtvis 6 – 10 veckor (figur 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. biblioteks konstruktion

  1. Använd en syntetisk kombinatorisk endomänsantikroppsbibliotek med en mångfald av ~ 1.23 – 7.14 x 109, som tidigare beskrivits19. Även om detta protokoll inte innehåller biblioteks konstruktion, kan det tillämpas på andra kombinatoriska pärmbibliotek.

2. biotinylering av ligand-mål eller ligand

  1. Biotinylate den valda ligand, till exempel, CBD och tetrahydrocannabinol (THC)19, via olika kemiska syntes strategier, beroende på lämpliga biotinylation platser av ett mål.

3. screening av ankar pärmar

  1. Början av urvalet
    1. Börja varje omgång av urvalet genom att vaccinera en enda TG1-cellkoloni, nyodlad i 6 mL 2YT vid 37 ° c och 250 varv per minut (rpm) till en 600 Nm (OD600) absorbans av ~ 0,5. Inkubera cellerna på is för användning i steg 3.5.1.
  2. Negativt val med biotin-Bound konjugerat pärlor
    1. Förbered "negativa markerings pärlor" genom att tvätta 300 μL streptavidin-belagda magnetiska pärlor med hjälp av ett magnetiskt separations rack, 3x med 0,05% fosfatbuffrad saltlösning med Tween buffert (PBST, 1 x PBS med 0,05% Vol/Vol Tween 20%) och 2x med 1 x PBS.
    2. Omsuspendera pärlorna med 1 mL 1% kasein i 1 x PBS (pH = 7,4), och mätta pärlorna genom att tillsätta 5x den rapporterade bindnings kapaciteten med hjälp av biotin. Inkubera vid rumstemperatur (RT) på en rotator i 1 h.
    3. Tvätta pärlorna 5x med hjälp av 0,05% PBST och 3x med 1 x PBS, för totalt åtta tvättar.
    4. Tillsätt ~ 1013 fagpartiklar i 1% kasein/1% BSA i 1 x PBS (pH = 7,4) och inkubera vid RT på en rotator under 1 h.
    5. Efter inkubering, samla supernatanten som ska användas i steg 3.3.6.
  3. Positivt urval med en ligand-bunden konjugerat pärlor
    1. Förbered "positiva val pärlor" med 1/2 volymen av pärlorna som används för "negativa markerings pärlor" enligt steg 3.2.1.
    2. Re-suspendera pärlorna med 1 ml 1% kasein i 1 × PBS, pH 7,4 och mätta pärlorna genom att lägga till 5x full bindnings kapacitet beräknas baserat på manualen med hjälp av en ligand val. Inkubera vid RT på en rotator för 1 h.
    3. Tvätta pärlorna 5x med hjälp av 0,05% PBST och 3x med 1 x PBS, för totalt åtta tvättar.
    4. Blockera pärlorna med 1 mL 1% kasein/1% BSA i 1 x PBS (pH = 7,4) och inkubera vid RT på en rotator i 1 h för att förhindra ospecifik bindning mellan Fager och de streptavidin-belagda magnetiska pärlorna.
    5. Tvätta streptavidin-belagda magnetiska pärlor 3x med 0,05% PBST och en gång med 1 x PBS, för totalt fyra tvättar.
    6. Omsuspendera de streptavidin-belagda magnetiska pärlorna med hjälp av obundna Fager tagna från steg 3.2.5 och inkubera vid RT på en rotator under 1 h.
    7. Extrahera supernatanten utan att störa de magnetiska pärlorna. Spara obundna Fager som indata, som ska användas i steg 3.5.1.
    8. Tvätta pärlorna 10X med hjälp av 0,05% PBST och 5x med 1 x PBS. I mellan varje tre tvättar överföra dem till ett nytt rör för att undvika Fager ospecifikt bunden till röret väggarna.
  4. Eluering av phage-visade nanokroppar
    1. Konkurrenskraftigt eluera bundna Fager genom att tillsätta 450 μl av icke-biotinylerade ligand, med hjälp av en koncentration i mikromolära Range (t. ex., 10 – 50 μm) och inkuberande vid RT på en rotator i 30 min. Den valda ligand-koncentrationen för den konkurrenskraftiga elueringen av bundna Fager är beroende av önskad KD av "Anchor binder". Ligand koncentrationer kan vara relativt hög i initiala urvals rundor och sedan minskade i senare omgångar.
    2. Samla supernatanten och spara eluerade Fager som produktion, som ska användas i steg 3.5.2.
  5. Input/output titreringar och infektion
    1. För intitrering, Förbered 10X seriella utspädningar i 1 x PBS upp till 109gånger med input phage från steg 3.3.7. Använd 107– 109 seriella utspädningar för att göra infektioner genom att överföra 10 μl tillförd FAGE från varje spädning till 70 μl TG1 celler (OD600 av ~ 0,5). Inkubera vid 37 ° c i 45 min, platta de infekterade TG1-cellerna på 3 90 mm 2YT-agar-rätter som innehåller 100 μg/mL ampicillin och 2% (WT/VOL) glukos och inkubera över natten vid 37 ° c. Från de över natten plattorna, kan FAGE ingång beräknas enligt följande:
      Equation 1
    2. För utgång infektion och titrering, överföra eluerade Fager från steg 3.4.2 till 3 mL av TG1 celler (OD600 av ~ 0,5). Inkubera i ett vattenbad vid 37 ° c i 45 min. Förbered sedan 10X seriella utspädningar i 2YT upp till 103-faldigt, platta varje utspädning på 90 mm 2yt-agar rätter, och inkubera över natten vid 37 ° c. Från de över natten plattorna kan phage produktionen beräknas enligt följande:
      Equation 1
    3. Dela de återstående infekterade TG1 cellerna på 3 150 mm 2YT-agar plattor som innehåller 100 μg/mL ampicillin och 2% (WT/VOL) glukos. Inkubera plattorna över natten vid 37 ° c.
  6. Biblioteks förstärkning och återhämtning för ytterligare urvals rundor
    1. Tillsätt 3 mL 2YT per tallrik, skrapa med en steril cell skrapa och samla alla celler i ett 50 mL koniskt rör. Blanda de insamlade cellerna med steril glycerol (20% WT/Vol slutlig koncentration). Mät blandningen OD600 och gör 3 – 5 lager alikvoter. Förvaras vid-80 ° c för långtidsförvaring.
    2. För fagräddning, späd den phagemid-innehållande TG1 bakterie blandningen med 25 mL 2YT-Media kompletterat med 2% glukos och 100 μg/mL ampicillin till en OD600 på ~ 0,1. Kultur celler vid 37 ° c och 250 RPM till en OD600 av ~ 0,5.
    3. Superinfektera cellerna genom att lägga CM13 Helper phage vid 5 x 109 PFU/ml och inkubera vid 37 ° c och 250 rpm för 45 min. Den CM13 Helper phage ger krävs phage Coat proteiner för montering av kompletta fagpartiklar.
    4. Centrifugera kulturen vid 8 000 x g i 10 min för att ta bort glukos. Omsuspendera cellerna med 50 mL 2YT-Media kompletterat med 100 μg/mL ampicillin och 50 μg/mL Kanamycin och inkubera vid 25 ° c och 250 rpm över natten.
    5. Centrifugera cellerna från natten kulturen på 9 000 x g, 4 ° c för 30 min. överföring supernatanten till ett nytt rör och fällningen fagers i supernatanten med 1/5 volym PEG/NaCl lösning (20% WT/Vol polyetylenglykol-6 000 och 2,5 M NaCl). Blanda försiktigt och placera på isen i 1 h.
    6. Samla fagpartiklar genom centrifugering med 12 000 x g vid 4 ° c i 30 min. Omsuspendera pelleten med 1 ml 1 x PBS och överför suspensionen till ett microcentrifugerör. Centrifugera röret vid 20 000 x g och 4 ° c i 10 minuter för att avlägsna kvarvarande bakterier.
    7. Överför supernatanten till ett nytt microcentrifugerör utan att störa bakterie pelleten. Använd en utspädning på 1:100 för att mäta absorptionen vid 269 nm och 320 nm. Det totala antalet Fager kan beräknas med hjälp av följande formel23:
      Equation 3
    8. Förvara fagbiblioteket vid 4 ° c vid kortvarig användning eller med 25% glycerol vid-80 ° c för långtidsförvaring.
    9. Upprepa valomgångar (steg 3.1 – 3.6) i 3 – 6 omgångar eller tills önskad anrikning observeras (se resultat avsnitt). Platta och plocka enstaka kloner (avsnitt 4) för att karakterisera deras affinitet och specificitet till ligand (avsnitten 5 – 7).

4. enstaka klon isolering

  1. Om du vill isolera enskilda kloner från en berikad sublibrary förbereder du 10X seriella utspädningar av de faginfekterade TG1 cellerna (steg 3.5.2). Platta seriella utspädningar på 90 mm 2YT-agar rätter som innehåller 100 μg/mL ampicillin och 2% (WT/VOL) glukos och inkubera vid 37 ° c över natten.
  2. Från natten plattorna, plocka enstaka kolonier i 250 μL av 2YT Media kompletteras med 100 μg/mL ampicillin per brunn i sterila djupa plattor och växa vid 37 ° c över natten.
  3. Från över natten kulturer, Inokulera 10 μL i 500 μL av färska 2YT-Media kompletterat med 100 μg/mL ampicillin.
  4. Odla celler till en OD600 på ~ 0,5, tillsätt CM13 Helper phage vid 5 x 109 PFU/ml och inkubera vid 37 ° c och 250 RPM för 45 min.
  5. Tillsätt 500 μL 2YT-Media kompletterat med 100 μg/mL ampicillin och 50 μg/mL kanamycin. Inkubera vid 25 ° c och 250 rpm över natten.
  6. Centrifugera de djupa plattorna från nattkulturerna vid 3 000 x g i 10 min. samla supernatanten som innehåller fagpartiklar utan att störa cellpelleten.
  7. Fagpartiklar kan användas för ELISA för att bestämma specificiteten hos de valda klonerna till ligand. Biotin eller en strukturell homolog av målet kan användas som en negativ kontroll.

5. validering av ankar pärmar med ELISA

  1. Coat 96 väl Elisa-plattor med 100 μl 5 μg/ml konjugerat i beläggningsbuffert (100 mm karbonatbuffert, pH = 8,6) vid 4 ° c över natten.
  2. Tvätta ELISA-plattorna 3x med 0,05% PBST och tillsätt 100 μL av 1 μM biotinylerat mål till mål brunnarna. Tillsätt 100 μL av 1 μM biotin eller Target homolog till kontroll brunnarna. Inkubera vid RT för 1 h.
  3. Tvätta plattorna 5x med 0,05% PBST och blockera icke-specifik bindning genom att tillsätta 300 μL 1% kasein i 1 x PBS. Inkubera vid RT för 1 h.
  4. Tvätta ELISA-plattorna 3x med 0,05%-PBST och tillsätt den renade phage supernatanten. Inkubera i 1 h vid RT.
  5. Tvätta ELISA plattorna 10X med 0,05% PBST och tillsätt 100 μL pepparrots peroxidas (HRP)-M13 Major Coat protein antikropp (1:10000 utspädning med 1 x PBS med 1% kasein). Inkubera vid RT för 1 h.
  6. Tvätta ELISA-plattorna 3x med 0,05% PBST och tillsätt 100 μL tetramethylbenzidin (TMB) substrat. Inkubera i 10 minuter eller tills en synlig färgförändring observeras. Stoppa reaktionen genom att tillsätta 100 μL av 1 M HCl. läsplattan vid 450 nm på en spektrofotometer.
  7. För proteinuttryck och rening, Välj klonerna som visar hög affinitet och specificitet för målet (se diskussion).

6. protein uttryck, rening och biotinylering

  1. Som tidigare rapporterats19, subklona utvalda kloner från avsnitt 5 och Express som C-Terminal AVI-märkta och hans-märkta nanobodies.
  2. Express utvalda nanoorgan i periplasm av E. coli WK6 celler (typiskt i 1 L kultur), frisättning av osmotisk chock, och rena med hjälp av en nickel-NTA kolumn (se tabell över material).
  3. Exchange-buffert med en avsaltning kolumn (1 x PBS med 5% glycerol; se tabell över material).
  4. Biotinylate nanobodies med hjälp av en kommersiell Kit (se tabell över material) för vidare användning.

7. ankar pärm karakterisering av BLI

  1. Analysera bindningsaffiniteten och kinetiken hos utvalda förankrings bindemedel genom att immobilisera 200 nm biotinylerade ankar pärmar på konjugerat biosensorer (se tabell över material) med bindnings analysbuffert (1 x PBS (pH = 7,4), 0,05% Tween 20, 0,2% BSA, 3% metanol).
  2. Beräkna dissociationskonstanter (KD) av ankare binder-ligand interaktioner genom steady-state analys med hjälp av dataanalysprogram vara (se tabell över material). Erhållna KD -värden varierar vanligtvis från enkel till tvåsiffrig micromolar.

8. screening av dimeriseringsbindemedel

Anmärkning: biopanning screening av "Dimerization bindemedel" är liknande den för ankare bindemedel, med undantag för två kritiska steg: 1) Dimerization bindemedel väljs med hjälp av en utvald en ankar pärm och ankaret binder-ligand komplex för den negativa respektive positiva val. 2) under elutionssteget används 100 mM trietylamin för att eluera positivt utvalda Fager som endast var bundna till ankaret bindemedel--ligand Target Complex. Den 100 mm trimetylamin lösning (pH = 11,5) används för att eluera positiva kloner genom att störa proteinet interaktioner.

  1. Början av urvalet
    1. Börja varje omgång av urvalet genom att vaccinera en enda TG1 cellkoloni, nyodlad på en minimal media, i 6 mL 2YT vid 37 ° c och 250 RPM till en OD600 av ~ 0,5. Inkubera celler på is.
  2. Avlägsnande av negativt utvalda nanoorgan
    1. Bered "subtraktionsröret" genom att använda 400 μL av streptavidin-belagda magnetiska pärlor och följ steg 3,2. Men istället för att mätta med biotin, tillsätt 5x den beräknade full bindnings kapaciteten med hjälp av den valda biotinylerade ankar pärmen och spara de obundna Fager som ska användas i steg 8.3.3.
  3. Urval av positivt utvalda nanoorgan
    1. Förbered "fånga röret" genom att använda 1/2 volymen av streptavidin-belagda magnetiska pärlor som används för "subtraktion röret" och följande steg 3.3.2 till 3.3.3. Men istället för att mätta med en ligand, tillsätt fem gånger Beräknad full bindnings kapacitet med hjälp av den valda en ankar pärmen.
    2. För att bilda ankaret binder-ligand komplex för den positiva Dimerization binder val, tillsätt en tillräckligt hög koncentration av icke-biotinylated ligand. Detta gör att de flesta streptavidin-bunden ankare bindemedel för att bilda ligand-bundna komplexa.
    3. Följ steg 3.3.3 till 3.3.8, med hjälp av de obundna Fager som tas från "subtraktionsröret".
  4. Av positivt utvalda nanoorgan
    1. Eluera faginen bunden till ankaret binder-ligand komplex genom att tillsätta 450 μL av 100 mM trietylamin, och inkuberande vid RT på en rotator i 10 min.
    2. Samla de konkurrensmässigt eluerade Fager och följ stegen 3.4.1 till 3.4.2.
  5. Ytterligare rundor av Dimerization binder val
    1. Följ steg 3,5 och 3,6 för att förstärka och återställa biblioteket för att kunna utföra ytterligare valomgångar. Upprepa valomgångar för 3 – 6 omgångar eller tills önskad anrikning observeras. Och plocka enstaka kloner (se avsnitt 4) för att karakterisera deras affinitet och specificitet till målet.

9. Dimerization bindemedel karakterisering av ELISA

  1. Följ stegen i avsnitt 4 för att isolera enskilda kloner för karakterisering via ELISA.
  2. För att testa affinitet av Dimerization binder kandidater till ankaret binder-ligand komplex, belägga den Elisa mål plattan med 100 μl av 100 nm en ankare bindemedel. Efter inkubering för 1 h, tillsätt 1 μM av ligand målet att bilda ankaret binder-ligand komplex.
  3. Kontrollplattan bör beläggas med hjälp av en ankare bindemedel ensam för att avskärma ut kloner som också kan binda till den fria ankare bindemedel. Tillsätt 100 μL av 100 nM biotinylerad ankar pärm och inkubera vid RT för 1 h.
  4. Följ avsnitten 5.3 – 5.7.

10. Dimerization bindemedel karakterisering av BLI

  1. Bindningsaffinitet och kinetiken hos dimeriseringsbindemedel för ankaret binder--ligand-komplexet kan analyseras genom immobilisering av biotinylerade dimeriseringsbindemedel på konjugerat (sa)-biosensorer med bindnings analysbufferten och därefter analyserades med 1 μm förankrings bindemedel som är förjämkade med seriella utspädningar av liganden. KD, koch koff av interaktioner kan beräknas med hjälp av vår rapporterade metod19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi beskriver två steg in vitro-urval och validering av ankare och Dimerization bindemedel genom screening av kombinatoriskt nanobody bibliotek med en mångfald högre än 109 med CBD som mål. Bedömning av berikning av fagbiopanning under de successiva valomgångar för både ankare och Dimerization bindemedel är viktigt. Typiska beriknings resultat efter 4 – 6 urvals rundor som visas i figur 5 är en bra indikation på att det finns en hög andel potentiella träffar i sublibraries, så ytterligare rundor av urval kanske inte nödvändigt.

Single-Clone ELISA är lämplig för att analysera den relativa bindningen samhörighet och selektivitet ankare och Dimerization bindemedel. Figur 6a är ett representativt val av ankare bindemedel efter sex omgångar av biopanning. Kloner som visar höga (t. ex. #87) eller låga (t. ex. #27) ligand selektivitet kan jämföras. Hög selektivitet kloner bör väljas som ankare bindemedel kandidater. På samma sätt visar figur 6B urvalet av Dimerization bindemedel efter fyra omgångar av biopanning. Vi observerade vanligtvis kloner som bildade en heterodimer med immobiliserade ankare bindemedel endast med ligand (t. ex., #49) eller utan (t. ex. #80). Den förstnämnda, som visar Dimerization specificitet, bör väljas för ytterligare validering.

Anchor binder Elisa förlitar sig på användningen av en målet. Därför måste vi använda BLI för att ytterligare bekräfta bindningen till det icke-märkta målet. BLI tillåter också karakterisering av bindningskinetik. Representativa BLI resultat av ankare och Dimerization bindemedel visas i figur 7A respektive 7b. De vänstra panelerna visar ligand koncentrationsberoende bindning, vilket tyder på att de är lämpliga för att konstruera ett CID-system. De högra panelerna visar de negativa kontrollerna. Den beräknade KD av ankare och Dimerization binder interaktioner i närvaro av ligand typiskt varierade från tvåsiffrig nanomolar till tvåsiffrig micromolar. De kan variera beroende på ligand och kombinatoriska bibliotek val.

Analytiskt uteslutnings kromatografi (SEC) utfördes för att bekräfta heterodimerbildningen mellan förankrings-och dimeriseringsbindemedel. En Dimerization Peak observerades när ankare och Dimerization bindemedel och CBD var blandade (figur 8A, röd linje). Däremot upptäcktes ingen dimeriseringstopp i avsaknad av CBD (figur 8A, blå linje) eller när varje pärm laddades till kolonnen ensamt (figur 8B). Den kemiska tvärbindning användes för att stabilisera CID komplex, och tvärbunden nanoorgan har något ökade storlekar som motsvarar tidigare eluerade toppar.

Figure 1
Figur 1: mekanism för kemiskt inducerad proteindimerisering. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Schematisk generering av ett syntetiskt nanobody kombinatoriskt bibliotek. Biblioteket är konstruerat med hjälp av en universell nanobody byggnadsställning och införliva designade distributioner av aminosyror till varje randomisering position i tre komplementaritetbestämmande regioner (CDRs) av en Trinukleotid mutagenitet (TRIM) teknik 24. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: flödesschema av (a) ankare och (B) Dimerization bindemedel screening. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: tidslinje för sammanslutningar-Cid. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: anrikning av fagtitrar efter varje omgång biopanning för val av ankar pärmar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: representativa Elisa-resultat som visar positiva (+) och negativa (*) kloner. A) ankarbindemedel Elisa resultat från 96 slumpmässigt plockade kloner efter sex omgångar av urval. (B) Dimerization bindemedel Elisa resultat av 96 slumpmässigt plockade kloner efter fyra omgångar av urval. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: kinetisk analys av förankra och Dimerization binder av bli. (A) analys av ankar pärmen med OMÄRKTA CBD (vänster) och THC (höger). Biotinylated ankare bindemedel var immobiliserade på Super Streptavidin (SSA) biosensorer titreras med olika koncentrationer av CBD. Uppmätta data för CBD-bindning (röda kurvor) var globalt monterade (grå linjer). Bvänster, bli-analys av en sa-biosensor-immobiliserad dimeriseringsbindemedel som är bindande för ankar pärmen som är förjämkade med olika koncentrationer av CBD. Rätt, var ankaret binder koncentrationen titrerades och bunden till immobiliserade Dimerization bindemedel i avsaknad av CBD. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8: SEC analys av heterodimerization mellan ankare och Dimerization bindemedel. A) dimeriserings-och förankrings bindare (5 μm vardera) i närvaro eller frånvaro av CBD korsbindes med 100 μm BIS-N-succinimidyl-(pentaetylenglykol) Ester för 30 min vid RT före analysen. Elueringvolymer av protein standarder är markerade med trianglar. (B) icke-crosslinked ankare och Dimerization bindemedel (30 μm vardera) injicerades separat. Kromatogrammen i A och B visas i olika Y-skalor. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det är viktigt att välja rätt koncentrationer av input phage bibliotek för olika omgångar av biopanning. Vi började vanligtvis från ett inmatnings bibliotek av ~ 1012-1013 fagpartiklar med en mångfald > 109, vilket gör ~ 100-1000 kopior av varje fagklon som skall presenteras i pull-down-analysen. Om fagkoncentrationen i ett bindnings test är för hög eller låg, kommer sannolikheten för icke-specifik bindning eller förlust av positiva kloner att öka. Valet av ankare eller Dimerization binder normalt består av tre till sex omgångar av biopanning, och output phage räknas brukar börja från ~ 104 och ökar till ~ 108– 109. Det är lämpligt att plocka enstaka kloner för ELISA validering efter att ha observerat sådan berikning. Ytterligare omgångar av biopanning kan minska chanserna att identifiera lämpliga låg-överflöd positiva kloner.

Det är viktigt att ställa in lämpliga negativa kontroller och markeringar för att öka framgången för valen. Till exempel, användning av strukturella analoger av ligand mål kommer att underlätta valet av ligand specificitet. I vårt arbete, en mycket liknande analog, THC, användes som en kontroll för CBD i ELISA och BLI validering av ankare och Dimerization bindemedel19. I valet av Dimerization binder, om ankar pärmar har relativt låg ligand-bindningstillhörighet, kan både fria och ligand-bundna förankrings bindemedel presenteras som mål i det positiva urvalet. Därför är det viktigt att grundligt ta bort bindemedel som binder till fri ankare bindemedel under det negativa urvalet. Detta kan åstadkommas genom att utföra flera omgångar av subtraktion med fria ankare bindemedel.

En begränsning av vårt protokoll är att målmolekyler måste vara en för valet av ankare bindemedel och endast en eller ett fåtal ankare bindemedel kan användas för Dimerization urval. Användningen av biotinylerade mål kan berika bindemedel som delvis binder till länkaren mellan biotin och mål. Därför är det viktigt att validera träffar med omärkta mål av BLI eller andra tekniker. Välja en enda eller ett fåtal ankare bindemedel för Dimerization binder val kan minska risken för att identifiera CID system med lämplig känslighet och specificitet. Således väntar multiplexering förmåga valet ytterligare förbättring genom koppling till andra tekniker, till exempel Single-molekylär-interaktion sekvensering (SMI-SEQ) som möjliggör en "bibliotek-by-Library" protein-protein interaktion screening25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ett provisoriskt patent relaterat till detta arbete har lämnats in av University of Washington.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av University of Washington Innovation Award (till L.G.), ett bidrag från US National Institutes of Health (1R35GM128918 till L.G.), och en startup fond vid University of Washington (till L.G.). H.J. stöddes av en Washington Research Foundation grundutbildning gemenskap. K.W. stöddes av en grundutbildning stipendium från University of Washington Institute for protein design.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Step Ultra TMB ELISA substrate solution Thermo Fisher Scientific 34029
Agar Thermo Fisher Scientific BP1423-2
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit (3 kDa cutoff) Millipore UFC900324
Ampicillin Thermo Fisher Scientific BP1760-25
Bio-Rad Protein Assay Kit II Bio-Rad 5000002
BirA biotin-protein ligase standard reaction kit Avidity BirA500
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153-50G
Casein Sigma-Aldrich C7078-1KG
CM13 Helper phage Antibody Design Labs PH020L
D-(+)-Glucose monohydrate Alfa Aesar A11090
Dynabeads M-280 Streptavidin Thermo Fisher Scientific 11205D
DynaMag-2 Magnet Thermo Fisher Scientific 12321D
EDTA Thermo Fisher Scientific BP120-1
Fast DNA Ladder New England Biolabs N3238S
FastDigest BglI Thermo Fisher Scientific FD0074
Glycerol Thermo Fisher Scientific BP229-1
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg GE Healthcare 28989335
HiPrep 26/10 Desalting Column GE Healthcare 17508701
HisTrap-FF-1ml GE Healthcare 11000458
Imidazole Alfa Aesar 161-0718
IPTG Thermo Fisher Scientific 34060
Kanamycin Thermo Fisher Scientific BP906-5
M13 Major Coat Protein Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-53004
NaCl Sigma-Aldrich S3014-500G
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermo Fisher Scientific ND-2000
Nunc 96-Well Polypropylene DeepWell Storage Plates Thermo Fisher Scientific 260251
Nunc MaxiSorp Thermo Fisher Scientific 44-2404-21
Octet RED96 ForteBio N/A
pADL-23c Phagemid Vector Antibody Design Labs PD0111
PEG-6000 Sigma-Aldrich 81260-1KG
Platinum SuperFi DNA Polymerase Invitrogen 12351010
PureLink PCR Purification Kit Thermo Fisher Scientific K310001
QIAprep Spin M13 Kit Qiagen 27704
Recovery Medium Lucigen 80026-1
SpectraMax Plus 384 Molecular Devices N/A
Sucrose Sigma-Aldrich S0389-1KG
Super Streptavidin (SSA) Biosensors ForteBio 18-5057
Superdex 75 increase 10/300 GL Column GE Healthcare 28-9909-44
T4 DNA Ligase Thermo Fisher Scientific 15224-025
TG1 Electrocompetent Cells Lucigen 60502-1
Triethylamine Sigma-Aldrich 471283-100mL
Trizma Base Sigma-Aldrich T1503
Tryptone Thermo Fisher Scientific BP9726-5
Tween 20 Thermo Fisher Scientific BP337-500
Yeast Extract Thermo Fisher Scientific BP1422-2
Zeba Spin Desalting Column Thermo Fisher Scientific 89882

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stanton, B. Z., Chory, E. J., Crabtree, G. R. Chemically induced proximity in biology and medicine. Science. 359, (6380), (2018).
  2. Wu, C. Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor. Science. 350, (6258), (2015).
  3. Straathof, K. C., et al. An inducible caspase 9 safety switch for T-cell therapy. Blood. 105, (11), 4247-4254 (2005).
  4. Di Stasi, A., et al. Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy. The New England Journal of Medicine. 365, (18), 1673-1683 (2011).
  5. Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophysical Journal. 90, (5), 1790-1796 (2006).
  6. Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, (6), 3197-3202 (2001).
  7. Hunter, M. M., Margolies, M. N., Ju, A., Haber, E. High-affinity monoclonal antibodies to the cardiac glycoside, digoxin. Journal of Immunology. 129, (3), 1165-1172 (1982).
  8. Bradbury, A. R. M., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies. Nature Biotechnology. 29, (3), 245-254 (2011).
  9. Chen, G., et al. Isolation of high-affinity ligand-binding proteins by periplasmic expression with cytometric screening (PECS). Nature. Biotechnology. 19, (6), 537-542 (2001).
  10. Tinberg, C. E., et al. Computational design of ligand-binding proteins with high affinity and selectivity. Nature. 501, (7466), 212-216 (2013).
  11. Spencer, D. M., Wandless, T. J., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. Controlling signal transduction with synthetic ligands. Science. 262, (5136), 1019-1024 (1993).
  12. Ho, S. N., Biggar, S. R., Spencer, D. M., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. Dimeric ligands define a role for transcriptional activation domains in reinitiation. Nature. 382, (6594), 822-826 (1996).
  13. Belshaw, P. J., Ho, S. N., Crabtree, G. R., Schreiber, S. L. Controlling protein association and subcellular localization with a synthetic ligand that induces heterodimerization of proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, (10), 4604-4607 (1996).
  14. Farrar, M. A., AlberolaIla, J., Perlmutter, R. M. Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization. Nature. 383, (6596), 178-181 (1996).
  15. Erhart, D., et al. Chemical Development of Intracellular Protein Heterodimerizers. Chemistry & Biology. 20, (4), 549-557 (2013).
  16. Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer. Nature Communications. 17, (5), 5475 (2014).
  17. Hill, Z. B., Martinko, A. J., Nguyen, D. P., Wells, J. A. Human antibody-based chemically induced dimerizers for cell therapeutic applications. Nature Chemical Biology. 14, (2), 112-117 (2018).
  18. Foight, G. W., et al. Multi-input chemical control of protein dimerization for programming graded cellular responses. Nature Biotechnology. 37, (10), 1209-1216 (2019).
  19. Kang, S., et al. COMBINES-CID: An efficient method for de novo engineering of highly specific chemically induced protein dimerization systems. Journal of the American Chemical Society. 141, (28), 10948-10952 (2019).
  20. Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
  21. Fanning, S. W., Horn, J. R. An anti-hapten camelid antibody reveals a cryptic binding site with significant energetic contributions from a nonhypervariable loop. Protein Science. 20, (7), 1196-1207 (2011).
  22. Zavrtanik, U., Luken, J., Loris, R., Lah, J., Hadzi, S. Structural basis of epitope recognition by heavy-chain camelid antibodies. Journal of Molecular Biology. 430, (21), 4369-4386 (2018).
  23. Denhardt, D. T., Dressler, D., Ray, D. S. The Single-Stranded DNA Phages. 605-625 (1978).
  24. Virnekas, B., et al. Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic Acids Research. 22, (25), 5600-5607 (1994).
  25. Gu, L., et al. Multiplex single-molecule interaction profiling of DNA-barcoded proteins. Nature. 515, (7528), 554-557 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics