Biochemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Detektion av protein ubiquitination platser av peptidanrikning och masspektrometri
Chapters
Summary March 23rd, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi presenterar en metod för rening, detektion och identifiering av diGly peptider som härrör från ubiquitinated proteiner från komplexa biologiska prover. Den presenterade metoden är reproducerbar, robust och överträffar publicerade metoder med avseende på nivån på djupet av ubiquitinome analysen.
Transcript
Den post translationella modifieringen av proteiner av det lilla proteinet ubiquitin är involverad i många händelser i cellen. Denna studie presenterar ett original tillägg till verktygslådan för protein ubiquitination analys. Vi använder anrikningstekniker och masspektrometri för att avslöja det djupa ubiquitinomet.
Vi har gjort flera förbättringar av analysen av diGly peptider som härstammar från ubiquitinerade proteiner. Dessa inkluderar rå peptidfraktionering före anrikning, och tillämpningen av mer avancerade peptid fragmentering inställningar i Orbitrap. Alldeles resulterar detta i en större täckning av ubiquitinomen.
Flera aspekter av protokollet är svåra att beskriva i ord. Visualisering av några av de viktigaste stegen är viktigt för att kunna upprepa dessa analyser av olika operatör i ett annat labb. Proceduren kommer att demonstreras av Karel Bezstarosti, som är senior tekniker i mitt labb.
Börja med att förbereda odlade celler eller mus hjärnvävnad för experimentet. Om du arbetar med celler, lysa cellpelletsen från en 150 centimeter i kvadrat odlingsplatta i två milliliter iskall, 50 millimolar Tris HCL med 0,5%natrium deoxicholat. Koka lysate vid 95 grader Celsius i fem minuter.
Sedan sonikera det vid fyra grader Celsius i 10 minuter. Om du använder in vivo-mus hjärnvävnad, lysa den i en iskall buffert som innehåller 100 millimolar Tris HCL, 12 millimolar natrium deoxicholat och 12 millimolar natrium N-lauroylsarkosasinate. Sonikera lysate i 10 minuter vid fyra grader Celsius.
Koka sedan den i fem minuter vid 95 grader Celsius. Därefter kvantifiera den totala proteinmängden med hjälp av en calorimetric absorbans BCA protein assay kit, som bör vara minst flera milligram för framgångsrik diGly peptid immunoprecipitation. För SILAC-experiment, blanda de lätta och tunga märkta proteinerna i ett ett till ett-förhållande baserat på den totala proteinmängden.
Minska alla proteiner med fem millimolar DTT i 30 minuter vid 50 grader Celsius. Och därefter alkylera dem med 10 millimolar iodoacetamid i 15 minuter i mörkret. Utför sedan proteins digestion med Lys-C i fyra timmar.
Och trypsin matsmältning över natten vid 30 grader Celsius, eller vid rumstemperatur. På nästa dag, dela provet i två två milliliter Eppendorf rör och tillsätt TFA till det smälta provet till en slutlig koncentration av 0,5%Centrifug det vid 10, 000 gånger G i 10 minuter för att fälla ut och ta bort allt rengöringsmedel. Samla in peptiden som innehåller supernatant för efterföljande fraktionering.
Använd hög pH omvänd fas C18 kromatografi för att fractionate de tryptiska peptider. Förbered en tom sex milliliter kolonn patron fylld med 0,5 gram stationärt fasmaterial för ca 10 milligram protein digest. Ladda peptiderna på den förberedda kolonnen och tvätta den med cirka 10 volymer på 0,1%TFA, följt av 10 volymer vatten.
Elute peptiderna i tre fraktioner med 10 kolumn volymer av 10 millimolar ammonium formate med sju, 13,5 och 50%acetonitrile, respektive. Sedan, litholyse alla fraktioner. En sats av ubiquitin kvarleva motiv antikroppar konjugerade till protein A agarose bead slurry är uppdelad i sex lika stora fraktioner.
Lös upp de tre peptidfraktionerna enligt manuskriptriktningarna och snurra ner skräpet. Tillsätt supernatanterna av de tre fraktionerna till pärlans slurry samtidigt som de andra tre fraktionerna på is. Och inkubera dem i två timmar vid fyra grader Celsius på en rotatorenhet.
Snurra sedan ner pärlorna. Överför supernatanten till en ny omgång pärlor. Och upprepa inkubationen med de återstående tre pärla slurry fraktioner.
Förvara supernatanterna för efterföljande global proteomanalys. Och överför pärlorna till 200 mikroliterpipettspetsar utrustade med en GFF-filterplugg. Sätt spetsarna i 1,5 milliliter rör utrustade med en centrifugsspetsadapatör och tvätta pärlorna tre gånger med 200 mikroliter iskall IAP-buffert, följt av tre tvättar med iskallt renat vatten.
Snurra ner kolumnerna på 200 gånger G i två minuter mellan tvättar, se till att inte låta kolonnen torka. Efter den slutliga tvätten, elute peptiderna med två cykler vid 50 mikroliter av 0,15%TFA. Desalt peptiderna med en C18 steg spets och torka dem med vakuum centrifugeringen.
Utför LC-MS/MS-experiment på en känslig masspektrometer som är kopplade till ett nanoflow LC-system. Kolonnen är inställd enligt manuskriptriktningar och hålls vid 50 grader Celsius. Driva masspektrometern i databeroende förvärvsläge.
Samla in MS1 massspektra med hög upplösning med en automatiserad förstärkningsstyrd målinställning på 4E5 och en maximal injektionstid på 50 millisekunder. Utför masspektrometrianalysen i det mest intensiva första läget, med topphastighetsmetoden med en total cykeltid på tre sekunder. Utför sedan en andra omgång av DDA MS-analys i minst intensiva första läge, vilket kommer att säkerställa optimal upptäckt av låga överflöd peptider.
Filtrera prekursorjonerna enligt deras laddningsstater och monoisotopisk topptilldelning. Och utesluta tidigare förhörda prekursorer dynamiskt i 60 sekunder. Isolera peptid prekursorer med en quadrupole massfilter inställd på en bredd av 1,6 Thomson.
Samla sedan in MS2-spektra i jonfällan vid en automatiserad förstärkningskontroll av 7E3 med en maximal injektionstid på 50 millisekunder och HCD-kollisionsenergi på 30%Analysera de masspektrometriska råfilerna med hjälp av en lämplig sökmotor, till exempel den fritt tillgängliga MaxQuant-programsviten baserad på Andromeda-sökmotorn. Öppna MaxQuant och välj lämpliga rådatafiler. Ställ in antalet processorer och klicka på fliken gruppspecifika parametrar.
Välj matsmältning, och möjliggöra tre missade klyvningar. Välj sedan modifikationer och lägg till diGly till de variabla modifieringarna. Välj fliken globala parametrar och lägg till rätt proteinsekvensdatabas.
Låt de andra inställningarna vara standard och tryck på start för att utföra databassökningen. För kvantitativ analys av SILAC experimentfiler, ställ in multipliciteten till två, och välj de tunga aminosyra etiketter. När sökningen är klar, importera textfilerna till Perseus.
Detta protokoll användes för att identifiera ubiquitination platser i proteiner från odlade celler och in vivo material genom att upptäcka diGly peptider med nanoflow LC-MS/MS. Flera förbättringar gjordes till det existerande protokollet som resulterade i högre antal av detekterade diGly peptider. En rå fraktionering i tre fraktioner utfördes före immunoprecipitation.
En av fraktionerna innehåller ubiquitins egna K48-modifierad tryptisk diGly-peptid, som kännetecknas av en bred topp i LC-kromatogrammet. Dessutom justerades peptidfragmenteringsregimen för att kombinera LC-MS-körningarna med de högsta första och lägsta första fragmenteringsregimerna i dataanalysförfarandet, som producerade mer än 4, 000 ytterligare unika diGly-peptider. Mer än 23, 000 diGly peptider kan rutinmässigt identifieras från ett enda prov av HeLa celler som behandlats med en proteasom hämmare.
Av alla diGly peptider identifieras över tre biologiska replikera skärmar, mer än 9, 000 var närvarande i alla tre, medan mer än 17, 000 var närvarande i minst två av tre replikat. Antalet peptididentifieringar är starkt beroende av mängden insatsmaterial. Ett ungefärligt antal identifierade diGly-peptider kan förväntas beroende på utgångsmaterialet, men dessa tal är endast uppskattningar och kommer också att bero på vilken typ av masspektrometer som används.
Vid utförandet av detta protokoll, tidigare erfarenhet av masspektrometri baserade proteomik metoder och hantering och analysera minut provmängder skulle säkert vara fördelaktigt. Den MaxQuant programvara skulle kunna ersättas av någon annan databas sökning algoritm. Även en annan typ av masspektrometer får användas.
Resultaten i termer av peptid identifieringar kan något skilja sig, men detta är typiskt för alla masspektrometri baserade proteomik analys. Ubiquitin är viktigt i framsteg av medierad proteinnedbrytning, men spelar också en roll i många andra processer i cellen. Djupare kunskap om ubiquitin som en post translationell modifiering är avgörande för att bättre förstå dess funktion.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
