Fabricação de Matrizes de microeletrodo Ti3C2 MXene para gravação neural in vivo

Bioengineering

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Summary

Descrevemos aqui um método para fabricar matrizes de microeletrodos Ti3C2 MXene e utilizá-las para gravação neural in vivo.

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Driscoll, N., Maleski, K., Richardson, A. G., Murphy, B., Anasori, B., Lucas, T. H., Gogotsi, Y., Vitale, F. Fabrication of Ti3C2 MXene Microelectrode Arrays for In Vivo Neural Recording. J. Vis. Exp. (156), e60741, doi:10.3791/60741 (2020).

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Abstract

As tecnologias de microeletrodos implantáveis têm sido amplamente utilizadas para elucidar a dinâmica neural na microescala para obter uma compreensão mais profunda dos fundamentos neurais de doenças cerebrais e lesões. Como os eletrodos são miniaturizados à escala de células individuais, um aumento correspondente na impedância da interface limita a qualidade dos sinais registrados. Além disso, os materiais de eletrodos convencionais são rígidos, resultando em uma significativa incompatibilidade mecânica entre o eletrodo e o tecido cerebral circundante, o que provoca uma resposta inflamatória que eventualmente leva a uma degradação do desempenho do dispositivo. Para enfrentar esses desafios, desenvolvemos um processo para fabricar microeletrodos flexíveis baseados em Ti3C2 MXene, um nanomaterial recentemente descoberto que possui notável alta capacidade volumétrica, condutividade elétrica, funcionalidade de superfície e capacidade de processamento em dispersões aquosas. Matrizes flexíveis de microeletrodos Ti3C2 MXene têm uma impedância notavelmente baixa devido à alta condutividade e alta área de superfície específica dos filmes Ti3C2 MXene, e eles provaram ser requintadamente sensíveis para registrar atividade neuronal. Neste protocolo, descrevemos um novo método para micropadronizar Ti3C2 MXene em matrizes de microeletrodos em substratos poliméricos flexíveis e delinear seu uso para gravação de microeletrocorticografia ao vivo. Este método pode ser facilmente estendido para criar matrizes de eletrodos MXene de tamanho arbitrário ou geometria para uma gama de outras aplicações em bioeletrônica e também pode ser adaptado para uso com outras tintas condutoras além de Ti3C2 MXene. Este protocolo permite a fabricação simples e escalável de microeletrodos a partir de tintas condutoras baseadas em soluções, e especificamente permite aproveitar as propriedades únicas de icti3C 2 MXene para superar muitas das barreiras que há muito dificultam a adoção generalizada de nanomateriais à base de carbono para microeletrodos neurais de alta fidelidade.

Introduction

Entender os mecanismos fundamentais subjacentes aos circuitos neurais e como sua dinâmica é alterada em doenças ou lesões, é um objetivo crítico para o desenvolvimento de terapêuticas eficazes para uma ampla gama de distúrbios neurológicos e neuromusculares. As tecnologias de microeletrodos têm sido amplamente utilizadas para elucidar a dinâmica neural em escalas espaciais e temporais finas. No entanto, obter gravações estáveis com alta relação sinal-ruído (SNR) a partir de eletrodos de microescala provou ser particularmente desafiador. À medida que as dimensões dos eletrodos são reduzidas à aproximação da escala celular, um aumento correspondente na impedância de eletrodos degrada a qualidade do sinal1. Além disso, inúmeros estudos têm demonstrado que eletrodos rígidos compostos por materiais eletrônicos convencionais de silício e metal produzem danos significativos e inflamação no tecido neural, o que limita sua utilidade para o registro a longo prazo2,3,4,5. Diante desses fatos, houve um interesse significativo no desenvolvimento de microeletrodos com novos materiais que podem reduzir a impedância da interface eletrodo-tecidual e podem ser incorporados em fatores de forma suave e flexível.

Um método comumente usado para reduzir a impedância da interface eletrodo-tecidual está aumentando a área sobre a qual espécies iônicas no fluido extracelular podem interagir com o eletrodo, ou a "área de superfície eficaz" do eletrodo. Isso pode ser alcançado através da nanopadronização6, roughening superficial7, ou eletroplating com aditivos porosos8,9. Os nanomateriais ganharam atenção significativa neste campo porque oferecem áreas de superfície específicas intrinsecamente altas e combinações únicas de propriedades elétricas e mecânicas favoráveis10. Por exemplo, nanotubos de carbono têm sido usados como revestimento para reduzir significativamente a impedância de eletrodos11,12,13, óxido de grafeno foi processado em eletrodos de sonda sem fio e flexíveis14, e o grafeno poroso piralificado a laser foi utilizado para eletrocorticografia flexível e de baixa impesão (micro-ECoG) eletrocógrafos15. Apesar de sua promessa, a falta de métodos de montagem escaláveis limitou a adoção generalizada de nanomateriais para eletrodos interligados neurais. Nanomateriais à base de carbono, em particular, são tipicamente hidrofóbicos, e, portanto, requerem o uso de surfactantes16, superácidos17, ou funcionalização superficial18 para formar dispersões aquosas para métodos de fabricação de processamento de soluções, enquanto métodos alternativos de fabricação, como deposição de vapor químico (DCV), normalmente requerem altas temperaturas incompatíveis com muitos substratos poliméricos19,20,21 ,22.

Recentemente, uma classe de nanomateriais bidimensionais (2D), conhecidos como MXenes, foi descrita que oferece uma combinação excepcional de alta condutividade, flexibilidade, capacitância volumétrica e hidrofilia inerente, tornando-os uma classe promissora de nanomateriais para eletrodos interficiais neurais23. MXenes são uma família de carbides de metal de transição 2D e nitrides que são mais comumente produzidos gravando seletivamente o elemento A de precursores em camadas. Estas são tipicamente fases MAX com a fórmula geral Mn+1AXn, onde M é um metal de transição precoce, A é um elemento de grupo 12-16 da tabela periódica, X é carbono e/ou nitrogênio, e n = 1, 2 ou 324. Os flocos mxene bidimensionais têm grupos funcionais de terminação de superfície que podem incluir hidroxilo (−OH), oxigênio (-O) ou fluorina (-F). Esses grupos funcionais tornam os MXenes inerentemente hidrofílicos e permitem modificação ou funcionalidade de superfície flexível. Da grande classe de MXenes, ti3C2 tem sido o mais estudado e caracterizado25,26,27. Ti3C2 mostra capacidade volumétrica notavelmente maior (1.500 F/cm3)28 do que o grafeno ativado (~60-100 F/cm3)29, carbonos derivados de carbóide (180 F/cm3)30, e filmes de gel de grafeno (~260 F/cm3)31. Além disso, ti3C2 mostra uma condutividade eletrônica extremamente alta (~10.000 S/cm)32, e sua biocompatibilidade tem sido demonstrada em diversos estudos33,34,35,36. A alta capacidade volumétrica dos filmes Ti3C2 é vantajosa para aplicações biológicas de sensoriamento e estimulação, pois eletrodos que exibem transferência de carga capacitiva podem evitar reações de hidrólise potencialmente prejudiciais.

Nosso grupo demonstrou recentemente matrizes flexíveis de microeletrodos Ti3C2, preparadas usando métodos de processamento de soluções, que são capazes de registrar tanto a microeletrocorticografia (micro-ECoG) quanto a atividade intracortical neuronal de piqueamento in vivo com o Alto SNR36. Estes eletrodos MXene mostraram impedância significativamente reduzida em comparação com eletrodos de ouro (Au) com tamanho, que podem ser atribuídos à alta condutividade de MXene e à área de superfície alta dos eletrodos. Neste protocolo, descrevemos os passos-chave para a fabricação de matrizes de microeletrodos planar de Ti3C2 MXene em substratos parylene-C flexíveis e utilizando-os in vivo para gravação intraoperatória de micro-ECoG. Este método aproveita a natureza hidrofílica da MXene, o que possibilita o uso de métodos de processamento de soluções simples e escaláveis, sem exigir o uso de surfactantes ou superácidos para alcançar suspensões aquosas estáveis. Essa facilidade de processabilidade pode permitir a produção econômica de biosensores MXene em escalas industriais, o que tem sido uma grande limitação para a adoção generalizada de dispositivos com base em outros nanomateriais de carbono. A principal inovação na fabricação de eletrodos está no uso de uma camada polimérica sacrificial para micropadronizar o MXene após o revestimento spin, um método adaptado da literatura sobre polipoli de solução processada (3,4-etilenoiophene):poly (sulfona estireno) (PEDOT:PSS) microelectrodes37,mas que não havia sido descrito anteriormente para o padrão MXene. As excepcionais propriedades elétricas de Ti3C2,juntamente com sua processabilidade e morfologia 2D fazem dele um material muito promissor para interfaces neurais. Em particular, o Ti3C2 oferece um caminho para superar a troca fundamental entre área geométrica de eletrodos e impedância de interface eletroquímica, fator principal de limitação para o desempenho de eletrodos em microescala. Além disso, o procedimento de fabricação descrito neste protocolo pode ser adaptado para produzir matrizes de eletrodos MXene de tamanhos e geometrias variados para diferentes paradigmas de gravação, e também pode ser facilmente adaptado para incorporar outras tintas condutoras além de MXene.

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Protocol

Todos os procedimentos vivos constituídos ao Guia nacional de Saúde (NIH) para o Cuidado e Uso de Animais Laboratoriais e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Pensilvânia.

1. Síntese de Ti3C2 MXene

NOTA: Os procedimentos de reação descritos nesta seção são destinados ao uso dentro de uma capa de fume química. As etapas de lavagem incluídas neste procedimento devem ser utilizadas com tubos de centrífuga equilibrados. Todos os resíduos produzidos são considerados resíduos perigosos e devem ser descartados adequadamente seguindo as diretrizes da Universidade.

ATENÇÃO: O ácido fluorídrico (HF) é um ácido extremamente perigoso e altamente corrosivo. Consulte as folhas de dados de segurança dos materiais (MSDS) para obter os produtos químicos usados para sintetizar MXenes antes de usar e implementar e seguir as medidas de segurança apropriadas. Equipamentos de proteção individual adequados (EPI) para manuseio de HF incluem um casaco de laboratório, avental resistente ao ácido, sapatos de dedo próximo, calças compridas, óculos, escudo facial completo, luvas de nitrile e luvas resistentes a HF feitas de borracha butil ou borracha neoprene.

  1. Síntese de fase MAX
    1. Sinthesize Ti3AlC2 por bola moendo TiC (2 μm), Ti (44 μm) e Al (44 μm) em uma relação molar (TiC:Ti:Al) de 2:1:1 para 18 h usando bolas de zircônia. Coloque os pós em um cadinho de alumina, aqueça a 1.380 °C (5 °C) e segure por 2 h argônio. Depois que os pós foram resfriados, moa o bloco MAX e peneira através de uma peneira de malha de 200 (<74 μm tamanho de partículas).
      NOTA: O precursor da fase Ti3AlC2 MAX usado para sintetizar MXenes mostrou-se ter implicações diretas nas propriedades Ti3C2 MXene resultantes38. O Ti3C2 usado para fabricar eletrodos neurais foi seletivamente gravado a partir de MAX preparado após um procedimento anterior26.
  2. Gravura: Remoção da camada Al em Ti3ALC2 em uma solução ácida etchant(Figura 1A)
    1. Prepare a solução de gravura seletiva em um recipiente plástico de 125 mL adicionando primeiro 12 mL de água deionizada (DI H2O) seguido pela adição de 24 mL de ácido clorídrico (HCl). Usando todos os PPE gravuras HF apropriados, adicione 4 mL de HF ao recipiente etchant. Realize a gravação seletiva adicionando lentamente 2 g de ti3alc2 max fase ao recipiente de reação e mexendo com uma barra magnética Teflon por 24 h a 35 °C a 400 rpm.
  3. Lavagem: Trazendo o material para pH neutro.
    1. Encha dois tubos centrífugas de 175 mL com 100 mL de DI H2O. Divida a mistura de reação de gravação em 175 tubos de centrífuga mL e lave o material por centrífuga repetida a 3.500 rpm (2.550 x g) por 5 min. Decant o supernatante ácido em um recipiente de resíduos perigosos plásticos. Repita até que o pH chegue a 6.
  4. Intercalação: Inserção de moléculas entre partícula Multicamada MXene para despertar interações fora do plano (Figura 1B)
    1. Adicione 2 g de cloreto de lítio (LiCl) a 100 mL de DI H2O e mexa a 200 rpm até dissolver. Misture 100 mL de LiCl/H2O com o sedimento Ti3C2/Ti3ALC2 e mexa a reação por 12 h a 25 °C.
  5. Delaminação: Esfoliação da partícula multicamada a granel em camada única a poucas Ti3C2 MXene (Figura 1C)
    1. Lave a reação intercalation em 175 tubos de centrífuga mL por centrífuga em 2.550 x g por 5 min. Decant o supernatante claro. Repita até que um supernatante escuro seja encontrado.
    2. Continue a centrífuga por 1h a 2.550 x g. Decante o supernatante verde diluído.
    3. Re-disperse o sedimento inchado com 150 mL de DI H2O. Transfira supernatante para tubos centrífugas de 50 mL e centrífuga sem 2.550 x g por 10 minutos para separar max (sedimento) restante de MXene (supernatante).
      NOTA: A redispersão do sedimento se tornará difícil e exigirá agitação ou agitação manual.
    4. Colecione supernatant como Ti3C2 MXene. Realize mais seleção de tamanho e otimização da solução para isolar flocos de camada única a pouca camada, coletando o supernatante após uma etapa de centrífuga em 2.550 x g por 1 h.
  6. Armazenamento de soluções: Embalagem da tinta MXene para armazenamento de longo prazo(Figura 1D)
    1. Argon borbulhe as soluções por 30 min antes da embalagem em um frasco de espaço de cabeça lacrado argon (transferência via seringa). Armazene soluções em altas concentrações (>5 mg/mL), longe da luz solar, e a baixas temperaturas (≤5°C) para garantir a longevidade.

2. Fabricação de Ti3C2 Matrizes de microeletrodo mxene

NOTA: O procedimento descrito nesta seção destina-se a uso dentro de uma instalação padrão de sala limpa da universidade, como o Singh Center for Nanotechnology da Universidade da Pensilvânia. Esta instalação, assim como instalações similares, são acessíveis a usuários externos como parte da Rede Nacional de Infraestrutura de Nanotecnologia (NNIN) apoiada pela Fundação Nacional de Ciência (NSF). Nessas instalações, muitas das ferramentas, equipamentos e materiais descritos nesta seção são fornecidos juntamente com o acesso à instalação da sala limpa e não exigiriam compra separada.

ATENÇÃO: Muitos dos produtos químicos usados na fabricação de eletrodos MXene são perigosos, incluindo fotoresists, desenvolvedor RD6, remover PG, solução de gravação de alumínio e etchant de óxido tampão. Consulte o MSDS para obter esses produtos químicos antes de usar e implementar e seguir as medidas de segurança apropriadas o tempo todo. Todos os produtos químicos devem ser manuseados em um capô de fumaça.

  1. Deposite uma camada inferior de 4 μm de espessura de parylene-C em um wafer Si limpo (ver Figura 2A).
  2. Use a primeira fotomáscara (máscara-1) para definir as interconexões metálicas dos dispositivos, bem como um anel de metal ao redor da borda do wafer para auxiliar em etapas posteriores de decolagem(Figura 2B).
    1. O casaco de giro NR71-3000p no wafer a 3.000 rpm para 40 s. Leve assar o wafer em uma placa quente por 14,5 min a 95 °C.
    2. Carregue o wafer e a máscara-1 em um alinhador de máscaras. Posicione o wafer para que o anel na fotomáscara se sobreponha a todas as bordas do wafer.
    3. Expor com i-line (comprimento de onda de 365 nm) em uma dose de 90 mJ/cm2. Asse o wafer em um prato quente por 1 min a 115 °C.
    4. Mergulhe o wafer no desenvolvedor RD6 por 2 minutos, agitando continuamente a solução. Enxágüe bem com DI H2O e seque com uma arma N2.
    5. Use um evaporador de feixe de elétrons para depositar 10 nm Ti, seguido por 100 nm Au no wafer.
      NOTA: Parâmetros típicos de depoimento são uma pressão base de 5 x 10-7 Torr e uma taxa de 2 Å/s.
    6. Mergulhe o wafer no removedor PG por ~10 minutos até que a fotoresiste se dissolva e o excesso de metal tenha sido totalmente levantado, deixando Ti/Au apenas nos traços de interconexão desejados e no anel ao redor da borda do wafer. Uma vez que a decolagem aparece completa, sonicate para 30 s para remover quaisquer traços restantes de metal indesejado. Enxágüe wafer primeiro em solução de remover limpo PG, depois enxaguar completamente em DI H2O e secar o wafer com uma arma N2.
  3. Deposite a camada parylene-C sacrificial(Figura 2C).
    1. Exponha o wafer ao plasma O2 por 30 s para tornar a camada parylene-C subjacente hidrofílica. Solução de limpeza do casaco de giro 2% (por exemplo, Micro-90) no DI H2O no wafer a 1.000 rpm por 30 s. Deixe o wafer secar por pelo menos 5 min.
      NOTA: A solução de sabão diluído atua como um antiadesivo, permitindo que a camada parylene-C sacrificial seja descascada mais tarde no processo.
    2. Deposite 3 μm de parylene-C no wafer.
  4. Use a segunda fotomáscara (máscara-2) para definir os padrões MXene e um anel ao redor da borda do wafer (Figura 2D).
    1. Repita as etapas 2.2.1-2.2.4, desta vez usando máscara-2 e alinhando cuidadosamente as marcas de alinhamento entre o wafer e a fotomáscara antes da exposição.
    2. Use a gravura de íonre reativo de plasma O2 (RIE) para gravar através da camada parylene-C sacrificial nas áreas não cobertas pela fotoresistpara definir os eletrodos e traços MXene, que devem se sobrepor parcialmente com as interconexões Ti/Au, bem como o anel ao redor das bordas do wafer. Confirme a gravação completa da camada parylene-C sacrificial usando um profilómetro para medir o perfil entre as interconexões Ti/Au expostas e a camada parylene-C inferior.
      NOTA: Quando a gravação estiver completa, o perfil através da superfície metálica exposta será suave, enquanto a camada parile-C inferior será áspera e parcialmente gravada. Esta etapa de gravação deve ser completada em um sistema rie planar, não um asher barril, e tempos e parâmetros de gravação serão altamente dependentes do sistema RIE.
  5. Spin-coat a solução MXene no wafer (Figura 2E).
    1. Pipette MXene solução em cada um dos padrões MXene desejados, em seguida, gire o wafer a 1.000 rpm para 40 s. Seque o wafer em uma placa quente de 120 °C por 10 min para remover qualquer água residual do filme MXene.
  6. Use um evaporador de feixe de elétrons para depositar 50 nm SiO2 no wafer, para agir como uma camada protetora sobre os padrões de MXene para etapas de processamento subsequentes.
    NOTA: Parâmetros típicos de depoimento são uma pressão base de 5 x 10-7 Torr e uma taxa de 2 Å/s.
  7. Remova a camada parylene-C sacrificial para padronizar as camadas MXene e SiO2 (Figura 2F).
    1. Aplique uma pequena gota de DI H2O à beira do wafer e use pinças para descascar a camada parylene-C sacrificial, começando onde suas bordas são definidas no ringue ao redor do wafer.
      NOTA: A água se combinará com o resíduo de sabão abaixo da camada parilencial-C sacrificial para permitir essa decolagem.
    2. Enxágüe o wafer completamente em DI H2O para remover qualquer resíduo de solução de limpeza restante. Seque o wafer com uma arma N2, em seguida, coloque em uma placa quente de 120 °C por 1h para remover qualquer água residual dos filmes mxene padronizados.
  8. Deposite a camada superior de 4 μm de espessura de parylene-C (Figura 2G).
  9. Use a terceira fotomáscara (máscara-3) para definir contorno saque do dispositivo e aberturas sobre eletrodos e almofadas de ligação Au (VIAs) (Figura 2H).
    1. Repita as etapas 2.2.1-2.2.4, desta vez usando máscara-3 e alinhando cuidadosamente as marcas de alinhamento entre o wafer e a fotomáscara antes da exposição.
    2. Use um evaporador de feixe de elétrons para depositar 100 nm Al no wafer.
      NOTA: Parâmetros típicos de depoimento são uma pressão base de 5 x 10-7 Torr e uma taxa de 2 Å/s.
    3. Mergulhe o wafer no removedor PG por ~10 minutos até que o metal tenha sido totalmente levantado, deixando Al cobrindo os dispositivos com aberturas para os eletrodos e almofadas de ligação. Quando a decolagem estiver completa, sonicate para 30 s para remover quaisquer traços restantes de metal indesejado. Enxágüe wafer primeiro em solução de remover limpo PG, depois enxaguar completamente em DI H2O e secar o wafer com uma arma N2.
  10. Etch o parylene-C para padronizar o contorno do dispositivo e aberturas sobre eletrodos e almofadas de ligação Au (VIAs) (Figura 2I). Use o O2 plasma RIE para gravar através das camadas parylene-C ao redor dos dispositivos, e através da camada parylene-C superior cobrindo os contatos de eletrodo MXene e as almofadas de ligação Au.
    NOTA: A gravação é completa quando nenhum resíduo parylene-C permanece no wafer entre os dispositivos. A camada SiO2 que cobre o MXene agirá como uma camada de parada de gravura, impedindo que o plasma O2 gravura ou danificasse os contatos do eletrodo MXene.
  11. Etch a camada Al cobrindo os dispositivos usando uma gravação química molhada em Al etchant tipo A a 50 °C ou por 10 min, ou por 1 min passado quando todos os traços visuais de Al desapareceram, o que vier primeiro. Etch the SiO2 cobrindo os eletrodos MXene usando uma gravura química molhada em 6:1 etchant de óxido tampão (BOE) para 30 s(Figura 2J).
    NOTA: As matrizes de microeletrodos MXene estão agora completas.
  12. Solte os dispositivos do wafer de substrato Si colocando uma pequena gota de DI H2O na borda de um dispositivo e descascando suavemente o dispositivo à medida que a água é perversa por baixo dele por ação capilar(Figura 2K e Figura 3).

3. Construção e Interface

NOTA: Neste ponto, as matrizes de microeletrodos de filme fino devem ser interfacedas com um adaptador para se conectar ao sistema de gravação de eletrofisiologia. O controlador de estimulação/gravação de 128ch com o headstage RHS2000 16-ch stim/record(Tabela de Materiais)usado neste protocolo requer entrada através de um conector compatível com o conector a79039-001. Esta seção utiliza uma placa de circuito impresso (PCB, Figura 4A) com um conector de força de inserção zero (ZIF) para interagir com as almofadas de ligação Au na matriz de microeletrodos e o conector A79040-001 para interagir com o estágio principal do sistema de gravação. Dependendo do sistema de aquisição de dados, diferentes conectores podem ser usados no PCB para permitir a interligação com o headstage da eletrofisiologia.

  1. Solde os conectores Omnetics e ZIF ao PCB, aplicando uma fina película de pasta solda da pasta solda em cada uma das almofadas de contato no PCB, colocando as peças em seus locais apropriados e aquecendo em uma placa quente até que a solda reflua reflua para formar conexões (Figura 4B).
    NOTA: A solda de refluxo pode ser feita muito facilmente em uma placa quente ou em um forno de torradeira e não requer o uso de um forno de refluxo caro.
  2. Aplique duas camadas de fita poliimide (Tabela de Materiais) na parte traseira da região da almofada de ligação Au da matriz de microeletrodo MXene para dar ao dispositivo espessura suficiente para ser fixado no conector ZIF. Depois de aplicar a fita, corte qualquer excesso além das bordas do dispositivo parylene-C usando uma lâmina de barbear ou tesoura de precisão(Figura 4C).
  3. Seja um escopo de inspeção ou usando óculos de ampliação, alinha mxene matriz de microeletrodo no conector ZIF para que as almofadas de ligação Au se alinham com os pinos dentro do conector ZIF, em seguida, feche o ZIF para formar uma conexão segura (Figura 4D,E).
    NOTA: O conector ZIF usado aqui é um conector de 18 canais, enquanto o dispositivo usado aqui tem 16 canais. Os canais extras não contatados são facilmente identificados como um circuito aberto por meio de testes de impedância durante as sessões de gravação.
  4. Teste a impedância eletroquímica dos eletrodos MXene usando um potenciostat para garantir a fabricação e conexão bem sucedidas com o adaptador PCB.
    NOTA: Valores razoáveis de impedância são dados na seção de discussão para ajudar na solução de problemas.

4. Implantação aguda e gravação neural

NOTA: Cirurgias em ratos machos adultos Sprague Dawley são realizadas usando instrumentos estéreis e com técnica asséptica. A taxa respiratória, o reflexo palpebral e o reflexo da pitada de pedal são verificados a cada 10 min para monitorar a profundidade da anestesia. A temperatura corporal é mantida com uma almofada de aquecimento.

  1. Administrar analgesia preventiva (injeção subcutânea de liberação sustentada de buprenorfina [SR], 1,2 mg/kg).
  2. Administrar anestesia (injeção intraperitoneal de uma mistura de 60 mg/kg de cetamina e 0,25 mg/kg dedexmedetomidina).
  3. Confirme o nível adequado de anestesia a cada 10 min ao longo do experimento, verificando se há ausência de reflexos palpebral e de pitada de pedal.
  4. Rato seguro em quadro estereotaxico, aplique lubrificante ocular aos olhos e limpe couro cabeludo raspado com 10% de povido-iodo.
  5. Exponha a calvaria com incisão única do couro cabeludo midline e dissecação contundente do tecido subjacente.
  6. Coloque um parafuso 00-90 no crânio para servir de chão para gravações.
  7. Usando uma broca dentária com uma pequena rebarba, faça uma craniotomia no local de gravação cortical desejado.
  8. Proteja o conector de matriz a um manipulador estereotaxic e posicione o dispositivo sobre a craniotomia. Suavemente mais baixo até que toda a matriz esteja em contato com o córtex exposto.
  9. Enrole o fio de chão ao redor do parafuso do crânio.
  10. Conecte o headstage do sistema de gravação à matriz e comece a registrar atividade espontânea.

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Representative Results

Os dados de micro-ECoG de amostra registrados em uma matriz de microeletrodo MXene são mostrados na Figura 5. Após a aplicação da matriz de eletrodos no córtex, sinais fisiológicos claros foram imediatamente aparentes nos eletrodos de gravação, com aproximadamente 1 mV de amplitude ECoG aparecendo em todos os eletrodos MXene. Espectros de energia desses sinais confirmaram a presença de dois ritmos cerebrais comumente observados em ratos anestesia de cetamina-dexmedetomidina: oscilações lentas de 1-2 Hz e oscilações γ a 40-70 Hz. Além disso, observou-se uma atenuação de potência de banda larga assinada durante o estado down da oscilação lenta, e observou-se amplificação de energia de banda larga (40-120 Hz) durante o estado up da oscilação lenta. Os resultados podem variar de acordo com as espécies animais utilizadas no estudo, na região cerebral alvo, no tipo anestesia e no tempo decorrido desde a administração da anestesia.

Figure 1
Figura 1: Esquemática representando o procedimento de síntese de Xene. (A) Ti3ALC2 MAX é adicionado a uma solução etchant seletiva (HF, HCl e DI H2O), resultando na remoção de alumínio (Al). (B) Depois de lavar a solução de gravura para pH neutro usando DI H2O, multicamadaed Ti3C2 é obtido. Multicamadaed Ti3C2 é intercalado com Li+ a partir de uma solução aquosa de cloreto de lítio (LiCl). (C) Após a lavagem da reação intercalation, observa-se o inchaço dos sedimentos representando a troca de Li+ com H2O. Agitação dos resultados de sedimentos inchados em flocos de camada única (ou delaminada) única a pouca camada de Ti3C2 MXene em H2O. Seleção de tamanho e separação doti3 C2 MXene delado da fase multicamadaed Ti3C2 e Ti3AlC2 MAX ocorre nesta fase. (D) A tinta Ti3C2 MXene é transferida via seringa para um frasco de espaço para cabeça lacrado argon para armazenamento a longo prazo. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figure 2
Figura 2: Esquemas do procedimento de fabricação para matrizes de microeletrodos MXene. (A)Camada parylene-C inferior é depositada em um wafer Si limpo. (B) Ti/Au (10 nm/100 nm) traços condutores são padronizados através da fotolitografia, deposição de e-feixe e decolagem. (C) Uma camada antiadesivo de 1% de solução de limpeza no DI H2O é aplicada, seguida de depoimento de uma camada parylene-C sacrificial. (D) A camada parylene-C sacrificial é padronizada através da fotolitografia e da gravação de O2 RIE. (E) Ti3C2 MXene é revestido de spin-coated no wafer, seguido de deposição de e-feixe de 50 nm de SiO2. (F)A camada parylene-C sacrificial é retirada, resíduos de solução de limpeza são enxaguados, e o wafer é assado seco. (G)A camada parylene-C superior é depositada. (H) Uma camada de máscara de gravação Al é padronizada através da fotolitografia, deposição de e-feixe e decolagem para definir VIAs e contorno do dispositivo. (I) Parylene-C sobre contatos de eletrodos e dispositivos circundantes é gravado através de O2 RIE. (J) A máscara de gravação al e a camada protetora SiO2 sobre MXene são gravadas através de processos de gravação molhada. (K) O dispositivo acabado é retirado do wafer. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figure 3
Figura 3: Fotografias e imagens de microscopia óptica de matrizes de microeletrodos MXene. (A)Fotografia de um wafer Si de 3 polegadas contendo 14 matrizes de microeletrodos MXene concluídas. Observe o anel de ouro ao redor da borda externa do wafer, o que é útil para executar a etapa 2.7 efetivamente. (B) Imagem de microscópio óptico mostrando a descascação de um dispositivo completo do wafer usando uma pequena quantidade de DI H2O.(C) Imagem de microscópio óptico mostrando a matriz de microeletrodos MXene. (D)Imagem de microscópio óptico de um eletrodo MXene individual. Barras de escala = 1 cm, 3 mm, 500 μm, 20 μm (da esquerda para a direita). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figure 4
Figura 4: Intervirando a matriz de microeletrodos MXene com a placa de adaptador. (A) PCB com almofadas para soldar conectores Omnetics e ZIF. (B) PCB após solda de conectores Omnetics e ZIF. (C) Adição de camadas de poliimida para a parte traseira das almofadas de ligação Au do dispositivo, para dar espessura suficiente para o conector ZIF. Duas camadas de poliimida são adicionadas (superior) e, em seguida, aparadas ao redor das bordas (inferior). (D) Matriz de microeletrodos MXene inserida no conector ZIF com alinhamento adequado. (E)Visão superior do conjunto de microeletrodos MXene conectado à placa de adaptador e pronto para um experimento de gravação. Barras de escala = 2 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Resultados representativos de gravação neural. (A)Ilustração da colocação de matriz micro-ECoG na superfície cortical de um rato anestesiado. (B) Segmento de atividade cortical registrada mostrado para 9 eletrodos. Estados cortical "para baixo" baseados no cocho da oscilação lenta (1-2 Hz) são indicados por círculos vermelhos. (C) Densidades espectrais de energia para cada canal de gravação. (D) Scalograma acionado pelo Estado para o canal micro-ECoG representativo. Observe a atenuação da potência da banda larga durante a amplificação de energia de energia "down" e seletiva (15-30 Hz) e da banda γ (40-120 Hz) durante a amplificação de energia "up". Traços pretos sobrepostos mostram oscilação lenta média. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

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Discussion

O procedimento de síntese e delaminação mxene descrito neste protocolo (HF/HCl/LiCl) foi construído a partir da abordagem de gravação MILD que empregava um LiF/HCl (in situ HF) etchant médio26. A abordagem MILD permite que grandes flocos Ti3C2 (vários μm em tamanho lateral) sejam espontaneamente delaminados durante a lavagem uma vez que pH ~5-6 tenha sido alcançado. Em comparação com a gravação apenas com HF, isso resulta em material com maior qualidade e melhoria de propriedades materiais, como condutividade eletrônica e estabilidade química. O método HF/HCl/LiCl aproveita as melhorias da síntese MILD, ao mesmo tempo em que separa cada passo (gravura, intercalação e delaminação) permitindo mais controle do usuário.

Durante a etapa 1.1, a proporção de matérias-primas (TiC, Al, Ti), temperatura, temperatura e tempo são fundamentais para alcançar a fase MAX correta. O sieving da fase MAX antes da gravação garantirá uma gravura mais homogênea. A adição da fase MAX à mídia etchant (passo 1.2) deve ser conduzida lentamente para evitar superaquecimento e uma regra geral de 5 min por 1 g de MAX é sugerida. Se o superaquecimento se tornar um desafio, um banho de gelo deve ser empregado durante a adição da fase Ti3AlC2 MAX. Ao lavar a reação gravura ao pH neutro (passo 1.3), cada supernatante ácido após a centrífuga deve ser transparente. Se o supernatante após a centrífuga é verde escuro ou diluído, aumente o tempo de centrífuga e/ou velocidade para o material sedimento. Como a adição de LiCl ao H2O é exotérmica, algum aquecimento ocorrerá (passo 1.4). Neste procedimento, o tempo de intercalação (passo 1.4) é de 12h, embora possa ser modificado ou encurtado para apenas 15 minutos. A qualidade da delaminação (etapa 1.5) é específica para a quantidade de água utilizada durante a lavagem e o grau de agitação. Os supernatantes decantados durante esta etapa podem ser diluídos em vez de transparentes. Se a sedimentação do material se tornar um desafio, o aumento da velocidade/rcf centrífuga deve ser usado. É fundamental realizar a separação e seleção de tamanho por centrífuga (passo 1.5) para evitar amostras de polidispersão. A não realização desta etapa resultará em uma tinta que tem contaminação em fase Ti3ALC2 MAX e grandes partículas Multicamada Ti3C2. Durante a etapa 1.6, é importante que o volume de espaço de cabeça do frasco seja minimizado.

Durante a fabricação das matrizes de microeletrodos MXene, existem vários passos críticos que são essenciais para produzir eletrodos em funcionamento e de alta qualidade. É importante projetar a primeira fotomáscara de tal forma que há um anel de metal estampado ao redor da borda externa do wafer (passo 2.2) e a segunda fotomáscara de tal forma que há um anel de diâmetro correspondente, ligeiramente maior, que será gravado através da camada parylene-C sacrificial (passo 2.4) para ajudar na remoção da camada de sacrifício. Sem este anel, pode ser difícil estabelecer uma borda para começar a descascar a camada parylene-C sacrificial na etapa 2.7. Durante a etapa 2.3, é fundamental expor o wafer ao plasma O2 para permitir que a solução de limpeza diluída se molhar adequadamente e aderir ao wafer. A não realização desta etapa resultará em áreas do wafer não acumulando uma camada antiadesivo, o que torna impossível a remoção da camada parylene-C sacrificial na etapa 2.7. Durante a remoção da camada parylene-C sacrificial na etapa 2.7, é importante ter cuidado para evitar arranhar ou danificar a camada parile-C inferior, pois isso pode levar à formação de bolhas entre o parylene-C inferior e o wafer Si, e posterior delaminação. Se a camada parylene-C sacrificial não descascar facilmente, uma solução de limpeza um pouco mais concentrada (4% em DI) pode ser usada na etapa 2.3.1, ou a exposição ao plasma O2 na etapa 2.3.1 pode ser prolongada para melhorar a hidrofilia da camada parylene-C subjacente.

Após a conclusão da fabricação, interagir adequadamente o dispositivo MXene com a placa do conector é essencial. A adição de duas camadas de fita poliimida na etapa 3.2 é essencial para garantir espessura adequada para inserção no conector ZIF, porém deve-se tomar cuidado para evitar dobras acidentais ou amassados do fino dispositivo parylene-C enquanto a fita é adicionada, pois não é possível remover a fita sem danificar o dispositivo. Posteriormente, o alinhamento adequado das almofadas de ligação Au no dispositivo MXene com pinos dentro do conector ZIF (Figura 4D) é essencial para formar uma conexão robusta (passo 3.3). Nesta fase, medir a impedância dos eletrodos MXene é útil para a solução de problemas. Um eletrodo MXene quadrado de 50 μm x 50 μm deve ter uma magnitude de impedância perto de 50 kΩ em uma frequência de 1 kHz em 1x PBS, e um eletrodo mxene circular de 25 μm de diâmetro deve ter uma magnitude de impeção perto de 200 kΩ os mesmos parâmetros36. Uma impedância significativamente maior do que isso pode indicar que o eletrodo não está devidamente conectado no conector ZIF, ou que o eletrodo MXene não está exposto, como pode acontecer se a camada parylene-C superior não foi completamente gravada na etapa 2.10 ou a camada protetora SiO2 não foi totalmente gravada na etapa 2.11.

Uma limitação deste método é a variabilidade na espessura do filme MXene que às vezes é observada após o spin-casting MXene no wafer. Essa variabilidade pode se tornar mais acentuada se os eletrodos forem dimensionados para áreas maiores. Essa limitação pode ser facilmente superada utilizando revestimento de spray em vez de revestimento de spin para aplicar MXene ao wafer, representando outro método simples de processamento de soluções de baixo custo com o qual a MXene, e este protocolo, são compatíveiscom 39.

O protocolo descrito aqui apresenta novas oportunidades emocionantes na neurociência e no campo maior da bioeletrônica. Embora há muito se interesse em aproveitar nanomateriais à base de carbono para microeletrodos neurais, a incorporação de Ti3C2 MXene em tais eletrodos permitiu uma fabricação significativamente mais simples e mais alta de rendimento do que foi possível com outros nanomateriais à base de carbono. Além disso, as propriedades excepcionais de Ti3C2 MXene dotam os eletrodos com uma impedância notavelmente baixa para o seu tamanho, melhorando assim a sensibilidade e a qualidade do sinal. Um corpo crescente da literatura também descreve uma série de métodos para micropadronização de MXene, que podem ser adaptados para fabricar microeletrodos MXene no futuro, incluindo impressão de microcontato40, impressão de jato de tinta41,42, e gravura automatizada de bisturi43. Existe um grande potencial para estender este protocolo para fabricar eletrodos Ti3C2 MXene de tamanho arbitrário e geometria para uma gama de aplicações de biossensoriamento.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho contou com o apoio dos Institutos Nacionais de Saúde (bolsa nº. R21-NS106434), o Citizens United for Research in Epilepsy Taking Flight Award, a Mirowski Family Foundation e Neil e Barbara Smit (F.V.); o Programa de Bolsas de Pesquisa de Pós-Graduação da Fundação Nacional de Ciência (bolsa nº. DGE-1845298 para N.D. e B.M.); o Escritório de Pesquisa do Exército (Acordo Cooperativo Número W911NF-18-2-0026 para K.M.); e pelo Exército dos EUA através do Programa de Iniciativa de Ciência de Superfície no Edgewood Chemical Biological Center (PE 0601102A Project VR9 para Y.G. e K.M.). Este trabalho foi realizado em parte no Singh Center for Nanotechnology, que é apoiado pelo Programa Nacional de Infraestrutura Coordenada de Nanotecnologia da Fundação Nacional de Ciência (NNCI-1542153).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
00-90 screw McMaster-Carr 90910A630 Skull screw around which ground wire is wrapped
128ch stimulation/recording controller Intan Technologies A component of the neural recording system.
175 mL polypropylene (PP) conical centrifuge tubes Falcon REF: 352076 Used for washing
18 position 0.5 mm pitch ZIF connector Molex 505110-1892 Used to interface the flexible Parylene microelectrode array with the PCB adapter board.
18 position dual row male nano-miniature (.025"/.64mm) connector Omnetics Connector Corporation A79008-001 Used to interface the PCB adapter board to the recording headstage.
3ML Disposable Plastic Set Transfer Graduated Pipettes Rienar Rienar-3ML-20PCS Used for transferring etchant or MXene solutions
50 mL polyproylene (PP) concial centrifuge tube Falcon REF: 352070 Used for washing and size selection
Al etchant Type A Transene 060-0026000-QT For removing Al etch mask layer after final Parylene-C etch.
Aluminum Powder, -325 Mesh, 99.5% (metals basis), particle size < 44 µm Alfa Aesar CAS: 7429-90-5 Used for MAX synthesis
AutoCAD software Autodesk Inc. Design software for drawing photomasks. Free alternatives include DraftSight and LayoutEditor.
Buffered Oxide Etchant 6:1 JT Baker 1178-03 For removing SiO2 layer to expose MXene electrode contacts at the end of the fabrication procedure.
Buprenorphine SR Wildlife Pharmaceuticals Analgesia for rat surgery
Centrifuge Hermle Benchmark Z 446 Used for washing and size selection
Dexdomitor Midwest Veterinary Supply 193.13250.3 Anesthesia for rat surgery
Drill burr Fine Science Tools 19007-07 Burrs for drill
Electric drill Foredom K.1070 Micromotor drill for craniotomies
Electron beam evaporator Kurt J. Lesker Company Used to evaporate Ti, Au, and SiO2 during fabrication. Most university clean rooms have this or a similar tool.
Ground wire A-M Systems 781500 Bare silver wire
Headspace Vial, glass Supelco REF: 27298 Used for storing MXene solutions
Hydrochloric acid (12.1N) Fisher Scientific CAS: 7647-01-0 Corrosive; etchant material
Hydrofluoric Acid, (48-51% solution in H2O) Acros CAS: 7664-39-3 Etchant material
Jupiter II RIE system March Plasma Systems Inc. Planar RIE etching system used to etch the Parylene-C using O2 plasma. Most university clean rooms have a comparable planar RIE etching system.
Kapton standard polyimide tape, 1/4" DuPont Used to add thickness to the Au bonding pad region of the flexible Parylene microelectrode array for insertion into the ZIF connector.
Ketamine Hospital of the Univ. of Penn. Anesthesia for rat surgery
KLA P-7 Stylus Profilometer KLA Corporation Used the measure 2D profiles to confirm complete etching through the sacrificial parylene-C layer in step 2.4.2. Most university clean rooms have this or a comparable stylus profilometer tool.
Lithium chloride, 99% for analysis, anhydrous Acros CAS: 7447-41-8 Hygroscopic; delamination material
MA6 mask aligner Karl Suss Microtec AG Used to align each photomask to the pattern on the wafer and expose the wafer to UV light. Most university clean rooms have this or a similar tool.
Micro-90 cleaning solution International Products Corporation M-9050-12 Used as the anti-adhesive layer to enable removal of the sacrificial Parylene-C layer to pattern the MXene
NR71-3000p photoresist Futurrex Inc. NR71-3000p Negative photoresist used to define Ti/Au traces and MXene patterns in the devices.
Ophthalmic ointment Midwest Veterinary Supply 193.63200.3 To prevent corneal drying during surgery
Parylene deposition system Specialty Coating Systems Used to evaporate thin conformal films of Parylene-C
Parylene-C dimer Specialty Coating Systems 980130-c-01lbe Flexible polymer used as bottom and top passivating layers for the flexible MXene devices
Photomasks (chrome on soda lime glass) University of Pennsylvania Our photomasks were produced in the University clean room using a Heidelberg DWL66+ laser writer system, however several vendors manufacture photomasks from provided design files.
Povidone-iodine solution Medline MDS093901 To help prevent infection around scalp incision
Printed Circuit Board (PCB) Advanced Circuits Used to interface between the MXene electrode array and the measurement electronics such as the potentiostat and the Intan recording system. Advanced Circuits and other vendors manufacture and assemble PCBs based on the provided design files.
RD6 Developer Futurrex Inc. RD6 Developer Used to develop NR71-3000p negative photoresist following UV exposure
Reference 600 potentiostat Gamry Instruments Used to measure the electrodes' impedance to assess quality of the devices
Remover PG MicroChem Corp. G050200 Used to remove NR71-3000p following metal deposition to perform lift-off patterning
RHS2000 Stim SPI interface cable Intan Technologies A component of the neural recording system.
RHS2116 amplifier board Intan Technologies A component of the neural recording system.
Si wafers Wafer World 2885 Substrate for fabrication
Spin Coater Cost Effective Equipment For coating wafers with resists and applying the Micro-90 and MXene layers. Most university clean rooms have spin coaters.
Stereotaxic frame Kopf Instruments Model 902 For positioning the rat for neurosurgery
Teflon-coated magnetic stir bar Corning REF: 1233W95 Used to stir during etching and intercalation
Titanium carbide, 99.5% (metals basis), particle size ~2 µm Alfa Aesar CAS: 12070-08-5 Used for MAX synthesis
Titanium powder, -325 mesh, 99% (metals basis), particle size < 44µm Alfa Aesar CAS: 7440-32-6 Used for MAX synthesis
Ultrasonic bath sonicator Reynolds Tech For removing metal and photoresist particles during lift-off processes to pattern metals.
UV vis spectrophotometer ThermoScientific Evolution 201 Used to determine concentration and observe absorption peak
Zetasizer, Particle Size Analysis Malvern Panalytical Nano ZS Used to determine particle lateral size distibution

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