Une méthode de co-culture pour étudier la croissance de la neurite en réponse aux signaux dentaires de paracrine de pulpe

Developmental Biology

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Summary

Nous décrivons l’isolement, la dispersion et le placage des cellules primaires de pulpe dentaire (DP) avec les neurones trigéminaux (TG) cultivés au-dessus des filtres transwell. Les réponses cellulaires des cellules DP peuvent être analysées avec l’immunofluorescence ou l’analyse d’ARN/protéine. L’immunofluorescence des marqueurs neuronaux avec la microscopie confocale permet l’analyse des réponses de excroissance neurite.

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Barkley, C., Serra, R., Peters, S. B. A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals. J. Vis. Exp. (156), e60809, doi:10.3791/60809 (2020).

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Abstract

L’innervation des dents permet aux dents de sentir la pression, la température et l’inflammation, qui sont toutes cruciales pour l’utilisation et l’entretien de l’organe dentaire. Sans innervation sensorielle, les activités orales quotidiennes causeraient des dommages irréparables. Malgré son importance, les rôles de l’innervation dans le développement et l’entretien des dents ont été largement négligés. Plusieurs études ont démontré que les cellules DP sécrètent des protéines de matrice extracellulaire et des signaux paracrines pour attirer et guider les axones TG dans et tout au long de la dent. Cependant, peu d’études ont fourni un aperçu détaillé dans le crosstalk entre le mesenchyme DeP et les afferents neuronaux. Pour combler cette lacune dans les connaissances, les chercheurs ont commencé à utiliser des co-cultures et une variété de techniques pour étudier ces interactions. Ici, nous démontrons les étapes multiples impliquées dans la co-culture des cellules primaires de DP avec des neurones de TG dispersés sur un filtre de transwell sus-lying avec des pores de grand diamètre pour permettre la croissance axonale par les pores. Des cellules primaires de DP avec le gène d’intérêt flanqué des emplacements de loxP ont été employées pour faciliter la suppression de gène utilisant un système de recombinase d’Adenovirus-Cre-GFP. L’utilisation des neurones TG de la souris Thy1-YFP a permis une imagerie afferente précise, avec une expression bien au-dessus des niveaux de fond par microscopie confocale. Les réponses dP peuvent être étudiées par la collecte et l’analyse de protéine ou d’ARN, ou alternativement, par la coloration immunofluorescente des cellules de DP plaquées sur des couvertures en verre amovibles. Les médias peuvent être analysés à l’aide de techniques telles que les analyses protéomiques, bien que cela nécessitera l’épuisement de l’albumine en raison de la présence de sérum bovin fœtal dans les médias. Ce protocole fournit une méthode simple qui peut être manipulée pour étudier les réponses morphologiques, génétiques et cytosquelettiques des neurones TG et des cellules DP en réponse à l’environnement contrôlé d’un test de co-culture.

Introduction

L’innervation des dents permet aux dents de sentir la pression, la température et l’inflammation, qui sont toutes cruciales pour l’utilisation et l’entretien de l’organe dentaire. Le fait de ne pas sentir la douleur dentaire associée aux caries dentaires et aux traumatismes entraîne une progression de la maladie. Ainsi, l’innervation appropriée est une exigence pour la croissance normale de dent, la fonction et les soins.

Alors que la plupart des organes sont entièrement fonctionnels et innervés au moment de la naissance, le développement des dents s’étend à la vie adulte, avec l’innervation des dents et la minéralisation se produisant de concert pendant les étapes postnatales1,2. Fait intéressant, la pulpe dentaire (DP) mesenchyme sécrète d’abord des signaux répulsifs au cours de l’embryogenèse pour empêcher l’entrée d’axone dans l’organe dentaire en développement, qui se déplace plus tard à la sécrétion de facteurs attractants que la dent se rapproche éruption3,4. Pendant les stades postnatals, les axones afférents du nerf trigéminal (TG) pénètrent dans et tout au long de la dent autour du dépôt de dentin de temps commence (examiné dans Pagella, P. et autres5). Plusieurs études in vivo ont démontré que les interactions neuronales-mesenchymal guident l’innervationdes dents chez la souris (revue dans Luukko, K. et al.6 ), mais peu de détails des mécanismes moléculaires sont disponibles.

Les cocultures cellulaires fournissent des environnements contrôlés dans lesquels les chercheurs peuvent manipuler les interactions entre les populations neuronales et mésenchymales. Les expériences de co-culture permettent d’approfondir les voies de signalisation guidant l’intérivation et le développement des dents. Cependant, plusieurs des méthodes conventionnelles utilisées pour étudier les cellules en co-culture présentent des défis techniques. Par exemple, la coloration violette de cristal de la croissance de neurite peut non-spécifiquement tacher des cellules de Schwann incluses dans des dispersions de faisceau de TG, et il peut y avoir des crêtes dans l’intensité de couleur avec des réponses relativement petites7. Les chambres microfluidiques offrent une option attrayante, mais sont considérablement plus chères que les filtres transwell8,9 et ne permettent que l’étude des réponses neuronales aux sécrétions DP. Pour résoudre ces problèmes, nous avons développé un protocole qui permet : a) la coloration précise et l’imagerie de la croissance de neurite de TG en réponse aux sécrétions de DP, b) la modification génétique des cellules dP et/ou des neurones de TG pour étudier des voies de signalisation spécifiques, et c) l’étude des réponses de cellules de DP aux facteurs sécrétés par des neurones de TG. Ce protocole fournit la capacité d’étudier précisément plusieurs caractéristiques de l’innervation des dents dans l’environnement contrôlé d’un résultat de co-culture in vitro.

   

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Protocol

Toutes les expériences sur des souris ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’UAB.

1. Préparation des plaques

REMARQUE : Les fiches de couverture peuvent être utilisées pour imager les cellules DP à la fin de l’analyse. Assurez-vous que le couvercle de la plaque est allumé pendant toutes les étapes d’incubation et de rinçant à l’extérieur du capuchon de culture de tissu stérile pour empêcher la contamination pendant le traitement d’échantillon.

  1. Préparation de la glissade de couverture
    1. Couvertures circulaires automatiques.
    2. Filtrer l’eau ultrapure sous le capot.
    3. Transférer les couvercles dans une plaque de 24 puits et couvrir chacune d’elles avec 400 l de 0,1 mg/mL de poly-lysine.
    4. Laisser tremper les couvercles, immergés pendant 5 min, sur un rocker à 12 tr/min ou un shaker orbital à 40-50 tr/min. Assurez-vous que le couvercle est allumé pour prévenir la contamination.
    5. Rincer les couvercles avec de l’eau ultrapure filtrée pendant environ 5 min sur un rocker à 12 tr/min ou shaker à 50 tr/min. Répéter.
    6. Laisser sécher les couvercles pendant au moins 2 h sous le capot avec le couvercle de la plaque pour faciliter l’évaporation. Ces fiches de couverture doivent être utilisées dans un délai de 48 h.
    7. Les cellules DP de graine au-dessus des couvertures et du processus à la fin de l’analyse pour l’immunofluorescence (section 3.3).
  2. Filtres de revêtement
    1. Diluer la laminine à 10 g/mL. Filtrer le laminin dilué sous le capot.
    2. Pipette 450-500 'L de laminin de 10 g/mL dans chaque puits d’une plaque de 24 puits.
    3. Placer le filtre transwell, porosity de 3 m, dans un puits afin qu’il entre en contact avec la solution de laminin et le laisser dans un incubateur de 37 oC pendant 2 h ou pendant la nuit. Les pores filtrants devraient permettre à une partie de la solution de diffuser et d’enrober le haut et le bas du filtre. Ces filtres doivent être utilisés dans un délai de 48 h ou être réfrigérés à 4 oC jusqu’à 1 semaine.

2. Plaquage cellulaire avec manipulation génétique facultative

  1. Souris : L’altération génétique des cellules DP peut être effectuée (mais n’est pas nécessaire) pour étudier les interactions mesenchymales-neuronales. Voir les sections 2.3 et 2.4 pour les variations génétiques suggérées.
  2. Dissection DP, dispersion et placage (Figure 1)
    REMARQUE : Pour la dissection DP, utilisez des forceps ultra-fins et à bord droit. Les bords ultra-fins permettront à l’utilisateur de coincer le bord du forcep entre la structure minéralisée et le tissu DP.
    1. Récoltez des souris P5-P8. À ce stade, les dents devraient minéraliser, et la racine est ouverte.
    2. Anesthésiez les nouveau-nés par hypothermie en les plaçant dans un plat dans le réfrigérateur à 4 oC jusqu’à ce qu’ils ne bougent plus ou ne répondent plus au toucher. Euthanasier les nouveau-nés par décapitation et conformément aux procédures de l’IACUC à l’installation désignée.
    3. Préparer un aliquot de 3-5 ml de 0,25% trypsin-EDTA dans un tube conique de 50 ml pour recueillir le DP de chaque souris. Cela facilitera la digestion de la pulpe dentaire des souris postnatales. Utilisez plus de 3 ml si vous digérez les tissus de plus de 10 souris postnatales.
    4. Placez la tête sur un sous-coussin jetable de sorte que la bouche est vers le plafond et la base du cou est plat sur la surface de travail. Utilisez une lame de rasoir dans un mouvement de sciage pour séparer la mandibule du maxillaire.
    5. Retirez la langue avec des ciseaux ou des forceps pour faciliter l’accès aux molaires.
    6. Placer la tête ouverte dans un plat au-dessus d’un tampon de gaze stérile et placer le spécimen sous un microscope à disséquer(figure 1D).
    7. Enlever le tissu osseux alvéolaire entourant les premières molaires. Les dents sous-mandibulaires ne sont pas entièrement éclatées à ce stade. Insérez les forceps dans l’ouverture alvéolaire et taquinez le tissu loin de la dent vers le côté buccal (joue) ou lingual (langue) de la bouche. Les dents maxillaires nécessiteront l’élimination complète de la fente autour de la dent pour l’exposition et l’enlèvement.
    8. Transférer délicatement les premières molaires submandibulaires et maxillaires (M1) dans un plat de culture cellulaire séparé avec 1x salin tamponné par phosphate (PBS).
    9. Répétez 2.2.4-2.2.8 jusqu’à ce que tous les M1 soient collectés. Conserver le plat contenant les M1 sur la glace pendant la récolte.
    10. Retirez l’organe extérieur d’émail (EOE) entourant l’extérieur de chaque M1. Cela peut également être fait après l’étape 2.2.11.
    11. Avec un ensemble de forceps, faites pivoter le M1 pour que les cusps soient baissés et que la racine ouverte soit exposée. Il y aura une ouverture ovale sur le fond de la dent, et un tissu opaque DP encapsulé par une fine couche de dentine et d’émail.
    12. À l’aide de la pointe des forceps, desserrer délicatement le DP en exécutant un bras des forceps autour de la circonférence interne du tissu minéralisé. Retirez le tissu DP de la structure minéralisée et transférez-le dans un troisième plat contenant 1x PBS. Supprimer l’EOE s’il n’était pas déjà séparé (Figure 1E).
    13. Transférer tous les tissus DP à 0,25% trypsin-EDTA dans un tube conique de 50 ml. Vortex le mélange et placer dans un bain d’eau chaude de 37 oC pendant 10 min. Cela peut être fait avec les mêmes forceps ou avec de longs, flacons forceps. Le tissu sera difficile à disperser et nécessitera un vortex toutes les 3-4 min. Ne dépassez PAS 10 min trypsinisation puisque la trypsine peut endommager les membranes cellulaires.
    14. Sous une hotte stérile, ajouter des supports de co-culture réchauffés (tableau 1) à un rapport final d’au moins 1:1 média pour trypsine pour inactiver l’enzyme. Des ratios plus importants sont acceptables si une plus grande dispersion des tissus est souhaitée.
    15. Pipette les médias de haut en bas à plusieurs reprises avec une pipette de 10 ml pour disperser davantage le DP dans les médias. Veillez à éviter les grosses bulles. La dispersion complète est presque impossible en raison de la nature collante du tissu. Cependant, il n’est pas non plus nécessaire puisque les cellules migreront vers l’extérieur du tissu une fois plaqué.
    16. Transférer 1 ml du DP dispersé à chaque puits d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits (figure 1F).
    17. Placer la plaque dans un incubateur à 37 oC et permettre aux cellules de se fixer et de migrer hors du tissu non dispersé pendant 48 h avant de changer de support. Les cellules primaires doivent être plaquées à des concentrations relativement élevées afin d’atteindre 85-90% de confluence dans un délai de 1 semaine. Si cela n’est pas atteint après 1 semaine, jetez la plaque.
  3. Manipulation génétique facultative des cellules DP
    1. Pour modifier les voies de signalisation cellulaire, récoltez les cellules DP à partir de souris knock-out génétiques ou de souris dans lesquelles un gène d’intérêt est flanqué de sites loxP. Dans ce dernier cas, le gène peut être supprimé à l’aide de recombinase Adenovirus-Cre-GFP (Ad-Cre-GFP) pour enlever le gène flanqué, tel que décrit ci-dessous. Utilisez Adenovirus-eGFP (Ad-eGFP) comme virus de contrôle pour s’assurer que l’infection virale ne provoque pas de réponse cellulaire.
      REMARQUE : L’ad-eGFP est contrôlé par l’améliorateur promoteur CMV, qui est très fort. Ad-Cre-GFP est réglementé par un IRES, une région de régulation interne entre la Cre et le GFP, qui n’est pas très forte. Il en résulte une fluorescence plus brillante dans les cellules Ad-eGFP que les cellules Ad-Cre-GFP. Confirmer des niveaux d’infection équivalents en fonction du nombre total de cellules fluorées, et non sur les niveaux de fluorescence cellulaire.
    2. Préparer 500 l de supports contenant le virus et 10 g/mL de polybrene par puits. Polybrene aide à l’infection virale dans les cellules près de la confluence10. Ce protocole est basé sur une multiplicité d’infection (MOI) de 100 pour Ad-eGFP et 200 Ad-Cre-GFP pour l’infection génique efficace avec peu ou pas d’effet sur la viabilité cellulaire. Le nombre de cellules estimé est de 4 x 104 cellules/puits d’une plaque de 24 puits :
      Equation 1
    3. Mélanger les milieux avec un vortex ou un tuyauterie bref et ajouter 500 l à chaque puits.
    4. Après 24 h, ajoutez 500 l de supports de co-culture supplémentaires qui ne contiennent pas de polybrene ou de virus supplémentaires.
    5. Après un total de 48 h, aspirez les médias contenant des virus et remplacez-les par de nouveaux médias de co-culture. À ce stade, les neurones TG peuvent être ajoutés au sommet des filtres transwell.
  4. Dissection, dispersion et placage des neurones trigéminaux
    REMARQUE : Dans ce protocole, l’imagerie de la croissance de neurite dans la co-culture avec des cellules dP a été optimisée utilisant l’adolescent (6-week-old) B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J souris. Les systèmes nerveux central et périphériquedes des souris Thy1-YFP ont une étiquette jaune de protéine fluorescente (YFP) dont l’expression commence autour de P6-P10 dans les neurones et augmente exponentiellement dans tout le système nerveux pendant la vie postnatale et adulte11,12. YFP et GFP ont conservé des séquences qui permettent à ces nerfs d’être tachés d’anticorps anti-GFP, résultant en une tache pan-neuronale. En fin de compte, ces souris permettent une meilleure visualisation et quantification des neurones utilisés et cultivés dans la culture cellulaire.
    1. Euthanasier les souris adolescentes avec du dioxyde de carbone suivi d’une luxation cervicale.
    2. Décapiter les souris et enlever la peau du crâne. Assurez-vous d’inclure un nombre équivalent d’hommes et de femmes.
    3. Insérez la pointe d’une paire de ciseaux micro-disséquants dans la base du crâne. Couper le long de la suture sagittale du crâne (Figure 1A).
    4. Faire quatre petites coupes horizontales: deux le long des sutures coronales par les oreilles, et deux le long des sutures lambdoid à la base du crâne. Cela devrait créer deux lambeaux d’os.
    5. Utilisez les forceps pour éplucher les deux volets d’os. Cela devrait révéler le cerveau.
    6. Enlevez le cerveau. Transférer la tête dans un plat de culture tissulaire avec 1x PBS et mettre sous le microscope.
    7. Localiser les ganglions TG, qui est facilement visible chez les rongeurs13, logé dans la matière dura entre le cerveau et l’os du processus maxillaire (Figure 1B).
    8. Couper les trois branches qui se déplacent vers les yeux, les maxillées et les mandibules et transférer les ganglions à froid 1x PBS en utilisant des forceps fins à bord droit. Gardez le plat contenant les ganglions TG sur la glace pendant la récolte.
    9. Une fois que tous les faisceaux de TG sont récoltés, transférer les ganglions dans un tube conique de 50 ml contenant 5 mg/mL de collagène stérile filtré de type II à l’aide de forceps à flacons.
    10. Vortex la collagène avec le faisceau TG et placer le tube dans un bain d’eau de 37 oC pendant 25-30 min. Pendant ce temps, sortir le tube conique du bain d’eau, du vortex et retourner au bain toutes les 5-10 minutes.
    11. Centrifugeuse de la solution neuronale collagène-TG pendant 2 min à 643 x g.
    12. Sous une hotte de culture tissulaire, aspirez doucement la collagène avec une micropipette.
    13. Ajouter 5 ml de trypsine stérile de type II et vortex. Placer le tube conique dans un bain d’eau de 37 oC pendant 5 min.
    14. Centrifuger le mélange trypsine-TG pendant 5 min à 643 x g. Retirez la partie supérieure de la trypsine à l’eau avec une micropipette, de sorte que les neurones TG ne sont pas enlevés. Il y aura encore du liquide dans le tube.
    15. Ajoutez suffisamment de support pour désactiver le reste de la trypsine (à un rapport de 1:1 ou inférieur de trypsine aux médias).
    16. Comptez le nombre de cellules et diluez la solution à 200 000 cellules/mL (250 l de cellules contenant 50 000 cellules).
    17. Placer les filtres transwell enduits de la section 1.2 dans les puits avec DP.
    18. Diluer la solution contenant des cellules afin qu’il y ait 200 000 cellules/mL. Pipette 250 l sur le filtre transwell, et la culture des cellules à 37 oC pendant la nuit (Figure 1F).
    19. Le lendemain, remplacez les médias par 1 ml de média co-culture par 1 uridine M et 15 M 5'-fluor-2'deoxyuridine pour arrêter la sur-prolifération des cellules mésenchymales qui peuvent empêcher la croissance neurite. Facultatif : Ajoutez des facteurs de croissance ou des inhibiteurs dans ce média si vous tentez d’autres manipulations.
    20. Culture des cellules pour des points de temps souhaités supplémentaires. Ce protocole a été optimisé pour 5 jours de culture au total, les médias n’ayant été modifiés que le jour 2 pour ajouter des inhibiteurs mitotiques. Des périodes plus longues nécessiteront des modifications supplémentaires pour les médias.

3. Collecte et traitement d’échantillons

  1. Coloration trigéninale
    1. Pipette 1 mL d’aliquots de 1x PBS stérile dans une plaque de 24 puits sous une hotte de culture tissulaire pour chaque filtre transwell à traiter.
    2. Retirez le liquide au-dessus du filtre être enlevé avec une pipette de 200-1000 L, en prenant soin de laisser les couches cellulaires intactes. Les cellules attachées doivent rester attachées et les cellules non attachées se détacheront pendant cette pipetage douce. Un filtre à vide peut endommager la couche cellulaire et n’est pas recommandé pour l’aspiration.
    3. Transférer le filtre à la plaque 1x PBS, en étant sûr de supprimer la couche supérieure de médias comme mentionné dans l’étape précédente.
    4. Placez la plaque avec tous les filtres et couvercles transwell sur un rocker à 12 tr/min ou 40-50 tr/min sur un shaker orbital pendant 10 min.
    5. Aspirez le PBS, y compris la couche supérieure décrite ci-dessus, ajoutez 500 l de 1xPBS et placez-le sur le rocker ou le shaker orbital pour un rinçage supplémentaire de 5 à 10 min.
    6. Aspirez le 1x PBS une fois de plus et remplacez-le paraformaldehyde (PFA) à 4 %. Utilisez au moins 500 l pour que toute la surface du filtre soit submergée. Placer la plaque sur un rocker à 12 tr/min ou un shaker orbital à 40-50 tr/min à température ambiante pendant 1 h.
    7. Retirer le PFA et rincer les plaques deux fois pendant 5-10 min chacune sur un rocker avec 500 L de 1x PBS.
    8. Bloc avec 10% d’albumine de sérum bovin (BSA) - 5% de sérum de chèvre/âne, selon l’animal hôte d’anticorps secondaire, dans 0.05% Tween-1xPBS (PBST). Utilisez 450-500 l de solution pour que le filtre soit immergé dans le liquide.
      REMARQUE : À ce stade, ces plaques peuvent être stockées à 4 oC pendant plusieurs mois pour être traités ultérieurement. Utilisez du parafilm pour sceller la plaque pour s’assurer que l’évaporation ne se produit pas et vérifiez régulièrement l’évaporation afin que les surfaces du filtre restent submergées.
    9. Retirez le bloc et ajoutez 450-500 l d’anticorps primaires dans 1% BSA-PBST sans un rinçat supplémentaire. Incuber à 4 oC pendant la nuit, en se balançant doucement.
    10. Enlever la solution d’anticorps primaire et rincer à 500 l de 1xPBST sur un rocker, 3 fois, à température ambiante
    11. Retirez la PBST, ajoutez un anticorps secondaire et incubez sur un rocker pendant la nuit à 4 oC enveloppédans de papier d’aluminium pour protéger les fluorophores de la dégradation de la lumière. Rincer à nouveau, 3 fois, avec 1x PBST sur un rocker à température ambiante. Remplacer par 1x PBS.
      REMARQUE : À ce stade, la plaque peut être stockée pendant plusieurs mois à 4 oC si elle est enveloppée dans du papier d’aluminium pour prévenir la dégradation du fluorophore. Utilisez du parafilm pour sceller la plaque pour s’assurer que l’évaporation ne se produit pas et vérifiez régulièrement l’évaporation afin que les surfaces du filtre restent submergées. Il est préférable d’imager dans un délai d’un mois.
    12. Pour une imagerie optimale, utilisez les neurones de souris Thy1-YFP avec un anticorps anti-GFP pour tacher spécifiquement les afferents neuronaux bien au-dessus des niveaux de fond. Utilisez Anti-Neurofilament 200 pour tacher précisément les structures axonales si les souris Thy1-YFP ne sont pas disponibles.
    13. Image comme désiré. Les filtres n’ont pas besoin d’être plaqués et peuvent plutôt être placés sur une glissière ou une glissière pour l’imagerie avec un microscope inversé.
      REMARQUE : Les zones du filtre ne contiennent pas de structures afférentes. Prenez plusieurs images avec une profondeur de z-pile qui capture toutes les structures afférentes. Utilisez un logiciel de couture pour visualiser la croissance neurite sur de grandes surfaces, ou (de préférence) des régions de filtre entières.
  2. Collecte d’ARN, de protéines et de médias
    1. Pendant que les filtres transwell sont en cours de traitement, collectez les supports dans des tubes sans RNAse/DNAse et congelez-les pour les essais ultérieurs (ELISA, protéomique, etc.).
    2. Immédiatement après la collecte des médias, aliquot lysis tampon ou Radio Immuno Precipitation Assay (RIPA) tampon avec inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase dans les puits. Ce protocole a été optimisé pour 100 l/puits dans une plaque de 24 puits.
    3. Laissez les tampons lyser les cellules pendant 5 min, puis grattez chaque filtre avec une nouvelle pointe de pipette, et collectez les échantillons de cellules dans des tubes sans RNAse/Adn. Congeler la lyse pour les essais futurs (PCR semi-quantitatif et/ou quantitatif, western blot, etc.).
  3. Immunofluorescence facultative des cellules de pulpe dentaire :
    1. Soulevez délicatement les couvre-couvertures de la section 1.1 avec des forceps et transférez-les à différents puits avec 4 % de PFA pour 1 h avec bascule.
    2. Aspirez PFA et rincez les couvertures deux fois avec 1x PBS. Suivez ceci avec la perméabilisation, le blocage et l’immunofluorescence pour des marqueurs d’intérêt avec des techniques standard d’immunofluorescence.

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Representative Results

Ces résultats montrent que la croissance de neurite de TG a été augmentée en présence des cellules primaires de DP dans le puits sous-jacent comparé au contrôle de la monoculture de neurite de TG (figure 2A,C). Il y a une certaine variabilité d’assay-to-assay dans la croissance neurite. Ainsi, une monoculture de neurones TG devrait être incluse dans toutes les analyses comme un contrôle pour détecter les niveaux basaux de la croissance neurite. Des cellules primaires de la souris Tgfbr2f/f ont été utilisées dans ce protocole après que l’infection de ad-Cre-GFP et d’Ad-eGFP ait été confirmée en nombre équivalent de cellules (figure 2D). L’Ad-eGFP a servi de vecteur viral de contrôle. L’Ad-Cre-GFP a supprimé le gène flanqué, Tgfbr2, comme le démontre le PCR semi-quantitatif(figure 2E). Dans les cultures avec la suppression du récepteur bêta 2 (Tgfbr2) du facteur de transformation, la croissance de la neurite a diminué (Figure 2A-C).

Nous avons utilisé les neurones Thy1-YFP souris TG et les a tachés avec un anticorps anti-GFP qui a produit des images très spécifiques et lumineuses de structures axonales bien au-dessus de ce fond, comme le montre la figure 2. Ceci a permis la coloration spécifique des marqueurs neuronaux sans coloration non-spécifique des cellules non-neuronales en utilisant des méthodes précédemment rapportées telles que le cristal violet7. Les grands pores des filtres peuvent autofluoresce et/ou accumuler des anticorps secondaires et diminuer la précision de l’imagerie axonale (Figure 3). Tandis que les neurones Thy1-YFP avec immunofluorescence améliorent considérablement l’imagerie, plus de fond peut être enlevé avec le logiciel de seuil automatique et puis quantifié. Nous recommandons également l’exécution de l’immunofluorescence pour Neurofilament 200 basé sur nos résultats préliminaires (non montrés) ainsi que d’autres8,9 si les souris Thy1-YFP ne sont pas disponibles.

Figure 1
Figure 1 : Schéma de la dissection de la souris pour obtenir des cellules pour la co-culture. (A) Un diagramme de l’endroit où couper pour ouvrir le crâne de la souris et localiser les nerfs TG, montré en noir dans la dernière représentation. Les ciseaux indiquent où insérer les pointes de ciseaux pour couper le long des lignes pointillées. (B) Une image combinée de champ sombre et de GFP montrant les nerfs Thy1-YFPMD TG encerclés en blanc. (C) Les ganglions TG disséqués peuvent alors être dispersés et cultivés, comme le montre F. (D) La mandibule d’une souris P7, avec des forceps tenant la mandibule sur la gauche et des crêtes osseuses alvéolaires contenant des dents ininterrompues de chaque côté de la langue. (E) Tissu DP (encerclé) extrait de la structure minéralisée (en haut), et de l’épithélium externe de l’émail (en bas) qui a été enlevé pour se disperser et plaquer dans une plaque traitée par la culture des tissus, comme le montre F. Les images ne sont pas montrées à l’échelle. Les cellules DP ont été dispersées et cultivées à la confluence avant d’ajouter des neurones TG. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Résultats représentatifs de la co-culture. (A-C) Les neurones Thy1-YFP TG ont été cultivés dans des filtres transwell avec 3 pores de m au sommet des cellules primaires DeP Tgfbr2f/f. La coloration immunofluorescente a été exécutée pour la protéine de YFP utilisant un anticorps anti-GFP pour fournir la coloration fortement spécifique des structures neuronales au-dessus du filtre entier. Les projections maximales de 100 images de microscopie confocale de 100 m z à 10x ont été recueillies et cousues avec un logiciel de couture. Les neurones TG ont démontré une croissance significativement plus importante lorsqu’ils sont co-cultivés avec des cellules DP (A) que lorsqu’ils sont cultivés seuls (C). La excroissance de neurite n’a pas été induite quand les neurones ont été co-cultivés avec des cellules de DP infectées par Ad-Cre-GFP pour renverser Tgfbr2 (B). Barre d’échelle de 1 000 m. Des nombres équivalents de cellules infectées par Ad-eGFP et Ad-Cre-GFP sont indiqués dans (D). Barre d’échelle de 125 m. PcR semi-quantitatif a confirmé le Tgfbr2 KD (E). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Difficultés techniques présentées dans l’imagerie afférente. (A) Imagerie Brightfield des filtres transwell après coloration violette cristalline des populations cellulaires. Les grands pores sont répandus. La grande flèche indique une cellule qui présente une morphologie mésenchymale, tandis que la petite flèche pointe vers une cellule de morphologie neuronale. Le violet cristallin a souillé les deux cellules sans biais. (B) La coloration immunofluorescente de la tubuline no 3 avec un anticorps secondaire Alexa-488 a montré la coloration non spécifique de cellules multiples, rendant l’imagerie des structures afférentes difficile. Les images sont représentatives et ont été répétées sur plusieurs essais afin d’optimiser l’imagerie montrée à la figure 2. Barre d’échelle de 50 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Composant Volume Concentration
MEM - MoiM 440 ml
Sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur 50 ml 10%
100x L-glutamine 5 mL 1x 1x
Pénicilline-streptomycine 100 x 5 mL 1x 1x
Changer les médias le jour 2 avec des inhibiteurs mitotiques à ces concentrations finales
Uridine 1 M
5'-Fluor-2'deoxyuridine 15 M

Tableau 1 : Médias de co-culture.

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Discussion

Les activités quotidiennes de la cavité buccale exigent que les dents sentent des stimuli externes et une inflammation interne afin de permettre une utilisation et un entretien appropriés. Cependant, seulement peu d’information est disponible concernant les signaux qui conduisent les processus développementaux de l’innervation de dent. Ce protocole fournit une méthode pour isoler et co-culture des cellules primaires DP et des neurones TG afin d’étudier la communication croisée entre les deux populations. Plusieurs variables ont été optimisées et laissent de nouvelles voies de recherche, comme décrit ci-dessous.

Les contrôles sont importants à chaque étape de cet avertissement. Un filtre transwell avec des neurones TG sans cellules DP sous-jacentes devrait être inclus dans chaque analyse pour fournir une base de référence pour la croissance TG. Lors de la suppression d’un gène d’intérêt flanqué avec une recombinase Ad-Cre-GFP, un virus témoin exprimant uniquement le marqueur fluorescent doit être utilisé pour confirmer que des nombres équivalents de cellules ont été infectés. Alors que nous avons démontré des niveaux élevés d’infection avec la mort cellulaire minimale à 100 et 200 MOI pour Ad-eGFP et Ad-Cre-GFP, respectivement, chaque laboratoire devrait optimiser cette étape. Parce que les protéines fluorescentes peuvent être fixées à différents promoteurs et donc causer une expression différentielle nombre équivalent de personnes infectées, les cellules fluorantes doivent être comptées. L’intensité globale de la fluorescence n’est pas pertinente parce qu’elle ne reflète pas exactement l’état de l’infection. Il est important de démontrer la suppression du gène, comme le montre le PCR semi-quantitatif dans ce protocole (figure 2). Bien que ce protocole n’aborde pas ce sujet, des recherches antérieures ont démontré que des essais de contrôle avec d’autres lignées de cellules pouvaient être inclus pour démontrer que la croissance neurite est spécifiquement induite par la co-culture avec les cellules DP8.

Étant donné que ce protocole utilise des cellules primaires, il y a plusieurs étapes où la contamination peut être introduite. Pour éviter cela, tous les réactifs doivent être filtrés stériles. En outre, il est recommandé que les expériences pour chaque variable soient menées en double ou en triple afin de permettre l’enlèvement d’un filtre et la stérilisation d’un puits contaminé sans échec complet de l’essai.

Les lames doivent être recouvertes de poly-D-lysine et/ou d’une protéine matricielle extracellulaire pour assurer l’adhérence cellulaire DP. Tandis que les cellules se fixent au commencement, l’infection virale cause la mort de levage de cellules sur des couvertures non enduites et empêche la manipulation génétique de l’analyse de co-culture.

Il est bien établi que les cellules non neuronales, telles que les cellules Schwann des ganglions TG, peuvent affecter la survie des cellules neuronales dans la culture14,15,16. Dans ce protocole, la survie neuronale a été optimisée en ajoutant 1 uridine M et 15 M 5-fluoro-2'deoxyuridine. Sans l’ajout de ces agents antimitotiques pour inhiber la prolifération des cellules de Schwann, la croissance neurite ne se produira pas. On ne sait pas si la présence de ces cellules sénescentes de Schwann dans la co-culture modifie la réponse neuronale. Isoler les neurones murins nécessite plusieurs étapes supplémentaires, et des protocoles sont disponibles pour les chercheurs qui veulent supprimer cette variable17. Dans les deux cas, la dispersion des neurones imite quelque peu une axotomie et pourrait être considérée comme représentant des blessures/réparations18 de plus que le développement. D’autres études seraient nécessaires pour déterminer les différences entre la croissance axonale in vivo des fascicles contre la croissance axonale des neurones individuels in vitro, et ceux-ci ne sont pas abordés dans ce protocole.

Ce protocole prend 1-3 semaines du début à la fin. Bien qu’il soit possible d’utiliser des cellules DP qui nécessitent plus d’une semaine pour atteindre 85-90% de confluence, il est recommandé que les cellules soient ensemencées à une densité assez élevée pour atteindre la confluence en quelques jours puisque ces cellules se divisent très lentement au-delà de ce point. Cela nécessite généralement environ 5-7 P5-8 souris par rangée d’une plaque de 24 puits. Ce protocole a été optimisé pour un total de 5 jours de co-culture, à quel point les médias avec le rouge phénol a commencé à changer de couleur. Les médias doivent être modifiés si des tests plus longs sont souhaités.

Plusieurs essais de co-culture ont été effectués pour démontrer la croissance neurite en réponse à des facteurs sécrétés par le DP sécrétés facteurs avec des plaques standard de culture de tissu ECM-enduit3,19,20,21 ou chambres microfluidiques8,22,23. Ce protocole offre plusieurs avantages par rapport à ces méthodes. Par exemple, la co-culture des ganglions TG et des tissus DP exige une relation spatiale spécifique pour que les neurites détectent et répondent aux signaux paracrines à courte portée. Avec la culture d’organe, seules les neurites dans les ganglions les plus proches du tissu DP sont capables de répondre3, tandis que les neurones TG dispersés utilisés dans ce protocole sont cultivés à une distance égale des cellules DP en dessous. Deuxièmement, les cultures d’organes peuvent introduire la nécrose tissulaire en raison du manque d’oxygène et de nutriments disponibles dans les grands échantillons24. La co-culture des cellules dispersées élimine cette possibilité. Certaines co-cultures, y compris les neurones, nécessitent des médias neuronaux3,22 qui peuvent jouer un rôle dominant dans la promotion de la croissance neurite. Ce protocole n’ajoute pas de facteurs de croissance spécifiques aux neurones, permettant ainsi une évaluation de la relation directe entre les signaux paracrines des cellules DP sous-jacentes et les réponses de croissance neurite. Il est à noter que les médias de co-culture manquent également de composants pour promouvoir la minéralisation, comme le bêta-glycérophosphate. Cela permet aux enquêteurs de déterminer comment les neurites pourraient sécréter des signaux pour encourager la minéralisation. Cependant, il limite également l’étude en incluant seulement les cellules DP moins différenciées sans les odontoblastes minéralisants qui seraient typiquement présents in vivo.

Les réponses coloriométriques de la recherche précédente7,8 ne délimitent pas les contributions des cellules de Schwann ni ne démontrent la morphologie neuronale puisque le violet cristal ne tache pas spécifiquement toutes les cellules. La coloration immunofluorescente des filtres peut entraîner des niveaux de fond élevés qui rendent l’imagerie afférente difficile (figure 2). Le protocole actuel permet la coloration précise des afferents neuronaux en utilisant des neurones Thy1-YFP TG et un anticorps anti-GFP et fournit un signal assez lumineux pour générer de grandes images de croissance tout au long d’une figure entière (Figure 3). Il est possible d’utiliser d’autres marqueurs neuronaux, tels que l’anti-Neurofilament 200, si les souris Thy1-YFP ne sont pas disponibles.

Enfin, l’utilisation de cellules Primaires DP de souris avec des gènes d’intérêt flanqués de sites loxP permet une suppression simple et efficace de ces gènes avec un système Ad-Cre-GFP. Dans de futures études, le système de recombinase Ad-Cre pourrait être utilisé sur les neurones TG s’ils ont un gène d’intérêt flanqué de sites loxP. Cela faciliterait les études sur la façon dont les signaux paracrines de la population neuronale influencent les cellules DP, en particulier si les cellules DP sont enseves au sommet des couvertures (section 1.1). Les études futures peuvent utiliser d’autres manipulations, telles que l’ajout d’inhibiteurs pharmacologiques et/ou de facteurs de croissance. Il est également possible de modifier ce protocole pour y inclure des études de migration en utilisant des filtres transwell de 8 m porosity.

En conclusion, cet essais de co-culture transwell utilisant des neurones et des cellules DP permet l’étude de paramètres cellulaires multiples. Cela permet d’élargir le corps des connaissances sur les interactions mesenchymal-neuronales qui favorisent et soutiennent l’innervation des dents.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par a) la subvention des National Institutes of Health/NIAMS (numéros de subvention R01 AR062507 et R01 AR053860 à RS), b) la subvention de l’Université de l’Alabama à Birmingham Dental Academic Research Training (DART) (numéro T90DE022736 (PI MacDougall)) au SBP du National Institute of Dental and Craniofacial Research/National Institutes of Health, c) une subvention pilote et de faisabilité du UAB Global Center for Craniofacial, Oral and Dental Disorders (GC-CODED) à SBP et d) le National Institute of Dental and Craniofacial Subvention K99 DE024406 de Recherche/National Institutes of Health à SBP.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-Fluoro-2'-deoxyuridine Sigma-Aldrich F0503 Used as a mitotic Inhibitor at 15 μM concentration in co-culture media, Day 2
24 Well Cell Culture Plate Corning 3524 Co-culture plate
Alexa-546 anti-chicken Invitrogen A-11040 Secondary to stain neurite outgrowth labeled by anti-GFP antibody, 1:500 dilution
Anti-GFP Antibody Aves Lab, Inc GFP-1010 Primary antibody to label Thy1-YFP neurons, 1:200 dilution
Anti-Neurofilament 200 antibody Sigma-Aldrich NO142 Monoclonal primary antibody to label neurons, 1:1000 dilution, alternative if YFP mice are not available
B6;129- Tgfbr2tm1Karl/J The Jackson Laboratory 12603 Tgfbr2f/f mouse model used for dental pulp cells in optimized protocol
B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J The Jackson Laboratory 3709 Thy1-YFP mouse model genotype used for trigeminal neurons
Collagenase Type II Millipore 234155-100MG Used to disperse trigeminal neurons
Fetal Bovine Serum Gibco 10437 Additive to co-culture media
Fine forceps Fine Science Tools 11413-11 Fine forceps for TG dissection
Laminin Sigma-Aldrich L2020 Coats the transwell inserts at final concentration of 10 μg/ml, stock solution is assumed at 1.5 mg/ml
Lysis Buffer (Buffer RLT) Qiagen 79216 Extracts RNA from dental pulp cells post co-culture
L-Glutamine Gibco 25030081 Additive to co-culture media
Micro-dissecting scissors Sigma-Aldrich S3146-1EA Dissection scissors to open skull
Microscope Cover Glass Fisherbrand 12-545-81 Circlular coverslip for optional cell culturing and immunofluorescence processing
Minimal Essential Medium a Gibco 12571063 Co-culture media base
Penicillin-Streptomycin Gibco 15070063 Antibiotic additive to co-culture media
Phosphatase Inhibitor Sigma-Aldrich 04 906 837 001 Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture
Polybrene Millipore TR-1003-G Used to aid in dental pulp cell transfection
Poly-D-Lysine Sigma-Aldrich P7280 Coverslip coating to aid dental pulp cellular adhesion
Protease Inhibitors Millipore 05 892 791 001 Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture
RNAse/DNAse free eppendorf tubes Denville C-2172 Presterilized 1.7 ml tubes for RNA, DNA or protein collection at the end of assay
ThinCert Cell Culture Insert Greiner Bio-One 662631 Transwell inserts for trigeminal neurons in co-culture assays
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200056 Used fto disperse dental pulp cells
Trypsin Type II Sigma-Aldrich T-7409 Used to disperse trigeminal neurons
Ultra Fine Forceps Fine Science Tools 11370-40 Ultra fine forceps for dissection
Uridine Sigma-Aldrich U3750 Used as a mitotic Inhibitor at 1 μM concentration in co-culture media, Day 2
Vacuum Filtration System Millipore SCNY00060 Steriflip disposable filter, 50 μm nylon net filter
Vial forceps Fine Science Tools 110006-15 Long forceps for tissue transfer to conicals

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References

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