क्लैमाइडिया ट्रेकोमेटिस में फ्लोक्सेड कैसेट एलीलिक एक्सचेंज मुटाजेनेसिस द्वारा मार्करलेस जीन विलोपन

Immunology and Infection

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Summary

यहां वर्णित फ्लोर्सेड कैसेट एलीलिक एक्सचेंज म्यूटाजेनेसिस, फ्लेम का उपयोग करके क्लैमाइडिया ट्रेकोमेटिस में लक्षित, मार्करलेस जीन विलोपन के लिए एक विधि है।

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Keb, G., Fields, K. A. Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis. J. Vis. Exp. (155), e60848, doi:10.3791/60848 (2020).

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Abstract

क्लैमाइडिया ट्रेकोमेटिस एक अनिवार्य इंट्रासेलुलर रोगजनक है जिसे आनुवंशिक रूप से हेरफेर करना ऐतिहासिक रूप से मुश्किल रहा है। सी ट्रेकोमेटिस बनाने और एक विशेषाधिकार प्राप्त इंट्रासेलुलर आला बनाए रखने के लिए उपयोग करने वाले तंत्र को स्पष्ट करने में निश्चित प्रगति आनुवंशिक उपकरणों की कमी के कारण सीमित रही है। सौभाग्य से, हाल ही में आनुवंशिक हेरफेर तकनीकों में कई नए अग्रिम हुए हैं। इनमें से फ्लोरेसेंस-रिपोर्ट एलीलिक एक्सचेंज म्यूटाजेनेसिस (FRAEM) का विकास है। यह विधि लक्षित जीन हटाने की अनुमति देती है जिसमें एक चयन कैसेट एन्कोडिंग एंटीबायोटिक प्रतिरोध और ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) के सम्मिलन के साथ मिलकर बनाया जाता है। डाउनस्ट्रीम जीन पर ध्रुवीय प्रभावों की क्षमता के कारण पॉलीसिट्रोनिक ऑपरॉन के भीतर जीन को लक्षित करते समय इस रणनीति पर निर्भरता जटिल हो सकती है। फ्लोक्सेड कैसेट एलीजेनेसिस (FLAEM), प्रोटोकॉल जिसके लिए यहां वर्णित है, कैसेट-प्रेरित ध्रुवीय प्रभावों को कम करने के लिए विकसित किया गया था। FLAEM एलीलिक एक्सचेंज द्वारा लक्षित हटाने के बाद चयन कैसेट को हटाने के लिए क्रे-लोक्सपी जीनोम संपादन का उपयोग करता है। परिणामस्वरूप उपभेदों में एक या एक से अधिक कोडिंग दृश्यों के मार्करलेस जीन विलोपन होते हैं। यह तकनीक जीन फ़ंक्शन के प्रत्यक्ष मूल्यांकन की सुविधा प्रदान करती है और सी ट्रेकोमेटिस में आनुवंशिक हेरफेर के लिए उपकरणों के प्रदर्शनों की सूची का विस्तार करती है।

Introduction

क्लैमाइडिया ट्रेकोमेटिस बैक्टीरियल यौन संचारित रोग का प्रमुख कारण है और मानव स्वास्थ्य के लिए एक महत्वपूर्ण बोझ का प्रतिनिधित्व करता है। सी ट्रेकोमेटिस1से हर साल १००,०००,००० से अधिक लोग संक्रमित होते हैं । महिलाओं में लगभग ७०% संक्रमण हानिकारक प्रजनन स्वास्थ्य प्रभावों के बावजूद स्पर्शोन्मुख होते हैं, जैसे पेल्विक भड़काऊ रोग, एक्टोपिक गर्भावस्था, और/या प्रजनन । रोग सीली सीधे सी ट्रेकोमेटिस संक्रमण2द्वारा शुरू की गई इम्यूनोपैथोलॉजी से संबंधित है। एक प्रभावोत्पादक टीका अभी विकसित किया जाना है; इसलिए, बैक्टीरियल उग्रता कारकों और अन्य जीवाणु जीन उत्पादों के कार्य को समझना एक महत्वपूर्ण और अत्यावश्यक अनुसंधान प्रश्न है।

इंट्रासेलर बैक्टीरिया के रूप में, मेजबान सेल आक्रमण, इंट्रासेलर प्रतिकृति, संतान की रिहाई, और मेजबान इम्यूनोलॉजिकल प्रतिक्रियाओं की चोरी महत्वपूर्ण प्रक्रियाएं हैं। सी ट्रेकोमेटिस इंट्रासेलर विकास के लिए एक परजीवी झिल्ली बाध्य vacuole बनाता है, एक समावेश कहा जाता है। समावेशन की स्थापना और कई अन्य महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं को एक प्रकार III स्राव प्रणाली (T3SS)3के माध्यम से प्रभावक प्रोटीन के स्राव द्वारा प्राप्त किया जाता है। सी ट्रेकोमेटिसकी आनुवंशिक असभ्यता के कारण इन स्रावित प्रभावकों के कार्यों को स्पष्ट करना कई वर्षों तक सीमित था। ई कोलाई केविपरीत, कई शास्त्रीय क्लोनिंग तकनीक क्लैमाइडियापर लागू नहीं होती हैं। कुछ प्रमुख सीमाओं में परिवर्तन दक्षता, सैब जैसे काउंटरइलेक्शन रिपोर्टर्स की कमी और प्लाज्मिड रखरखाव शामिल हैं। जबकि ई. कोलाई प्लाज्मिड को आम तौर पर प्रतिकृति और उचित चयनात्मक दबाव की उत्पत्ति के साथ अनिश्चित काल तक बनाए रखा जा सकता है, सी ट्रेकोमेटिस प्लाज्मिड ्स को रखरखाव के लिए अतिरिक्त आठ ओपन रीडिंग फ्रेम(पीजीपी1-8) की आवश्यकता होती है जो एल2 सेरोवर4के भीतर देशी पीएल2 प्लाज्मिड पर पाए जाते हैं।

हाल के वर्षों में कई आनुवंशिक उपकरण उत्पन्न हुए हैं जो क्लैमाइडिया के अद्वितीय जीव विज्ञान को समायोजित करते हैं, फिर भी अभी भी5,6,7सीमाएं हैं। एथिल मीथेनसल्फोनेट (ईएमएस) उपचार द्वारा रासायनिक म्यूटाजेनेसिस गलत उत्परिवर्तन शुरू कर सकता है, या (कम बार) न्यूक्लियोटाइड संक्रमण में परिणाम कर सकता है जो एक बकवास उत्परिवर्तन8को उपज देने के लिए समय से पहले स्टॉप कोडन शुरू कर सकता है। ट्रांसपोसन प्रविष्टि जीन व्यवधान के लिए कुशल है, लेकिन क्लैमाइडिया अनुसंधान में वर्तमान प्रौद्योगिकी श्रमसाध्य और समय लेने वाली9है। ईएमएस उपचार और ट्रांसपोसन म्यूटाजेनेसिस तकनीक दोनों यादृच्छिक उत्परिवर्तन उत्पन्न करते हैं और उत्परिवर्ती उपभेदों को अलग करने के लिए कठोर स्क्रीनिंग विधियों की आवश्यकता होती है। समूह द्वितीय इंट्रॉन (जैसे, टार्जेट्रॉन) के सम्मिलन द्वारा जीन को बाधित करने की एक विधि निर्देशित म्यूटाजेनेसिस की अनुमति देती है; हालांकि, इस विधि दक्षता से सीमित है, और प्रविष्टि साइट हमेशा ठीक से10भविष्यवाणी नहीं है .

फ्लोरेसेंस-रिपोर्ट एलीलिक एक्सचेंज म्यूटाजेनेसिस (FRAEM) एक रणनीति है जो एंटीबायोटिक प्रतिरोध और फ्लोरेसेंस रिपोर्टर11प्रदान करने वाले चयन कैसेट के सम्मिलन के साथ-साथ लक्षित जीन विलोपन के लिए उपयोग की जाती है। फिर भी, FRAEM डाउनस्ट्रीम जीन पर कैसेट-प्रेरित ध्रुवीय प्रभावों की क्षमता से जटिल है, खासकर पॉलीसिस्ट्रोनिक ऑपरॉन के भीतर जीन को लक्षित करते समय। फ्लक्सेड कैसेट एलीजेनेसिस (फ्लेम) एक उपन्यास आनुवंशिक दृष्टिकोण है जो पहले फ्राईएम चयन कैसेट12के साथ मनाए गए कैसेट-प्रेरित ध्रुवीय प्रभावों को कम करने के लिए विकसित किया गया है। FLAEM चयन कैसेट को हटाने और डाउनस्ट्रीम जीन की अभिव्यक्ति को बहाल करने के लिए क्रे-लोक्सपी जीनोम संपादन का उपयोग करता है। एंटीबायोटिक प्रतिरोध और हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) युक्त चयन कैसेट को पार्श्व लोक्सपी साइटों के साथ फिर से इंजीनियर किया जाता है। ये लोक्सप साइटें क्रे रिकॉम्बिनेज की उपस्थिति में फिर से गठबंधन कर सकती हैं और इसके परिणामस्वरूप जीनोम13से कैसेट का उत्सर्जन होसकता है। 12,14को हटाने के लिए TmeA को लक्षितकरते समय कैसेट प्रेरित ध्रुवीय प्रभावों को कम करने के लिए यह रणनीति दिखाई गई है ।

एफआरईएम और फ्लेम दोनों विधियां एक ही आत्महत्या वेक्टर, pSUmC 4.0 का उपयोग करती हैं, जिसे पीजीपी6 की प्रेरक अभिव्यक्ति के माध्यम से सशर्त रूप से बनाए रखा जा सकता है। पीजीपी6 की अभिव्यक्ति को पहले प्लाज्मिड रिटेंशन के लिए आवश्यक दिखाया गया है और इसलिए प्लाज्मिड रखरखाव11,15को नियंत्रित करने के लिए लीवरेज किया जाता है । जब सी ट्रेकोमेटिस को मीडिया में उगाया जाता है, तो पीजीपी6 अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए हाइड्रोस टेट्रासाइक्लिन (एटीसी) के साथ पूरक हो जाता है, वेक्टर बनाए रखा जाता है। एटीसी के अभाव में वेक्टर खो जाता है। चयन कैसेट के लिए जीन के एलीलिक एक्सचेंज के माध्यम से लक्षित जीन विलोपन प्राप्त किया जाता है। लक्षित जीन के सीधे ऊपर और डाउनस्ट्रीम 3 केबी क्षेत्र पुनर्संयोजन के लिए होमोलॉजी हथियार के रूप में काम करते हैं । इन हथियारों को pSUmC 4.0 वेक्टर में झुकाया जाता है जो चयन कैसेट को फ्लैंक करते हैं। सफल सी ट्रेकोमेटिस परिवर्तन और पुनर्संयोजन घटनाओं फ्लोरेसेंस रिपोर्टिंग के माध्यम से मनाया जाता है। चयन कैसेट के भीतर वेक्टर रीढ़ और जीएफपी पर एमचेरी की अभिव्यक्ति लाल और हरे फ्लोरोसेंट समावेशन उपज। एक बार एटीसी संस्कृति मीडिया से हटा दिया जाता है, हरे रंग के समावेशन आत्महत्या वेक्टर के नुकसान और जीवाणु जीनोम में चयन कैसेट के एकीकरण के साथ सफल पुनर्संयोजन घटनाओं का संकेत मिलता है ।

FLAEM एक क्रे recombinase-व्यक्त वेक्टर, pSU-Cre, नव निर्मित उत्परिवर्ती तनाव में बाद के परिवर्तन के माध्यम से FRAEM के एक विस्तार का प्रतिनिधित्व करता है । क्रे पुनर्संयोजन loxP साइटों और चयन कैसेट के एक्सिजन के बीच पुनर्संयोजन की सुविधा प्रदान करता है। फ्लोरेसेंस रिपोर्टिंग के माध्यम से पुनर्संयोजन घटनाओं को इंगित किया जाता है। PSU-Cre वेक्टर एमचेरीएनकोड; इस प्रकार, सफल परिवर्तन जीएफपी-व्यक्तसमावेशन के लिए लाल फ्लोरेसेंस के अलावा संकेत दिया जाता है। कैसेट के लिए चयनात्मक दबाव के अभाव में खेती के परिणामस्वरूप क्रे-मध्यस्थता वाले पुनर्संयोजन में लोक्सपी साइटों पर, और कैसेट की हानि लाल-केवल समावेशन द्वारा इंगित की जाती है। PSUmC-4.0 के साथ के रूप में, पीजीपी 6 की प्रेरक अभिव्यक्ति सशर्त पीएसयू-क्रे बनाए रखने के लिए प्रयोग किया जाता है। एक बार एटीसी और एंटीबायोटिक चयन को हटा दिया जाता है, प्लाज्मिड ठीक हो जाता है, और जिसके परिणामस्वरूप मार्करलेस विलोपन तनाव नॉनफ्लोरोसेंट होता है। यह विधि कैसेट-प्रेरित ध्रुवीय प्रभावों के मुद्दे को संबोधित करती है।

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Protocol

1. डिजाइन और PSUmC-4.0 के साथ होमोलॉजी शस्त्र ब्याज के जीन के लिए विशिष्ट की विधानसभा

  1. ~3 केबी क्षेत्रों की पहचान सीधे ऊपर और जीन के डाउनस्ट्रीम को हटाने के लिए लक्षित 5 ' और 3 ' होमोलॉजी हथियारों के रूप में काम करने के लिए अनुसार पुनर्संयोजन(चित्रा 1)के लिए ।
  2. डिजाइन पीसीआर प्राइमर 1 करने के लिए) क्लैमाइडायल जीनोमिक डीएनए और 2 से 3 केबी 5 ' होमोलॉजी आर्म को बढ़ाना) में 15-30 बीपी ओवरहांग होते हैं, जब सभी प्रतिबंध एंजाइम साइट पर पचा जाते हैं। सुनिश्चित करें कि pSUmC-4.0 के साथ ओवरलैपिंग प्राइमर क्षेत्रों में 55 डिग्री सेल्सियस का तापमान पिघला हुआ है और पूरे प्राइमर के लिए हेयरपिन पिघलने का तापमान & 35 डिग्री सेल्सियस है।
  3. डिजाइन पीसीआर प्राइमर 1 करने के लिए) क्लैमाइडायल जीनोमिक डीएनए और 2 से 3 केबी 3 ' होमोलॉजी आर्म को बढ़ाना) में 15-30 बीपी ओवरहांग होते हैं, जब एसबीबी प्रतिबंध एंजाइम साइट पर पचा जाता है। सुनिश्चित करें कि pSUmC-4.0 के साथ ओवरलैपिंग प्राइमर क्षेत्रों में 55 डिग्री सेल्सियस का तापमान पिघला हुआ है और पूरे प्राइमर के लिए हेयरपिन पिघलने का तापमान & 35 डिग्री सेल्सियस है।
  4. डिजाइन पीसीआर स्क्रीनिंग प्राइमर जो डीएनए असेंबली रिएक्शन16के बाद प्रत्येक होमोलॉजी आर्म के सम्मिलन को pSUmC-4.0 वेक्टर में बढ़ादेगा। इन प्राइमर को प्रतिबंध साइटों के बाहर ~500 बीपी के लिए डिजाइन करें ताकि पीसीआर उत्पाद के आसान दृश्य की अनुमति दी जा सके, भले ही प्रविष्टि असफल हो(चित्रा 1)।
  5. 3 केबी 5 ' और 3 ' होमोलॉजी हथियारों को पीसीआर द्वारा ताजा निकाले गए क्लैमाइडायल जीनोमिक डीएनए से बढ़ाना बाद में डीएनए असेंबली के लिए पर्याप्त टुकड़ा निकलने के लिए दो प्रतिक्रियाओं में । विशिष्ट प्रतिक्रिया सेट-अप और साइकिल चालन की स्थिति के लिए डीएनए पॉलीमरेज निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें।
  6. सत्यापित करें कि पीसीआर दोनों उत्पाद सही आकार के हैं और प्रतिक्रियाओं में कोई दूषित बैंड नहीं है। 1% डीएनए अगारोज जेल पर प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया के 5 माइक्रोन चलाएं।
  7. पीसीआर के टुकड़ों को फिनॉल/क्लोरोफॉर्म एक्सट्रैक्शन और इथेनॉल वर्षा द्वारा शुद्ध और केंद्रित करें।
    1. एक 1.5 mL ट्यूब में एक साथ सभी 3 पीसीआर प्रतिक्रियाओं पूल और nuclease मुक्त एच2O. 5 ' पीसीआर प्रतिक्रियाओं के लिए इस प्रक्रिया को दोहराने के साथ 200 μL की एक अंतिम मात्रा में लाने के लिए।
    2. 30-60 एस के लिए प्रत्येक ट्यूब और भंवर में फिनॉल के 200 माइक्रोन जोड़ें। 20 मीटर कमरे के तापमान (आरटी) पर 20 मीटर के लिए 21,000 x ग्राम पर एक माइक्रोसेंट्रिकफ्यूज में प्रत्येक ट्यूब स्पिन करें।
    3. प्रत्येक ट्यूब के जलीय चरण शीर्ष परत को एक नई 1.5 मिलीएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, प्रत्येक ट्यूब में 3 एम सोडियम एसीटेट की मात्रा एक-दसवें जोड़ें, फिर मिश्रण करने के लिए झटका दें।
    4. प्रत्येक ट्यूब में 100% इथेनॉल के 3 वॉल्यूम जोड़ें और मिश्रण करने के लिए झटका दें। 20 मिन के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर दोनों ट्यूबों को इनक्यूबेट करें।
    5. आरटी में 5 मिन के लिए >21,000 x ग्राम पर प्रत्येक ट्यूब कताई द्वारा डीएनए गोली मार । अधिनायक को त्यागें ।
    6. डीएनए पैलेट को 70% इथेनॉल के 100 माइक्रोन से धोएं। प्रत्येक ट्यूब को आरटी पर 5 मिन के लिए >21,000 x ग्राम पर स्पिन करें । सुपरनेटेंट को छोड़ दें ।
    7. डीएनए पैलेट को फिर से 100% इथेनॉल के 100 माइक्रोन से धोलें। प्रत्येक ट्यूब को आरटी में 5 मिन के लिए 21,000 पर स्पिन करें।
    8. गोली पूरी तरह से हवा सूखी चलो, तो धीरे से मिश्रण करने के लिए flicking द्वारा nuclease मुक्त एच2ओ के 12 μL में डीएनए को फिर से निलंबित ।
  8. निर्माण के प्रोटोकॉल के अनुसार सल की 1 इकाई और एसबीबीआई की 1 इकाई के साथ 20 माइक्रोन प्रतिक्रिया में PSUmC-4.0 वेक्टर के 500 एनजी को डाइजेस्ट करें। वेक्टर के पूर्ण पाचन को सुनिश्चित करने के लिए लगभग 3 घंटे या रात भर के लिए प्रतिक्रिया को इनक्यूबेट करें।
  9. पहले वर्णित फिनॉल/क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण और इथेनॉल वर्षा द्वारा पचाई हुई रीढ़ को शुद्ध और केंद्रित करें (चरण 1.7.1-1.7.9)।
  10. पचाए गए pSUmC-4.0 वेक्टर और दोनों 5 'और 3' होमोलॉजी आर्म पीसीआर उत्पादों को 0.01 बजे के अनुपात में एक साथ मिलाएं। निर्माण के प्रोटोकॉल के अनुसार डीएनए असेंबली प्रतिक्रिया में टुकड़ों को इकट्ठा करें।
  11. डीएनए असेंबली प्रतिक्रिया के 1 माइक्रोन के साथ इलेक्ट्रोसक्षम ई कोलाई के 50 माइक्रोन को बदलें। प्लेट एलबी एगर प्लेटों पर परिवर्तित ई. कोलाई जिसमें प्रति प्लेट १५० माइक्रोन का प्रसार करके १०० μg/mL स्पेक्ट्नोमाइसिन युक्त है । प्लेटों को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  12. अगले दिन, एक एपिफ्लोरेसेंस उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके हरे और लाल फ्लोरेसेंस के लिए स्क्रीन उपनिवेश। आगर प्लेट के हिसाब से कुल 5-30 कॉलोनियों की उम्मीद है।
  13. 100 μg/mL स्पेक्ट्नोमाइसिन के साथ पूरक पौंड शोरबा के 4 मिलीग्राम टीका लगाने के लिए 5-10 उपनिवेशों उठाओ। 250 आरपीएम पर मिलाते हुए रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृतियों को इनक्यूबेट करें।
  14. रातोंरात ई. कोलाई संस्कृतियों का उपयोग करना, छोटे पैमाने पर डीएनए शुद्धि प्रदर्शन करते हैं । न्यूस्लीज-फ्री एच2ओ के 50 माइक्रोन के साथ डीएनए को एल्यूट करें।
  15. प्रत्येक प्रविष्टि को बढ़ाने के लिए पीसीआर स्क्रीनिंग प्राइमर (चरण 1.4 में डिजाइन) का उपयोग करके प्रत्येक होमोलॉजी आर्म के प्रत्येक होमोलॉजी आर्म के सम्मिलन की पुष्टि करें। यदि डीएनए असेंबली सफल होती है, तो 5 और 3 ' आर्म क्षेत्रों दोनों के लिए 1% डीएनए अगारोज जेल में ~ 4 केबी पीसीआर उत्पाद मनाया जाना चाहिए। एक ~ 1 केबी पीसीआर उत्पाद प्रविष्टि की कमी को इंगित करता है।
    नोट: यदि होमोलॉजी हथियारों का सम्मिलन दोहरे टुकड़े विधानसभा प्रतिक्रिया में असफल होता है, तो व्यक्तिगत रूप से 5 'बांह तो 3' बांह डालने के लिए दो असेंबली प्रतिक्रियाएं करें। 5 'बांह के साथ कोडांतरण से पहले केवल Sall के साथ वेक्टर पचाने, तो 3 ' बांह इकट्ठा करने के लिए SbfI के साथ वेक्टर पचा।
  16. ट्रांसफॉर्मबांध-/डीसीएम-सक्षम ई. कोलाई के २०० एनजी के साथ pSUmc-४.० दोनों homology हथियारों के साथ इकट्ठे हुए । प्लेट एलबी एगर प्लेटों पर परिवर्तित बैक्टीरिया जिसमें प्रति प्लेट 25 माइक्रोन फैलकर १०० μg/mL स्पेक्ट्नोमाइसिन युक्त है । प्लेटों को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। कुल 20-200 कॉलोनियों की उम्मीद है।
  17. चरण 1.13 में वर्णित लाल और हरे रंग की फ्लोरोसेंट उपनिवेशों के लिए प्लेटों को स्क्रीन करें।
  18. लाल और हरे रंग की कालोनियों के साथ १०० μg/mL स्पेक्ट्नोमाइसिन युक्त पौंड शोरबा के १०० मीटर का उपयोग करके बड़े पैमाने पर डीएनए शुद्धि के लिए एक संस्कृति की स्थापना की । 250 आरपीएम पर मिलाते हुए रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति को इनक्यूबेट करें।
  19. संस्कृति की कटाई करें और बड़े पैमाने पर डीएनए शुद्धिकरण का उपयोग करके डीएनए को शुद्ध करें।
    1. एनएफ-एच2ओ के 100 माइक्रोन में शुद्ध प्लाज्मिड डीएनए को फिर से निलंबित करें। सी ट्रेकोमेटिस ट्रांसफॉर्मेशन के लिए कम से कम 2 μg/μL की कुल डीएनए यील्ड आदर्श है ।
    2. सी ट्रेकोमेटाइटिसको बदलने से पहले PSUmC-4.0 में सही असेंबली सुनिश्चित करने के लिए 5 ' और 3 ' होमोलॉजी आर्म क्षेत्रों का अनुक्रम ।

2. एलेलिक एक्सचेंज द्वारा जीन विलोपन के लिए pSUmC 4.0 + होमोलॉजी आर्म्स के साथ सी ट्रेकोमेटिस का परिवर्तन

  1. बीज McCoy कोशिकाओं, माउस फाइब्रोब्लास्ट मानकरूप से क्लैमाइडियाकी खेती के लिए इस्तेमाल किया, दो 6 अच्छी तरह से प्लेटों में (1 x १० कोशिकाओं/अच्छी तरह से) विकास मीडिया #1 के साथ । मोनोलेयर शंखनाद (लगभग 24 घंटे) होने तक 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
  2. 1.5 एमएल ट्यूब में, सी ट्रेकोमाटिस डब्ल्यूटी सेरोवर एल 2 प्राथमिक निकायों (ईबी) की मात्रा जोड़ें जो 2 के एमओआई में 6 अच्छी प्लेट के 12 कुओं को संक्रमित करने के लिए पर्याप्त है। 30 मिन के लिए >20,000 x g पर ईबीएस को गोली, फिर अतिशयोक्ति को त्यागें।
  3. CaCl2 बफर के 600 μL में ईबी को धीरे से फिर से निलंबित करके क्लैमाइडायल परिवर्तन शुरू करें, और फिर ट्यूब में 24 μg pSUmC-4.0+ होमोलॉजी हथियार जोड़ें। धीरे-धीरे घोल को फ्लिकिंग करके मिलाएं। RTfor 30 मिन में ट्यूब इनक्यूबेट और फ्लिक हर 10 मिन मिश्रण करने के लिए ।
  4. हैंक्स के संतुलित नमक समाधान (एचबीएस) के 24 मिलीएल में परिवर्तन समाधान जोड़ें और धीरे-धीरे पाइपिंग द्वारा मिलाएं। इनोकुलम के 2 एमएल को 6 अच्छी प्लेटों में कन्फ्लोरेंट मैककॉय कोशिकाओं के प्रत्येक कुएं में स्थानांतरित करें और 20 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 900 x ग्राम पर केंद्रीकरण से संक्रमित करें।
  5. इनोकुलम निकालें और 2 mL/अच्छी तरह से RPMI विकास मीडिया #2 के साथ बदलें । प्लेटों को 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  6. न्यूनतम 7 घंटे के बाद, लेकिन 12 घंटे से अधिक नहीं, मीडिया की जगह 2 mL/अच्छी तरह से चयन मीडिया #1 की । संक्रमण के समय से 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन जारी रखें।
  7. फसल और McCoy कोशिकाओं के एक ताजा मोनोलेयर पर बैक्टीरिया पारित ।
    1. एक सेल स्क्रैपर का उपयोग करना, धीरे से मीडिया में कोशिकाओं को उठाने के लिए McCoy मोनोलेयर परिमार्जन । प्रत्येक कुएं से सामग्री को 2 मिलीएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिन के लिए एक माइक्रोसेंट्रिकेज में 20,000 x ग्राम पर सेल सामग्री को गोली।
    2. अधिनेता को निकालें और त्यागें। धीरे पाइपिंग द्वारा एचबीएसएस के 1 mL में सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 200 x ग्राम पर सेल मलबे को गोली। कृपालु McCoy कोशिकाओं की एक ताजा अच्छी तरह से अतिशयोक्ति पर अतिशयोक्ति हस्तांतरण। 2 mL/well की कुल मात्रा के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से एचबीएसएस का एक अतिरिक्त 1 mL जोड़ें ।
    4. 20 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 900 x ग्राम पर केंद्रीकरण से संक्रमित करें। संक्रमण के तुरंत बाद चयन मीडिया #1 के साथ inoculum की जगह ।
  8. तीन या अधिक मार्ग के लिए मैककॉय कोशिकाओं (धारा 2.7) के एक ताजा मोनोलेयर पर बैक्टीरिया को पासिंग जारी रखें जब तक कि लाल और हरे रंग के समावेशन का पता चला न हो, तब तक एक एपिफ्लोरेसेंस उल्टे माइक्रोस्कोप 24 एच पोस्ट-इंफेक्शन (24 एचपीआई) का उपयोग करके पता नहीं चला या नहीं।
  9. एक बार लाल और हरे रंग के समावेशन का पता चलने के बाद, चयन मीडिया #2 का उपयोग करमोनोलेयर (धारा 2.7) को पासिंग जारी रखें।
  10. मोनोलेयर को तब तक पासिंग जारी रखें जब तक कि हरे-केवल समावेशन का पता न चले 24 एचपीआई (#3 या बाद में मार्ग), जो जीनोम में लोक्सपी चयन कैसेट के pSUmC-4.0 वेक्टर और समावेश के नुकसान को इंगित करता है।
  11. पासिंग द्वारा समृद्ध करने के लिए हरे-केवल समावेशन में से एक अच्छी तरह से चुनें। फसल और फ्रीज किसी भी अन्य कुओं कि भी सुक्रोज-फॉस्फेट-ग्लूटामेट बफर (एसपीजी) में हरे रंग की ही समावेशन होते हैं।
    1. हरे-केवल समावेशन को समृद्ध करने के लिए, चरण 2.7 में किए गए 6 अच्छी प्लेट के एक कुएं से मोनोलेयर को पारित करें, लेकिन सेल मलबे (चरण 2.7.3) को गोली मारने के बाद, अधिनायक को एचबीएसएस के 12 मिलील के साथ एक शंकुमें स्थानांतरित करें। इस इनोकुलम का उपयोग प्रति अच्छी तरह से 2 mL जोड़कर दो 6 अच्छी तरह प्लेटों को संक्रमित करने के लिए करें, फिर प्लेटों को 20 डिग्री सेल्सियस पर 60 मीटर के लिए 900 x ग्राम पर स्पिन करें।
    2. अतिरिक्त कुओं को फ्रीज करने के लिए, मोनोलेयर को चरण 2.7.1 के रूप में काटें, लेकिन एचबीएसएस के बजाय एसपीजी के 1 एमएल में छर्रों को फिर से निलंबित करें। सेल मलबे (चरण 2.7.3) को गोली दें और सुपरनेट को 1.5 एमएल क्रायोट्यूब में स्थानांतरित करें। -80 डिग्री सेल्सियस पर सामग्री फ्रीज।
  12. 0.5-1.0 (पता लगाने के बाद एक से दो और मार्ग) के एमओआई के लिए हरे-केवल समावेशन को समृद्ध करने के बाद, चरण 2.11.2 में वर्णित एसपीजी में मोनोलेयर की कटाई करें। 1.5 मिलीएल ट्यूबों में 50 माइक्रोन के एलिकोट्स प्राप्त करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।
  13. टिटर ग्रीन-केवल बैक्टीरिया समावेशन का निर्धारण करने के लिए,इकाइयों का गठन/

3. ग्रीन-केवल सी ट्रेकोमेटिस विलोपन उत्परिवर्ती का क्लोनल अलगाव जिसमें कमजोर पड़ने को सीमित करके लोक्सपी फ्लैंक्ड चयन कैसेट शामिल है

  1. बीज ~ २,००० कोशिकाओं पर McCoy कोशिकाओं के ५० μL के साथ एक ३८४ अच्छी तरह #1 से ऊतक संस्कृति थाली/ ~ 24 घंटे के लिए या शंखनाद तक 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  2. एचबीएस में हरे-केवल बैक्टीरिया का एक बहाना पतला करें ताकि प्रति 20 मीटर ~ 50 ईबीएस प्राप्त किया जा सकता है। पतला इनोकुलम को जलाशय ट्रे में स्थानांतरित करें।
    1. पूरी थाली को एक बेकार कंटेनर में उल्टा करके ३८४ अच्छी तरह से थाली से मीडिया को हटा दें । मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके, प्रत्येक कुएं में सी ट्रेकोमेटिस इनोकुलम के 50 माइक्रोन जोड़ें। 20 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 900 x ग्राम पर केंद्रीकरण से संक्रमित करें।
      नोट: ध्यान रखें कि इतनी मेहनत से झटका न दें कि मोनोलेयर अलग हो जाए। यदि कोशिकाएं अधिक अनुकूल हैं, तो वे अधिक आसानी से अलग हो जाएंगी।
  3. फ्लिकिंग द्वारा इनोकुलम को हटा दें और ५० μL/well विकास मीडिया #2 के साथ बदलें । 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट प्लेटें।
    नोट: इस स्तर पर, जीनोम में चयन कैसेट का एकीकरण स्थिर है, इसलिए स्पेक्ट्नोमाइसिन के साथ एंटीबायोटिक चयन की आवश्यकता नहीं है।
  4. 5-12 दिनों के लिए प्लेट इनक्यूबेटिंग के बाद, एक एपिफ्लोरोसेंस उल्टे माइक्रोस्कोप या एक उच्च सामग्री स्क्रीनिंग प्लेटफॉर्म का उपयोग करके हरे फ्लोरोसेंट समावेशन के साथ व्यक्तिगत कुओं की पहचान करें।
  5. एक पी-10 टिप के साथ मोनोलेयर स्क्रैपिंग और एचबीएस के 2 mL युक्त ट्यूब में अच्छी तरह से की पूरी सामग्री को स्थानांतरित करके हरे रंग के केवल समावेशन के साथ फसल कुओं । धीरे मिश्रण और संक्रमण के लिए एक 6 अच्छी तरह से थाली में एक ताजा confluent McCoy मोनोलेयर के लिए इनोकुलम के 2 एमएल लागू होते हैं ।
    नोट: समावेशन के साथ व्यक्तिगत कुओं की पहचान करते समय, समावेशन प्रारंभिक समावेश से विस्तार के कारण एक क्लस्टर में होगा । यदि एक अच्छी तरह से कई समूह ों है, यह संभावना है कि एक से अधिक ईबी शुरू में संक्रमित है कि अच्छी तरह से । इन कुओं की कटाई नहीं की जानी चाहिए, और कुछ मामलों में, धारावाहिक कमजोर पड़ने से क्लोनल अलगाव के कई दौर आवश्यक हो सकते हैं ।
  6. 20 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 900 x ग्राम पर सेंट्रलाइज्ड द्वारा 6 अच्छी प्लेट को संक्रमित करें। इनोकुलम को 2 mL/well विकास मीडिया #2 से बदलें । 48 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  7. समृद्ध, फ्रीज, और टिटर क्लोनल आबादी के लिए कदम 2.11-2.13 दोहराएं।
  8. पहलेवर्णित 12क्यूपीसीआर का उपयोग करके क्लोनी से अलग सी ट्रेकोमेटिस से लक्षित जीन को हटाने की पुष्टि करें।

4. पॉक्सी फ्लैंक्ड चयन कैसेट को हटाने की शुरुआत करने के लिए पीसीयू-क्रे के साथ सी ट्रेकोमेटिस फ्राईएम उत्परिवर्ती का परिवर्तन

  1. क्लोनी से अलग सी ट्रेकोमेटिस एफआरईएम उत्परिवर्ती, पीसीयू-क्रे वेक्टर और चयन मीडिया #3 का उपयोग करके पहले वर्णित (चरण 2.1-2.8) के रूप में 6 अच्छी तरह से प्लेट में परिवर्तन प्रक्रिया दोहराएं।
    नोट: लाल और हरे रंग के फ्लोरोसेंट वाले समावेशन द्वारा एक सफल परिवर्तन का संकेत दिया जाता है।
    1. मोनोलेयर को तब तक पारित करें जब तक कि लाल-केवल समावेशन का पता एक एपिफ्लोरेसेंस उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके नहीं किया जाता है, जो चयन कैसेट (दो से तीन मार्ग) के नुकसान को इंगित करता है। मोनोलेयर को तब तक पासिंग जारी रखें जब तक कि लाल-केवल समावेशन ~ 0.5 के एमओआई से समृद्ध न हो जाएं।
  2. क्लोनली एक 384 अच्छी तरह से प्लेट में कमजोर पड़ने को सीमित करके लाल-केवल समावेशन को अलग करें जैसा कि पहले वर्णित था (चरण 3.1-3.8); हालांकि, सभी चरणों के लिए चयन मीडिया #3 का उपयोग करें।
  3. 0.1 के एमओआई तक पासिंग द्वारा क्लोनल आबादी को समृद्ध करें। एक बार समृद्ध होने के बाद, पीसीयू-क्रे वेक्टर (लगभग तीन से चार मार्ग) के नुकसान को शुरू करने के लिए विकास मीडिया #2 के साथ अनुभाग मीडिया को प्रतिस्थापित करें।
  4. क्लोनली नॉनफ्लोरोसेंट बैक्टीरिया (चरण 3.1-3.8) को अलग करें; हालांकि, समावेशन का पता लगाने के लिए प्लेट को ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप के साथ मैन्युअल रूप से स्कैन करें। बैक्टीरिया को समृद्ध और फ्रीज करें (चरण 2.11-2.12)।
  5. मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर, पश्चिमी दाग, और पूरे जीनोम डीएनए अनुक्रमण का उपयोग कर उत्परिवर्ती तनाव के लिए स्क्रीन के रूप में पहलेवर्णित 12

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Representative Results

FLAEM का उपयोग कर सी ट्रेकोमेटिस में मार्करलेस जीन हटाने के लिए विधि सावधान क्लोनिंग और परिवर्तन तकनीकों पर निर्भर है। सफल एलीलिक पुनर्संयोजन एक आवश्यक पहला कदम है और इसके लिए पीएसयूएमसी-4.0 क्लोनिंग वेक्टर(चित्रा 1)में होमोलॉजी हथियारों की पहचान और प्रविष्टि की आवश्यकता होती है। मार्करलेस जीन विलोपन के लिए एक आवश्यक दूसरा कदम क्रे-लोक्स जीनोम संपादन द्वारा फ्लोरेसेंस रिपोर्टर और एंटीबायोटिक चयन कैसेट को हटाना है, जो चित्रा 2में प्रतिनिधित्व करता है । इनमें से प्रत्येक चरण को पूरा करने के लिए उपयोग किए जाने वाले वेक्टर को चित्र 3में एनोटेट किया जाता है । चित्रा 4 जंगली प्रकार सी ट्रेकोमैटिससे शुरू करते समय मार्करलेस विलोपन उत्परिवर्ती उत्पन्न करने के लिए परिवर्तन रणनीति का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व दिखाता है।

प्रतिनिधि डेटा चित्रा 5 और चित्रा 6में दिखाया गया है, जिसमें टीईए जीन हटाने के लिए लक्षित है। सी ट्रेकोमेटिस tmeA हटाने तनाव FRAEM का उपयोग कर उत्पन्न होता है, और सी ट्रेकोमेटिस tmeA-lx तनाव FLAEM का उपयोग कर उत्पन्न होता है। दोनों उत्परिवर्ती उपभेदों में TmeA लोकस का विलोपन होता है; हालांकि, टीईए-एलएक्स में चयन कैसेट शामिल नहीं है, जैसा कि चित्रा 5में दिखाए गए जीएफपी डीएनए की अनुपस्थिति से संकेत मिलता है। TmeA उत्परिवर्ती तनाव mmeBकी अभिव्यक्ति में कमी आई है, MRNA और प्रोटीन के स्तर से चित्रा 6 में दिखाया गया है । जब फ्लेम का उपयोग टीईए-एलएक्स उत्परिवर्ती तनाव उत्पन्न करने के लिए किया जाता है, तो चित्रा 6 से पता चलता है कि टीएमईबी की अभिव्यक्ति बहाल है।

Figure 1
चित्रा 1: जीनोमिक डीएनए और पीसीआर स्क्रीनिंग से 5 ' और 3 ' होमोलॉजी हथियारों की पहचान करने के लिए योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व pSUmC-4.0 में उनके सम्मिलन के लिए । (क) सी ट्रेकोमेटिस जीनोम से हटाने के लिए लक्षित जीन नीले तीर द्वारा दर्शाया जाता है। एलीलिक रिकॉम्बिनेशन के लिए 5 ' और 3 ' होमोलॉजी आर्म्स के रूप में पहचाने जाने वाले 3 केबी क्षेत्रक्रमशः बैंगनी और लाल रंग में कोष्ठक हैं । (बी, सी) PSUmC-4.0 में 5 ' और 3 ' होमोलॉजी हथियारों का सम्मिलन पीसीआर स्क्रीनिंग द्वारा निर्धारित किया जाता है । Sall और Sbfl प्रतिबंध एंजाइम साइटों aadA (काले तीर) और gfp (हरे तीर) चयन कैसेट जो pSUmC-४.० वेक्टर पर loxP साइटों (पीले वर्गों) द्वारा flanked है flanking दिखाया गया है । (ख)कोई प्रविष्टि 1 केबी पीसीआर उत्पाद द्वारा निर्धारित नहीं की जाती है जब 5 ' स्क्रीनिंग प्राइमर (बैंगनी तीर सिर) का उपयोग सभी साइट पर पीसीआर बढ़ाने के लिए किया जाता है, या 3 ' स्क्रीनिंग प्राइमर (लाल तीर सिर) का उपयोग एसबीबी साइट पर बढ़ाने के लिए किया जाता है । (ग)सफल प्रविष्टि का निर्धारण 3 केबी पीसीआर उत्पादों द्वारा एक ही शर्तों के तहत किया जाता है । 5 ' और 3 ' होमोलॉजी हथियार क्रमशः बैंगनी और लाल कोष्ठक द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: जीएफपी-aaDA चयन कैसेट को हटाने के लिए क्रे-लोक्स का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व मध्यस्थता पुनर्संयोजन। क्रे रिकॉम्बिनेज़ की उपस्थिति में, लोक्सपी साइटें (पीले) को फिर से जोड़ती हैं, जिसके परिणामस्वरूप जीएफपीका उत्तेजन होता है -aaDA चयन कैसेट (हरे और काले वर्ग)। परिणामस्वरूप लोकस एक शेष लोक्सपी निशान अनुक्रम युक्त दिखाया गया है । अपस्ट्रीम (यूएस) और डाउनस्ट्रीम (डीएस) क्षेत्रग्रे में दिखाए जाते हैं। इस आंकड़े को केब एट अल12से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: PSUmC-4.0 और एसएसयू-सीआरई के आनुवंशिक संगठन। सी ट्रेकोमेटिस में वेक्टर के नियंत्रणीय रखरखाव के लिए, पीजीपी 6 को टेट्रासाइक्लिन-प्रेरक प्रमोटर के डाउनस्ट्रीम में इंजीनियर किया जाता है। शेष पीजीपी जीन उनके मूल क्लैमिडियल प्रमोटरों के डाउनस्ट्रीम हैं, और एमचेरी दोनों वैक्टर पर संविलियन रूप से व्यक्त किया जाता है। (क)पीएसयूएमसी-4.0 में एंटीबायोटिक और फ्लोरेसेंस चयन क्षमता के लिए क्रमशः एक कैसेट एन्कोडिंग एनकोडिंग एनकोडिंग एनकोडिंग है। क्रे मध्यस्थता पुनर्संयोजन के लिए LoxP साइटों के साथ ही जीन विशिष्ट homology हथियारों के सम्मिलन के लिए प्रतिबंध एंजाइम साइटों चयन कैसेट पार्श्व । (ख)पीएसयू-सीआरई में PSUmC-4.0 की समान रीढ़ शामिल हैं; फिर भी, पुनर्संयोजन कैसेट के बजाय, ब्लाम और सीआरई क्रमशः एंटीबायोटिक चयनात्मकता और सीआरई पुनर्संयोजन पीढ़ी के लिए व्यक्त किए जाते हैं। इन आंकड़ों को केब एट अल12से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: एक मार्करलेस हटाने उत्परिवर्ती बनाने के लिए उपयोग की जाने वाली फ्लेम परिवर्तन रणनीति का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। सामान्य फ्लेम विधि का प्रतिनिधित्व यहां किया जाता है जहां जंगली-प्रकार सी ट्रेकोमेटिस क्रमिक रूप से बदल जाता है और क्रमिक रूप से एक मार्करलेस विलोपन उत्परिवर्ती उत्पन्न करने के लिए मार्गित होता है। परिवर्तन चरणों का प्रतिनिधित्व छोटे तीरों के अलावा द्वारा किया जाता है, और आनुवंशिक तत्वों के नुकसान का प्रतिनिधित्व छोटे तीरों के घटाव द्वारा किया जाता है। सी ट्रेकोमेटिस मध्यवर्ती (हलकों) एंटीबायोटिक संवेदनशीलता (पेनिसिलिन प्रतिरोधी या पेनिसिलिन-संवेदनशील = पेंगआर या पेनजीएस;स्पेक्ट्नोमाइसिन प्रतिरोधी या स्पेक्ट्नोमाइसिन-संवेदनशील = स्पेकआर यास्पेकएस) और फ्लोरेसेंस-रिपोर्टिंग गुण (ग्रीन = जीएफपी+, रेड = एमचेरी +, ग्रे = नो फ्लोरेसेंस) के साथ प्रतिनिधित्व किया जाता है। प्रत्येक चरण पर जीन लोकस के योजनाबद्ध अभ्यावेदन नीचे दिखाए जाते हैं। इस आंकड़े को केब एट अल12से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: फ्राईम और फ्लेम का उपयोग tmeA जीन हटाने उत्पन्न करने के लिए किया जाता है। (ए)एफआरईएम का उपयोग टीईएउत्पन्न करने के लिए किया गया था, और फ्लेम का उपयोग टीईए-एलएक्स उत्पन्न करने के लिए किया गया था। TmeA और डाउनस्ट्रीम tmeB के सापेक्ष डीएनए कॉपी संख्या; पीएसयूएमसी-4.0 चयन कैसेट पर निहित जीएफपी; और पीएसयू-सीआरई वेक्टर पर निहित सीआरई सभी दिखाए गए हैं। डब्ल्यूटी, एल2 टीईए,या एल2रिफटीईए-एलएक्स सी ट्रेकोमेटिस की समान समावेशन बनाने वाली इकाइयों से संक्रमित मैककॉय कोशिकाओं को 24 एचपीआई में काटा गया था, और क्यूपीसीआर के लिए डीएनए निकाला गया था। सापेक्ष प्रतिलिपि संख्या का मूल्यांकन सिग्नल सामान्यीकरण द्वारा क्लैमाइडायल 16एसआरएनए को किया गया था। ND = किसी का पता नहीं चला। (ख)L2RiftmeA-lx से अनुक्रमित tmeAB लोकस एक शेष loxP निशान अनुक्रम (रेखांकित) के साथ दिखाया गया है । डीएनए के पार्श्व क्षेत्रों नीले रंग में दिखाया गया है, शुरू कोडन हरे रंग में दिखाए जाते हैं, और TmeA स्टॉप कोडन लाल रंग में दिखाया गया है । TmeB के लिए गैर विहित शुरू कोडन भी चित्रित किया गया है। इन आंकड़ों को केब एट अल12से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: फ्लेम का उपयोग करके चयन कैसेट का एक्सिजन tmeA को लक्षित करते समय tmeB की अभिव्यक्ति को पुनर्स्थापित करता है और डाउनस्ट्रीम जीन को बाधित नहीं करता है। (A) सी ट्रेकोमेटिस tmeA और tmeB उत्परिवर्ती उपभेदों के सापेक्ष mRNA स्तर । टीएमईए के डाउनस्ट्रीम ट्रांसक्रिप्ट्स की उपस्थिति रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज़ (आरटी) मात्रात्मक पीसीआर द्वारा निर्धारित की गई थी। इस क्षेत्र में तुरंत tmeA/बी ऑपरन एनकोड ct696 के बहाव । कुल आरएनए को डब्ल्यूटी, एल2 टीईए,एल2 टीईबी,या एल2रिफटीईए-एलएक्सके साथ 1 के एमओआई में संक्रमित मैककॉय कोशिकाओं से 24 एचपीआई पर अलग किया गया था। क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा टीईए, टीएमईबीऔर सीटी696 के लिए ट्रांसक्रिप्ट का पता लगाया गया। आरपीओडीको सामान्य करने के बाद सिग्नल प्रस्तुत किए जाते हैं । ND = किसी का पता नहीं चला। (ख) सी ट्रेकोमेटिस उत्परिवर्ती उपभेदों में TmeA और TmeB की उपस्थिति के लिए पश्चिमी दाग । डब्ल्यूटी, एल2 टीईए,एल2रिफटीईए-एलएक्स, या एल2रिफटीईए-एलएक्स पीटीमईए की समान समावेशन बनाने वाली इकाइयों से संक्रमित 24 एचपीआई संस्कृतियों से संपूर्ण संस्कृति सामग्री की समान मात्रा की जांच टीमईए और टीमईबी के लिए इम्यूनोलॉट में की गई थी। Hsp60 एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था, और प्रोटीन केमिल्यूमिनेसेंस द्वारा कल्पना की गई थी । केब एट अल12से चित्रा संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यहां बताए गए प्रोटोकॉल में सी ट्रेकोमेटिस में मार्करलेस जीन विलोपन की पीढ़ी के लिए कहा गया है, जो अनावश्यक जीन ों को लक्षित हटाने की अनुमति देता है और कैसेट-प्रेरित ध्रुवीय प्रभावों को समाप्त करता है। प्रोटोकॉल 5 ' और 3 ' homology हथियारों के सावधान डिजाइन पर निर्भर करता है pSUmC ४.० आत्महत्या वेक्टर में डाला, सी trachomatis के कुशल परिवर्तन, और अलग उत्परिवर्ती उपभेदों की सावधान स्क्रीनिंग । इस विधि के माध्यम से सफल जीनोम इंजीनियरिंग बैक्टीरिया में परिणाम है कि nonfluorescent है और लक्षित जीन हटाने की साइट पर एक ही loxP निशान अनुक्रम होते हैं । इसके अलावा, इस विधि में एक ही सी ट्रेकोमेटिस तनाव के भीतर जीन के अनुक्रमिक लक्ष्यीकरण के लिए अनुकूलित करने की क्षमता है।

5 ' और 3 ' होमोलॉजी हथियारों और आत्महत्या वेक्टर में प्रविष्टि का सावधान डिजाइन क्लोनिंग प्रक्रिया का पहला और सबसे महत्वपूर्ण कदम है । यह पाया गया है कि 3 केबी होमोलॉजी हथियार सबसे कुशल एलीलिक रिकॉम्बिनेशन प्रदान करते हैं। जबकि इन हथियारों का सम्मिलन एक वेक्टर उत्पन्न करता है जो बड़ा है और कभी-कभी काम करना मुश्किल है, कम हथियारों के साथ कम सफलता मिली है, जिसमें ~ 2 केबी सफलता के लिए न्यूनतम का प्रतिनिधित्व करता है। डीएनए असेंबली प्रदर्शन करते समय Sall और Sbfl प्रतिबंध साइटों का उपयोग एक सुविधाजनक एक कदम निर्माण प्रतिक्रिया प्रदान करता है।

अन्य क्लोनिंग विधियां, जैसे कि प्रविष्टि पीसीआर, होमोलॉजी हथियार डालने में भी प्रभावी रही हैं, लेकिन वे पीसीआर आधारित त्रुटियों की अधिक संभावना पेश करते हैं। दिलचस्प बात यह है कि यह देखा गया है कि 5 ' बांह की क्लोनिंग तुलनात्मक रूप से 3 ' बांह की तुलना में अधिक कुशल है । यदि मुद्दा उठता है, तो डीएनए असेंबली को दो प्रतिक्रियाओं में विभाजित करने और वेक्टर का निर्माण चरणबद्ध तरीके से करने की सिफारिश की जाती है। फिर, एसबीएफआई के साथ वेक्टर रीढ़ को पचाने, 3 'आर्म पहले डालें, फिर सल के साथ वेक्टर को पचाने और दूसरी डीएनए असेंबली प्रतिक्रिया में 5'बांह डालने की सलाह दी जाती है।

होमोलॉजी हथियारों के लिए पीसीआर के टुकड़ों को बढ़ाते समय, ताजा शुद्ध सी ट्रेकोमेटिस जीनोमिक डीएनए का उपयोग करने की भी सिफारिश की जाती है जो पहले से जमे हुए नहीं हैं। यह डीएनए बाल काटने की संभावना को सीमित करता है और बड़े एम्प्लिस पैदा करने के लिए दक्षता बढ़ाता है। यदि किसी अन्य वेक्टर से होमोलॉजी हथियारों को बढ़ाना, तो शुद्ध पीसीआर उत्पाद को ई. कोलाई परिवर्तन के दौरान पृष्ठभूमि उपनिवेशों को कम करने के लिए डीएनए असेंबली में आगे बढ़ने से पहले डीपीएनआई प्रतिबंध एंजाइम का इलाज करने की आवश्यकता होगी।

परिवर्तन इस प्रोटोकॉल का एक और महत्वपूर्ण कदम है जिसमें मुद्दे पैदा हो सकते हैं । यदि PSUmC 4.0 के साथ परिवर्तन सफल है, हरे और लाल समावेशन #3 पारित होने से दिखाई देना चाहिए; हालांकि, ट्रांसफॉर्मेंट समृद्ध होने से पहले कई और मार्ग लग सकते हैं। अन्य म्यूटाजेनेसिस दृष्टिकोणों की तरह, यह विधि गैर-आवश्यक जीनों को लक्षित करने तक सीमित है, फिर भी परिवर्तन को आसानी से पूरा किया जाना चाहिए। लाल फ्लोरेसेंस को बनाए रखने से संकेतित एलीलिक एक्सचेंज के अभाव में ट्रांसफॉर्मेंट की दीर्घकालिक निष्क्रियता से संकेत मिल सकता है कि लक्षित जीन को हटाना एक घातक घटना है ।

क्योंकि सी ट्रेकोमेटिस के लिए परिवर्तन वैक्टर में देशी पीएल2 के रूप में प्रतिकृति की एक ही उत्पत्ति होती है, देशी प्लाज्मिड के लिए कई (>5) मार्ग के बाद ठीक होना असामान्य नहीं है। PSUmC वेक्टर पर पीजीपी जीन देशी pL2 की तुलना में एक अलग क्रम में हैं; इसलिए, पीसीआर का उपयोग पीजीपी7-पीजीपी8में फैले क्षेत्र को बढ़ाकर एक अलग तनाव में पीएल 2 की उपस्थिति का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। यदि देशी प्लाज्मिड अंतिम विलोपन उत्परिवर्ती में खो जाता है, तो इसे विकासात्मक अध्ययन करने से पहले फिर से शुरू करने की आवश्यकता होगी। लैलेटरल जीन ट्रांसफर (एलजीटी) का उपयोग पीएल2 प्लाज्मिड19को फिर से शुरू करने के लिए किया जा सकता है।

कई मामलों में, चयन कैसेट के साथ जल्दी हटाने म्यूटेंट अभी भी pL2 प्लाज्मिड होते हैं। हमने पीएल2 को फिर से शुरू करने और हटाए गए जीन की मरम्मत से बचने के लिए सफलता के साथ एलजीटी के लिए इन उपभेदों का उपयोग किया है। एलजीटी को टीएसयू-क्रे शुरू करते समय परिवर्तन के लिए एक माध्यमिक विधि के रूप में भी उपयोग किया जा सकता है। कुछ मामलों में, एलजीटी शास्त्रीय सीएसीएल2 परिवर्तन की तुलना में अधिक कुशल था। जिन उदाहरणों में एलजीटी का उपयोग pSU-Cre को पेश करने के लिए किया जाता है, सी ट्रेकोमेटिस के साथ शुरू करना महत्वपूर्ण है जो एक आरपीओबी एलील को व्यक्त करता है, जो एलेलिक एक्सचेंज और स्पेक्ट्नोमाइसिन चयन कैसेट12,19के सम्मिलन से पहले रिफाम्पिन प्रतिरोध प्रदान करता है। रिफाम्पिन प्रतिरोधी बैक्टीरिया के साथ शुरू सह संस्कृति के बाद चयन की अनुमति देता है।

FLAEM जीन व्यवधान को प्राप्त करने के लिए यादृच्छिक म्यूटाजेनेसिस या न्यूक्लियोटाइड दृश्यों के सम्मिलन पर भरोसा करने वाले अन्य आनुवंशिक तरीकों की तुलना में पूरे कोडिंग दृश्यों के लक्षित विलोपन के साथ रिवर्स-जेनेटिक दृष्टिकोण ों को सक्षम बनाता है। FLAEM अनिवार्य रूप से FRAEM का एक विस्तार है, क्योंकि यह चयन कैसेट को हटाने की अनुमति देता है और पहले मनाया कैसेट प्रेरित ध्रुवीय प्रभाव समाप्त । यह विधि एकल सी ट्रेकोमेटिस तनाव में कई जीन विलोपन उत्पन्न करने का अवसर भी बनाती है।

दो अलग-अलग तंत्रों के माध्यम से कई उत्परिवर्तन उत्पन्न किए जा सकते हैं। पहले, FLAEM एक मार्करलेस जीन उत्परिवर्तन उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और क्रमिक रूप से एक ही तनाव में एक और जीन को लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया । पहले विलोपन उत्परिवर्ती pSUmC ४.० वेक्टर ब्याज के माध्यमिक जीन के लिए विशिष्ट homology हथियारयुक्त के साथ फिर से बदल सकता है । इस मामले में, प्रोटोकॉल को उसी तरीके से दोहराया जाना चाहिए जैसे पहले विलोपन और जीन को क्रमिक रूप से लक्षित करने के लिए कई बार दोहराया जाना चाहिए। दूसरे तंत्र में, FLAEM के बाद अलग मार्करलेस हटाने उत्परिवर्ती एक हटाने उत्परिवर्ती है कि अभी भी एक चयन कैसेट शामिल से सह संक्रमित किया जा सकता है । एलजीटी के माध्यम से, दूसरा विलोपन प्राप्त किया जाता है और इसके लिए चुना जा सकता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग करते समय, जीनोम में छोड़े गए अद्वितीय चयन कैसेट की संख्या से अतिरिक्त उत्परिवर्तन सीमित होते हैं। आमतौर पर परिवर्तन के दौरान चयनात्मक दबाव के रूप में उपयोग किए जाने वाले एंटीबायोटिक ्स सी ट्रेकोमेटिस के लिए सीमित होते हैं, लेकिन उनमें पेनिसिलिन, क्लोरम्फेनिकोल और स्पेक्ट्नोमाइसिन शामिल होते हैं। क्रे-लोक्सपी जीनोम संपादन द्वारा चयन कैसेट को हटाने से चयनात्मक दबाव के लिए कई एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग करने की आवश्यकता कम हो जाती है। संबंधित कार्यों या जैविक प्रक्रियाओं के साथ प्रोटीन का अध्ययन करते समय एक ही समय में कई जीन दृश्यों को हटाना फायदेमंद होता है जिसमें कई प्रमुख खिलाड़ी हो सकते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, एनआईएड (अनुदान A1065530 और Al124649) से सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, केए फील्ड्स के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose KSE Scientific BMK-A1705 Molecular Biology Grade
Anhydrotetracycline hydrochloride ACROS Organics 233131000
CaCl2 Buffer 10 mM Tris pH 7.4, 50 mM Calcium Chloride Dihydrate
Calcium Chloride Dihydrate Sigma C7902-500G Suitable for cell culture
Cycloheximide Sigma 7698-1G
dam-/dcm- Competent E. coli New England BioLabs C2925H
DMSO ATCC 4-X Sterile filtered cell culture tested
Glutamic acid Sigma G8415-100G L-Glutamic acid
Growth Media #1 RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS).
Growth Media #2 RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) and 1 µg/mL cycloheximide
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x) Gibco 24020-117
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Qualified One Shot (FBS) Gibco A38402-02
McCoy Cells ATCC CRL-1696
Monarch Plasmid Miniprep Kit New England BioLabs T1010S Small scale DNA purification
NaH2PO4 Sigma S3139-250G Sodium phosphate monobasic
Na2HPO4 Sigma S5136-500G Sodium phosphate dibasic
NEB 10-beta Electrocompetent E. coli Cells New England BioLabs C3020K
NEBuilder HiFi DNA assembly Cloning Kit New England BioLabs E5520S Gibson Assembly Kit
Penicillin G sodium salt Sigma P3032-10MU Bioreagent suitable for cell culture
QIAGEN Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12162 Large scale DNA purification
Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase New England BioLabs M0515 Fragment PCR Polymerase
RPMI 1640 Medium (1x) Gibco 11875-093 Containing 2mM L-glutamine
Sall-HF New England BioLabs R3138S
Sbfl-HF New England BioLabs R3642S
Selection Media #1 RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin, and 50 ng/mL anhydrous tetracycline dissolved in DMSO
Selection Media #2 RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin
Selection Media #3 RPMI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 50 ng/mL aTc, and 0.6 µg/mL penicillin
Sodium Acetate Buffer Solution Sigma S7899-100ML 3M
SOC Outgrowth Medium New England BioLabs B9020SVIAL
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate, Cell Culture Grade Alfa Aesar J61820
Sucrose Sigma S1888-1KG Bioreagent suitable for cell culture
Sucrose-Phosphate-Glutamate Buffer (SPG) 37.5g sucrose, 1.25 g Na2HPO4, 0.18 g NaH2PO4, 0.36 glutamic acid for 500 ml tissue culture grade water
Tris AMRESCO 0497-5KG Ultrapure grade
Trypsin-EDTA (1x) Gibco 25200-056 0.25%
Water Sigma W3500-500ML Sterile-filtered, BioReagent, Suitable for cell culture

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References

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  3. Mueller, K. E., Plano, G. V., Fields, K. A. New Frontiers in Type III Secretion Biology: the Chlamydia Perspective. Infection and Immunity. 82, 2-9 (2014).
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