작은 모발 샘플에서 11가지 약물 내성 결핵 약물 정량화를 위한 LC-MS/MS 패널 검증

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Medicine

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Summary

복잡한 약 저항하는 결핵 (DR-TB) 식이요법에 환자의 준수를 분석하는 현재 방법은 부정확하고 자원 집약적 일 수 있습니다. 우리의 방법은 11 DR-TB 약물의 농도에 대한 쉽게 수집하고 저장 매트릭스, 머리를 분석합니다. LC-MS/MS를 사용하여 약물 순임을 더 잘 이해하기 위해 활용할 수 있는 하위 나노그램 약물 수준을 결정할 수 있습니다.

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Reckers, A., Wen, A., Aguilar, D., Bacchetti, P., Gandhi, M., Metcalfe, J., Gerona, R. Validated LC-MS/MS Panel for Quantifying 11 Drug-Resistant TB Medications in Small Hair Samples. J. Vis. Exp. (159), e60861, doi:10.3791/60861 (2020).

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Abstract

약물 내성 결핵(DR-TB)은 공중 보건 위협이 증가하고 있으며 치료 약물 수준의 평가는 중요한 임상적 이점을 가질 수 있습니다. 혈장 약 수준은 현재 금 표준 평가입니다, 그러나 phlebotomy 및 감기 사슬을 요구하고, 단지 아주 최근 준수를 붙잡습니다. 우리의 방법은 모발을 사용하여, 쉽게 수집하고 장기 준수의 반사 매트릭스, 11 항 결핵 약물을 테스트합니다. 우리 그룹에 의한 이전 작업은 모발의 항 레트로 바이러스 약물 수준이 HIV 결과와 관련이 있음을 보여줍니다. DR-TB 약물에 대한 우리의 방법은 2 mg의 모발 (뿌리근에 3cm 근위)을 사용하며, 이 모발은 분쇄되어 메탄올로 추출됩니다. 샘플은 단일 LC-MS/MS 방법으로 분석되어 16분 동안 11개의 약물을 정량화합니다. 11개의 약물에 대한 정량화(LLOQs)의 하한은 0.01 ng/mg에서 1 ng/mg에 이르는 범위입니다. 샘플은 약물의 면적 비를 사용하여 정량화되고, 15N-또는 13C 표지된 약물 동위 원소 폴로그. 우리는 0.001-100 ng/mg에 이르는 교정 곡선을 사용했습니다. 직접 관찰 된 치료 (DOT)에 DR-TB 환자로부터 수집 된 모발 샘플의 편의 샘플에 대한 방법의 적용은 11 개의 약물 중 9 개의 선형 동적 범위 내에서 모발의 약물 수준을 나타내고 있습니다 (이소니아지드, 피라진아미드, 에탐부톨, 라인졸리드, 레보플록사신, 목시플로이신, 클로파지민, 베아퀴린, 프리토만). 어떤 환자도 프로티오나미드에 없었고, 에티오나미드에 대한 측정된 수준은 LLOQ에 가까웠습니다(노출 모니터링을 위한 에티오아마이드 대사산물의 적합성을 조사하는 대신 추가 작업). 요약하면, 우리는 약물 내성 결핵 치료 중 치료 약물 모니터링을위한 기술로 머리에 DR-TB 약물에 대한 다중 타액 화 패널의 개발을 설명합니다.

Introduction

21 세기에, 약 저항하는 결핵 (DR-TB)는 이미 약한 국가 결핵 통제 프로그램에 대한 진화하는 재앙입니다, 확인된 케이스는 전 세계적으로 항균 저항과 관련있는 모든 죽음의 거의 1/3을 차지하는, 지난 5 년 에서만 두 배로,1,,2. DR-TB의 성공적인 치료는 약물 에 민감한 결핵에 대한 치료보다 전통적으로 더 길고 독성이 있는 2차 처방이 요구되고 있다. 더욱이, DR-TB를 가진 환자는 수시로 저항의 출현에 처음에 기여한 준수에 중요한 기존 도전이있습니다 3.

바이러스 성 부하가 처리를 감시하기 위하여 이용될 수 있는 HIV 감염과는 달리, 결핵에 있는 처리 반응의 대리 종점은 개별 수준4에연기되고 믿을 수 없습니다. 환자 준수를 모니터링, 하위 치료 항 결핵 약물 농도 및 치료 실패의 중요한 예측, 또한 도전이다. 자체보고 준수는 리콜 편견과공급자를기쁘게하는 욕망에서 고통5,6. 알약 수 및 약물 치료 이벤트 모니터링 시스템 (MEMS)은 더객관적일 수 있지만 실제 약물 소비를 측정하지 는 않지만8,,9,,10. 바이오 매트릭스의 약물 수준은 준수 및 약물 동력학 데이터를 모두 제공할 수 있습니다. 따라서, 혈장 약물 수준은 일반적으로 치료 약물 모니터링에 사용된다 11,,12. 그러나 약물 준수 모니터링의 맥락에서, 플라즈마 수준은 단기 노출을 나타내며 적절한 준수 기준 범위를 결정할 때 상당한 환자 간 가변성에 의해 제한됩니다. "백색 코트" 효과는, 클리닉 또는 연구 방문 전에 순도가 향상되는 데, 정확한 약물 준수 패턴을 제공하는 혈장 수준의 능력을 더욱 복잡하게 한다13.

모발은 장기간 약물 노출을 측정할 수 있는 대체바이오매트릭스(14,,15)이다. 많은 약물과 내인성 대사 산물은 모발이 성장함에 따라 전신 순환에서 모발 단백질 매트릭스에 통합됩니다. 이 역동적 인 과정이 모발 성장 중에 계속됨에 따라 모발 매트릭스에 증착 된 약물의 양은 순환약물의 지속적인 존재에 따라 달라지므로 모발은 약물 섭취의 훌륭한 시간적 판독입니다. 바이오매트릭스로서의 모발은 혈액에 비해 저장 및 선적을 위한 콜드 체인없이 쉽게 수집할 수 있다는 추가적인 이점이 있다. 또한, 모발은 비생체 위험성이며, 이는 현장에서 추가적인 타당성 이점을 제공한다.

모발 약물 수준은 법의학 응용 프로그램16에서오랫동안 사용되어 왔습니다. 지난 10 년 동안, 머리 antiretroviral (ARV) 수준은 HIV 치료 및 예방에 약물 준수를 평가에 유틸리티를 입증했다, 이는 우리의 그룹이 기여하는. 모발의 ARV,수준은 HIV 감염17,18,,19,20,,21에서치료 결과의 가장 강력한 독립적 인 예측 변수로 나타났다., DR-TB 환자의 모발 수치가 치료 결과를 예측하는 데 동일한 유용성을 가질 지 여부를 결정하기 위해 LC-MS/MS를 사용하여 작은 모발 샘플에서 11개의 DR-TB 약물을 분석하는 방법을 개발하고 검증했습니다. 분석의 성과의 초기 평가로, 우리는 남아프리카 공화국 웨스턴 케이프에 있는 직접 관찰한 치료 (DOT)를 수신하는 DR-TB를 가진 환자의 편의 표본에 있는 DR-TB 약 수준을 측정했습니다22.

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Protocol

모든 환자는 모발 샘플 수집 전에 서면 으로 통보된 동의를 제공했습니다. 우리는 케이프 타운 대학과 캘리포니아 대학, 샌프란시스코에서 기관 검토 위원회의 승인을 얻었다.

1. 모발 샘플링

  1. 서면 으로 동의를 얻으십시오.
  2. 깨끗한 가위를 사용하여 후두 부위에서 약 20-30 개의 두피 모발 가닥을 가능한 한 두피에 가깝게 자른다.
  3. 방향성을 나타내기 위해 머리카락의 말단 주위에 테이프를 놓습니다. 모발 샘플을 알루미늄 호일 정사각형으로 접고 실온에서 보관하십시오. 모발의 말단에 라벨을 붙이면 근위쪽 끝의 추가 취급으로 인한 오염가능성을 방지합니다.
  4. 환자 샘플 외에도 결핵 약을 복용하지 않은 사람으로부터 두피 모발 샘플인 "빈 모발"을 수집합니다. 다량 (각 20 명의 환자 샘플에 대해 30 mg의 빈 머리카락)을 수집합니다.

2. 약물 추출

  1. 비드 튜브에 레이블을 지정합니다. 각 환자 샘플에는 하나의 튜브가 필요합니다. "C0"에서 "C11"까지 12개의 튜브를 레이블로 지정하고 각 12개의 교정 지점에 대해 하나씩 레이블을 지정합니다. 저품질 관리를 위한 튜브, 중간 품질 관리를 위한 튜브 및 고품질 관리를 위한 튜브에 라벨을 붙입니다. 마지막으로 매트릭스 블랭크에 대한 튜브에 레이블을 지정합니다.
  2. 모발 샘플이 들어 있는 알루미늄 호일 사각형을 엽니다. 모발 샘플이 3cm 이상인 경우, 근위쪽 끝에서 3cm로 머리를 자르고 그 근위 부분을 분석에 사용하십시오.
  3. 비드 튜브에 모발 샘플 2 mg의 무게를 달아 주세요.
  4. 16 개의 추가 비드 튜브에 2 mg의 빈 머리카락을 무게. 교정 지점, 품질 관리 및 매트릭스 블랭크로 사용됩니다. 관은 단계 2.8 및 2.9에 표시된 수준에서 약물 기준 표준으로 스파이크되는 것을 제외하고, 환자 견본과 동일한 추출 절차를 따를 것입니다.
  5. 모든 비드 튜브를 균질화에 넣습니다. 속도 6.95 m/s에서 동질화기를 실행.
  6. 내부 표준 믹스를 만들고 샘플에 추가합니다.
    1. 50 mL 부피 플라스크에 ~ 40 mL의 메탄올을 추가하십시오.
    2. 호박색 유리 바이알에서, 메탄올을 용매로 사용하여 표 1에나타낸 내부 표준을 혼합한다.
      참고 : 메탄올은 매우 휘발성입니다. 증발로 인한 손실을 방지하기 위해이 과정에서 모든 바이알을 덮어 둡니다.
    3. 이러한 혼합물에서 표 1에 표시된 볼륨을 50mL 체적 플라스크에 추가합니다. 그런 다음 플라스크를 메탄올로 50 mL로 채웁니다.
    4. 캡과 체적 플라스크를 혼합합니다. 매트릭스 블랭크 튜브를 제외하고, 각 분쇄된 모발 튜브에 혼합물의 500 μL을 첨가한다. 매트릭스 빈 튜브에 500 μL 메탄올을 추가합니다.
  7. 참조 표준 믹스를 만듭니다.
    1. 2.7.2단계에서 표에 나타낸 농도를 얻기 위해 메탄올과 함께 다음 약물의 깔끔한 기준 기준을 구성한다. 다음 농도의 1 mL만 필요합니다.
    2. 1768 μL의 메탄올을 바이알에 첨가한 다음 표 2에 나열된 기준 표준의 양을 동일한 바이알에 추가하여 최종 부피를 2mL로 얻습니다. 이 바이알 "Ref Std 믹스 1x"에 레이블을 지정합니다. 소용돌이.
    3. 스파이크 100 μL에서 "Ref Std Mix 1x"를 새로운 바이알에서 900 μL 메탄올로 넣습니다. 이 바이알 "Ref Std 믹스 10x"에 레이블을 지정합니다. 소용돌이.
    4. 스파이크 100 μL에서 "Ref Std Mix 10x"를 새로운 바이알에서 900 μL 메탄올로 넣습니다. 이 바이알 "Ref Std Mix 100x"에 레이블을 지정합니다. 소용돌이.
    5. "Ref Std Mix 100x"에서 900 μL 메탄올로 스파이크 100 μL을 새로운 바이알에 넣습니다. 이 바이알 "Ref Std Mix 1000x"에 레이블을 지정합니다. 소용돌이.
  8. 표 3에기재된 Ref Std Mix의 양을 추가하여 캘리브레이션 곡선 튜브를 스파이크합니다.
  9. QC 믹스를 생성하고 품질 관리 튜브를 스파이크합니다.
    1. "QC-E"를 통해 "QC-A"를 5개의 바이알에 표시합니다.
    2. 다음과 같은 양의 메탄올을 5개의 라벨이 붙은 바이알에 추가하십시오.
      QC-A: 990 μL
      QC-B: 940 μL
      QC-C: 950 μL
      QC-D: 980 μL
      QC-E: 950 μL
       
    3. 2.7.1단계에서 생성된 1 mg/mL 약물 주식을 사용하여 아래에 나열된 특정 바이알에 10 μL을 추가합니다. 0.5 mg/mL에 있는 BDQ 및 CLF 주식의 경우 아래에 나열된 바이알에 20 μL을 추가하십시오.
      QC-A: PTH
      QC-B: EMB, CLF, BDQ, PTM
      QC-C: INH, LFX, LZD, MFX, PZA
      QC-D: PTH, EMB
      QC-E: CLF, BDQ, PTM

      참고 : 일부 약물은 여러 믹스에 존재합니다.
    4. 바이알을 "QC-A df100"으로 레이블을 지정합니다. QC-A 10 μL을 990 μL 메탄올로 희석합니다.
    5. 바이알을 "낮은 QC 스톡"으로 레이블을 지정합니다. 이 바이알에 1832 μL 메탄올을 첨가하십시오. 아래에 자세히 설명된 QC 믹스의 양을 추가합니다.
      QC-A df100: 80 μL
      QC-B: 8 μL
      QC-C: 80 μL
       
    6. 바이알을 "미드 QC 스톡"으로 레이블을 지정합니다. 이 바이알에 760 μL 메탄올을 첨가하십시오. 아래에 자세히 설명된 QC 믹스의 양을 추가합니다.
      QC-A df100: 800 μL
      QC-B: 40 μL
      QC-C: 400 μL
       
    7. 바이알을 "높은 QC 스톡"으로 레이블을 지정합니다. 이 바이알에 1376 μL 메탄올을 첨가하십시오. 아래에 자세히 설명된 QC 믹스의 양을 추가합니다.
      QC-D: 160 μL
      QC-E: 320 μL
      MFX, 1mg/mL 재고: 16 μL
      INH, 1mg/mL 재고: 32 μL
      LFX, 1mg/mL 재고: 32 μL
      LZD, 1mg/mL 재고: 32 μL
      PZA, 1mg/mL 재고: 32 μL
       
    8. 스파이크 10 μL 낮은 QC 재고는 낮은 QC 비드 튜브에.
    9. 스파이크 10 μL 미드 QC 스톡을 미드 QC 비드 튜브에 넣습니다.
    10. 스파이크 10 μL 높은 QC 스톡을 높은 QC 비드 튜브에 넣습니다.
  10. 모든 튜브를 37°C에서 2시간 동안 핫 셰이커에 놓습니다. 흔들림은 물이 튜브에 튀지 않을 정도로 느려야합니다.
  11. 셰이커에서 튜브를 제거합니다. 비드 튜브에서 새로운 미세 원심 분리관으로 액체를 옮김. 이러한 미세 원심분리기 튜브에 같은 방법으로 라벨을 붙입니다.
  12. 오래된 튜브에 500 μL 메탄올을 추가합니다. 캡 과 소용돌이.
  13. 두 번째로 비드 튜브에서 액체를 해당 미세 원심 분리튜브로 옮김을 옮김으로 옮김을 전달합니다. 분쇄 된 머리카락을 옮기는 것은 괜찮습니다. 이것은 결국 원심 분리될 것입니다.
  14. 2,800 x g에서10 분 동안 미세 원심 분리튜브를 .
  15. 조심스럽게 액체를 제거하고 해당 라벨이있는 새로운 원심 분리튜브로 옮김을 옮김하십시오. 헤어 펠릿을 방해하거나 옮기지 않도록 주의하십시오.
  16. 원심분리기 튜브의 액체를 증발하여 32°C에서 건조시다.
  17. 건조 튜브에 200 μL의 이월 상 A (1% 포르믹산이있는 HPLC 등급의 물)를 추가하여 샘플을 재구성합니다. 소용돌이.
  18. 250 μL 인서트가 있는 앰버 바이알로 액체를 옮김.

3. LC-MS/MS 준비

  1. 1리터 의 체적 플라스크에 HPLC 등급의 물을 추가하여 1리터의 이머지 A(1% 포르믹산을 가진 HPLC 급 물)를 만듭니다. 그런 다음 10 mL의 >95% 포름산을 플라스크에 넣고 HPLC 등급의 물로 라인을 채웁니다.
    1. 1리터 부피 플라스크에 아세토니트릴을 추가하여 이머지 B(0.1% 포르믹산을 가진 아세트니트릴)의 1리터를 만드세요. 그런 다음 1 mL의 >95% 포름산을 플라스크에 넣고 아세토니트릴로 라인을 채웁니다.
  2. 2.5 μm 입자 크기와 100 Å 모공 크기의 2 x 100mm 컬럼을 기둥 구획에 다공성 실리카로 완전히 만든 극성 끝뚜껑, 에테르 연결 페닐 비드로 설치합니다. 열에도 제조업체권장 가드 카트리지가 설치되어 있는지 확인합니다.
  3. 데이터 수집 소프트웨어를 열고 하드웨어 구성을 두 번 클릭합니다. LCMS를 강조 표시하고 프로필 활성화를클릭합니다.
    1. 새 하위 프로젝트,또는 다른 하위 프로젝트가 이미 있는 경우 하위 프로젝트 복사를클릭합니다. 하위 프로젝트의 이름을 지정합니다.
    2. 새 문서를 클릭합니다. 두 번 클릭 수집 방법. 수집 메서드 창 에서 질량 스펙을 클릭합니다.
    3. 스캔 유형 드롭다운을 MRM(MRM)으로변경합니다. 극성이 양수로 Positive설정되어 있는지 확인합니다.
    4. 가져오기 목록을 클릭하고 보충 재질에 포함된 .csv 파일 MDR-TB LCMS 메서드 transitions.csv를 선택합니다.
    5. 아래로 스크롤하여 지속 시간을 16.751분으로 설정합니다. 적절한 사이클 시간 및 사이클 수가 자동으로 채워집니다.
    6. 왼쪽 사이드바에서 통합 발코 밸브를클릭합니다. 단계 0의 위치 이름이 A인지 확인합니다. 총 시간(min) 열에서 첫 번째 행의 0.4를 입력하고 두 번째 행에 13을 입력합니다.
    7. 위치 열에서 행을 B로 설정하고 행을 2를 A로 설정합니다.
    8. 왼쪽 사이드바에서 바이너리 펌프를 클릭합니다. 표 4에따라 그라데이션 및 유량 표를 설정합니다.
    9. 왼쪽 사이드바에서 자동 샘플러를 클릭합니다. 주입 량을 10 μL로 변경합니다. 온도 제어를 활성화하고 4 °C로 설정합니다.
    10. 왼쪽 사이드바에서 열 구획을 클릭합니다. 좌우 온도를 50°C로 설정합니다.
    11. 메서드를 닫고 저장합니다.
  4. 새 문서를 클릭하고 수집 일괄 처리를 선택하여 일괄 처리를만듭니다. 설정된 이름을 입력하고 드롭다운 표시줄에서 새로 만든 메서드를 선택합니다.
    1. 스프레드시트에서 교정 곡선, 품질 관리, 환자 샘플, 교정 곡선, 품질 관리, 환자 샘플, 교정 곡선, 교정 곡선, 품질 관리 등 이 순서를 따르는 일괄 처리를 만듭니다. 캘리브레이션 곡선, 품질 관리 및 환자 샘플 전후뿐만 아니라 실행의 시작과 끝에 용매 블랭크 주사를 추가합니다. 해석이이이이월을 줄이기 위해 교정 곡선과 고품질 관리 바이알을 주사한 후 적어도 8개의 용매 블랭크 주사를 넣습니다.
      참고: 컬럼 나이에 따라 더 많은 용매 블랭크 주사를 추가해야 할 수도 있습니다.
    2. 샘플 이름에 인접한 열에서 해당 바이알에 대한 적절한 자동 샘플러 위치를 입력합니다.
    3. 세트 추가를 클릭합니다. 팝업 창에서 일괄 처리의 샘플 수를 입력합니다.
    4. 샘플 이름과 바이알 위치를 스프레드시트에서 새로 만든 일괄 처리로 복사하여 붙여넣습니다.
    5. 제출 탭으로 이동합니다. Submit
  5. 이월상 A와 용매 라인 B에 용매 라인 A를 삽입하여 시스템을 평형화.
    1. 4 mL/min 유량에서 용매 조성을 50% B로 설정합니다. 바이너리 펌프를 켭니다.
    2. 5분 후, 0.3 mL/min로 흐름을 줄입니다. 누출 여부를 확인합니다.
    3. 소프트웨어에서 상단 도구 모음에서 평형을 누릅니다. 시간을 >5분으로 설정하고 확인을누릅니다.
    4. 계측기의 평형이 조정되면 창 오른쪽 하단에 있는 모듈이 녹색으로 나타납니다. 압력이 안정화되었는지 확인한 다음 시작 샘플을클릭하여 일괄 처리를 시작합니다.

4. 데이터 분석

  1. 일괄 처리가 완료된 후 정량 소프트웨어를 엽니다. 지팡이 아이콘을 클릭하여 새 결과 테이블을 만듭니다.
    1. 찾아보기를 클릭하여 해당 폴더로 이동한 다음 데이터 파일을 강조 표시하고 오른쪽 을 가리키는 화살표를 클릭하여 데이터를 선택한 영역으로 이동합니다. 다음을 클릭합니다.
    2. 새 메서드 만들기를 선택하고 새 을 클릭합니다. 입력 새 정량 메서드 이름 및 다음 저장을 누릅니다. Next
    3. 중간 보정 지점의 첫 번째 분사를 선택합니다. 다음을누릅니다.
    4. 눈금은 IS 열의 내부 표준의 모든 전환을 표시합니다.
    5. 참조 표준에 대한 수량자 전환의 경우 IS 이름 열에서 해당 IS를 선택합니다. 다음을 클릭합니다.
    6. 전환을 스크롤하여 자동으로 선택된 보존 시간이 정확한지 확인합니다. 가우시안 스무딩이 1.5로 설정되어 있는지 확인합니다. 다른 모든 기본 설정은 있는 상태로 유지될 수 있습니다(즉, 노이즈 백분율 100%, 기준 선 하위). 창 2.00 분, 피크 분할 2 점).
      참고: 원하는 경우 이 시점에서 자동 통합 매개변수를 수정합니다. 이러한 매개 변수는 악기 설정에 따라 변경되기 때문에, 우리는 여기에 우리의 포함하지 않았습니다.
    7. 마무리를 클릭하여 배치에 정량 메서드를 적용합니다.
  2. 크로마토그램을 보려면 왼쪽 상단을 클릭합니다피크 검토 버튼을 표시합니다. 왼쪽 사이드바를 사용하여 전환을 탐색합니다. 모든 정량자 전환의 각 주입을 스크롤하고 필요한 경우 올바른 피크를 수동으로 통합합니다.
    1. 피크를 수동으로 통합하려면 수동 통합 모드 활성화 버튼을 클릭하고 x 축 또는 y축을 따라 클릭하고 드래그하여 크로마토그램을 확대한 다음 한 기준선에서 다른 기준선으로 선을 그려 피크를 정의합니다. 그림 3은 두 개의 크로마토그램을 보여 주며, 하나는 INH를 가지고 있고, 따라서 수동으로 통합된 크로마토그램이고, 다른 하나는 INH가 없는 것을 나타낸다.
      참고: 모든 주사는 동일한 매개 변수를 사용하여 통합되어야 합니다. 피크 너비는 이러한 매개변수를 준수하기 위한 지침을 제공할 수 있지만 피크 너비가 다를 수 있습니다. 피크를 정량화하려면 보존 시간이 해당 분석물의 예상 보존 시간 중 ±0.15 분 이내여야 하며(기준 표준 피크에 의해 정의된 바와 같이), 정성적으로 예상 정량자 대 한 한정자 비율을 갖는 것으로 확인(그림 2와같이), 신호 대 잡음 비율이 10보다 큰 것으로 확인되어야 합니다.
  3. 샘플 유형 컬럼에서 캘리브레이션 곡선 주입(빈 교정 곡선 주입 제외)을 표준으로설정합니다. 품질 관리 주사를 품질 관리로 설정합니다. 나머지 주사를 알 수 없는것으로 둡니다.
    참고: 모든 전환에서 설정됩니다.
  4. 실제 농도 열에서 모든 교정 곡선 및 품질 관리 주사에 대해 표 5에 있는 농도를 입력합니다.
  5. 왼쪽 상단에서 두 번째를 클릭보정 곡선 버튼을 표시합니다. 회귀 버튼을 클릭합니다.
  6. 가중치 유형을 1/x로 설정하고 확인을누릅니다.
  7. 교정 곡선과 품질 관리 샘플을 검증하여 배치가 성공적으로 실행되었는지 확인합니다.
    1. 각 수량자 기준 전이(내부 표준 전환 아님)에 대해 각 교정 곡선 주입 정확도(정확도 열)를 살펴봅니다. 교정 점의 3분의 2 이상이 80-120% 이내의 정확도를 가져야 합니다.
    2. 예상 정확도를 훨씬 벗어난 교정 지점의 경우 사출이 이상값일 수 있습니다. 계산된 농도가 해당 바이알의 다른 두 주사에서 2개 이상의 표준 편차인 경우 이상값을 제외합니다. 각 크로마토그램 위에'찾을 수 없는 버튼'을 클릭합니다.
    3. 보정 곡선 위에 표시된 R 값이 >0.975인지 확인합니다.
    4. 모든 품질 관리 주사가 80-120% 이내에 정확도가 있는지 확인합니다.
  8. 위의 모든 조건이 충족되면 배치가 통과되고 샘플을 정량화할 수 있습니다. 도구 모음에서 편집을 클릭한 다음 전체 테이블 복사를클릭합니다. 스프레드시트에 테이블을 붙여넣습니다.
  9. 두 샘플 주사의 계산된 농도의 평균을 취하여 각 샘플의 보고된 농도를 결정합니다.

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Representative Results

모든 11 DR-TB 약물의 확인 된 수준을 가진 크로마토그램의 그림은 그림 1에나와 있습니다. 각 측정기와 컬럼을 사용할 때 각 측정기의 보존 시간이 변경될 수 있으므로 정확한 보존 시간은 개별적으로 결정해야 합니다.

캘리브레이터 중 하나(DR-TB 약물 기준로 스파이크된 빈 모발 샘플) 중 하나에 대한 특정 약물(이소니아지드, INH)에 대한 추출된 이온 크로마토그램(EIC)은 도 2에나타내었다. 정량자 및 한정자 전이는 정성적 약물의 존재를 확인하는 데 사용됩니다, 수량체의 영역과 한정자의 영역 사이의 비율은 샘플에 걸쳐 일정하게 유지로. 또한 내부 표준을 모니터링하여 각 샘플 주입이 정규화되도록 합니다.

데모를 위해 남아프리카 공화국 웨스턴 케이프에서 DR-TB 약물을 복용한 96명의 총 연구 집단 중 15개의 모발 샘플의 편의 샘플을 분석했습니다. 표 6은 각 측정체에 대해 측정된 가장 낮은 수준과 가장 높은 수준에서 DR-TB 약물의 대표적인 수준을 제시합니다. 15명의 참을성 있는 견본을 위한 데이터가 제출되더라도, 각 분석체는 각 환자가 DR-TB 약물의 다른 조합에 있기 때문에 보고된 15 수준이 없었습니다. 환자 중 누구도 프로티오나미드에 있지 않았으며, 단 한 명의 환자만이 프리토마니드를 복용하고 있었습니다.

Figure 1
그림 1. DR-TB 방법에서 11개의 골수의 피크를 보여주는 대표적인 크로마토그램의 그림(EMB= 에탐부톨; INH= 이조니아지드; PZA= 피라진아미드; ETH= 에티오나미드; PTH= 프로티오나미드; LFX= 레보플로사신; MFX= 목시플록사신; LZD= 라인졸리드; PTM= 프리토마니드; BDQ= 베다퀼린; CLF= 클로파지민). 각 어날수에 대한 방법의 민감도가 다르기 때문에, INH, LZD, LFX, MFX 및 LZD는 20 ng/mg 모발에서 스파이크되었고 BDQ, CLF, EMB, ETH, PTH 및 PTM은 2 ng/mg 모발에서 스파이크되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2. 20 ng/mg에서 교정 점 9(C9), 이소니아지드(INH)의 주입으로부터 추출된 이온 크로마토그램(EIC)을 추출하였다. 맨 위 EIC는 INH 수량자 전환(파란색, 레이블이 지정된 INH-2)과 INH 한정자 전환(빨간색, 레이블이 지정된 INH-3)을 모두 표시합니다. 하단 EIC는 INH를 정량화하는 데 사용되는 내부 표준(IS)인 INH-d4의 반응을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3. 정량 화 과정의 스크린 샷. 상단 부분은 12개의 교정 포인트(라벨이 부착된 C0-C11), 3개의 QC 수준 및 6개의 샘플에 걸쳐 하나의 분석물(INH, isoniazid)에 대한 주입 데이터를 보여주는 부분 샘플 목록입니다. 왼쪽 아래 부분은 0.5 ng/mg -100 ng/mg에 이르는 보정 곡선입니다. 투명한 파란색 사각형은 품질 관리 지점입니다. R-값은 왼쪽 위(0.99722)에 가중치가 1/x로 표시됩니다. 오른쪽 하단에 있는 두 개의 크로마토그램은 INH(상부 크로마토그램)와 INH(하단 크로마토그램)가 없는 샘플을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

각 믹스의 약물 혼합된 각 약물의 농도 50mL vol. 플라스크에 추가된 혼합 량
믹스 1: CLF-d7, EMB-d4 10 μg/mL 40 μL
믹스 2: LFX-d8, PTH-d5 10 μg/mL 10 μL
믹스 3: BDQ-d6, LZD-d3, MFX 13C-d3, OPC (PTM용 IS) 10 μg/mL 20 μL
믹스 4: PZA 15N-d3 10 μg/mL 200 μL
믹스 5: INH-d4 10 μg/mL 100 μL

표 1. 50 mL 체적 플라스크에 추가하는 각 내부 표준의 농도 및 양.

약물 재고 농도 볼륨 추가
BDQ 0.5 mg/mL 8 μL
CLF 0.5 mg/mL 8 μL
Emb 1 mg/mL 4 μL
Pth 1 mg/mL 4 μL
Ptm 1 mg/mL 4 μL
인 (동안) 1 mg/mL 40 μL
LFX 1 mg/mL 40 μL
LZD 1 mg/mL 40 μL
MFX 1 mg/mL 40 μL
PZA 1 mg/mL 40 μL

표 2. "Ref Std Mix 1" 바이알에 첨가하는 각 약물 기준 표준의 양.

레이블 이름 바이알에서 가져온 볼륨 추가
C0 (주) 해당/A 0 μL
C1 참조 Std 믹스 df1000 5 μL
C2 참조 Std 믹스 df1000 10 μL
C3 참조 Std 믹스 df1000 20 μL
C4 참조 Std 믹스 df100 5 μL
C5 참조 Std 믹스 df100 10 μL
C6 참조 Std 믹스 df100 20 μL
C7 참조 Std 믹스 df10 5 μL
C8 참조 Std 믹스 df10 10 μL
C9 참조 Std 믹스 df10 20 μL
C10 참조 Std 믹스 df1 5 μL
C11 참조 Std 믹스 df1 10 μL

표 3. 12개의 보정 포인트에 추가할 각 Ref Std 혼합 중간량.

총 시간(최소) 유량(μL/min) A (%) B (%)
0 450 95 5
0.3 450 95 5
2.3 450 0 100
5 550 0 100
11 550 0 100
11.1 550 95 5
13 450 95 5
16.75 450 95 5

표 4. 각 사출에 사용되는 유량 및 이월 구배.

교정 점 BDQ, CLF, ETH, EMB, PTH, PTM(ng/mg)의 실제 농도 INH, LFX, LZD, MFX, PZA (ng/mg)의 실제 농도
C0 (주) 0 0
C1 0.005 0.05
C2 0.01 0.1
C3 0.02 0.2
C4 0.05 0.5
C5 0.1 1
C6 0.2 2
C7 0.5 5
C8 1 10
C9 2 20
C10 5 50
C11 10 100

표 5. 각 교정 지점에서 최종 타액 농도.

약물 Lod
(ng/mg 머리)
LLOQ
(ng/mg 머리)
울로크 (미국)
(ng/mg 머리)
샘플 값(ng/mg 모발)
샘플: UC-04, UC-08, UC-11, UC-16, UC-25, UC-36, UC-69, UC-83, UC-89, UC-90, UC-91, UC-104, UC-105, UC-108, UC-109
베다퀼린 0.005 0.05 10 0.21, 0.38, 0.56, 0.86, 0.90, 1.04, 1.29, 2.15, 2.29, 5.64
클로파지민 0.005 0.05 10 0.37, 0.61, 1.84, 2.20, 2.90, 3.41, 3.90, 6.03, 8.25, 10.66, 11.01
에탐부톨 0.005 0.05 10 0.04, 0.05, 0.25, 0.42, 0.43, 0.5, 0.68, 0.92, 0.95, 1.01, 1.53, 1.54, 9.76
에티오나미드 0.01 0.01 10
이세니아지드 주 0.05 0.5 100
레보플로사신 0.1 0.5 100 8.01, 8.42, 15.37, 24.41, 39.45, 42.12, 56.15, 75.58, 119.96
라인졸리드 0.1 0.5 100 0.87, 1.09, 3.51, 5.51, 7.80, 9.21, 15.68, 18.32, 19.13, 21.22
목시플록사신 0.05 0.5 100 0.35, 0.49, 1.58, 1.59, 6.23, 7.06, 13.14, 17.37, 21.72, 55.88, 86.64
프리토마니드 0.005 0.05 10 0.57
프로티오나미드 0.002 0.01 10
피라진아미드 0.05 1 100 1.14, 1.74, 1.86, 3.21, 5.94, 11.39, 12.36, 12.71, 12.85, 14.38, 16.13, 44.17, 69.66

표 6. DOT하에서 DR-TB 약물을 복용한 15명의 환자에서 측정된 약물의 대표적인 수준. 각 약물에 대한 검출 한계(LOD), 하한정(LLOQ) 및 각 약물에 대한 방법의 정량화 상한(ULOQ)이 비교를 위해 주어진다.

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Discussion

우리는 LC-MS/MS를 사용하여 작은 모발 샘플에서 DR-TB 치료에 활용된 11가지 항결핵 약물을 정량화하기 위해 개발하고 검증한 방법에 대한 프로토콜을 여기에서 보고합니다. 모발에 있는 이 11개의 약을 정량화하는 그밖 방법은 이전에 개발되고, 검증되고 간행되었습니다. 우리의 방법은 약 3 센티미터 (cm)의 약 20-30 머리 가닥에서 약물의 하위 나노 그램 수준을 정량화 할 수 있으며 이미22mg이 검증되었습니다. 분석된 머리의 낮은 무게는 연구 결과에 관련시킨 환자가 대머리 두피를 노출의 두려움 없이 반복 시험을 위해 신중하게 잠재적으로 돌아올 수 있다는 것을 의미합니다. 우리는 이전에 머리와 DR 처리 결과에 있는 DR-TB 약 수준 사이 협회에 데이터를 간행했습니다23. 따라서, 이러한 다중-매해 패널 방법의 개발 및 검증은 DR-TB 치료 약물 모니터링 분야에서 상당한 진전을 나타낸다.

모발에는 액체 바이오 매트릭스에 필요한 것과 는 다른 균질화 기술이 필요합니다. 모발 가닥의 분쇄를 통해 모발 매트릭스에서 분석된 추출 용매에 효율적으로 접근할 수 있었습니다. 따라서, 우리의 방법의 한 가지 중요한 특징은 분쇄 된 샘플을 사용하여 모발에서 약물의 빠르고 쉬운 추출 과정입니다. 추출 과정 동안 의 배양 시간은 분쇄 된 모발의 큰 접근 가능한 표면적으로 인해 2 시간이며, 작은 샘플 크기 (2 mg)로 인해 정리 단계가 없습니다. 그러나 추출 과정에서 약물 분해를 제한하기 위해 주의를 기울여야 합니다. 이 프로토콜은 사이클 사이에 45초의 냉각 기간을 가진 2주기 분쇄를 사용합니다. 이 과정은 과열을 방지하고 잠재적으로 머리에 약물을 저하.

남용 약물에 대한 많은 모발 분석과는 달리,이 방법은 세척 단계를 사용하지 않습니다. DR-TB 약물은 캡슐 또는 태블릿 형태로 제공되어 외부 오염의 가능한 원인을 제한하고 분석 전에 모발을 씻어야 합니다. 향후 연구는 외부 오염을 평가하기 위해 DR-TB 환자 모발의 세척 용매를 분석할 수 있습니다.

모발 분쇄는 효율적인 약물 추출을 촉진하지만, 그 자체의 한계가 있습니다. 우리의 실험실은 머리가 구슬 ruptor에서 분쇄하고 실온에서 방치하는 경우에, 11의 약의 몇몇의 사격량이 주 및 달에 걸쳐 감소한다는 것을 것을을 발견했습니다. 이는 산화 및 기타 분해 반응을 촉진할 수 있는 대기에 노출된 분쇄된 모발의 넓은 표면적 때문일 수 있다. 모발에 있는 약의 안정성 연구가 요구되는 경우에, 머리는 <1 cm의 작은 세그먼트로 가위로 절단될 수 있고, 손으로 균질화되고, 그 때 안정성 연구 도중 몇 주 또는 달 동안 실온에서 방치될 수 있습니다. 이 절단 된 머리카락이 분석 당일에 분쇄 될 때, 우리는 시간이 지남에 따라 중요한 약물 저하를 관찰하지 않았습니다. 따라서 설명된 프로토콜을 수행할 때 추출된 날에 머리카락을 분쇄하는 것이 좋습니다. 마찬가지로, 10 μg/mL 농도 이하의 모든 약물 혼합물은 추출 당일에 준비되어야 합니다.

이전에 발표된 방법은 다중 해석기 방법에서 각 결핵 약물에 대해 확립된 선형 동적 범위(LLOQ-ULOQ)의 적합성을 평가하기 위해 사용할 수 없습니다. 그러나 남아프리카 공화국 웨스턴 케이프에서 모발 샘플의 편의 샘플은이 방법의 선형 동적 범위의 적합성을 나타냅니다. 에티오나미드, 프리토마니드 및 프로티오미드를 제외하고, 이 환자에서 측정한 약물 수준의 95% 이상이 각 측정물의 선형 동적 범위 내에 있습니다. 오직 한 명의 환자만이 프리토마니드(검출됨)를 복용하고 있었고, 어떤 환자도 프로티오나미드를 복용하지 않았습니다. 에티오아마이드의 경우, LOD가 0.01 ng/mg 모발(또는 10 pg/mg 모발)이기 때문에 약물이 모발 매트릭스에 잘 증착되지 않을 수 있다는 가설을 세우고, 에티오아마이드를 복용한 8명의 환자 중 한 명만이 0.02 ng/mg 모발보다 높은 수치를 가지고 있습니다. 추가 검사는 머리에 있는 다른 결핵 약의 약동학을 결정하기 위하여 보증됩니다. 예를 들어, 에티오아마이드와 같은 약물을 모니터링하기 위한 잠재적대안은 대사산물을 대신 표적화하는 방법을 개발하는 것이다. 우리는 delamanid, 이 위원회의 처음에 부분인 새로운 DR-TB 약물에 대한 유사한 관찰을 했습니다. 대사 산물은 부모 약 보다는 더 높은 농도에서 발견되기 때문에 delamanid의 대사 산물을 표적으로 하는 방법은 현재 우리의 실험실에서 검증되는 과정에 있습니다. 에티오아마이드에 대해동일한 절차를 수행 할 수 있습니다. 표 6의 약물 농도는 개별적인 결과 및 임상 결과가 이 방법 논문의 초점이 아니기 때문에 그룹으로 제시된다. 환자의 이 단의 개별적인 평가는 다른 곳에간행되었습니다 23.

데모 연구를 위한 작은 머리 견본을 기여하는 환자는 입원 환자 조정에 있는 DOT를 통해 다양한 약 식이요법을 관리되고, 모든 식이요법은 입원 기간 도중 간호 기록에 따라 문서화되었습니다. 그러나, DR-TB 환자 중 일반적인, 이전, 잘못 문서화 된 약물 처방 또한 그들의 입원 환자 체류 전에 관리 했다. 이것은 그들의 입원 환자 기록에 기록되지 않은 참을성 있는 머리에 있는 약의 탐지로 이끌어 냈습니다. 따라서 이러한 샘플이 실제로 거짓 긍정인지 확인할 수 없으므로 이러한 샘플을 사용하여 메서드의 특이성을 확인할 수 없습니다. 대신, 우리는 DR-TB 약물을 복용하지 않은 환자에서 모발을 테스트했습니다. 이 샘플에서 DR-TB 약물이 검출되지 않았으며, 이는 방법이 구체적임을 나타냅니다.

우리의 방법은 DR-TB 약물을 측정에 머리를 사용하는 유틸리티를 보여 주지만, 머리 분석은 한계의 자신의 세트가있다. 모발은 고체 매트릭스이기 때문에, 방법 검증 중에 약물 기준 표준의 급증은 소변과 혈액과 같이 매트릭스에 표준의 완전한 통합을 허용하지 않습니다. 따라서, 회수 평가는 매트릭스로부터의 실제 검색이 아닌 고체 매트릭스 상에 스파이크후 약물의 검출에 제한된다. 마찬가지로, 머리는 여전히 테스트를 위해 탐구되고있는 대체 매트릭스이기 때문에, 약물에 대한 쉽게 사용할 수있는 참조 범위는 방법 적합성을 평가하기 위해 사용할 수 없습니다. 모발에 약물을 혼입시키는 방법에 대한 더 많은 약물 동태학적 연구는 순응도 모니터링에서 모발 약물 수준의 유용성을 더 이해하는 데 유용할 것입니다. 마지막으로, 현장 현장에서 모발 샘플의 적절한 수집에는 고유한 문제가 있습니다. 모발 샘플의 수집 및 저장은 다른 바이오 매트릭스보다 적은 자원을 필요로하지만, 2cm 보다 긴 모든 모발 가닥의 말단과 근위 끝을 식별하기 위해주의를 기울여야합니다. 적절한 라벨링을 통해 가닥의 특정 세그먼트를 분석할 수 있습니다. 우리의 방법의 경우, 두피에 가장 가까운 머리의 3 센티미터는 약물 준수에 대한 가장 최근의 데이터를 결정하는 데 사용되었다. 적절한 라벨링을 위해서는 현장에서의 교육 및 품질 보증 절차가 필요합니다.

요약하자면, 우리는 작은 모발 샘플에서 LC-MS/MS를 통해 DR-TB에 사용되는 결핵 약물을 분석하기 위한 최초의 다중 분석패널을 개발했습니다. 자원 제한 설정에서 모발을 수집하고 저장하는 가능성을 감안할 때, 우리의 방법은 결핵 치료 약물 모니터링 분야에서 잠재적으로 중요한 진보를 나타냅니다. 준수 및 개별 약물 동태성 가변성을 모두 고려한 약물 노출의 객관적인 척도는 비효과적인 치료 요법의 조기 표시를 제공할 수 있으며, 이로 인해 개별 치료뿐만 아니라 DR-TB24의지역 사회 전달을 제한할 수 있습니다.

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Disclosures

이 작품은 국립 알레르기 및 전염병 연구소 RO1 AI123024 (공동 파이 : 존 멧칼프와 모니카 간디)에 의해 지원되었다.

Acknowledgments

저자는 케이프 타운 폐 연구소의 대학에서 키에르탄 Dheda 교수, 알리 에스마일 박사, 마리에지 프레토리우스 에게 감사하고 싶습니다 연구를위한 모발 샘플의 수집을 촉진. 저자는 이 연구 참가자들의 기여를 더욱 감사하게 인정한다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 mL injection vials Agilent Technologies 5182-0716
250 uL injection vial inserts Agilent Technologies 5181-8872
Bead ruptor 24 OMNI International 19001
Bead ruptor tubes (2 mL bead kit, 2.8mm ceramic, 2 mL microtubes) OMNI International 19628
Bedaquiline Toronto Research Chemicals B119550
Bedaquiline-d6 Toronto Research Chemicals B119552
Clofazimine Toronto Research Chemicals C324300
Clofazimine-d7 Toronto Research Chemicals C324302
Disposable lime glass culture tubes VWR 60825-425
Ethambutol Toronto Research Chemicals E889800
Ethambutol-d4 Toronto Research Chemicals E889802
Ethionamide Toronto Research Chemicals E890420
Ethionamide-d5 ClearSynth CS-O-06597
Formic acid Sigma-Aldrich F0507-100mL
Glass bottles Corning 1395-1L
Hot Shaker Bellco Glass Inc 7746-32110
HPLC Agilent Technologies Infinity 1260
HPLC grade acetonitrile Honeywell 015-4
HPLC grade methanol Honeywell 230-1L
HPLC grade water Aqua Solutions Inc W1089-4L
Isoniazid Toronto Research Chemicals I821450
Isoniazid-d4 Toronto Research Chemicals I821452
LC column, Synergi 2.5 um Polar RP 100 A 100 x 2 mm Phenomenex 00D-4371-B0
LC guard cartridge Phenomenex AJ0-8788
LC guard cartridge holder Phenomenex AJ0-9000
LC-MS/MS quantitation software Sciex Multiquant 2.1
Levofloxacin Sigma-Aldrich 1362103-200MG
Levofloxacin-d8 Toronto Research Chemicals L360002
Linezolid Toronto Research Chemicals L466500
Linezolid-d3 Toronto Research Chemicals L466502
Micro centrifuge tubes E&K Scientific 695554
Moxifloxacin Toronto Research Chemicals M745000
Moxifloxacin-13C, d3 Toronto Research Chemicals M745003
MS/MS Sciex Triple Quad 5500
OPC 14714 Toronto Research Chemicals O667600
Pretomanid (PA-824) Toronto Research Chemicals P122500
Prothionamide Toronto Research Chemicals P839100
Prothionamide-d5 Toronto Research Chemicals P839102
Pyrazinamide Toronto Research Chemicals P840600
Pyrazinamide-15N, d3 Toronto Research Chemicals P840602
Septum caps for injection vials Agilent Technologies 5185-5862
Turbovap LV evaporator Biotage 103198/11

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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