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Livraison intra-artérielle de cellules souches neuronales au cerveau du rat et de la souris : application à l’ischémie cérébrale

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Neuroscience

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Summary

Une méthode pour fournir des cellules souches neurales, adaptable pour injecter des solutions ou des suspensions, par l’artère carotide commune (souris) ou l’artère carotide externe (rat) après un AVC ischémique est rapporté. Les cellules injectées sont réparties largement dans tout le parenchyme cérébral et peuvent être détectées jusqu’à 30 d après l’accouchement.

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Zhang, B., Joseph, B., Saatman, K. E., Chen, L. Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia. J. Vis. Exp. (160), e61119, doi:10.3791/61119 (2020).

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Abstract

La thérapie à base de cellules souches neuronales est un nouveau traitement novateur pour les accidents vasculaires cérébraux, les lésions cérébrales traumatiques et les troubles neurodégénératifs. Par rapport à la livraison intracrânienne, l’administration intra-artérielle des NSC est moins invasive et produit une distribution plus diffuse des NSC dans le parenchyme cérébral. En outre, la livraison intra-artérielle permet l’effet de première passe dans la circulation du cerveau, réduisant le potentiel de piégeage des cellules dans les organes périphériques, tels que le foie et la rate, une complication associée aux injections périphériques. Ici, nous détaillons la méthodologie, chez les souris et les rats, pour la livraison des NSC par l’artère carotide commune (souris) ou l’artère carotide externe (rat) à l’hémisphère ipsilateral après un accident vasculaire cérébral ischémique. À l’aide de NSC étiquetés GFP, nous illustrons la distribution généralisée réalisée dans tout l’hémisphère ipsilateral des rongeurs à 1 d, 1 semaine et 4 semaines après l’accouchement postischemique, avec une densité plus élevée dans ou près du site de blessures ischémiques. En plus de la survie à long terme, nous montrons des preuves de différenciation des cellules étiquetées GFP à 4 semaines. L’approche de livraison intra-artérielle décrite ici pour les NSC peut également être utilisée pour l’administration de composés thérapeutiques, et a donc une large applicabilité aux diverses lésions du SNC et les modèles de maladies chez plusieurs espèces.

Introduction

La thérapie à base de cellules souches (SC) offre un potentiel énorme en tant que traitement des maladies neurologiques, y compris les accidents vasculaires cérébraux, les traumatismes crâniens et la démence1,2,3,4,5,6. Cependant, une méthode efficace pour fournir des SC exogènes au cerveau malade reste problématique2,6,7,8,9,10,11,12,13. Les SC délivrés par voie d’accouchement périphérique, y compris l’injection intraveineuse (IV) ou intrapéritoneal (IP), sont soumis à un filtrage de première passe dans la microcirculation, en particulier dans le poumon, le foie, la rate et les muscles8,9,13,14, augmentant les chances d’accumulation de cellules dans les zones non ciblées. La méthode invasive d’injection intracérébrale entraîne des lésions localisées des tissus cérébraux et une distribution très restreinte des SC près du site d’injection2,6,8,14,15,16. Nous avons récemment établi une méthode d’injection intra-artérielle basée sur le cathéter pour fournir des SC neuronaux exogènes (NSC), qui est décrit ici appliqué dans un modèle de rongeur de course ischémique focale. Nous indussons transitoire (1 h) des dommages d’ischémie-reperfusion dans un hémisphère utilisant un filament enduit de caoutchouc de silicone pour occluser l’artère cérébrale moyenne gauche (MCA) dans la souris ou le rat17,18,19. Dans ce modèle, nous avons reproductiblement observé environ 75-85% dépression du flux sanguin cérébral (CBF) dans l’hémisphère ipsilateral avec Laser Doppler ou Laser speckle image image17,19, produisant des déficits neurologiques cohérents17,18,19.

Pour gagner du temps, la vidéo est réglée pour jouer à deux fois la vitesse normale et les procédures chirurgicales de routine telles que la préparation de la peau et la fermeture des plaies avec suture et l’utilisation et l’installation de la pompe à seringues motorisées ne sont pas présentés. La méthode de l’administration intra-artérielle des NSC est démontrée dans le contexte du modèle d’occlusion cérébrale moyenne (MCAO) de course expérimentale chez les rongeurs. Par conséquent, nous incluons la procédure transitoire d’AVC ischémique afin de démontrer plus tard comment la deuxième chirurgie, l’injection intra-artérielle, est exécutée utilisant le site chirurgical précédent sur le même animal. La faisabilité de l’administration intra-artérielle de la CSN dans les modèles d’AVC de rongeurs est démontrée par l’évaluation de la distribution et de la survie des NSC exogènes. L’efficacité de la thérapie de NSC pour atténuer la pathologie de cerveau et le dysfonctionnement neurologique sera rapportée séparément.

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Protocol

Toutes les procédures sur les sujets animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université du Kentucky, et des précautions appropriées ont été prises pour minimiser le stress ou la douleur associés à la chirurgie.

1. Préparation de cathéters d’injection et de crochets chirurgicaux

  1. Construire le cathéter d’injection (figure 1). Recueillir les matériaux nécessaires, y compris: MRE010, MRE025, et MRE050 tubes, 20 G, 26 G et 27 G aiguilles d’injection (Figure 2A), 600 papier de verre de gravier, superglue et deux composants 5 minutes époxy.
    1. Couper 20 G et 26 G d’aiguilles à 1 cm du moyeu d’aiguille et polir l’extrémité sur du papier de verre (figure 2B). Rincer les aiguilles avec 10 mL d’eau double distillée pour nettoyer l’alésage de l’aiguille.
      REMARQUE : Deux modèles différents (figure 1) sont utilisés. Design 1 a un connecteur unique et est utilisé pour l’injection de solutions ou de suspensions. Design 2 dispose de connecteurs de verrouillage Luer de 20 G et 26 G pour l’injection de cellules (aiguille de 20 G) et de la chasse d’eau du volume mort (aiguille de 26 G) pour assurer la livraison du volume complet de solution contenant le CNS.
  2. Conception 1 : Insérez un cathéter MRE010 de 3 à 4 cm de longueur dans un cathéter MRE025 de 15 cm de longueur et fixe avec de la superglue.
    1. Connectez l’autre extrémité du tube MRE025 à un segment de cathéter MRE050, et fixez-vous avec de la superglue. Insérez une aiguille de 20 G émoussée dans l’extrémité restante du cathéter MRE050 et fixez-les avec de la superglue (figure 1).
    2. Renforcer davantage les sites de connexion avec de la colle époxy. Cette conception de cathéter est optimale pour l’injection de réactifs (comme les solutions chimiques ou pharmaceutiques ou d’autres produits biologiques tels que les cytokines).
  3. Conception 2 : Insérez un cathéter MRE010 de 3 à 4 cm de longueur dans un cathéter MRE025 de 15 cm de longueur et fixe avec de la superglue.
    1. Connectez l’autre extrémité du tube MRE025 à un segment de cathéter MRE050, et fixez-vous avec de la superglue. Insérez une aiguille de 20 G émoussée dans l’extrémité restante du cathéter MRE050 et fixez-les avec de la superglue.
    2. Insérez une aiguille de 26 G émoussée dans le tube MRE050 près de l’extrémité de la première aiguille, suivant la direction du flux d’injection, et fixez-vous avec de la superglue (figure 1 et figure 2C). Renforcer les deux aiguilles et le segment du tube MRE050 avec de l’époxy clair (figure 2C). Cette conception permet l’injection de solution de véhicule par l’aiguille 2 (26 G) après l’injection de NSC par l’aiguille 1 (20 G) pour rincer le volume mort dans le cathéter dans la circulation du cerveau, obtenant un contrôle plus précis des volumes d’injection.
    3. Utiliser une aiguille de 20 G pour l’injection de la CSN afin de minimiser les dommages causés aux CSN, ce qui pourrait nuire à la viabilité.
  4. Après la construction, rincer les cathéters avec 10 mL d’eau double distillée, suivie de 70% d’éthanol, puis les tremper dans 70% d’éthanol pendant la nuit.
  5. Avant la chirurgie, retirez les cathéters de 70 % d’éthanol et rincez-les avec 10 mL de PBS stérile, et placez-les dans une boîte à outils chirurgicale autoclaved pour le stockage et le transport.
  6. Préparation des crochets chirurgicaux
    1. Couper un arbre d’aiguille de 1,5 à 2 cm de long à partir d’une aiguille de 27 G et polir les deux extrémités sur du papier de verre jusqu’à ce qu’il soit terne. Ensuite, utilisez une petite pince hémostatique pour plier l’arbre dans un crochet à une extrémité et une forme d’anneau à l’autre extrémité.
    2. Insérez un cathéter MRE025 de 10 à 15 cm de long à travers l’anneau et fixez-les à l’aide d’un ruban chirurgical transparent (figure 2D). Faire 2 crochets de plus en utilisant la même méthode.
    3. Tremper tous les crochets et les systèmes de cathéter dans 70% d’éthanol jusqu’à ce qu’ils soient utilisés.

2. Préparation des animaux : Livraison, logement, adaptation à l’environnement

  1. Des souris C57BL/6 mâles et femelles (10-12 semaines, n=10/point de temps) et des rats Wistar (10-12 semaines, n=10) ont été utilisées dans cette étude.
  2. Les loger dans un vivarium animal contrôlé par l’environnement avec de la nourriture et de l’eau ad libitum.
  3. Permettez-leur de s’adapter à l’environnement au moins 1 semaine avant la chirurgie de l’AVC.
    NOTE : Une souris et un rat sont morts à 1 d après chirurgie d’AVC et une souris a été euthanasiée à 3 d après l’avc avant l’injection de NSC pour des raisons humaines en raison de la paralysie grave.

3. Culture des cellules souches neurales de souris et de rats (NSCs)

REMARQUE : Les CNS ont été isolés et cultivés selon un protocoleétabli 20.

  1. Souris
    1. Isoler le type sauvage (WT) et les NSC étiquetés GFP du cortex embryonnaire E18 à partir de souris femelles C57BL/6 de grossesse chronométrée accouplées à des souris mâles GFP-positives (B6 ACTb-EGFP). Pour identifier les embryons de GFP (+), observez les embryons récoltés à l’aide du canal FITC. Les embryons de GFP (+) donnent un signal de fluorescence vert tandis que les embryons WT ne présentent qu’une faible autofluorescence (figure 3A).
  2. Rat
    1. Isoler les NSC de la zone subventriculaire (SVZ) des jeunes rats adultes WT. Étiquetez-les avec diI juste avant l’injection suivant les instructions du fabricant21.
  3. Culture souris ou rat NSCs jusqu’à ce qu’ils se développent en neurosphères, et les passer lorsque le diamètre de la sphère atteint environ 100 μm (Figure 3B). Utilisez les NSC pour l’injection entre les passages 3 et 5.
  4. Vérifiez leurs propriétés de cellules souches à l’aide d’un panneau de marqueurs de cellules souches embryonnaires (Figure 3C).
  5. Le jour de l’injection, recueillir les sphères de NSC et se dissocier avec la solution de détachement cellulaire, suspendre dans pbs sans calcium et magnésium à une concentration de 107 cellules/mL, et placer sur la glace humide jusqu’à l’injection.

4. Préparation chirurgicale

  1. Avant la chirurgie, marquez un point sur la suture commerciale mcao avec un stylo marqueur argenté à 9 mm (pour la souris) ou 15 mm (pour le rat) de la pointe pour la référence en chirurgie de la longueur d’insertion. Autoclavez les outils chirurgicaux (ciseaux, forceps) et les instruments avant chaque chirurgie, et la chaleur les stériliser dans un stérilisateur de perles de verre entre les opérations.
  2. Induire l’anesthésie chez les animaux avec 5% d’isoflurane par inhalation et maintenir l’anesthésie avec 1-2% isoflurane. Évaluer la profondeur de l’anesthésie par l’observation des conditions générales (modèle de respiration, mouvement de moustache, et posture spontanée de correction de corps), réflexe cornéen et réponse à la pince d’orteil.
  3. Déposer la supination animale sur un coussin chauffant et préparer le site chirurgical sur l’animal en coupant et en frottant avec une solution de bétadine suivie de 70 % d’éthanol. Protégez les yeux de l’animal contre le séchage en appliquant de l’onguent ophtalmologique (p. ex., onguent artificiel de déchirure) pendant la chirurgie.
  4. Demandez aux chirurgiens de se frotter soigneusement les mains avec un gommage bactériocidal et de porter un masque, des gants stériles et un manteau de laboratoire propre.

5. Chirurgie de l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (MCAO)

REMARQUE : Les chirurgies pour induire un ACCIDENT VASCULAIRE CÉRÉBRAL ischémique dans un hémisphère de souris ou de rat sont semblables en ce qu’une suture est introduite dans l’artère carotide interne (ICA) pour occluser le flux sanguin (Figure 4)17,18,19,22. Cependant, l’artère choisie pour l’insertion de suture diffère en fonction de l’espace d’opération disponible requis pour l’injection ultérieure de cellules souches. Le rat a suffisamment d’espace dans le segment externe de l’artère carotide (ECA) pour permettre deux chirurgies distinctes et séquentielles (avc et injection de NSC), mais la souris ne le fait pas, nécessitant une approche alternative. Des changements de flux sanguins cérébraux induits par l’AVC, la taille infarctus du cerveau et des déficits neurologiques ont été rapportés comme dans les rapports précédents des auteurs17,18,19.

  1. Pour induire un AVC ischémique, commencez les chirurgies de souris et de rat avec une incision médiane sur la région cervicale, et l’isolement de l’artère carotide commune gauche (CCA), ECA et ICA (Figure 4). Faites preuve de prudence pour ne pas étirer, déplacer ou presser le CCA ou le nerf vague. Puisque la sélection des étapes d’artère et chirurgicales sont différentes par la suite, la chirurgie de MCAO sur la souris et le rat sera décrite séparément.
  2. Chirurgie mcao sur la souris (Figure 4A)
    1. Placez trois sutures en nylon tressées de 6 à 0 sous le CCA(figure 4A, étape 1) et faites un nœud chirurgical serré pour occluser le navire aussi loin que possible de la bifurcation à l’aide de la corde proximale (figure 4A, étape 2). Couper les extrémités de suture.
    2. Faire un slipknot du côté distal du CCA (attention : ne pas trop serrer car il sera libéré à l’étape 6) et un slipknot lâche entre les deux noeuds serrés(figure 4A, étape 2).
    3. Couper une petite incision (~ 1/4 - 1/3 de la circonférence) près du nœud proximal sur le CCA avec des microscisseurs(figure 4A, étape 3), et insérer soigneusement la suture commerciale en silicone en silicone 7-0 en nylon solide(figure 4A, étape 4). Fixer cette suture avec la corde du milieu, en se resserrant suffisamment (figure 4A, étape 5) pour assurer aucune fuite de sang de l’incision et aucun mouvement du filament de nylon en caoutchouc de silicone par le flux arrière de l’ICA, tout en permettant l’avancement de la suture vers l’ECA avec une poussée douce par les pinces.
    4. Relâchez le slipknot supérieur (distal)(figure 4A, étape 6) et avancez la suture de nylon dans l’ICA jusqu’à ce que sa pointe passe la bifurcation de 9 mm (en utilisant le marqueur d’argent sur la suture comme référence). Serrez les deux slipknots supérieurs pour fixer la suture et prévenir le flux sanguin.
    5. Retirez le filament 1 h plus tard (figure 4A,étape 7) et ligoter le CCA en utilisant le nœud central pour prévenir les saignements (figure 4A, étapes 5-7 dans l’ordre inverse, résultats finaux vus à l’étape 8). Relâchez le nœud supérieur. Fermez la plaie avec une suture chirurgicale de 4-0.
  3. Chirurgie mcao sur le rat (Figure 4B)
    1. Placez deux sutures en nylon tressées 6-0 sous la CEA (figure 4B, étape 1) et faites un nœud serré à l’extrémité distale autant que possible (figure 4B, étape 2).
    2. Placez des pinces de vaisseau sur l’ICA et le CCA pour occluser le flux sanguin artériel (figure 4B, étape 3). Un slipknot peut être utilisé comme alternative pour un clip de navire.
    3. Faire une petite incision sur l’ECA avec des microscises(figure 4B, étapes 3-4), insérer un filament commercial en silicone recouvert de nylon 6-0(figure 4B, étape 5), et fixer correctement avec un slipknot sur la CEA.
    4. Relâchez le clip du navire sur l’ICA, avancez le filament dans l’ICA jusqu’à ce que le marqueur argenté (15 mm) atteigne la bifurcation(figure 4B, étape 6), puis fixez la suture avec le2e nœud de la CEA (figure 4B, étape 6).
    5. Après 1 h d’ischémie, retirez ce filament et ligotez l’incision pour prévenir les saignements (figure 4B, étape 7), retirez le clip du vaisseau de la CCA (résultat final à l’étape 8) et fermez la plaie avec une suture chirurgicale de 4-0.

6. Récupération

  1. Après la chirurgie d’AVC, placez les animaux sur un coussin chauffant jusqu’à ce qu’ils reprennent pleinement conscience.
  2. Fournir l’analgésie par injection sous-cutanée. Renvoyez les animaux dans leurs cages d’origine avec accès à l’eau et à la nourriture ad libitum.

7. Injection intra-artérielle

  1. Laver le cathéter entier avec 70% d’éthanol et tremper toute la nuit jusqu’à ce qu’il soit utilisé. Juste avant l’injection, connectez la serrure Luer de l’aiguille avec une seringue stérile, et lavez l’ensemble du côté lumen du système de cathéter avec 10 mL de PBS stérile.
  2. Fenêtre de temps et préparation pour l’injection de NSC
    REMARQUE : D’après l’expérience et les rapports d’autres équipes de recherche, le moment de l’injection de la CSN est crucial pour la survie des sujets et des NSC exogènes. Dans notre étude pilote, l’injection de NSC aux premiers moments (dans les 6 premiers h après la reperfusion) a conduit à une mortalité plus élevée. Ainsi, nous avons testé des points de temps d’injection ultérieurs et déterminé la fenêtre de temps entre 2 d (48 h) à 3 d (72 h) après l’AVC est sûr et tolérable pour les animaux, et est efficace dans la réalisation de la distribution intraparenchymale des NSC. Les résultats présentés ici sont des animaux reçus injection NSC à 3 d après une blessure.
    1. Réglez le taux d’injection de la pompe à seringues à 20 μL/min pour les souris et à 50 μL/min pour les rats. La vitesse excessive ou la durée de l’injection peut entraîner une surcharge systémique de volume, à laquelle les souris sont plus vulnérables que les rats.
    2. En bref, à 3 d après la chirurgie d’AVC, anesthésiez les animaux avec l’isoflurane et les déposent sur un coussin chauffant.
    3. Rouvrir la plaie cervicale et exposer à nouveau la CEA, l’ICA et le CCA(figure 5, étape 1). Comme dans les chirurgies d’AVC, déterminer la voie d’injection en fonction de l’espèce. Utilisez le CCA pour l’injection de NSC dans la souris, et l’ECA pour le rat23.
  3. Injection intra-artérielle par le CCA chez la souris
    1. Placez deux sutures en nylon tressés 6-0 sous le CCA. Créer un slipknot lâche avec chacun d’eux entre la bifurcation et les noeuds inférieurs de la chirurgie précédente de course(figure 5, étape 2).
    2. Serrer le slipknot supérieur, puis faire une petite incision au-dessus du nœud inférieur (figure 5, étape 3). Insérez un cathéter MRE010 par l’incision(figure 5,étape 4) et fixez-vous avec le nœud central sans bloquer le flux d’injection (figure 5, étape 5). Le flux de sang doit être visible dans le cathéter lors de la libération du nœud supérieur et de l’ajustement de la position du cathéter.
    3. Placez un clip de navire sur la ECA, injectez 1 x 106 GFP-NSC à travers ce cathéter à 20 μL/min pendant 5 min avec une pompe à seringues, suivie d’une chasse d’eau avec 50-100 μL de PBS à la même vitesse.
    4. Après l’injection, ligoter le CCA au-dessus de l’incision avec le nœud de glissement supérieur et retirer le cathéter MRE010 (figure 5, étape 6). Serrer et couper le nœud du milieu et le nœud supérieur. Retirez le clip du navire de la CEA. Reportez-vous à l’image finale de la figure 5, étape 7.
    5. Fermez la plaie avec une suture chirurgicale de 4-0.
    6. Après avoir fourni une récupération adéquate sur un coussin chauffant et une injection analgésique sous-cutanée, renvoyez les animaux dans leur cage d’origine.
  4. Injection intra-artérielle par l’ECA chez le rat
    1. Occluser temporairement la CEA et la CCA avec des clips de navire (figure 5, étape 2).
    2. Faire une petite incision du côté proximal de l’ECA(figure 5, étape 3), insérer le cathéter MRE010 et fixer avec un nœud (figure 5, étape 4).
    3. Retirez les deux clips de navire, injectez 5 x10 6 NSC dans 100 μL de PBS à 50 μL/min pendant 2 min, suivie d’une chasse d’eau avec 50-100 μL de PBS(figure 5, étape 5) à la même vitesse, à l’aide d’une pompe à seringues motorisée.
    4. Après l’injection, occlusez le CCA et l’ECA avec des pinces de vaisseau à nouveau et l’ECA sur le côté proximal de la deuxième incision après le retrait du cathéter d’injection (figure 5, étape 6).
    5. Retirez les deux clips du vaisseau(figure 5, étape 7) et fermez la plaie avec une suture chirurgicale de 4-0.
    6. Après avoir fourni une récupération adéquate sur un coussin chauffant et une injection analgésique sous-cutanée, renvoyez les animaux dans leur cage d’origine.
  5. Essai histologique
    1. Recueillir les cerveaux de souris et de rats qui ont reçu un AVC ischémique suivi d’une injection de NSC ou d’une solution de véhicule après l’euthanasie et la perfusion intracardiaque avec 4 % de paraformaldéhyde à 1 d (souris et rat), 7 d (souris) et 30 d (souris) après injection. Chacun de ces quatre groupes était composé de 5 animaux injectés dans la CSN et 5 véhicules.
    2. Fixer les cerveaux pendant la nuit et cryoconserver dans 30% de saccharose pour 3 d.
    3. Incorporer les cerveaux dans les PTOM, trancher à 40 μm d’épaisseur, et examiner la distribution des NSC après immunostaining avec des marqueurs spécifiques à la cellule, y compris la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP, astrocytes), Tuj1 (neurones matures), et la doublecortine (DCX, neurones immatures).
      REMARQUE : En raison de l’absence d’une souche de rat qui exprime le GFP, nous avons utilisé le DiI, une étiquette fluorescente transitoire, pour les NSC de rat, qui ne permet qu’une observation à relativement court terme. Par conséquent, la distribution de NSC a été seulement examinée à 1 d après course chez les rats.

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Representative Results

Les NSC étiquetés GFP ont été facilement détectés dans le cerveau ischémique, principalement dans l’hémisphère ipsilateral, en particulier dans la pénombre et le long de la jante de blessure (Figure 6). L’examinateur a été aveugle pendant l’imagerie et l’analyse.

Par exemple, à 1 d après l’injection, des NSC ont été détectés dans l’hippocampe de souris. Un sous-ensemble de NSCs a montré la co-expression du marqueur de neurone immature DCX dans le gyrus denté même à ce point de temps tôt (Figure 6A).

À 10 d après un AVC (7 d après l’injection de la CSN), des GFP-NSC exogènes ont été observés à la densité la plus élevée au bord des blessures (zone de bassin versant) dans le striatum et le cortex (figure 6B). Il est à noter que par 7 d après l’injection beaucoup de GFP-NSCs ont également exprimé DCX (montré par les cercles bleus), indiquant leur sort neuronal. Comparativement aux animaux qui ont reçu l’injection de solution de véhicule, l’injection de NSC a également augmenté la coloration de DCX (rouge) dans l’hémisphère ipsilateral.

À 30 d après injection, les NSC étaient encore détectés dans le cortex blessé, et une partie d’entre eux ont montré l’expression du marqueur glial GFAP (Figure 6C) ou du marqueur neuronal mature Tuj1 (Figure 6D), indiquant le potentiel des NSC exogènes de se différencier en un destin glial ou neuronal, et de survivre jusqu’à 1 mois dans le cerveau blessé.

Figure 1
Figure 1 : Conceptions schématiques des cathéters d’injection. Nous introduisons deux conceptions, design 1 pour l’injection de solution composée et conception 2 pour l’injection de cellules. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Préparation du cathéter pour l’injection de NSC et des crochets chirurgicaux. (A) Matériaux pour la construction de cathéters : cathéters MRE010, MRE025 et MRE050 à 3 cm, ~10-15 cm et 3 cm de longueur, respectivement. (B) Couper les extrémités de l’aiguille et polir jusqu’à ce qu’ils soient ternes. (C) Connecter chaque segment et sécurisé avec superglue, puis intégrer les deux serrures aiguille Luer et MRE050 segment en époxy pour l’amélioration. (D) Faire crochet chirurgical à l’aide de l’arbre d’aiguille 27 G et cathéter MRE025. Barre d’échelle: 5 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Culture des cellules souches neurales GFP (+). (A) Identifier les embryons GFP (+) avec microscope à fluorescence à l’aide du canal FITC. (B) Isoler et culture cortical NSCs jusqu’à ce qu’ils forment des neurosphères. Barre d’échelle : 100 μm. (C) Examiner les propriétés de la neurosphère à l’aide d’un panneau de marqueur de cellules souches. Barre d’échelle : 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Images schématiques de la chirurgie de l’occlusion cérébrale moyenne (MCAO) sur la souris ou le rat. Reportez-vous à la vidéo pour une opération chirurgicale détaillée. ICA, artère carotide interne; ECA, artère carotide externe; CCA, artère carotide commune. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Images schématiques de l’injection de cellules souches neurales intraétriels (CSN) chez la souris ou le rat. Reportez-vous à la vidéo pour une opération chirurgicale détaillée. ICA, artère carotide interne; ECA, artère carotide externe; CCA, artère carotide commune. La flèche verte indique la direction du débit pendant l’injection. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Distribution, survie et différenciation des cellules souches neurales (NSC) dans le cerveau ischémique. (A) Détection des NSC de GFP (+) dans le gyrus denté hippocampal à 1 d après injection. Cellules souches fluorescence verte; immunostaining doublecortine (DCX) montré en rouge. La flèche blanche indique un NSC GFP (+) avec expression DCX. (B) Carte schématique des cellules GFP (+) et des cellules étiquetées DCX à 10 d après Ischémie-Reperfusion (I-R) dans les contrôles fictifs (pas d’injection) et les souris injectées par véhicule (I-R) ou NSC (I-R + NSC). La topographie de l’insulte ischémique est représentée dans le dernier schéma, où l’orange plus claire et plus foncée représentent la zone soumise au défi ischémique et le noyau nécrotique, respectivement. Le ruban bleu indique la zone « bassin versant ». Les rectangles gris représentent les endroits où les images pour (C) et (D) ont été prises. (C,D) Les NSC exogènes peuvent se différencier en un destin glial (GFAP, C) ou un destin neuronal (Tuj1, D) de 30 d après l’accouchement. Aucun signal significatif n’a été observé dans le canal du FITC (GFP) chez les animaux qui ont reçu l’injection de véhicule (véhicule en C et D),tandis que chez les souris injectées par la CSN, les GFP-NSC survivants ont été visualisés et colocalisés avec la coloration GFAP (C) ou Tuj1 (D). Les flèches indiquent la superposition de 2 canaux. Barre d’échelle : 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

La thérapie de cellules souches pour les maladies neurologiques est encore à un stade exploratoire précoce. Un problème majeur est qu’il n’existe pas de méthode établie pour une livraison suffisante de SC ou de NSC dans le cerveau.

Bien que des CSC/NSC exogènes puissent être détectés dans le cerveau après l’injection intraveineuse (IV), intrapéritoneal (IP) ou intraparenchymal/intracérébrale, chaque approche d’accouchement présente des inconvénients. On estime que la population détectable dans le cerveau est très faible avec injection périphérique (IV ou IP), ne représentant qu’une petite fraction des cellules injectées ou infusées. L’injection intracérébrale donne une distribution très focale, et peut directement induire des lésions cérébrales2,6,7,8,9,10,11,12,13. Par conséquent, nous avons testé la faisabilité de l’injection intra-artérielle comme méthode alternative pour l’accouchement de NSC suivant l’AVC ischémique. Cette méthode fournit NSCs par la perfusion cérébrale ipsilateral après une insulte de course. S’ils sont injectés tôt après l’AVC, les NSC exogènes peuvent traverser la barrière hémato-encéphalique perturbée (BBB), ce qui entraîne une large distribution dans tout le cerveau. Un avantage à l’injection intra-artérielle est qu’il utilise un effet de première passe au sein du SNC, maximisant le potentiel pour les NSC exogènes de s’installer dans le cerveau, contrairement aux voies périphériques de livraison dans lesquelles les cellules passent d’abord par la microcirculation riche des organes filtrants tels que le poumon et le foie.

L’approche intra-artérielle décrite ici est polyvalente et peut être adaptée pour s’adapter à différents types de paradigmes d’accouchement et de modèles de blessures ou de maladies. Bien que dans l’étude actuelle une seule injection intra-artérielle soit effectuée, le cathéter MRE025 peut être relié à un microport qui est intégré sous-cutanéement, par lequel les animaux peuvent recevoir des injections intra-artérielles répétitives12. En outre, avec la conception plus simple et unique de lumen, cette méthode d’injection peut être employée pour la livraison des réactifs dans la solution12,23. Si la livraison de plusieurs thérapies est nécessaire, la conception de lumen double pourrait être utilisée pour fournir une solution initiale simultanément ou séquentiellement avec un deuxième médicament ou composé. Pour les applications aux modèles de rongeurs de neurodégénérescence ou de lésions cérébrales traumatiques, où il n’est pas nécessaire de subir la chirurgie du premier AVC, la chirurgie pour l’installation du cathéter d’injection chez la souris peut être effectuée sur l’ECA (même protocole que celui du rat, ajustant de façon appropriée le volume d’injection et le taux à l’étape 7.4 pour les souris), afin d’éviter une perturbation potentielle du flux sanguin cérébral à travers la CCA.

Plusieurs inconvénients et conséquences négatives potentielles de cette injection intra-artérielle devraient être considérés. Les animaux reçoivent une deuxième chirurgie, qui comporte le potentiel de complications liées à l’anesthésie ou à la chirurgie. Le flux sanguin cérébral à travers le CCA ipsilateral est perturbé, quoique transitoirement (moins de quelques minutes), qui peut induire un autre épisode transitoire de dépression légère de CBF. En outre, la perturbation ou l’ouverture de BBB est critique pour l’accouchement intra-artériel de NSC, qui limite la fenêtre thérapeutique. Dans l’étude pilote, presque aucun NSC de GFP (+) n’a été détecté dans le cerveau naïf après injection intra-artérielle. Toutefois, si le sujet peut tolérer les médicaments qui peuvent ouvrir de façon transitoire BBB, tels que le mannitol à haute osmolalité ou saline, cela pourrait être utilisé pour créer une fenêtre transitoire d’ouverture BBB pour l’injection NSC à des moments ultérieurs. Dans les études préliminaires, nous avons constaté que l’injection intra-artérielle dans les 6 premiers h après l’AVC a eu comme conséquence la mortalité plus élevée que observée avec l’AVC seul. Ceci peut être lié à une deuxième chirurgie invasive après une période relativement courte de rétablissement après la première chirurgie. Alternativement, après insulte ischémique, la cérébrovasculature blessée peut avoir une tendance plus élevée à se contracter en réponse à tout stimulus supplémentaire, tels que l’introduction du cathéter, la charge supplémentaire de fluide, ou l’attachement des NSC exogènes au mur luminal après injection. Une autre préoccupation raisonnable concernant l’accouchement par la CSN après un AVC est que les CNS pourraient former des embolies qui s’occlusent ou perturbent davantage les microvessels. En accord avec les rapports précédents8,16,24, nous n’avons pas trouvé de preuves significatives de GFP (+) emboli dans la microvasculature, bien que nous ayons trouvé des NSC GFP (+) dans l’espace périvasculaire (espace Virchow-Robin) dans les premiers jours après l’injection. Après avoir optimisé la fenêtre de temps pour l’injection, il n’y avait aucune différence dans la complication ou le taux de mortalité entre les groupes d’AVC qui ont reçu l’injection de véhicule ou de NSC dans l’étude actuelle. Par conséquent, l’injection intra-artérielle bien conçue est une méthode sûre et efficace de traitement de la CSN ciblant les maladies neurologiques.

Pour obtenir une injection réussie de la CSN et améliorer les résultats chez les animaux, plusieurs aspects doivent être traités avec prudence pendant la chirurgie de l’AVC ou l’injection de la CSN. Le soutien chirurgical général et les soins, tels que la protection de la cornée et le maintien de la température centrale, devraient être pratiqués. Ici, nous introduisons quelques complications potentielles de cette chirurgie spécifique et des conseils pour minimiser leur occurrence.

Il peut y avoir du stress sur le nerf vague. Pendant la chirurgie, le nerf vague ne doit pas être étiré, écrasé, ligaté ou stimulé. La stimulation accidentelle du nerf vague peut induire l’arythmie telle que la bradycardie, l’arrêt cardiaque, ou même la mort.

Un mauvais placement ou un resserrement de la suture, ou un mauvais placement ou un glissement d’une pince de navire peut entraîner des saignements artériels de l’extrémité proximale de la CCA (à partir de la sortie cardiaque) ou de l’extrémité distale par le cercle de Willis. À chaque étape, assurez-vous que le clip ou les noeuds du vaisseau sont placés correctement pour occluser le flux sanguin. En cas de saignement, essayez de rétablir le bon emplacement des nœuds ou des pinces à nœuds. Si le champ visuel est brouillé avec du sang, placez la pointe d’un coton-tige stérile sur le CCA et maintenez-le avec pression pour arrêter le flux sanguin. L’hémoglobine due facilitera la fermeture de l’incision sur l’artère. Après l’arrêt du saignement, serrez le noeud ou placez le clip du vaisseau à l’emplacement correct, nettoyez le sang dans le champ visuel et continuez la chirurgie.

Il peut y avoir des blessures ou des complications de l’insertion de cathéter. Coupez la pointe MRE010 à un angle de 45°, de sorte qu’elle puisse entrer facilement dans la petite incision de l’artère, sans provoquer de blessure au vaisseau. Dans de rares cas, une pointe sur-aiguisée peut pénétrer dans l’artère ou entrer dans l’espace entre la membrane du sous-sol et tunica externe. Pour éviter ces blessures, faire une incision de taille appropriée sur l’artère. Nous recommandons une taille de 1/4-1/3 la circonférence de l’artère, qui est assez grande pour permettre l’entrée de la pointe de cathéter, mais conserve la force suffisante dans la paroi du navire pour envelopper à l’extérieur du cathéter. Une incision trop grande peut entraîner une déchirure de l’artère au site de l’incision. Guidez doucement la pointe du cathéter MRE010 pour entrer dans l’incision. Ne forcez pas l’entrée de la pointe du cathéter ou l’avancement du cathéter. Si nécessaire, des forceps tranchantes peuvent être utilisés pour soulever le bord de l’incision. Avancez le cathéter avec un angle bas par rapport à l’artère de sorte que le cathéter et l’artère sont presque parallèles.

Il existe également des complications liées à l’injection. Une complication commune de l’injection intra-artérielle est la charge excessive de volume, qui peut mener à la surcharge cardiaque aiguë et à l’oedème pulmonaire. Les taux d’injection rapide peuvent amplifier ces risques et endommager la paroi du vaisseau8. Ainsi, le taux et le volume total doivent être soigneusement contrôlés. Nous recommandons 20 μL/min comme généralement sûr pour les souris lorsqu’ils sont utilisés sur une courte période comme 5 minutes. Si des symptômes de surcharge de volume sont notés, tels que le souffle rapide et peu profond, les bulles roses des nares, ou le mouvement aberrant dysphorie-comme, l’injection devrait être arrêtée ou avortée, et les animaux laissés récupérer. Une autre complication possible est la formation de l’embolie de NSC dans le système cérébrovasculaire. La solution de suspension ne doit pas contenir de calcium ou de magnésium, qui sont connus pour favoriser l’agrégation cellulaire. Pour réduire les risques d’induire des embolies, les suspensions à cellules simples des NSC doivent être examinées au microscope juste avant l’injection pour confirmer l’absence de grappes cellulaires. Si des grappes cellulaires sont présentes, titrer avec un pipet stérile de 1 mL jusqu’à ce que la suspension à cellule unique soit atteinte.

Cette étude établit la faisabilité de l’approche de livraison intra-artérielle pour les souris et les rats, et révèle plusieurs caractéristiques importantes de cette injection intra-artérielle des NSC dans le contexte de l’AVC ischémique. En comparaison avec la distribution relativement focale des NSC survivant dans le parenchyme cérébral typiquement rapporté avec l’injection intra-cérébrale1,7,9,1111,15,16, nous avons observé une distribution diffuse dans tout l’hémisphère ipsilateral, y compris le cortex, l’hippocampe et le striatum. Ainsi, l’accouchement intra-artériel est bien adapté non seulement à l’AVC, mais aussi à de multiples types de blessures ou de maladies qui impliquent des lésions cérébrales diffuses. Dans le cadre de l’ACMAO, la plus forte concentration de NSCs a été trouvée le long du bord du site de blessures. L’augmentation de la densité des NSC exogènes dans la zone de la pénombre peut être due à l’augmentation de la livraison dans cette région par le biais du flux collatéral provenant de la perfusion sanguine rétablie et de l’ouverture du BBB ainsi que de la migration des CRN vers la zone endommagée. Bien que la livraison IV de SC peut entraîner une distribution diffuse, le nombre de cellules qui atteignent le cerveau est estimé à une petite fraction du total livré, en partie en raison de la filtration par les organes périphériques8,13. Basé sur une étude précédente sur la métastasecérébrale 12, intra-artériel injecté luciferase-étiquetés D122 cellules tumorales ont profité de l’effet de premier passage pour s’installer dans la vascularature cérébrale et développer des sites métastatiques dans le cerveau plutôt que les organes périphériques. Des sites métastatiques cérébraux dus aux cellules tumorales exogènes ont été détectés dans l’ipsilateral du cerveau à l’injection dès 1 semaine après l’injection à l’aide d’un système d’imagerie IVIS pour détecter le signal bioluminescent à travers le crâne intact et le cuir chevelu. En revanche, les signaux luminescents (indiquant la charge tumorale associée aux cellules tumorales exogènes) des organes périphériques, tels que le foie, le poumon et le muscle, n’ont été détectés que 3-4 semaines après l’injection intra-artérielle. Par conséquent, nous nous attendons, dans un scénario similaire, l’accouchement intra-artériel NSC bénéficiera également de l’effet de premier passage dans la circulation cérébrale pour augmenter considérablement la localisation au cerveau par rapport aux organes périphériques.

Bien que l’injection intracérébrale directe puisse être utilisée pour fournir un grand nombre de cellules au cerveau blessé, l’approche entraîne des dommages cellulaires ou une hémorragie due à la pénétration de l’aiguille du parenchyme qui déclenche la neuroinflammation localisée, ce qui compromet potentiellement la survie et l’intégration des cellules nouvellement livrées14,15,16,25,26. L’approche intra-artérielle pour l’accouchement par la CSN est avantageuse en ce qu’elle évite ces lésions cérébrales localisées et cette neuroinflammation, et soutient la survie à long terme des NSC3,,8,9,14,24. Nous avons observé la survie et la différenciation des GPF-NSC injectés dans le cerveau blessé aux points de temps jusqu’à 30 d après injection. Bien que nous ayons trouvé des NSC qui s’étaient différenciés en neurones et astrocytes matures, des études détaillées sont nécessaires pour déterminer la distribution relative de divers types de cellules générés à partir de GFP-NSC et les proportions qui survivent dans la période post-jugement chronique. Plus important encore, la question de savoir si les NSC exogènes survivants peuvent interagir avec les cellules constitutives du cerveau pour reconstruire le réseau cérébral et modifier la fonction neurologique n’est pas encore claire et devrait être explorée.

Pris ensemble, nous introduisons une méthode de livraison intra-artérielle pour fournir des NSC dans le cerveau ischémique, démontrant la survie à long terme dans l’hémisphère ischémique et la différenciation dans les types de cellules neuronales et gliales. L’approche de prestation intraériel est adaptable pour de nombreuses espèces et de multiples modèles de lésions et de maladies du SNC et peut être utilisée pour la livraison d’autres types de cellules ou de composés thérapeutiques ou de produits biologiques isolés ou multiples, ce qui fournit une large utilité à la communauté des neurosciences.

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Disclosures

Aucun.

Acknowledgments

Cette recherche a été soutenue par ce qui suit : Prix AHA 14SDG20480186 pour LC, équipe d’innovation sujet de l’Université Shanxi de médecine chinoise 2019-QN07 pour BZ, et Kentucky Spinal Cord and Head Injury Research Trust subvention 14-12A pour KES et LC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20 G needle Becton & Dickinson BD PrecisionGlide 305175 preparation of injection catheter
26 G needle Becton & Dickinson BD PrecisionGlide 305111 preparation of injection catheter
27 G needle Becton & Dickinson BD PrecisionGlide 305136 preparation of injection catheter
4-0 NFS-2 suture with needle Henry Schein Animal Health 56905 surgery
6-0 nylon suture Teleflex/Braintree Scientific 104-s surgery
Accutase STEMCELL Technologies 7922 cell detachment solution
blade Bard-Parker 10 surgery
Buprenorphine-SR Lab ZooPharm Buprenorphine-SR Lab® analgesia (0.6-1 mg/kg over 3 d)
Calcium/magnisum free PBS VWR 02-0119-0500 NSC dissociation
DCX antibody Millipore AB2253 immunostaining
GFAP antibody Invitrogen 180063 immunostaining
Isoflurane Henry Schein Animal Health 50562-1 surgery
MCAO filament for mouse Doccol 702223PK5Re surgery
MCAO filament for rat Doccol 503334PK5Re surgery
MRE010 catheter Braintree Scientific MRE010 preparation of injection catheter
MRE025 catheter Braintree Scientific MRE025 preparation of injection catheter
MRE050 catheter Braintree Scientific MRE050 preparation of injection catheter
Nu-Tears Ointment NuLife Pharmaceuticals Nu-Tears Ointment eye care during surgery
S&T Forceps - SuperGrip Tips JF-5TC Angled Fine Science Tools 00649-11 surgery
S&T Forceps - SuperGrip Tips JF-5TC Straight Fine Science Tools 00632-11 surgery
Superglue Pacer Technology 15187 preparation of injection catheter
syringe pump Kent Scientific GenieTouch surgery
Tuj1 antibody Millipore MAb1637 immunostaining
two-component 5 minute epoxy Devcon 20445 preparation of injection catheter
Vannas spring scissors Fine Science Tools 15000-08 surgery
vascular clamps Fine Science Tools 00400-03 surgery
Zeiss microscope Zeiss Axio Imager 2 microscopy

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